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Manual Virologia Prtica

Mestrado Integrado
em Cincias Farmacuticas

Expresso de GFP
- clulas GHOST

3 Edio
Lisboa 2008
HIV-2ALI; JM Azevedo Pereira resultados no publicados

Este manual foi elaborado com o objectivo de dar apoio s aulas prticas da cadeira de Virologia do
Mestrado Integrado em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa.
Aqui so abordados vrios temas relacionados com o diagnstico laboratorial das infecces virais. Para
algumas das infecces virais mais importantes, so aprofundados os conceitos e procedimentos usados
nesse diagnstico.
Docentes:
Jos Miguel Azevedo Pereira (Professor Auxiliar da FFUL)

Contacto: Telf: 217946400; ext: 266

e-mail: miguel.pereira@ff.ul.pt

home page: http://web.mac.com/jmiguelap/Entrada_geral/Entrada.html

http://www.ff.ul.pt/paginas/jazevedo/Site/Welcome.html
Quirina Santos Costa (Assistente da FFUL)

Contactos: Telf.: 217946200; ext: 226

e-mail: quirina.c@ff.ul.pt

home page: http://web.mac.com/santoscostaq/santoscostaq/Santos-CostaQ.html

Abreviaturas usadas:
Ac- Anticorpo
Ag- Antignio
CMSP- Clulas mononucleadas do sangue perifrico
CMV- Citomegalovirus
DNA- cido Desoxirribonucleico
EBV- Vrus Epstein-Barr
EIA- Ensaio imunoenzimtico
HHV-8- Herpes vrus humano tipo 8
HIV- Vrus da Imunodeficncia Humana
HPV- Vrus do Papiloma Humano
HSV- Vrus Herpes Simplex

HTLV- Human T-cell Lymphotropic Virus


IF- Imunofluorescncia
IHA- Inibio de hemaglutinao
LCR- Lquido cfalo-raquidiano
ME- Microscopia electrnica
PCR- Polymerase chain reaction
RFC- Reaco de fixao do complemento
RIA- Ensaio imuno-radioactivo
RNA- cido Ribonucleico
RSV- Vrus Respiratrio Sinccial
TTV- Transfusion Transmited Virus
VZV- Vrus da Varicela-Zona

ndice
I- Mtodos de diagnstico em Virologia

1- Mtodos directos
2- Deteco de anticorpos especficos (serologia)
3- Cultura de clulas eucariotas

4
12
15

II- Diagnstico da Infeco por HSV

17

1- Caractersticas gerais
2- Diagnstico 

17
19

III- Diagnstico da Infeco pelo citomegalovirus (CMV)

21

1- Caractersticas
2- Diagnstico

21
21

IV- Diagnstico da Infeco pelo vrus da rubola

25

1- Caractersticas
2- Sndroma de Rubola congnita
3- Diagnstico laboratorial

25
25
25

V- Diagnstico da Infeco pelo vrus da hepatite B (HBV)

28

1- Caractersticas
2- Diagnstico da infeco pelo HBV

28
28

VI- Diagnstico da Infeco pelo HIV

32

1- Caractersticas
2- Organizao genmica
3- Ciclo replicativo
4- Patognese da infeco
5- Diagnstico da infeco pelo HIV
6- Principais problemas no diagnstico da infeco pelo HIV
7- Outros marcadores de diagnstico e monitorizao da infeco
8- Mtodos usados na monitorizao e prognstico da infeco:
9- Quantificao da carga viral

32
32
33
35
35
39
40
40
41

Anexos

43

Perfil serolgico de uma infeco crnica pelo VHB


Perfil serolgico de uma infeco aguda pelo VHB

43
43

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

I- Mtodos de diagnstico em
Virologia

igualmente possvel detectar-se a presena/


subida de anticorpos da classe IgM. As tcnicas
disponveis para a deteco e quantificao de
anticorpos so:
Ensaios imunoenzimticos (EIA: ELISA,
ELFA, etc.)
Ensaios radioimunolgicos (RIA)
Aglutinao
Western-blot
Recombinant immunoblot assay (RIBA)
Imunofluorescncia
Fixao de complemento
Inibio de hemaglutinao

Duma forma geral, os mtodos de diagnstico usados no diagnstico de viroses humanas


podem ser agrupados em duas categorias diferentes: os mtodos directos e os mtodos
indirectos.
Nos mtodos directos pretende-se identificar,
na amostra clnica, a presena do vrus ou de
componentes desse vrus. Assim, englobam-se
nesta categoria a microscopia electrnica (ME),
a cultura viral, a deteco de antignios virais
(Ag) e a deteco do cido nucleico viral.
Nos mtodos indirectos pesquisa-se a presena
de anticorpos especficos para um determinado
vrus (serologia). Este tipo de mtodos constituem a maioria das tcnicas executadas num
laboratrio de virologia, uma vez que a maioria
das infeces virais pode ser diagnosticada por
este tipo de mtodos. O diagnstico serolgico
de uma infeco viral pode ser feito detectando
a presena ou a subida do ttulo de anticorpos
especficos para um determinado vrus. Esta
deteco envolve, normalmente, os anticorpos
da classe IgG ou a totalidade de anticorpos circulantes presentes (IgG+IgM). Em alguns casos

1- Mtodos directos
1.1. Deteco de antignio viral
A principal vantagem destes mtodos a rapidez com que o resultado obtido. No entanto,
na maior parte dos casos, trata-se de tcnicas
que envolvem a correcta interpretao das observaes feitas, o que torna os resultados menos objectivos. A sensibilidade e especificidade
so igualmente menores quando comparadas

Figura 1- Clula epitelial infectada pelo

Figura 2- Antignio pp65 do CMV detecta2- Antignio


pp65 do
do nos Figura
ncleos
de neutrfilos
doCMV
sangue
detectado
nos ncleos
de por
neutrfilos
do
perifrico
detectado
IF

Figura 1- Clula
infectada
HSV-1 epitelial
detectada
por IF
pelo HSV-1 detectada por IF

sangue perifrico detectado por IF

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com outras tcnicas. Est muito dependente da
qualidade da amostra clnica. So ainda tcnicas no automatizadas que envolvem a interveno frequente do operador.
Exemplos de deteco de antignios como mtodo de diagnstico de viroses: deteco de
clulas infectadas por RSV, ou adenovirus, em
aspirados naso-farngeos ou bronco-alveolares;
deteco de HSV (Figura 1) ou VZV em zaragatoas de leses cutneas (exemplos em que se
utiliza a tcnica de imunofluorescncia); deteco de rotavirus ou adenovirus nas fezes (por
reaco de aglutinao de partculas de ltex);
deteco de antignio p24 do HIV no soro ou
plasma (antigenmia); deteco de antigenmia
pp65 do CMV (por mtodos imunoenzimticos
- EIA).

1.2. Microscopia electrnica (ME)


As partculas virais so detectadas e identificadas com base na sua morfologia. A sua principal vantagem reside no facto de ser possvel visualizar directamente a partcula viral. Desta
forma possvel examinar a amostra sem que
para tal seja necessrio o conhecimento prvio
dos possveis agentes causais, em contraste
com outros mtodos que usam clulas (cultura
celular) ou sondas especficas (PCR, deteco
de antignio, deteco de anticorpos).

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A rapidez outra das vantagens da ME, podendo por isso ser usada em diagnstico virolgico
rpido. No entanto, exige que na amostra clnica existam partculas virais em quantidade suficiente para poderem ser visualizadas (105-106
partculas virais/ml). Devido a isso, a sua sensibilidade baixa, podendo, no entanto, ser aumentada utilizando a imuno-microscopia electrnica
(IME), onde so usados anticorpos especficos
do vrus a pesquisar, por forma a aglutinar as
partculas virais, tornando-as mais fceis de visualizar e reconhecer. Para alm da sua baixa
sensibilidade, a ME tem como desvantagem ser
uma tcnica dispendiosa, quer na aquisio do
equipamento, quer na sua manuteno e utilizao, exigindo pessoal devidamente treinado.
Devido a isso, e ao facto dos mtodos de deteco de antignios e de diagnstico molecular, se terem tornado mais fiveis, sensveis e
econmicos, fizeram com que cada vez menos
se utilize a ME como mtodo de diagnstico. Actualmente a ME usada no diagnstico de gastrenterites virais a partir das fezes (rotavirus,
adenovirus - Fig 3, astrovirus, calicivirus, etc).
Menos frequentemente pode ser usada para
a deteco de vrus em leses cutneas, como
por exemplo o HSV ou o HPV.

Figura 4- Corpos de Negri (setas) presentes


no citoplasma de um neurnio infectado com
o vrus da raiva

1.3. Deteco de corpos de incluso


Figura 3- Partculas virais de Adenovirus presentes nas fezes

A replicao viral provoca, por vezes, alteraes


histolgicas (corpos de incluso) nas clulas infectadas in vivo. Estas alteraes podem ser

Prticas de Virologia

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caractersticas ou no-especficas. Os corpos


de incluso, observveis por microscopia ptica
nas clulas presentes na amostra clnica, so
basicamente conjuntos de partculas virais que
esto a ser produzidas pela clula infectada no
ncleo ou no citoplasma. Exemplos de corpos
de incluso so os corpos de Negri (Fig. 4) e os
corpos de incluso citomeglicos, encontrados
nas infeces pelos vrus da Raiva e pelo CMV
(citomegalovirus), respectivamente. Embora
pouco sensvel e especfica, a identificao histolgica dos corpos de incluso pode, ainda assim, ser til no diagnstico de algumas viroses,
em conjunt com outros mtodos mais especficos e sensveis.

Southern-blot os quais dependem do uso de


sondas marcadas (com radioactividade ou com
enzimas) especficas do DNA/RNA a pesquisar
(por hibridao da sonda com a sequncia alvo).
A especificidade depende das condies usadas
durante o processo de hibridao. A sensibilidade destas tcnicas , em geral, idntica observada para os testes convencionais.
As tcnicas mais recentes, tal como a polymerase chain reaction (PCR), a ligase chain reaction
(LCR), a nucleic acid based amplification (NASBA), e branched DNA (bDNA), dependem todas
elas de alguma forma de amplificao, seja do
cido nucleico a pesquisar, seja do prprio sinal emitido pela reaco final. Destas tcnicas
a mais sensvel e a que mais usos tem tido no
diagnstico virolgico o PCR. Teoricamente,
1.4. Deteco do genoma viral
pela tcnica de PCR possvel amplificar-se
Os mtodos baseados na deteco do genoma
uma nica cpia de DNA alvo presente na amosviral, so igualmente conhecidos como mtotra clnica. Devido a esta extrema sensibilidade,
dos de biologia molecular. Embora estes mtoa execuo desta tcnica traz consigo alguns
dos tenham, nos ltimos anos, aumentado de
problemas, o maior dos quais tem a ver com
importncia no contexto do diagnstico viral, o
a possibilidade de contaminaes, uma vez que
papel desempenhado por eles na rotina laborabasta a presena duma quantidade mnima de
torial ainda pequeno, quando comparado com
DNA contaminante para se obter um resultaos outros testes convencionais.
do falsamente positivo. Por outro lado, a detecOs testes clssicos de deteco do genoma
o por PCR de DNA de um determinado vrus,
viral englobam as tcnicas de dot-blot e de
no significa necessariamente que se esteja na

A
B

Figura
5- Exemplo
de reaco
de hibridao
in situ.
Deteco
clulasinfectadas
infectadas com
com oo vrus
Figura
5- Exemplo
de reaco
de hibridao
in situ.
A-ADeteco
dede
clulas
vrus do
papiloma
humano
numa
amostra
obtida
do coloB-do
tero; B-de
Deteco
clulas com o
do papiloma
humano
numa
amostra
obtida
do colo
do tero;
Deteco
clulas de
infectadas
amostra
de uma leso
doleso
Sarcoma
de Kaposi
infectadasHHV-8
com o numa
HHV-8
numa amostra
de uma
do Sarcoma
de Kaposi

Prticas de Virologia
presena real duma patologia. Casos como a
deteco de genomas virais identificados como
sendo do vrus da hepatite G ou do TTV (transfusion transmited virus) no permitem, por si s,
fazer a respectiva associao com qualquer estado patolgico agudo ou crnico. Tambm nos
casos de infeces por vrus que se mantm
latentes no hospedeiro, a deteco de genoma
viral a nvel celular, no implica necessariamente que esteja a ocorrer uma manifestao patolgica desse vrus.
Dentro deste grupo de testes h ainda a referir os que utilizam as reaces de hibridao in
situ (Fig. 5). Neste caso a integridade da clula
mantida, sofrendo somente uma permeabilizao de forma a permitir a entrada da sonda
molecular marcada com uma enzima. Uma vez
que a estrutura celular e tecidular so mantidas, permite quantificar o nmero de clulas infectadas e quais os tipos de clulas, ou compartimentos celulares, onde o genoma viral existe.

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de mtodo utiliza quase sempre culturas de clulas mantidas in vitro.
As clulas eucariotas variam muito quanto
sua susceptibilidade aos diferentes vrus. de
importncia crucial a escolha da(s) clula(s)
mais susceptveis para um determinado vrus
suspeito de estar presente numa determinada amostra (dependendo dos sinais clnicos).
Alm disso, a amostra dever ser enviada ao
laboratrio o mais rapidamente possvel aps
a colheita.
Depois de recebida a amostra, esta inoculada
em diferentes tipos de culturas celulares dependendo dos vrus supostamente envolvidos. Este
inculo mantido durante pelo menos 1 hora
at ao mximo de 16-18 horas (overnight). As
clulas so mantidas a 37C em estufa com atmosfera controlada (5% CO2).
As culturas celulares podem ser de diferentes
tipos. Assim podemos classific-las quanto ao
modo de cultura ou quanto ao tipo de clulas.

Quanto ao modo de cultura, as clulas podem


ser classificadas como clulas em suspenso
O isolamento de vrus a partir de amostras clou clulas em monocamada. As primeiras,
nicas constitui um importante mtodo de diagcomo o nome indica, crescem no aderentes
nstico de infeces virais. Este pode ser conseao suporte slido, dispersas no meio de cultura.
guido por inoculao das amostras clnicas em
As segundas crescem aderentes s paredes
clulas eucariotas mantidas em cultura in vitro,
internas do frasco de cultura ou outro suporte
ou, em alternativa, por inoculao em animais
slido. Esta caracterstica est dependente da
ou ovos embrionados. Estas duas ltimas alterorigem das clulas: se as clulas, in vivo, exisnativas so usadas somente em casos muito
tirem em suspenso (clulas sanguneas por
particulares, devido principalmente maior diexemplo) mantm essa caracterstica in vitro.
ficuldade na sua manuteno. Assim, este tipo
Se in vivo as clulas formarem tecidos ou r-

1.5. Isolamento viral

Figura 6- Exemplos de efeitos citopticos (ECP) induzidos por alguns vrus. Da esquerda para a direita: ECP do HSV-1, HIV-2 e RSV

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gos slidos, existindo aderentes entre si, mantero essa propriedade in vitro.
Quanto ao tipo de clulas, estas podem ser classificadas como clulas primrias, clulas secundrias e clulas contnuas (ver mais adiante no
texto).

Alternativamente, a presena de vrus em cultura pode ser feita recorrendo tcnica de hemaglutinao ou tcnica de interferncia viral.
No primeiro caso, pesquisa-se a presena de
protenas com capacidade de aglutinar hemcias de espcies animais especficas (humanas
tripsinizadas, de pombo, etc.). Essas protenas
so pesquisadas no sobrenadante da cultura
infectada pondo em contacto esse sobrenadante com uma suspenso de hemcias em placas
com cpulas de fundo em V. Caso existam hemaglutininas, as hemcias ficam em suspenso
no se concentrando no fundo da cpula (vrtice do V). Os resultados possveis esto representados na Figura 11.
A tcnica de interferncia viral usada nos casos em que nenhuma das anteriores tcnicas
pode ser usada. O seu princpio baseia-se no
facto de haverem determinados vrus que interferem com a replicao de outros que se multiplicam nas mesmas clulas, impossibilitando
estes ltimos de fazerem o seu ciclo replicativo.
O sistema vrus-clula portanto constitudo
por um tipo de clulas e por dois vrus: o vrus
que se pretende detectar (vrus A que interferente) e o vrus indicador (vrus B). Este ltimo ter de ser capaz de induzir um ECP claro e
rpido. Caso na cultura celular inoculada existir
o vrus A, ele vai impedir que, aps inoculao
posterior do vrus B, este possa fazer o seu ciclo de replicao e por isso no aparea o ECP
esperado. Caso no exista o vrus A na cultura,
a inoculao do vrus B ir resultar no aparecimento do ECP esperado e caracterstico. Este
procedimento obviamente mais laborioso e,
como j foi dito s usado em casos particulares em que nenhuma das tcnicas anteriores
passvel de ser utilizada. Alm disso, impe a
conhecimento presuntivo de qual o vrus que
dever estar presente em cultura para que a
escolha do vrus B possa ser convenientemente
feita. Essa suspeita baseia-se em vrios parmetros dos quais os mais importantes so: tipo
de sintomatologia, amostra biolgica usada e o
facto de se verificar a ausncia de ECP.

1.5.1. Deteco dos vrus em cultura


Aps inoculao da amostra, e aps o tempo
necessrio para que a replicao viral ocorra,
a deteco de replicao viral nas clulas inoculadas pode ser feito pela visualizao do efeito citoptico (ECP - Fig 6). Com esse objectivo,
as culturas inoculadas devem ser observadas
diariamente. Regularmente tambm, o meio de
cultura deve ser mudado por forma a manter
as clulas em crescimento e em bom estado
fisiolgico.
Alguns vrus, no entanto, no induzem o aparecimento de ECP. Nesses casos tem que se
recorrer a tcnicas de deteco alternativas.
Uma dessas tcnicas a hemadsoro. Esta
tcnica baseia-se no facto de alguns vrus (influenza e parainfluenza, por exemplo) induzi
rem a expresso de hemaglutininas, de origem
viral, na membrana da clula infectada. Desta
forma, a clula adquire a capacidade de fixar
hemcias na sua membrana. Nesta tcnica,
o meio de cultura removido e as clulas so
incubadas com uma suspenso de hemcias a
4C ou TA durante 30 minutos. A suspenso
de hemcias removida e o tapete celular observado ao microscpio. Caso exista hemadsoro (Figura 7), as hemcias vo ficar aderentes
a algumas clulas (clulas infectadas e por isso
expressando hemaglutininas virais).

1.5.2. Identificao dos vrus em cultura


A identificao presuntiva de um vrus em cultura pode ser feita com base no seu ECP, na capacidade de induzir hemadsoro e no tipo de

Figura 7- Exemplo de um resultado positivo pela tcnica de hemadsoro. Reparar


na acumulao de hemcias junto de algumas clulas (seta)

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clula onde esse vrus foi capaz de se replicar
(susceptibilidade celular). No entanto, para a
identificao cabal e objectiva do vrus em questo, torna-se necessrio recorrer a tcnicas
como a imunofluorescncia, imunoperoxidase,
neutralizao, inibio da hemaglutinao, microscopia electrnica e eventualmente a tcnicas de biologia molecular (amplificao, clonagem e sequenciao do genoma viral).
1.5.3. Vantagens e desvantagens do isolamento e cultura do vrus in vitro
A principal vantagem do isolamento viral, no
mbito do diagnstico viral, a especificidade
e a capacidade de usar os vrus obtidos para
futuras caracterizaes. No entanto esta tcnica tem vrias desvantagens: necessidade de
existirem linhas celulares adequadas em cultura, laboratrio devidamente apetrechado para
a manipulao de amostras contendo vrus patognicos, pessoal devidamente treinado, custos elevados. Alm disso, as culturas celulares
so, devido aos meios de cultura extremamente
ricos que so utilizados, facilmente contaminveis por bactrias e/ou fungos.

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1.5.4. Cultura viral com centrifugao
Um dos avanos mais importantes, no diagnstico rpido das infeces virais, foi a aplicao
da centrifugao cultura viral tradicional. Esta
tcnica baseia-se no facto de se conseguir aumentar a eficincia de infeco (infecciosidade)
de alguns vrus quando, aps inoculao da
amostra, se submete as culturas a uma fora
centrfuga de baixa velocidade. As clulas assim
tratadas so incubadas, 24-48 horas depois da
inoculao, com anticorpos monoclonais marcados, especficos de antignios precoces do vrus suspeito de estar presente na amostra biolgica inoculada (presumido a partir dos sinais
clnicos e do tipo de amostra colhida). Um dos
melhores exemplos de aplicao desta tcnica
o diagnstico precoce da infeco pelo CMV
(citomegalovirus). Neste caso a amostra inoculada numa cultura de fibroblastos humanos
(Fig.8).
1.5.5. Titulao de um vrus
Em Virologia, existem dois mtodos para quantificar (titular) uma suspenso viral: o mtodo
das placas e o da diluio limite.
Mtodo das placas:
Baseia-se no princpio de que um vrus, ao infectar uma clula e ao ser transmitido s clulas
vizinhas, ir provocar a morte a essas clulas.
Estas clulas mortas sero visualizadas, aps
adio de um corante vital (vermelho neutro).
As clulas susceptveis ao vrus a titular so postas em cultura, numa placa de Petri ou numa
cpula de dimenses apropriadas, e usadas
quando tiverem numa densidade correspondente sub-confluncia.
A suspenso viral a titular diluda sucessivamente, num factor de diluio 1:10 e cada
10-5

Figura 8- Exemplo do resultado obtido pela


tcnica de cultura com centrifugao. Uma
cultura de fibroblastos humanos (MRC-5)
foi inoculada com uma amostra contendo
CMV, submetida a centrifugao e incubada com anticorpo monoclonal para o antignio precoe do CMV, pp72, marcado com
fluorescena

10-6

10-7

Figura 9- Mtodos das placas. Foram inoculadas as diluies 10-5,


-6 e 10-7; as
9-placas
Mtodos
das
Foram
inocula10Figura
formadas
emplacas.
cada diluio
so visveis
aps
adio do corante
das as diluies
10-5, vermelho
10-6 e neutro
10-7; as placas

formadas em cada diluio so visveis aps


adio do corante vermelho neutro

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Tabela 1- Esquema do clculo da TCID50 por inoculao de clulas susceptveis

Diluio
viral

N de
culturas
infectadas/
inoculadas

Total
acumulado
de culturas
infectadas

Total
acumulado
no
infectadas

Taxa de
infeco

Percentagem
infectadas

10-4

5/5

10

10/10

100%

10-5

4/5

5/6

83%

10-6

1/5

1/6

17%

10-7

0/5

10

0/10

0%

A diluio correspondente TCID50 est localizada entre as diluies 10-5 e 10-6 (83% e 17%,
respectivamente). Para se calcular essa diluio recorre-se formula de interpolao:
% de infeco > 50% - 50%
% de infeco > 50% - % de infeco < 50%
No caso do exemplo ser:
83 - 50/83-17 = 33/66 = 0,5
O valor encontrado multiplicado pelo negativo do log10 do factor de diluio, que no caso do
exemplo d igual a -1, ficando por isso
-1 x 0,5 = -0,5
O log10 da diluio que corresponde TCID50 obtido adicionando o valor obtido anteriormente
ao valor do log10 da diluio acima dos 50%. Ou seja:
-5 + (-0,5) = -5,5
Ou seja, a diluio correspondente TCID50 igual a 10-5,5 e portanto o ttulo da suspenso
105,5 TCID50

uma das diluies ser inoculada numa placa


individualmente. Na prtica, sero inoculadas
somente as diluies mais provveis de darem
uma leitura adequada (por exemplo as diluies
10-5, 10-6 e 10-7). Aps a inoculao as clulas
inoculadas so inundadas com meio de cultura contendo agarose, por forma a favorecer as
infeces clula-clula e no permitir a difuso
das partculas virais entretanto formadas. Ao
fim de algum tempo (varivel consoante o tipo

de vrus), adicionado o corante vermelho neutro que ir corar de vermelho as clulas vivas
e manter incolor as clulas mortas (Figura 9).
O clculo da concentrao de partculas virais
feita usando a diluio que melhor contagem
apresentar (nem demasiado elevada nem baixa demais). Nessa, sero contadas as zonas de
morte celular (denominadas placas), e multiplicadas pelo inverso da diluio usada como inculo (ex: 50 placas na diluio 10-5, correspon-

10

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

de um ttulo de 50x105 ou seja 5x106). H ainda


que ter em conta o facto de o ttulo ser dado em
PFU (plaque forming units; ou UFP, unidades formadoras de placas) por mililitro. Assim sendo,
ter-se- ainda que multiplicar o resultado pelo
inverso da fraco de mililitro que foi usada (se
s se inoculou 0,1 ml, ter que se multiplicar
por 10 para se ter o valor por mililitro; ou seja,
no exemplo dado anteriormente, ficar como
resultado final: 5x107 PFU/ml).

que apresentam sinal de infeco (por pesquisa


do ECP, por exemplo). O objectivo identificar
aquela diluio para a qual se conseguiu infectar metade das culturas inoculadas. Constri-se
assim uma tabela onde vo figurar o nmero de
culturas infectadas e no infectadas para cada
diluio, bem como os totais acumulados de culturas infectadas e no infectadas para uma das
diluio (Tabela 1). Os clculos a realizar, para
se calcular a TCID50 esto tambm esquematizados na Tabela 1. Este mtodo mais laboMtodo da diluio limite:
rioso mas tem a vantagem de poder ser usado
Neste caso calcula-se a diluio que provoca mesmo em vrus que no induzam a morte cea infeco em 50% das culturas inoculadas lular, a qual, como foi referido, a marca que,
(TCID50 ou dose infectante 50%). A suspenso no mtodo das placas nos permite quantificar o
viral diluda sucessivamente (factor de diluio ttulo da suspenso viral em estudo.
1:10 normalmente) e as diferentes diluies
so inoculadas individualmente em culturas de 1.5.6. Linhas celulares susceptveis
clulas susceptveis. Para cada diluio, e ao No diagnstico baseado no isolamento dos vrus
fim do tempo adequado replicao viral, vai-se in vitro, bem como na sua titulao, importanobservar qual o nmero de culturas inoculadas te a escolha das clulas sobre as quais se vai
Tabela 2- Exemplos de alguns vrus possveis de serem isolados in vitro e algumas clulas usadas
para o seu isolamento.

Vrus

Exemplos de Clulas Susceptveis

Herpes Simplex (HSV)

Vero, Hep-2

Varicela-Zona (VZV)

Clulas diplides humanas (HEK, HEL)

Citomegalovirus (CMV

Fibroblastos humanos (MRC-5

Adenovirus

Hep-2, HEK

Poliovirus

MK, BGM, LLC-MK2, Vero

Coxsackie B

MK, BGM, LLC-MK2, Vero

Echovirus

MK, BGM, LLC-MK2

Influenza A e B

MK, LLC.MK2, MDCK

Parainfluenza

MK, LLC-MK2

Papeira

MK, LLC-MK2, HEK, Vero

Respiratrio Sinccial (RSV)

Hep-2, Vero

Rinovirus

HEK, HEL

Sarampo

MK, HEK

Rubola

Vero, RK13

11

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

inocular a amostra. Na Tabela 2 apresentam-se


alguns exemplos de linhas celulares possveis
de serem usadas para vrios vrus. Quando o vrus novo, ou seja em que a experincia ainda
restrita, deve-se seguir a norma de se utilizar
in vitro as clulas mais provveis de serem as
clulas-alvo in vivo. Convm ainda realar que,
sempre que possvel devero ser usadas clulas primrias ou secundrias, pois so essas as
que mais prximas esto da situao in vivo.

de detectar uma primo-infeco, no entanto a deteco especfica de IgM por vezes


difcil de se conseguir devido a reaces
cruzadas/interferncia (factor reumatide), presena de IgM devido a reinfeces
e ainda devido persistncia das IgM vrios
meses/anos aps a infeco primria.
Seroconverso: definida como sendo a
evoluo duma situao de ausncia de anticorpos para uma outra onde esses anticorpos passam a estar presentes.
Uma nica amostra com ttulo elevado
de IgG (ou anticorpos totais): mtodo muito
pouco fivel pois no permite confirmar se
se trata duma infeco primria, reinfeco
ou vacinao.

2- Deteco de anticorpos especficos (serologia)


O diagnstico baseado na deteco de anticorpos especficos, constitui a maioria dos ensaios
de rotina em viroses humanas. Baseia-se no
facto de, aps a exposio a um antignio, o sistema imunolgico responder com a produo
de anticorpos especficos para esse antignio.
Os primeiros anticorpos a aparecerem so da
classe das IgM, seguidos dos anticorpos da
classe IgG. No caso de uma reinfeco, o nvel
das IgM especficas poder aumentar, enquanto que as IgG aumentam significativamente.
Existem vrios tipos de tcnicas serolgicas.
Nalgumas delas possvel descriminar a presena de IgM e de IgG (caso das tcnicas EIA e
RIA), enquanto que noutras somente possvel
avaliar a presena da totalidade dos anticorpos
(fixao do complemento, inibio da hemaglutinao). De igual forma, a sensibilidade e especificidade dos mtodos varia significativamente.
Assim os mtodos EIA e RIA so em geral mais
especficos e sensveis do que as tcnicas de
fixao do complemento (FC) ou inibio da hemaglutinao (IHA).

2.2- Critrios para o diagnstico duma


reinfeco/reactivao
Na maior parte dos casos difcil de distinguir
uma reinfeco de uma reactivao, e, em
certas circunstncias, estas de uma infeco
primria. Embora seja verdade que em muitos
casos no primordial distinguir uma primoinfeco de uma reinfeco, outros h em que
essa distino fundamental. o caso da infeco pelo vrus da rubola (ver captulo referente ao diagnstico por este vrus mais adiante)
durante o primeiro trimestre da gravidez, onde
uma primo-infeco est associada a um alto
risco de mal-formaes enquanto que a reinfec-

2.1. Critrios para o diagnstico duma


primo-infeco
Um aumento significativo do ttulo de anticorpos especficos (IgG ou totais) entre uma
amostra colhida durante a existncia de sintomas (fase aguda) e a convalescena. Os
principais problemas deste tipo de critrio
a definio de subida significativa e o facto
de ser um diagnstico retrospectivo.
Presena de IgM: uma forma rpida

12

Figura 10- Evoluo dos nveis de anticorpos


em consequncia de uma primo-infeco e reinfeco. De notar que, na reinfeco, as IgM
podem estar ausentes ou presentes transitoriamente a baixas concentraes.

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

o no est.

Em indivduos que sofreram transfuses


de sangue, podem existir anticorpos devido
transferncia passiva desses anticorpos a
partir do dador.

Em geral, durante a reinfeco/reactivao,


ocorre um aumento rpido dos nveis de IgG
com ausncia, ou presena de nveis muito baixos, de IgM (Figura 10).
2.4- Presena de anticorpos no LCR

Numa pessoa saudvel, poucos ou nenhuns an-

2.3- Limitaes do diagnstico serol- ticorpos devem ser detectados no LCR. Em situgico
aes de meningite ou encefalite, podero ser
A utilidade do diagnstico serolgico vai depender do vrus em questo.
Assim:
Para vrus como os da rubola ou da hepatite A, o aparecimento dos sinais clnicos
coincide com o desenvolvimento de anticorpos. Desta forma, a deteco de IgM ou ttulos de IgG aumentados no soro do indivduo,
indica uma infeco activa
Noutros casos, no entanto, os sinais clnicos surgem antes do aparecimento dos
anticorpos. o caso dos vrus responsveis
por infeces respiratrias ou por diarreias.
Nestes casos, o diagnstico serolgico ser
sempre retrospectivo e por isso sem interesse prtico.
Outros vrus provocam o aparecimento
de manifestaes clnicas muitos meses/
anos aps a seroconverso. Servem de
exemplos para esta situao o HIV e o vrus
da raiva. Nestes casos a simples presena
de anticorpos suficiente para fazer um
diagnstico definitivo, excepto nas situaes
em que esses anticorpos possam ter sido
transmitidos passivamente (caso da transmisso vertical do HIV).
Em casos de infeces localizadas, como
por exemplo as leses herpticas a nvel labial ou genital, podem no induzir uma resposta humoral significativa
Ocorrncia de reaces cruzadas entre
vrus devidas a identidades antignicas (por
ex: HSV/VZV) que podem levar a falsos resultados positivos
Ocorrncia de falsos positivos devido a
anticorpos interferentes: frequente em doentes com Lupus Eritematoso disseminado
ou com mononucleose infecciosa.
Indivduos imunodeficientes podem ter
uma resposta humoral ausente ou muito
reduzida.

produzidos anticorpos especficos do vrus em


causa. A presena de anticorpos no LCR diz-se
que significativa quando a razo entre o ttulo
de anticorpos no soro e no LCR inferior a 100.
No entanto, isto s verdade se a barreira hemato-enceflica estiver intacta (o que frequentemente deixa de ser verdade numa meningite
ou encefalite). Caso contrrio os anticorpos do
soro podem passar facilmente para o LCR. O
mesmo se passa quando a colheita do fluido
espinal tiver sido feita com a ocorrncia de hemorragia. Nesse caso o LCR vir contaminado
com sangue, o que invalida a interpretao da
razo de anticorpos sangue/LCR. Uma forma
de comprovar a no contaminao do LCR com
sangue (seja por compromisso da barreira hemato-enceflica, seja por m colheita) pesquisar, no LCR, a presena de anticorpos especficos para um vrus para o qual toda a populao
tenha sido vacinada (papeira, sarampo, rubola...). Caso no tenha havido contaminao com
sangue, a presena de anticorpos no LCR ser
muito baixa ou nula.

2.5- Testes usados na deteco de anticorpos especficos


2.5.1- Reaco de fixao do complemento
(RFC)
A RFC um testes simples, rpido e que exige
pouco equipamento e reagentes. A sua utilizao cada vez menor, tendo gradualmente sido
substitudo por testes mais sensveis e especficos (EIA e RIA). Este teste consiste em duas reaces antignio-anticorpo (Ag-Ac) sucessivas,
uma das quais (a segunda) serve de teste indicador. A primeira reaco, entre um antignio
viral conhecido e titulado e o soro em estudo,
ocorre na presena de uma quantidade pr-determinada de complemento. Este complemento

13

Prticas de Virologia

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2.5.2- Reaco de inibio da hemaglutinao


(IHA)
Vrios vrus possuem a capacidade de aglutinar
hemcias de algumas espcies de mamferos
e de aves (Fig. 11). A espcie cujas hemcias
so aglutinadas depende do vrus. Exemplos de
vrus que possuem hemaglutininas so: influenza, parainfluenza, adenovirus, rubola, flavivirus,
e algumas estirpes de picornavirus. O princpio
deste teste baseia-se no facto de, caso existam
Ac especficos do vrus em estudo (com capacidade hemaglutinante), estes Ac iro impedir
Figura 11- Reaco de hemaglutinao. Na aua hemaglutinao por parte do Ag. Tal como
sncia de hemaglutininas livres, as hemcias
sedimentam no fundo da microplaca. Caso esa RFC, a IHA um teste simples e que requer
sas hemaglutininas estejam presentes, iro
muito pouco equipamento/reagentes. mais
aglutinar as hemcias impedindo a formao
sensvel que a RFC mas menos do que o EIA ou
do boto devido sua sedimentao
o RIA. Diluies sucessivas do soro em estudo
(1:10, 1:20, 1:40, 1:80, ...) so postas em conir ser removida ou fixada pelo complexo Ag- tacto com uma quantidade constante e pr-deAc eventualmente formado. A segunda reaco terminada de hemaglutinina viral. Em seguida
Ag-Ac consiste na juno de hemcias de car- adicionada uma suspenso de hemcias. Caso
neiro e hemolisina (tambm esta previamente existam Ac no soro em estudo, estes iro ligartitulada). Quando este sistema indicador adi- se ao Ag especfico (com capacidade hemaglucionado primeira reaco, as hemcias sero tinante), impedindo que este aglutine as hemlisadas somente na presena de complemento cias presentes. Uma vez que este ensaio envolve
livre (no fixado pela primeira reaco Ag-Ac. a diluio sucessiva do soro, permite quantificar

Figura 12- Microplaca de um ensaio de ELISA: as cpulas coradas


indicam reaces positivas; as incolores revelam a ausncia de
anticorpos nas amostras testadas.

Desta forma indirecta ficamos a saber se na


amostra de soro em estudo existiam Ac especficos do Ag usado. Exige a titulao prvia do
antignio, complemento e hemolisina usados.

qual a maior diluio, desse mesmo soro, para


a qual ainda se verificou a inibio da hemaglutinao. O inverso dessa diluio corresponde
ao ttulo de anticorpos especficos para o vrus

14

Prticas de Virologia

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em estudo (ex: maior diluio=1:160, logo o culturas celulares de trs formas: pela forma
como se propagam in vitro, conforme a sua
ttulo=160).
morfologia e consoante o tipo de clulas.
2.5.3- Mtodos imunoenzimticos (EIA) e imu1- Quanto forma de propagao, as culturas
no-radioactivos (RIA)
Baseiam-se na formao de complexos Ag-Ac celulares podem-se classificar em:
Culturas em suspenso: as clulas crese posterior deteco destes complexos pela
cem sem estarem aderentes entre si ou ao
adio de um segundo Ac marcado enzimatisuporte slido (paredes interiores do frasco
camente (EIA) ou radioactivamente (RIA). No
de cultura ou outro recipiente onde estejam
segundo caso, quanto maior o nmero de coma ser cultivadas)
plexos Ag-Ac formados maior a quantidade de
Culturas em monocamada: crescem
radioactividade presente. No primeiro caso, a
aderindo ao suporte slido e entre si. Estas
quantidade destes imuno-complexos ir deterclulas necessitam, para serem transferiminar a quantidade de enzima presente e esta
das para outro suporte slido, de serem dispor sua vez ir degradar em maior quantidade
sociadas entre si e do suporte slido onde
o substracto adequado, entretanto adicionado
se fixaram. Os mtodos de dissociao se reaco, donde resulta um composto corado.
ro referidos mais adiante.
Assim, quanto maior a intensi dade da colorao, maior a quantidade de enzima e, portanto,
maior a quantidade de complexo Ag-Ac forma- 2- Quanto sua morfologia as clulas podem-se
classificar em:
dos no incio (Fig 12).
Epiteliais: com morfologia poligonal
Os mtodos EIA e RIA apresentam maior sensi Fibroblsticas: com morfologia fina e
bilidade, maior especificidade e so mais prtialongada
cos de executar, tendo ainda a vantagem de se Outras: com outros tipos de morfologias
rem automatizveis, com benefcios em termos
(clulas sanguneas, nervosas, musculares,
de diminuio de erros de execuo, de maior
etc.)
objectividade e rapidez e de permitir uma melhor organizao do laboratrio.

3- Cultura de clulas
eucariotas
As culturas celulares em virologia so fundamentais, na medida em que permitem a multiplicao in vitro dos vrus presentes nas amostras biolgicas. So, por isso, um elemento
fundamental em todos as tcnicas virolgicas
que envolvam o isolamento (no diagnstico das
infeces virais) ou a propagao (estudos de
caracterizao fenotpica) de vrus.
Tratando-se de vrus causadores de patologias
no ser humano, as clulas a utilizar tm de ser
necessariamente eucariotas (os fagos multiplicam-se em clulas procariotas). As clulas
eucariotas so muito mais difceis de manter
em cultura do que as clulas procariotas. Elas
exigem meios de cultura muito ricos e so, por
isso, muito susceptveis contaminao por microorganismos como as bactrias e fungos.
Duma forma simples, podemos distinguir as

Figura 13- Clulas MRC5;


fibroblastos de pulmo humano; so usadas para, por
exemplo, isolar e propagar
o CMV

15

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Figura 14- Clulas HeLa; clulas epiteliais


obtidas a partir dum carcinoma do colo do tero; so usadas, nomeadamente, no isolamento
e propagao do HSV

3- Quanto ao tipo de clulas as culturas celulares podem-se classificar em:


Clulas primrias: constituem o melhor
sistema celular uma vez que permitem a replicao de um maior nmero de vrus e so
aquelas que mais se assemelham s clulas
in vivo, constituindo, por isso, o modelo mais
prximo desse sistema. So clulas normais,
obtidas directamente de animais. Permitem
um nmero muito limitado de passagens
(1 a 2). Tm inibio de contacto: uma vez
justapostas, param de se dividir. Para alm
disso so difceis de manter em quantidade
suficiente. Exemplos de culturas de clulas
primrias: linfcitos humanos.
Clulas secundrias: So obtidas originalmente a partir de um dador animal e,
se as condies de cultura forem as ideais,
podem-se dividir e crescer durante algum
tempo in vitro (entre 50-100 geraes ou
passagens). No entanto, elas no tm a capacidade de se dividirem e crescer indefini-

16

damente e eventualmente, ao fim de algum


tempo, as suas caractersticas alteram-se
e acabam por entrar em senescncia e
morrem. Os factores que controlam a capacidade de propagao destas clulas in
vitro esto relacionados com o grau de diferenciao das clulas - em geral, as clulas mais diferenciadas so mais difceis de
manter em cultura do que as clulas menos
diferenciadas (menos especializadas). Exemplo de cultura de clulas secundrias: clulas MRC5 (Fig 13) - fibroblastos humanos
obtidos a partir do pulmo e que em geral
conseguem atingir as 60-70 geraes.
Clulas contnuas: Tambm denominadas (erradamente) de clulas imortalizadas,
as clulas contnuas tm a capacidade de
crescerem indefinidamente in vitro, desde
que as condies de cultura sejam as adequadas. Tambm so denominadas clulas
transformadas uma vez que as suas caractersticas fisiolgicas normais foram alteradas. Em geral so obtidas a partir de tecidos
neoplsicos (cancros, linfomas, leucemias)
ou, alternativamente, so o resultado da
transformao in vitro de clulas normais
atravs, por exemplo, da infeco com vrus com capacidade transformante (EBV,
HHV-8, HTLV, etc). Estas clulas caracterizam-se por, em geral, terem perdido a inibio por contacto, isto , quando duas
clulas adjacentes se tocam, continuam a
dividir-se, ao contrrio do que acontece nas
clulas normais em que esse facto sinaliza
as clulas para pararem de se dividir. As clulas HeLa (Fig. 14) so um exemplo de clulas contnuas. Estas so clulas epiteliais
obtidas dum carcinoma do colo do tero e
esto infectadas com o vrus do papiloma
humano tipo 18 (HPV 18).

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II- Diagnstico da Infeco


por HSV
1- Caractersticas gerais
A infeco pelos vrus Herpes simplex (HSV)
das infeces virais de maior prevalncia na populao mundial. Existem dois serotipos: HSV-1
e HSV-2. So vrus com genoma DNA, da famlia Herpesviridae, possuindo cerca de 50% de
homologia na sua sequncia nucleotdica. Esta
identidade leva ocorrncia de reaces cruzadas entre os dois tipos de antignios. Apesar
disso, possvel identificar e diferenciar os dois
serotipos recorrendo a tcnicas de deteco
de anticorpos (no soro ou plasma) ou de antignios (directamente nas clulas de leses herpticas).
A transmisso ocorre por contacto com as mucosas infectadas, principalmente se existirem
escoriaes ou quebras de continuidade da
pele e mucosas, durante as relaes sexuais e
durante o parto. A disseminao do vrus ocorre por migrao centrfuga das partculas virais atravs dos nervos sensoriais perifricos.
Na porta de entrada, na derme e na epiderme,
ocorre o processo de replicao, e as partculas virais so transportadas pela terminao
nervosa at ao ncleo dos neurnios sensitivos.
Conhece-se menos a sucesso de eventos a
partir desse ponto. Em alguns casos, ocorre a
infeco com replicao viral e morte celular.
Em outros, o vrus fica em estado de latncia
(Fig. 15). Os factores envolvidos nos mecanismos de persistncia do HSV e a sua reactivao peridica permanecem por esclarecer.

Figura 15- Latncia ao nvel dos gnglios nervosos do trigemio, associada infeco oro-

Figura1616-Exemplo
Exemplode
deleso
lesooro-labial
oro-labial
causaFigura
causada
da por HSV-1
por HSV-1
labial pelo HSV

Aps o primeiro contacto com o HSV (primoinfeco), podem surgir sinais e sintomas
envolvendo leses nas mucosas. A durao
dos sintomas, a infecciosidade das leses e a
possibilidade de complicaes durante a primo-infeco maior do que nos episdios de

Figura 17- Exemplo de leses vulvares causadas pelo HSV-2

Figura 17- Exemplo de leses vulvares


causadas pelo HSV-2
17

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reactivao. A gengivoestomatite aguda a manifestao mais comum das primo-infeces, as


quais ocorrem mais frequentemente entre 1 e
4 anos de idade. O herpes labial e as lceras da
crnea (queratites herpticas) so as manifestaes clnicas mais frequentes nos casos de
reactivao.
As manifestaes clnicas e a evoluo da infeco dependem da idade, da localizao, do
estado imunolgico do paciente e do tipo antignico do vrus. A exposio ao sol (luz ultravioleta), a imunossupresso e traumas cutneos
podem levar reactivao. Ocasionalmente,
vrias estirpes do mesmo subtipo viral podem
ser detectadas num mesmo paciente, principalmente nos imunodeficientes (doentes com
SIDA ou transplantados). Este facto sugere a
possibilidade de poder haver infeco exgena
por diferentes estirpes virais.
A infeco pelo HSV tipo 1 (HSV-1) , em geral, adquirida mais cedo do que a do tipo 2
(HSV-2).
Cerca de 90% dos adultos com idade de 50
anos, apresenta anticorpos contra HSV-1. Nas
populaes socio-econmicas mais desfavorecidas, esta percentagem encontrada na faixa etria dos 30 anos. Os anticorpos contra o
HSV-2 no so normalmente detectados at
a puberdade. As taxas de prevalncia desses
anticorpos correlacionam-se com o incio da

vida sexual activa, o que distingue este vrus do


HSV-1. A percentagem de indivduos com anticorpos para o HSV-2 aumentou 30 pontos nos
ltimos 12 anos nos Estados Unidos. Numa
avaliao obsttrica, 25% da populao estudada tinham anticorpos para o HSV-2; destes,
apenas 10% apresentavam histria clnica de
leses genitais. Cerca de 50% dos adultos heterossexuais, com vida sexual activa, apresenta
anticorpos positivos, sendo a taxa 5% maior entre as mulheres.
O HSV tipo 1 est associado a uma variedade
de infeces envolvendo leses mucocutneas
orolabiais (Fig. 16), oftlmicas, meningoenceflicas, podendo eventualmente causar leses viscerais e genitais, enquanto o HSV tipo 2 (HSV2)
est associado a infeces genitais sexualmente adquiridas (Fig. 17). Ambos os tipos podem
causar leses nas diferentes localizaes, e os
sinais clnicos so idnticos (Fig. 18).
Tanto o HSV-1 como o HSV-2 podem ser responsveis por leses mucocutneas primrias em
qualquer localizao. A durao e a intensidade
da infeco no dependem do serotipo envolvido. No entanto, o tipo de vrus e a localizao
da primo-infeco podem afectar a frequncia
e a probabilidade das recidivas. Estudos recentes demonstram que tanto a frequncia como
a probabilidade so maiores quando a infeco
causada pelo HSV-2. A infeco genital por

Figura 18- Esquema das possveis localizaes e manifestaes

Figura 18- Esquema das possveis


localizaes
e manifestaes
clnicas das
infeces pelo
HSV-1 e HSV-2clnicas das infeces pelo
HSV-1 e HSV-2

18

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HSV-2 ocorre com uma frequncia oito a dez


vezes maior que a infeco genital por HSV-1.
Por outro lado, a infeco oral-labial por HSV-1
ocorre mais frequentemente do que a infeco
oral-labial por HSV-2. A probabilidade de reactivao da infeco causada pelo HSV-2 duas
vezes maior.
Em indivduos imunocompetentes, a infeco
limita-se s localizaes mucocutanas e aos
gnglios sensoriais. Em indivduos imunodeficientes, as leses causadas tanto pela primoinfeco como pelas reactivaes tendem a ser
mais extensas e a persistir por muito mais tempo do que nos indivduos imunocompetentes.
Nesses pacientes, o quadro grave, geralmente com comprometimento esofgico, pneumonite intersticial e infeco disseminada com comprometimento visceral. A infeco pelo HSV-2
um tipo de infeco oportunista importante em
indivduos infectados pelo HIV. Calcula-se que
at 90% desses indivduos estejam coinfectados com o HSV-2.
Num pequeno nmero de casos, a infeco
pelo HSV pode levar a uma encefalite viral com
danos neurolgicos severos. O HSV, principalmente o do tipo 1, pode causar encefalite em
adultos pela reactivao dos vrus latentes. As
infeces mais agressivas, com risco de vida,
so a perinatal e as que ocorrem em indivduos imunodeficientes, em particular os doentes
com SIDA.
Existem dados que demonstram que os pacientes que apresentam uma infeco primria
mais agressiva e no tratada tm ndices mais
elevados de recorrncia a longo prazo.
As respostas imunolgicas, humorais e celulares manifestam-se nas primeiras semanas e
persistem por toda a vida. Embora no possuam capacidade neutralizante, induzem o aparecimento de manifestaes clnicas mais atenuadas e apresentam reaces cruzadas entre os
dois subtipos.

Figura1919-Exemplos
Exemplos de
de ECP
ECP induzido
pelo
Figura
induzido pelo
HSV in vitro
HSV in vitro

vrus pode no ser isolado. A sensibilidade do


isolamento do HSV em cultura de clulas de
aproximadamente 105 partculas virais por mL.
A deteco em geral conseguida pela visualizao do ECP caracterstico: arredondamento
das clulas e formao de sinccios e ainda,
aps colorao com hematoxilina-eosina, pelo
aparecimento de clulas apresentando uma incluso eosinfila intra-nuclear (Fig. 19).
2- Diagnstico
Actualmente, a reaco em cadeia da poliO isolamento viral em cultura de clulas eucario- merase (PCR) o mtodo mais sensvel para
tas o mtodo de referncia para o diagnstico o diagnstico da infeco por HSV (Fig. 20).
e tipagem do HSV. O HSV pode ser detectado altamente sensvel (at 5 viries por amostra),
em cultura 2 a 8 dias aps inoculao, mas, em especfica (98-100%), e pode identificar o genvrios casos, como nos de baixos ttulos virais, tipo e ainda permitir a quantificao viral. O PCR
convalescena das leses ou leses atpicas, o
19

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

quantitativo pode ser til para a monitorizao


da resposta terapia antiviral.
Alm disso, o ensaio realizado por PCR, permite
o diagnstico utilizando-se diferentes amostras
como sangue, LCR, lquido amnitico e sangue
fetal.
O lquido amnitico poder ser colhido a partir
da 12 semana at o final da gestao. No entanto, a altura ideal situa-se entre a 14 e a 16
semana. Em relao ao sangue fetal a altura

Figura
Esquemada
da reaco
reaco de
Figura
20-20Esquema
dePCR
PCR

ideal para essa colheita situa-se entre 18 e a


22 semana de gestao.
Em alternativa, o diagnstico das infeces
por HSV pode ser feito recorrendo tcnica
de imunofluorescncia (Fig. 21 e Fig. 1 da pgina 3). Esta tcnica sensvel e especfica
uma vez que se utilizam anticorpos monoclonais dirigidos para o HSV-1 e HSV-2. Esses
anticorpos so marcados com um fluorocromo (FITC - isotiocianato de fluorescena, por
exemplo). Caso as clulas colhidas a partir da
leso estejam infectadas, vo expressar antignios virais que sero reconhecidos pelos
respectivos anticorpos marcados. Assim, as
clulas infectadas iro apresentar fluorescncia enquanto que as no infectadas manterse-o no fluorescentes (Fig. 21).
Esta tcnica exige no entanto um particular
cuidado na obteno da amostra, uma vez
que o que se pretende obter nessa amostra
so clulas da base da leso. por isso necessrio retirar previamente,
com uma zaragatoa de algodo, os possveis
contaminantes e s depois proceder colheita de clulas da leso propriamente dita
com o recurso a uma zaragatoa abrasiva
(em plstico com reentrncias). Este cuidado na colheita particularmente importante
em leses situadas no colo do tero, onde as
clulas de descamao e outras, devem ser
cuidadosamente retiradas, antes da colheita,
por forma a evitar-se os resultados falsamente negativos (devidos m colheita).

Figura 21- Imunofluorescncia em clulas no infectadas (esquerda) e infectadas pelo HSV-1 (direiFigura
21- Imunofluorescncia
em
clulas
no infectadas
(esquerda)
e infectadas
pelo
ta).
Fluorocromo
usado: FITC; a
cor
vermelha
das clulas
no infectadas
deve-se
ao HSV-1
uso do(direita).
contraFluorocromo usado: FITC; a cor vermelha
das clulas
infectadas deve-se ao uso do contra-corante,
corante,
azul no
de Evans

azul de Evans

20

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

III- Diagnstico da Infeco


pelo citomegalovirus (CMV)
1- Caractersticas

pelo CMV pode tornar-se extremamente preocupante. Exemplos destes grupos so os imunodeficientes e a mulher grvida, esta ltima pelo
risco de poder transmitir a infeco ao feto.
Durante a gravidez, o maior risco para o feto
provm de uma primo-infeco (Fig. 23). Nas
situaes em que j tenha ocorrido uma infeco por CMV no passado (reactivaes), o risco
para o feto praticamente nula. Ainda dentro
da infeco me-filho, de referir que o risco
maior est associado infeco congnita (adquirida durante a gestao). As infeces perinatal (trabalho de parto) ou ps-natal (aleitamento) esto, em geral. associadas a situaes
de muito menor gravidade para a criana.

O CMV pertence famlia Herpesviridae, sub-famlia Betaherpesvirinae, podendo ser tambm


denominado por HHV-5. Encontra-se largamente distribudo na espcie humana. Dados dos
EUA apontam para que 50-80% da populao,
com mais de 40 anos, possua anticorpos para
este vrus. A sua prevalncia maior quanto
mais baixo for o nvel scio-econmico das populaes.
A transmisso ocorre por via vertical (durante
a gestao, no trabalho de parto ou no aleitamento), ou por contacto com lquidos biolgicos
onde o vrus pode estar presente, nomeadamente: urina, saliva, sangue, smen e fluidos vaginais. Para alm disso a transmisso tambm 2- Diagnstico
pode ocorrer em consequncia de transfuses
O diagnstico da infeco pelo CMV feito reou transplantes de rgos (Fig. 22).
Na maior parte dos casos, a infeco pelo CMV correndo a vrias tcnicas:
Deteco de anticorpos por reaco
est associada ausncia de sintomatologia ou
imunoenzimtica (ELISA)
a situaes benignas, podendo em alguns ca Deteco de antignio viral (pp65) por
sos ocorrer um sndroma mononuclesico com
IF
febre ou ainda hepatite. Aps esta infeco
Cultura do vrus in vitro em fibroblastos
primria, o vrus fica latente podendo sofrer re humanos
activaes ao longo da vida do hospedeiro. No
Deteco do genoma viral por PCR
entanto, em certos grupos de risco, a infeco
urina, saliva

me
infantrio

relaes
sexuais

in utero, parto, aleitamento, saliva


urina, saliva

criana

esperma, fluidos vaginais, saliva

adolescente
adulto

transfuso
transplante
Figura 22- Esquema das vias de transmisso da infeco pelo CMV

21

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

A deteco de anticorpos pode ser feita quer


para as IgG quer para as IgM. A deteco de
IgM em geral problemtica visto que podem
ocorrer falsos positivos (devido por exemplo
presena de factor reumatide) ou falsos negativos. Por outro lado, as IgM podem manter-se
em circulao por vrios meses (anos, eventualmente), podendo conduzir a falsas interpretaes relativamente ao momento da primoinfeco. H a acrescentar ainda o facto de, em
alguns casos de reactivaes, poderem surgir,
de novo, IgM em circulao, conduzindo a falsas

mulher grvida, constitui um grave risco para


o feto devido possibilidade de ocorrer uma infeco congnita.
No contexto do diagnstico da infeco por
CMV na mulher grvida, h dois pontos de extrema importncia que convm aqui realar:
Somente a infeco congnita apresenta um risco elevado para o recm-nascido
Somente a primo-infeco apresenta risco para o recm-nascido

Infeco primria durante a gravidez

40% fetos infectados

60% fetos no infectados

10% recm-nascidos sintomticos


A maioria afectando o SNC, surdez,
ictercia, trombocitopnia,
hepatoesplenomeglia

90% recm-nascidos assintomticos; dos


quais cerca de 10-20% apresentam
surdez, atraso mental a mdio prazo

Figura 23- Esquema mostrando as consequncias de uma infeco primria na mulher grvida

interpretaes de primo-infeces.
Por outro lado, a presena de IgG no recm
nascido no tem qualquer significado, visto elas
terem sido adquiridas passivamente a partir do
sangue materno. Tambm nas crianas, a pesquisa de IgM pode conduzir a interpretaes
errneas, uma vez que a sua ausncia pode ser
somente devido imaturidade do seu sistema
imunolgico e no real ausncia de uma primo-infeco.
Por tudo isto, o uso da deteco de anticorpos
especficos para o CMV (IgG ou IgM) carece de
uma cuidadosa interpretao. Mais recentemente, a quantificao do grau de avidez das
IgG revelou-se extremamente til como auxiliar
da interpretao dos dados serolgicos uma
vez que permite, com alguma segurana, descriminar as infeces antigas (h mais de 3
meses) das mais recentes. Pode-se assim confirmar, ou no, a existncia de uma possvel primo-infeco recente, o que, a verificar-se numa

Da que o intuito do diagnstico vise, por um


lado, averiguar da presena ou no de uma
primo-infeco recente, e por outro, localizar a
infeco durante o perodo de gestao ou fora
dele.
O diagnstico de uma infeco pelo CMV pode
ser feito:
No perodo pr-natal (durante a gestao), recorrendo ao sangue da mulher grvida e pesquisando a presena de IgG e IgM.
Pretende-se nesta fase identificar uma possvel infeco primria.
Caso se suspeite de uma primo-infeco
pelo CMV, essa suspeita ter de ser confirmada recorrendo ao Western-blot para as
IgM e avidez das IgG.
No perodo pr-natal recorrendo amniocentese para confirmar a infeco fetal,
atravs da tcnica de PCR ou cultura viral.
De notar que, apesar de poder ter ocorri-

22

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

Urina

Negativo

Positivo

Guthrie card - PCR


Sem infeco por CMV
Negativo

Positivo

Infeco perinatal

Infeco congnita

Figura 24- Esquema do procedimento a seguir no diagnstico ps-natal, no caso da amostra ser colhida aps as 3 primeiras semanas de vida

do uma primo-infeco na grvida, isso no


IgM-/IgG+
IgM-/IgGsignifica forosamente que tenha havido infeco fetal (40% de possibilidades; ver Fig.
IgM+/IgG IgM+/IgG+
23).
No perodo ps-natal precoce (at s 3
semanas de vida do recm-nascido), recor- B- Diagnstico ps-natal
rendo ao sangue ou (mais frequentemente)
urina do recm-nascido. As tcnicas neste Mtodos
Isolamento do vrus (mtodo de referncaso sero a pesquisa de IgM no soro (pouco sensvel), ou de preferncia a cultura viral
cia)
PCR
ou PCR a partir das clulas do sedimento
Amostra
urinrio.
No perodo ps-natal tardio (aps as 3
Urina
semanas de vida), recorrendo s mesmas
Saliva
tcnicas referidas anteriormente e, caso
Sangue
o resultado aponte para um infeco do
recm-nascido, a pesquisa do genoma viral Quando: nas 3 primeiras semanas de vida
por PCR no sangue dos Guthrie Cards, com
vista a distinguir uma eventual infeco con- C- Diagnstico ps-natal tardio (aps as 3 segnita de uma infeco adquirida aps ou manas de vida; Fig. 24)
Amostra: Sangue (Guthrie cards)
durante o parto.
Mtodo: PCR (pesquisa de DNA viral)
Assim e em esquema, com as possveis interpretaes (ver tambm as Figuras 24 e 25):
Teste de avidez das IgG:
O teste de avidez das IgG usado, como j foi
A- Diagnstico serolgico pr-natal (tambm referido, para distinguir infeces que ocorreaplicvel a outros grupos para alm das mulhe- ram menos de 3 meses das que ocorreram
res grvidas); exemplos de situaes provveis: h mais tempo. Baseia-se no facto de os anticor-

23

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

pos recentemente formados, terem uma menor afinidade para os respectivos antignios, do
que os que resultam de infeces mais antigas.
Esta diferena de afinidade pode ser posta em
evidncia se, durante a incubao do soro com
os antignios da fase slida, estiver presente
um agente desnaturante (ureia, normalmente). A presena deste composto, ir dificultar a
formao dos complexos antignio-anticorpo,
diminuindo a quantidade de complexos formados. No final, devido reduo de anticorpo ligado, o resultado da reaco colorimtrica (ou
outra, consoante o formato do teste usado) vir
significativamente menor, quando comparado
com a mesma incubao feita na ausncia de
ureia. A razo do valor da reaco na presena
da ureia, sobre o valor na ausncia desta ser,
caso a avidez dos anticorpos seja baixa, significativamente inferior a 1 (na realidade ser inferior a 0,65). Desta forma possvel identificar
os soros provenientes de indivduos que tiveram

uma infeco recente dos que tiveram uma infeco h mais tempo.
O recurso ao teste de avidez das IgG no caso do
CMV (e em geral em todas as infeces virais)
tem interesse sempre que os testes serolgicos apresentem resultado positivo ou duvidoso
para IgM, com a presena bvia de IgG especficas.
Para alm do CMV, existem outras infeces
virais nas quais se torna importante determinar a avidez das IgG para identificar infeces
recentes:
Rubola
VZV
HSV
HHV 6
Parvovirus B19
HCV
EBV
Vrus do Sarampo

IgM positiva
(desconhecimento do estado
imunitrio antes da gravidez)

<0,6

>0,8

Avidez
IgG

0,6- 0,8

Compatvel com
Infeco Primria
Recente

Semanas de
gestao

>12

Pos

Westernblot IgM

Provvel
Infeco Primria
Recente

Neg

<12

Compatvel com
Infeco antiga

Figura
25-25Esquema
dodo
procedimento
a terano
caso
uma
de umade
grvida
apresentar
IgM
Figura
Esquema
procedimento
ter
no de
caso
deamostra
uma amostra
uma grvida
apresentar
IgM
positiva
positiva

24

Prticas de Virologia

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IV- Diagnstico da Infeco


pelo vrus da rubola
1- Caractersticas
O vrus da Rubola pertence famlia Togaviridae, gnero Rubivirus. um vrus com invlucro
e genoma RNA de cadeia simples, polaridade
positiva.
Transmite-se por gotculas de saliva ou pelas
secrees naso-farngeas. O indivduo infectado contagioso 8 dias antes a 8 dias aps o
incio dos sinais clnicos. O perodo de incubao de 14-21 dias (mdia: 15 dias), durante o
qual ocorre a virmia e a disseminao do vrus.
Os sintomas que esto em geral associados a
esta infeco consistem em: erupo mculopapulosa generalizada (Fig. 26), aparecendo
em primeiro lugar na face e alastrando para o
tronco e membros; artralgias e lifoadenopatias
acompanhadas de febre moderada.
Aps esta infeco inicial (infeco primria ou
primo-infeco) surgem anticorpos protectores. Apesar disso, as situaes de reinfeco
podem ocorrer, sendo estas, no entanto, em
geral assintomticas.
Devido presena de sintomatologia inespecfica ou, na maior parte dos casos, ausncia de
sintomatologia, o diagnstico da infeco pelo
vrus da rubola s pode ser feito recorrendo
aos dados laboratoriais. Estes envolvem a deteco de anticorpos especficos (IgM e IgG),
isolamento viral e deteco do genoma viral por
RT-PCR.

2- Sndroma de Rubola
congnita
Durante a virmia, o vrus da rubola pode, numa
mulher grvida, atravessar a placenta e causar
infeco fetal. Esta infeco ocorre em praticamente todos os casos numa situao de primoinfeco materna durante o primeiro trimestre
de gravidez. Os riscos para o feto advm dos
mecanismos patognicos envolvidos na infeco por este vrus: morte celular, aberraes
cromossomais e paragem do ciclo celular. Este
conjunto de acontecimentos particularmente

Figura 26- Apresentao tpica da erupo


mculo-papulosa caracterstica da infeco
pelo vrus da rubola

gravoso durante a fase de embriognese (primeiro trimestre de gravidez), levando ao aparecimento de graves mal-formaes. A partir do
primeiro trimestre, o risco de mal-formaes
decresce significativamente.
Perante este cenrio, fcil perceber que o
principal objectivo no diagnstico da infeco
pelo vrus da rubola o de identificar primoinfeces na mulher grvida e de as localizar
no perodo de gestao: primeiro trimestre, vs.
segundo ou terceiro trimestre.

3- Diagnstico laboratorial
Testes serolgicos
A deteco de anticorpos especficos constitui
a base do diagnstico do vrus da rubola. Uma
infeco recente pelo vrus da rubola pode ser
identificada por:

25

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Deteco de IgM especficas


A sua presena pode ser detectada em
Aumento do ttulo de anticorpos nos ensituaes de reinfeces, embora com nsaios de ELISA ou de IHA (inibio de hemaveis baixos e transitoriamente
glutinao)
Podem perdurar em circulao para
Seroconverso (ausncia de anticorpos
alm do tempo normal
na primeira amostra; presena de anticorpos numa segunda amostra)
Por tudo isto necessrio por vezes recorrer
a testes adicionais a fim de confirmar uma priA acompanhar os testes serolgicos funda- mo-infeco recente. Uma vez mais, e tal como
mental obter o mximo de informao relativa- acontecia com o CMV, o teste da avidez das
mente data e tempo da possvel exposio ao IgG pode ser extremamente til, uma vez que
agente viral, bem como a data de incio dos sin- nos ir permitir distinguir infeces antigas de
tomas (caso haja sintomatologia). Uma histria infeces recentes (ver captulo respeitante ao
de vacinao anterior para o vrus da rubola diagnstico do CMV).
ou de testes anteriormente feitos, so tambm
auxiliares importantes na interpretao dos da- Isolamento viral
Esta tcnica usada normalmente nos casos
dos serolgicos.
A amostra de sangue deve ser colhida o mais de diagnstico ps-natal de uma infeco pelo
cedo possvel aps o possvel contgio, ou o vrus da rubola. Com ela possvel identificar
mais precocemente possvel aps o inicio dos infeces congnitas (adquiridas durante a gessintomas. Desta forma, por comparao com tao) e determinar a durao da excreo do
uma segunda amostra colhida numa altura ade- vrus pelo recm-nascido. A amostra (zaragatoa
quada, ser possvel por em evidncia uma subi- naso-farngea) inoculada em clulas RK13 ou
da do ttulo de anticorpos em IHA ou em ELISA. SIRC. Alternativamente, pode ser inoculada em
Esta segunda amostra (S2) dever ser colhida, clulas Vero seguida de passagem para RK13
regra geral, 15 dias aps a primeira (S1). Em ou SIRC. O ECP lento a aparecer e pouco peralternativa, caso S1 tenha sido colhida ainda ceptvel, pelo que a identificao do vrus em culdurante o perodo de incubao (menos de 15 tura , em geral, feito recorrendo a tcnica de
aps o possvel contgio), dever-se- colher S2 IF ou de hemaglutinao.
15 dias depois do incio dos sintomas (ou 15
dias aps o final do perodo de incubao no Diagnstico da infeco congnita
caso de se tratar de uma infeco assintom- O diagnstico de uma infeco adquirida durante a gestao feito, no recm-nascido, por:
tica).
Presena de IgM especfica no sangue
O soro S1 deve ainda ser colhido o mais precodo cordo ou no sangue do recm-nascido
cemente possvel a fim de se poder observar
(a possibilidade de contaminao com sanum aumento ntido do ttulo e anticorpos no
gue materno tem de ser cuidadosamente
soro S2. De referir a propsito que o ttulo mexcluda)
ximo do anticorpos atingido ao fim de 3 dias a
Deteco de IgG para alm do tempo
3 semanas aps o incio dos sintomas, depennormal de durao dos anticorpos materdendo do hospedeiro (Ver Anexo).
nos (para alm dos 6 meses)
A pesquisa de IgM um dado importante na
Isolamento viral
identificao de uma primo-infeco. A sua interpretao, no entanto, requer algumas cautelas, principalmente se no houver dados relati- O diagnstico de uma infeco congnita pode
vos a duas amostras espaadas no tempo (S1 ser feito ainda durante o perodo pr-natal, ree S2). Assim, h que ter em conta os seguintes correndo s seguintes tcnicas:
Pesquisa de IgM no sangue fetal. No endados:
tanto o feto no produz IgM em quantidade
A durao em circulao das IgM , em
suficiente para serem detectadas antes da
geral, entre a 3 e as 6 semanas aps o incio
22 semana de gestao
dos sintomas, aps o qual tendem a desaparecer
26

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Isolamento do vrus da rubola a partir do


lquido amnitico
Deteco do genoma viral ou de protenas virais a partir do lquido amnitico.

Perfil serolgico duma infeco pelo vrus da rubola


Primo-infeco

Reinfeco

27

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V- Diagnstico da Infeco
pelo vrus da hepatite B
(HBV)
1- Caractersticas

com eliminao do agente viral, convalescena


e cura. No entanto, em cerca de 10% dos casos, a resposta imunolgica menos vigorosa,
dando origem a sintomas mais atenuados, e
favorecendo a manuteno da infeco. Nestas circunstncias no se d a eliminao viral,
havendo lugar ao surgimento de uma infeco
crnica no seguimento da infeco aguda no
resolvida. Esta infeco crnica pode conduzir a
uma situao de hepatite crnica que, por sua
vez, pode conduzir a cirrose heptica e a carcinoma hepatocelular.

O HBV um vrus com invlucro pertencente


famlia Hepadnaviridae, com genoma DNA, parcialmente bicatenrio.
A infeco por este vrus pode apresentar-se
clinicamente de duas formas: infeco aguda
(com ou sem sintomatologia) e infeco crnica (com ou sem sintomatologia). Uma infeco
aguda pode ou no evoluir para uma infeco
crnica, dependendo do tipo de vrus e, principalmente, da resposta imunolgica do hospedeiro. A transmisso ocorre por contacto com
fluidos biolgicos, nomeadamente, sangue, es- 2- Diagnstico da infecperma, fluidos vaginais, saliva e leite materno.
Aps um perodo de incubao longo (45-180 o pelo HBV
dias; em mdia: 60-90), surgem os sintomas Uma hepatite comea por ser diagnosticada
que incluem ictercia (Fig. 27), fadiga, dores clinica e bioquimicamente (aumento das transaminases e bilirrubina). No entanto, devido
s vrias causas possveis para essa hepatite,
somente atravs do diagnstico laboratorial
possvel identificar o agente causal e, no caso
das infeces provocadas pelo HBV, distinguir
infeces agudas de infeces crnicas. O
diagnstico laboratorial da infeco pelo HBV
baseia-se na deteco serolgica de antignios
virais e dos respectivos anticorpos, bem como
do DNA viral (constituinte do genoma viral). Os
antignios que so possveis de detectar em circulao so: AgHBe e AgHBs; por parte dos anticorpos podem-se detectar: anti-HBs, anti-HBe
e anti-HBc, (IgG e IgM). Vejamos as principais
Figura
27- Ictercia
a hepatite
provocaFigura
27- Ictercia
devidadevida
a hepatite
provocada
por
caractersticas de cada um destes marcadoda
por infeco
pelo HBV
infeco
pelo HBV
res:
abdominais, perda de apetite, nuseas e vmi- 1- AgHBs: antignio de superfcie do HBV
tos. Estes sintomas resultam da destruio dos
Juntamente com o DNA viral, o primeihepatcitos infectados, mediada pela resposta
ro marcador da infeco a ser detectvel
imunolgica do hospedeiro (reaco inflamat(2-6 semanas antes dos sintomas)
ria e resposta por linfcitos T-citotxicos). Esta
A sua presena, juntamente com o antiresposta imunolgica vai, na maioria dos casos,
corpo anti-HBc, indica infeco activa
ser suficiente para a resoluo da infeco
A sua persistncia em circulao por

28

Prticas de Virologia

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mais de 6 meses aps o incio dos sintomas,


indica uma infeco crnica
Em contrapartida, a sua desapario do
soro sugere a resoluo da infeco com
a consequente convalescena e cura. Esta
desapario ocorre, em geral, ao fim de 4-6
meses aps o aparecimento dos sintomas e
seguida, aps algumas semanas (por vezes meses), pelo aparecimento em circulao do respectivo anticorpo (anti-HBs).
produzido em grande quantidade, podendo por isso existir em circulao no associado a partculas virais.

A sua presena est geralmente associada com a deteco de DNA viral no soro.
Aparece em circulao pouco tempo
aps o aparecimento do AgHBs, e normalmente antes do aparecimento dos sintomas.
No caso de infeco aguda com resoluo, desaparece de circulao antes do
AgHBs, dando-se a seroconverso para
anti-HBe.
Deriva do AgHBc por modificaes pstraduo
Nos indivduos infectados por vrus com
mutaes na regio promotora do gene
core e pr-core (denominados mutantes do
pr-core), o AgHBe pode no ser detectado
em circulao

2- AgHBe: antignio de replicao viral


considerado um marcador de replicao e de infecciosidade do HBV, indicando, a
sua presena no soro, que se trata de uma
hepatite activa

Tabela 3- Interpretao dos marcadores serolgicos da infeco pelo HBV

Anti- Anti- Anti- AntiHBc HBc HBe HBs


IgM
IgG

Ag
HBs

Ag
HBe

DNAHBV

-/+

Fase de incubao

Fase aguda

-/+

Infeco crnica c/ replicao


viral

-/+

Infeco crnica c/ replicao


viral (mutantes do pr-core)*

-/+

Infeco crnica s/ replicao


viral (portador assintomtico)

+/-

Perodo de janela ou anti-HBs


com ttulo baixo

+/-

Imunidade aps infeco pelo


HBV

Imunidade aps vacinao

Ausncia de contacto prvio

Interpretao

* Estes mutantes podero prevalecer no incio da infeco (estirpe infectante), ou serem seleccionados no decurso da infeco. Tm sido associados a situaes mais graves como hepatites fulminantes, uma taxa mais elevada de cirrose e reactivaes mais frequentes ao longo da infeco crnica.

29

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Figura 28- Algoritmo do diagnstico da infeco pelo HBV

Soro

Neg

AgHBs

Pos

AntiHBc
Neg

AntiHBc
Pos
Neg

AntiHBs
Neg
Susceptvel

AntiHBs
Pos

Neg

Pos

Perodo
de
incubao
Pos

Imune
Quatro
Imune
devido
interpretaes devido
a vacinao**
possveis*
a infeco
natural

AntiHBc
IgM
Neg

Pos

AntiHBs -

AntiHBs -

Infeco
crnica

Infeco
aguda

* Convalescena de uma infeco aguda (perodo de janela); Infeco antiga (a sensibilidade do teste no suficiente para detectar as baixas concentraes de anti-HBs); Susceptvel (falso positivo
para anti-HBc); Infeco crnica (nveis indetectveis de AgHBs).
** Nveis protectores de anti-HBs pressupem um ttulo 10 mU/ml. O teste ps-vacinao deve ser
efectuado 1-2 meses aps a ltima (3) dose da vacina.

30

Prticas de Virologia
3- AgHBc: antignio do core
um antignio intracelular que detectado nos hepatcitos infectados mas no no
soro
4- Anti-HBs: anticorpo especfico do AgHBs
Marca a recuperao e resoluo da infeco pelo HBV, podendo persistir por toda
a vida, conferindo imunidade protectora.
Em cerca de 10% dos pacientes com hepatite aguda pelo HBV no se desenvolve o
anti-HBs (infeces crnicas)
Pode coexistir com o AgHBs em situaes excepcionais onde tenha havido lugar
a sobre-infeco por subtipos diferentes de
vrus.
Deve estar presente aps vacinao eficaz.
5- Anti-HBc: anticorpo especfico do AgHBc
IgM
Predomina durante a fase aguda da infeco
o primeiro anticorpo a ser detectado
Surge cerca de 1 ms aps o aparecimento do AgHBs, desaparecendo, em geral,
ao fim de 6 meses.
Em geral a sua deteco significa uma
infeco aguda pelo HBV
Pode, no entanto, persistir, em baixos ttulos, nas infeces crnicas.
IgG
No indicador de imunidade, nem induzido pela vacinao
Pode aparecer isoladamente durante o
perodo de janela, quando o AgHBs j no
detectado e o anti-HBs ainda no apareceu.
Em certas circunstncias pode ainda
surgir isoladamente muitos anos aps a infeco crnica pelo HBV (quando o anti-HBs
tem nveis indetectveis) ou durante a infeco crnica quando o AgHBs apresente nveis abaixo do limite de deteco.

J. Miguel Azevedo Pereira


6- Anti-HBe: anticorpo especfico do AgHBe
Surge em circulao, nos casos de resoluo da infeco, antes do anti-HBs
Pode persistir durante anos aps a resoluo de uma infeco aguda por HBV
Normalmente vem associado ao declnio
da infecciosidade e o seu aparecimento geralmente corresponde resoluo da infeco activa
7- DNA-HBV: genoma do HBV
Aparece no soro ao mesmo tempo ou
ligeiramente antes do AgHBs
o indicador mais sensvel da replicao
viral activa
Os doentes AgHBe+ so, por regra, positivos para o DNA-HBV, excepto os mutantes do pr-core que no possuem AgHBe
Desaparece nos casos de infeco resolvida (auto-limitada).
A tabela 3, apesar de no ser exaustiva em todas as circunstncias que podem estar envolvidas numa infeco pelo HBV, d uma ideia da
complexidade de interpretao dos dados serolgicos resultantes de uma infeco pelo HBV.
No entanto, a maioria dos casos de diagnstico,
podero ser interpretados usando um algoritmo mais simplificado (Fig. 28). Este algoritmo,
convm realar, no substitui a tabela anterior.
Ver ainda o esquema duma infeco aguda e
duma infeco crnica na seco Anexos.
Definies de alguns termos usados na infeco pelo HBV:
Hepatite B crnica: doena necro-inflamatria crnica do fgado causada por uma
infeco persistente pelo HBV. Esta hepatite
crnica pode ser AgHBe+ ou AgHBe Portador assintomtico: Infeco persistente do fgado pelo HBV sem doena necro-inflamatria significativa associada. Tm
AgHBs+ e AgHBe-.
Hepatite B resolvida: tambm denominada hepatite auto-limitada, indica a existncia
de uma infeco prvia pelo HBV sem evidncia, no presente, de sinais virolgicos,
bioqumicos ou histolgicos de infeco.

31

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VI- Diagnstico da Infeco


pelo HIV
1- Caractersticas

2- Organizao genmica

O vrus da imunodeficincia humana (HIV) pertence famlia Retroviridae, sub-famlia Orthoretrovirinae e ao gnero Lentivirus. Existem dois
tipos, HIV-1 e HIV-2, e so ambos os agentes
causais do sndroma de imunodeficincia adquirida (SIDA).
A estrutura da partcula viral (Fig. 29) revela a
presena de um invlucro de natureza lipdica,
onde se inserem duas protenas de origem viral:
a glicoprotena de superfcie (SU) e a glicoprotena transmembranar (TM). A sua cpside tem
um formato cnico, contendo no seu interior as
duas molculas de RNA genmico e vrias enzimas necessrias ao ciclo replicativo viral, nomeadamente a retrotranscriptase (RT). Esta DNA
polimerase RNA-dependente caracterstica
de todos os retrovrus e sintetiza uma cadeia
de DNA a partir de um molde de RNA.

A sua estrutura genmica (Fig. 30) revela uma


organizao complexa, com trs genes estruturais - gag, pol e env - que codificam para as
protenas que constituem a partcula viral. Para
alm destes, o genoma do HIV possui mais 6
genes, ditos reguladores ou acessrios, que
codificam para protenas importantes no ciclo
replicativo viral: vif, vpr, vpu (s no HIV-1), vpx
(s no HIV-2), tat, rev e nef. Finalmente, o genoma proviral ainda composto por duas regies
no codificantes, iguais entre si, localizadas nas
duas extremidades desse mesmo genoma. Essas regies, denominadas LTR (Long Terminal
Repeat), contm, entre outros elementos, as
regies de ligao de factores de activao celulares e virais, funcionando como regies promotoras.

Figura
Esquema da
viral
do HIV
Figura
29-29Esquema
dapartcula
partcula
viral
do HIV

32

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

p55; p24; p18

p68; p52; p34

p56; p26; p16

gp160; gp120; gp41

p68; p52; p34

gp140;
gp105;
gp36

Figura 30- Organizao genmica do HIV-1 e HIV-2. A cheio esto representados os genes estruturais
Figura
30- Organizao genmica do HIV-1 e HIV-2. A cheio esto representados os genes estruturais e a
e a tracejado os genes reguladores e acessrios. Esto referidos ainda, os principais antignios
tracejado os genes reguladores
acessrios. por
Esto
referidos
ainda, os principais antignios virais,
virais,e codificados
cada
gene estrutural
codificados por cada gene estrutural

3- Ciclo replicativo

clulas dendrticas.
Resumidamente, o ciclo replicativo do HIV (Fig.
Durante o seu ciclo replicativo, o HIV infecta c- 31) pode ser dividido em duas fases: a primeira
lulas que possuam na sua membrana os recep- que culmina com a integrao do genoma protores CD4 e um dos receptores das quimioci- viral (j sob a forma de DNA de dupla cadeia) no
nas (normalmente o CCR5 ou o CXCR4). Devido genoma celular; a segunda que culmina com a
a isso, o seu tropismo celular in vivo resume-se produo de novas partculas virais.
praticamente aos linfcitos T-auxiliadores (ou Durante a primeira fase, intervm quase excluT-CD4+), aos moncitos, aos macrfagos e s sivamente protenas e enzimas de origem viral.
adsoro
descapsidao

Virio
maduro

transporte
para o ncleo

sada do
ncleo

citoplasma
CD4

reunio das protenas e


libertao

RE, Golgi
ncleo

Processamento
do env

CCR5 ou
CXCR4

Virio
imaturo

PIC

core

Vif, Vpr
e Vpu
Reunio das
protenas
PR
Nef
Clivagem
Rev
Tat
Gag

RT

IN

Transcrio
reversa

Integrao

Figura 31- Esquema representando as principais etapas do ciclo replicativo do HIV. RT= retrotransFigura
31Esquema representando
as principais
etapas do ciclo
replicativo RE=
do HIV.
RT= endocriptase;
core=
nucleocpside;
PIC= complexo
de pr-integrao;
IN= integrase;
retculo
retrotranscriptase; core= nucleocpside;
PIC=
complexo
de
pr-integrao;
IN=
integrase;
RE=
plasmtico; PR= protease

retculo endoplasmtico; PR= protease

33

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Figura 32- Esquema da evoluo, ao longo do tempo, da infeco pelo HIV

Figura 32- Esquema da evoluo, ao longo do tempo, da infeco pelo


HIV

Assim, aps a ligao (denominada adsoro)


do vrus clula, por intermdio da interaco
entre a glicoprotena SU e o receptor CD4, dse a fuso do invlucro viral com a membrana
celular. Nesta fuso intervm as duas glicoprotenas do invlucro viral (SU e TM) e os receptores celulares (CD4 e CCR5 ou CXCR4).
Aps esta fuso, a nucleocpside libertada
no interior do citoplasma celular, iniciando-se
a retrotranscrio do RNA genmico em DNA
de dupla cadeia. Esta retrotranscrio mediada pela enzima RT. O DNA de dupla cadeia
assim formado (denominado DNA proviral), ir
ser integrado no genoma da clula hospedeira
por aco de uma outra enzima viral denominada integrase e que tambm est presente na
partcula viral infecciosa. A partir daqui o DNA
proviral do HIV pode seguir dois caminhos: ou
a clula est activada e, nesse caso, existem
factores de transcrio celulares que induzem
a transcrio desse DNA, dando assim origem
aos RNAm que sero traduzidos em protenas que daro forma partcula viral; ou, pelo
contrrio, a clula no est activada e, nessa
circunstncia, o DNA no ser transcrito, no
havendo lugar produo de novas partculas
virais. O DNA proviral mantm-se no entanto integrado, sendo por isso transmitido s clulas
filhas em cada diviso celular, perpetuando-se
no hospedeiro. Desta forma, num indivduo in34

Figura3333-Esquema
Esquemada
dareaco
reaco
imunoenzimti-com
Figura
imunoenzimtica
ca com leitura
final
colorimtrica
leitura final
colorimtrica

Prticas de Virologia
fectado possvel detectar-se o DNA proviral
nas clulas alvo do HIV: linfcitos e moncitos
(clulas mononucleadas do sangue perifrico CMSP).

4- Patognese da infeco

J. Miguel Azevedo Pereira


a qual foi ocorrendo gradualmente ao longo
da fase assintomtica.

5- Diagnstico da infeco pelo HIV

Os mtodos de diagnstico da infeco pelo HIV


A infeco pelo HIV uma infeco dita crnica/
dividem-se em dois grupos:
persistente uma vez que o hospedeiro infectado
incapaz de eliminar o agente infeccioso. O perMtodos directos, onde se pe em evidncia a

Figura 34- Esquema da reaco de WB, desde a separao das protenas, em gel de poFigura
34- Esquema
reaco de
desde a especficos
separao das
protenas,
em gel de
liacrilamida,
at da
deteco
dosWB,
anticorpos
para
cada antignio

poliacrilamida, at deteco dos anticorpos especficos para cada antignio

curso patognico desta infeco passa por trs


fases principais e sequenciais (Fig. 32):
Fase inicial ou primria: caracterizada
por uma elevada replicao viral e ausncia
de resposta imunolgica por parte do hospedeiro
Fase assintomtica ou de latncia clnica: caracterizada por cargas virais (concentrao de vrus no plasma) baixas (por vezes
indetectveis) devido forte resposta imunolgica do hospedeiro
Fase sintomtica: aparecimento de infeces oportunistas devidas diminuio
da resposta imunolgica, devida, nomeadamente, diminuio dos linfcitos T-CD4+,

presena da partcula viral ou de componentes


dessa partcula viral:
Isolamento viral
PCR
Agp24
Mtodos indirectos, onde se pe em evidncia
a presena de anticorpos especficos para os
antignios virais
Testes de rastreio
Testes de confirmao
A forma mais normal e rotineira de se fazer o
diagnstico da infeco pelo HIV pesquisando a presena de anticorpos especficos. Para

35

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira


Figura 35- WB
positivo para o
HIV-1; notar a
localizao dos
vrios
antignios virais

Figura 35- WB positivo para o HIV-1;


notar a localizao dos vrios antignios virais

36- Seroconverso
numa infeco
pelo
FiguraFigura
36- Seroconverso
numa infeco
pelo HIV-1.
HIV-1. As amostras de soro colhidas ao longo
As amostras de soro colhidas ao longo dos vrios
dos vrios dias aps a infeco (referidos
dias
aps a infeco (referidos direita), foram
direita), foram testadas em simultneo. A ltestadas
emdesimultneo.
A ltima
de WB potima tira
WB representa
umtira
controlo
representa um controlo
sitivo positivo

esse objectivo usa-se como amostra o sangue,


mais propriamente o soro/plasma, e um dos
testes de rastreio disponveis no mercado. Estes testes de rastreio baseiam-se em ensaios
Controlo
imunoenzimticos com uma leitura final coloriHIV-2 +
mtrica (Fig. 33) ou fluorimtrica. Em qualquer
HIV-1 +
dos casos o sinal detectado no final da reaco
Figura
37-de
Teste
de Pepti-LAV.
(da
Figura
37- Teste
Pepti-LAV.
ResultadosResultados
(da
imunoenzimtica directamente proporcional esquerda
esquerda
para aHIV-1
direita):
HIV-1
e HIV-2
para a direita):
+; HIV-1
e HIV-2
+; +; HIV-1
+; HIV-2
+
quantidade de anticorpos presente na amosHIV-1 +; HIV-2
+
tra. A presena de anticorpos numa amostra
suficiente, devido s caractersticas da infeco 100%. Este ltimo facto faz com que possam
pelo HIV, para concluir que se trata de algum ocorrer reaces falsamente positivas, pelo
infectado pelo HIV. Isto s no verdade no que qualquer resultado positivo no teste de rascaso de crianas recm-nascidas cujas mes treio impe a sua confirmao por testes com
sejam seropositivas para o HIV, uma vez que uma especificidade maior.
os anticorpos maternos (IgG) so transferidos Estes testes de confirmao esto, hoje em dia,
passivamente atravs da placenta. Assim, a limitados ao teste de Western-blot (WB). Neste
presena de anticorpos, antes da idade de 18 teste ocorre igualmente uma reaco imunoenmeses, no significa necessariamente a exis- zimtica em fase slida (tal como nos testes de
rastreio), mas em que possvel descriminar
tncia de uma infeco pelo HIV.
Os testes de rastreio apresentam como carac- para que antignios virais existem anticorpos
tersticas principais o terem uma sensibilidade na amostra em estudo. Isso possvel porque
de 100% (no admissvel ocorrerem falsos os antignios virais so previamente separados
negativos) e uma especificidade abaixo dos entre si (devido aos seus diferentes pesos rela-

36

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira


os antignios virais codificados por cada
gene estrutural e da sua localizao nas tiras de WB)
Negativo: ausncia de anticorpos para
qualquer das protenas virais. Este resultado negativo anula a positividade detectada
no teste de rastreio.
Indeterminado: presena de anticorpos
para uma ou mais protenas virais mas em
que o critrio de positividade no preenchido.

Teste de
rastreio de 4
gerao positivo

Agp24 c/
dissociao

Pos

Pepti-LAV

Neg

Neg

HIV-1 +

WB para
o HIV-1

HIV-2 +

WB para
o HIV-2

HIV-1 e
HIV-2 +

WB para
o HIV-1
e HIV-2

Se a interpretao dos resultados positivos e


negativos se revela simples, j a classificao
da serologia em indeterminada revela-se problemtica, uma vez que no permite a conclutivos), atravs de uma electroforese em gel de so sobre o diagnstico do indivduo em estudo.
poliacrilamida (Fig. 34), antes de serem trans- As razes para uma serologia indeterminada
feridos para o suporte slido final (neste caso, podem ser:
uma membrana de nitrocelulose).
Seroconverso aps infeco recente
pelo HIV
Consoante o perfil de anticorpos presente na
Reaces cruzadas de certos anticorpos
amostra (ou seja dependendo para quais dos
com os antignios do HIV
antignios existem anticorpos), assim os soros
sero classificados como positivos, negativos Em qualquer dos casos o procedimento a seou indeterminados. Os critrios para esta clas- guir passa por:
sificao so os preconizados pela OMS e so
Pedir uma nova amostra passadas 4-6
os seguintes:
semanas
Positivo: presena de anticorpos para,
Recorrer, na primeira amostra (e evenpelo menos, duas das trs protenas codifitualmente na segunda), aos mtodos direccadas pelo gene env (gp160, gp120 e gp41,
tos de diagnstico
no caso do HIV-1; gp140, gp105 e gp36, no
caso do HIV-2), independentemente se exis- Caso se trate de uma seroconverso, no s
tem, ou no, anticorpos para as restantes possvel detectar a presena do HIV pelos mtoprotenas dos outros genes (ver Fig. 35 e dos directos, como, na segunda amostra, ser
Fig. 30 para tomar conhecimento de quais possvel de observar uma evoluo do perfil de
Figura
38-38Interesse
do Pepti-LAV
no rastreio
derastreio
anticorpos
Figura
Interesse
do Pepti-LAV
no
especficos
para o HIV
de anticorpos
especficos
para o HIV

Figura
da reaco
reaco de
PCR (A)
(A)eeresultado
resultado final
dada
amplificao
de
Figura3939-Esquema
Esquema da
de PCR
final
amplificao
de
fragmento
DNA
com
cerca
300pb,
pb,visualizado
visualizado
num
gel
agarose
umum
fragmento
de de
DNA
com
cerca
dede300
num
gel
dede
agarose
e
e corado
coradocom
com brometo
brometode
deetdeo
etdeo(B)
(B)

37

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

anticorpos, presentes na amostra, pela tcnica


de WB.
Se, ao invs, se tratar de uma reaco cruzada,
os testes de diagnstico directo no iro dar
qualquer resultado positivo, bem como, na segunda amostra, no se verificar a esperada
evoluo no perfil de anticorpos.
Como exemplo, na Figura 36, encontram-se representados um conjunto de resultados de WB,
obtidos em amostras sequenciais, do mesmo
indivduo, ao longo do tempo. possvel a observar a evoluo da produo de anticorpos,
desde as amostras totalmente negativas at s
j classificadas como positivas, passando por
vrias amostras intermdias com resultados
indeterminados.
Este tipo de situao evolutiva, caracterstica de
uma seroconverso, levanta um outro problema que se prende com a impossibilidade de um
indivduo recentemente infectado ser diagnosticado recorrendo deteco de anticorpos. Na
realidade, se se observar a Figura 35, conclui-se
que durante as primeiras duas semanas aps a
infeco, o indivduo apresenta serologia negativa, implicando assim um diagnstico errado,
se este diagnstico for somente baseado nos
mtodos indirectos.
Com o objectivo de minorar este facto, inerente
prpria resposta imunolgica do hospedeiro,
os testes actuais de rastreio (testes de 4 gerao) permitem detectar em simultneo, anticorpos para o HIV-1, anticorpos para o HIV-2
e ainda antignio p24 (Agp24). Desta forma,
caso a amostra ainda no possua anticorpos
em quantidades suficientes para serem detectados, poder j possuir Agp24 em circulao
que permita a identificao da infeco nessa
amostra.
Para alm dos j descritos testes de rastreio e
de confirmao (WB), existe um outro tipo de
teste que poder ser usado com vista deteco de anticorpos especficos do HIV-1 e HIV-2,
denominado Pepti-LAV (Fig. 37). Este teste, que
no considerado nem como um teste de rastreio nem de confirmao, permite, distinguir serologias positivas para o HIV-1 ou para o HIV-2
ou, eventualmente, duplas seropositividades
(presena de anticorpos para o HIV-1 e HIV-2
simultaneamente). Desta forma, aps um teste
de rastreio de 4 gerao positivo, e consoante
o resultado do Pepti-LAV, o laboratrio far um

WB para o HIV-1 ou para o HIV-2 (obviamente


se houver dupla seropositividade, os dois WB
tero de ser feitos).
O Pepti-LAV , semelhana do WB, um teste imunoenzimtico realizado sobre uma tira
de nitrocelulose na qual existem dois tipos de
antignios, sob a forma de pequenos pptidos,
das regies imunodominantes da glicoprotena
TM do HIV-1 (gp41) e da glicoprotena TM do
HIV-2 (gp 36), para alm de um antignio de
controlo (para o qual todos os soros tero de
ter anticorpos e que serve de controlo da reaco imunoenzimtica). Assim, aps um teste de
4 gerao positivo, e antes de executar o WB,
poder-se- testar o soro no Pepti-LAV de forma
a s executar o WB adequado possvel seropositividade dessa amostra (Fig. 38).
Do que atrs ficou dito, em certos casos, o diagnstico da infeco pelo HIV no possvel de
ser feito recorrendo unicamente aos mtodos
indirectos. Nessas circunstncias torna-se necessrio usar os mtodos directos, de preferncia mais do que um deles, para se chegar a
um correcto diagnstico da infeco.
Os mtodos directos so, como j foi referido,
os seguintes: deteco de Agp24, cultura viral
e PCR. Destes j foi abordado sumariamente o
Agp24, havendo no entanto que acrescentar
que se trata de um ensaio que tem, como grande inconveniente, o facto de ter uma sensibilidade que depende da fase da infeco em que
o indivduo se encontra. Na verdade, durante a
fase assintomtica (ou de latncia clnica) da infeco (ver Fig. 32), este mtodo d resultados
negativos devido ao facto de existir pouca quantidade de antignio viral livre (nica forma possvel do Agp24 ser detectado) no soro/plasma,
devido forte resposta humoral do hospedeiro.
Por isso, a seu utilizao est restrita a duas situaes particulares: diagnstico de infeces
que ocorreram h pouco tempo, ou no diagnstico da infeco em crianas, filhas de mes seropositivas, antes dos 18 meses de idade.
Em qualquer destes casos, para que a sensibilidade do mtodo seja mxima, impe-se que se
faa a dissociao dos imunocomplexos Ag-Ac
que podem estar presentes nesses dois tipos de
amostras. Com esta dissociao, consegue-se
libertar o Agp24 do respectivo anticorpo (caso
ele exista), e assim, sob a sua forma livre, ser
detectado pelos testes disponveis no mercado.

38

J. Miguel Azevedo Pereira

Plasma+plaquetas

Centrifugao
Ficoll

CMSP

Ficoll

Sangue

Prticas de Virologia

Figura 40- Separao da


CMSP (linfcitos e monci
por centrifugao em gradi
de Ficoll

PMN+hemcias

Figura 40- Separao das CMSP (linfcitos e moncitos) por centrifugao em gradiente de Ficoll

Se no caso das infeces recentes isso no


crtico (devido natural escassez de anticorpos
que caracteriza essa fase recente da infeco),
j o mesmo no verdade quando se pretende
detectar o Agp24 nos soros de crianas cujas
mes sejam seropositivas para o HIV. Nestes
casos, vo necessariamente coexistir, caso a
criana esteja realmente infectada, o Agp24 e
os anticorpos anti-p24 de origem materna. Esta
dissociao feita tratando os soros a testar
com um tampo glicina a pH cido (pH 3).
A reaco em cadeia da polimerase (PCR), cujo
esquema base foi j abordado (ver Fig. 20 e 39),
um mtodo que oferece, como principal vantagem, o facto de ter uma elevada sensibilidade,
o que o faz ser um mtodo de eleio para os
casos de infeces recentes, em que o nmero
de CMSP infectadas baixo. igualmente til
nos casos de diagnstico de crianas filhas de
mes seropositivas para o HIV, antes do 18 meses de idade.
Finalmente, a cultura do HIV apresenta basicamente as mesmas limitaes das referidas
para o Agp24: sensibilidade que varia com a
fase da infeco, sendo mxima nas fases iniciais e terminais (fase sintomtica - ver Fig. 32),
e baixa durante a fase assintomtica. Estas variaes na sensibilidade, tal como no caso do
Agp24), reflectem os nveis de replicao viral,
a quantidade de partculas virais, bem como de
clulas infectadas, presentes no sangue perifrico em cada uma dessas fases.
A forma mais comum e eficaz de proceder
cultura e isolamento do HIV, baseia-se no m-

todo de co-cultura. Neste mtodo as CMSP do


doente, separadas previamente por centrifugao em gradiente de Ficoll (Fig. 40), so co-cultivadas com CMSP de dadores no infectados,
previamente estimuladas com fitohemaglutinina (agente mitognico), na proporo de 1:2 ou
1:3 (CMSP doente:CMSP dador). Esta co-cultura prossegue, em meio contendo IL-2, durante
4 semanas, aps as quais, caso a pesquisa de
HIV na cultura tenha dado sempre negativa durante esse tempo, a cultura ser dada como
negativa.
As tcnicas usadas para por em evidncia a presena do HIV so: pesquisa, no sobrenadante da
cultura da presena da enzima retrotranscriptase (RT), pesquisa, tambm no sobrenadante,
de Agp24, ou ainda pesquisa de clulas infectadas por imunfluorescncia (menos usual).

6- Principais problemas
no diagnstico da infeco pelo HIV
De forma a resumir os problemas inerentes
utilizao dos testes indirectos como mtodos
de diagnstico do HIV, so de seguida referidos as principais causas desses problemas, os
quais podem-se traduzir em falsos positivos ou
falsos negativos:
1- Inmeros subtipos, principalmente no HIV-1:
possibilidade de alguns desses subtipos induzirem anticorpos suficientemente diferentes que

39

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

41C

Promotor da T7
RNA-polimerase

Primer 1

Cyclic Phase
5
3

RT

5
5

5
5
3

RT

RT

Primer 2

3
3
3
3
3

5
5
5
5
5

3
5

3
5
RNase H

5
3

Primer 1
5

3
3

5
3

3
RNase H
Primer 2

5
T7 RNA
Polymerase

RT
3
5

Figura 4141- Esquema


Esquema da
Figura
da reaco
reaco de
de NASBA
NASBA

no sejam detectados nos testes de rastreio


comercializados no momento (ex: subtipo O).
2- Ocorrncia de falsos positivos (testes de rastreio + com WB negativo ou persistentemente
indeterminado) devido a situaes patolgicas
ou fisiolgicas, tais como:
Leucemias
Infeces virais agudas
Auto-anticorpos
Doenas auto-imunes
Gravidez
Multi-transfusionados
Hemodialisados
Recm-vacinados

7- Outros marcadores de
diagnstico e monitorizao da infeco

Para alm dos mtodos j aqui referidos, existem outros que podero ser usados, em casos
muito particulares, como auxiliares no diagnstico da infeco pelo HIV. Outros so usados
principalmente como marcadores de prognstico ou de monitorizao da teraputica. Do primeiro grupo temos como exemplos:
Pesquisa de anticorpos da classe das
IgA ou IgM
Imuno-histoqumica e IF directa: deteco de clulas infectadas expressando antignios virais
3- Falsos negativos (resultados de testes de
Hibridao in situ: deteco de clulas
rastreio negativos em situaes onde exista recontendo DNA proviral usando sondas maralmente infeco pelo HIV):
cadas
Recm-infectados (janela imunolgica)
2-microglobulina e neopterina
Infectados por subtipo extico
Seroconverso tardia devida, nomeada8- Mtodos usados na momente:

Hipogamaglobulinmia
nitorizao e prognsti
Disfuno das clulas B
co da infeco:

Quimioterapia
4- Recm-nascidos de mes seropositivas

1- Quantificao da carga viral:


RT-PCR (PCR associado a uma reaco
de transcrio reversa)

40

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

Sonda do RNA alvo e do bDNA


Sonda do RNA
alvo e da sonda de
captura
Sonda de captura
bDNA

Fase slida

Sonda do bDNA marcada com


fosfatase alcalina

Figura 42- Esquema da reaco de bDNA

Figura 42- Esquema da reaco de bDNA

que acontece no RT-PCR, a molcula que amplificada o RNA viral e no o DNA. A enzima interveniente nesta amplificao a T7-RNA polimerase. A reaco inicia-se com a ligao do
2- Quantificao de linfcitos CD4 e CD8
primer (primer 1 - P1) regio alvo da molcula
Relao CD4:CD8
de RNA viral. Este P1 tem a particularidade de,
Contagem absoluta de linfcitos CD4
na sua extremidade 5, possuir o promotor da
T7-RNA polimerase, enquanto que a sua extre9- Quantificao da car- midade 3 complementar da regio alvo da cadeia de RNA viral. Aps o annealing deste P1,
ga viral
a RT faz uma cpia (cDNA) da cadeia de RNA
Os mtodos que so usados para a quantifica- alvo. Fica assim formado um hbrido RNA:DNA.
o da carga viral usam, como lquido biolgico, Pela fraco RNAseH da RT, a cadeia de RNA
o plasma. Qualquer um deles expressa o resul- degradada e, novamente por intermdio da
tado em nmero de cpias de RNA viral/ml de RT (agora pela sua actividade DNA polimerase
DNA-dependente), e aps hibridao de um seplasma.
O mtodo clssico o RT-PCR em que a reaco gundo primer (Primer 2 - P2), sintetiza-se uma
de PCR normal precedida de uma reaco de dupla cadeia de DNA, contendo o promotor da
retrotranscrio mediada pela RT (transcripta- T7-RNA polimerase totalmente funcional. Este
se reversa). Como todas as reaces de PCR, promotor ento reconhecido pela T7-RNA pocomposta por trs ciclos que ocorrem, normal- limerase que sintetiza uma grande quantidade
mente, a temperaturas diferentes: desnatura- de RNA de cadeia simples, correspondente ao
o, hibridao dos primers e elongamento das RNA viral inicial. Cada uma destas novas cadeias
ir ser usada na fase de amplificao (Cyclic
cadeias)
O mtodo NASBA (nucleic acid sequence-based Phase), na qual se repete os passos referidos
amplification) um mtodo alternativo em que anteriormente (annealing do P1, sntese do
toda a reaco se processa mesma tempe- cDNA, sntese do DNA de dupla cadeia, produratura (Fig 41). Neste mtodo, ao contrrio do o de RNA pela T7-RNA polimerase), aumen NASBA
bDNA

41

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

tando o nmero de cpias de RNA. A deteco


das molculas de RNA amplificadas feita por
quimioluminescncia, usando sondas marcadas
especficas da regio de RNA amplificada.
Finalmente pode-se quantificar a carga viral
usando o mtodo Branched DNA (b-DNA). Trata-se de uma tcnica de hibridao usando molculas bDNA (Fig. 42). A amostra , tal como
nas tcnicas anteriores, o RNA viral. Este RNA,
depois de extrado, hibridado com dois tipos
de sondas:
As que vo servir de sondas de captura (localizadas na face interna das cpulas da microplaca) e que, ao hibridarem especificamente com
o RNA alvo vo fix-lo microplaca;
As que hibridam simultaneamente com o RNA
alvo e com as molculas de bDNA.
As molculas de bDNA, ligadas ao RNA alvo por
intermdio das sondas, vo agir como amplificadores do sinal, uma vez que a elas se iro ligar
um outro conjunto de sondas marcadas com
fosfatase alcalina. O sinal vai ser detectado por
quimioluminescncia, aps adio de um substracto da enzima fosfatase alcalina.

Convm realar que, na determinao da carga


viral, importante que a monitorizao dos doentes seja feita sempre no mesmo laboratrio
e usando a mesma tcnica, pois as variaes
inter-ensaio podem atingir 0,3-0,5 log de diferena. Em geral, uma carga viral abaixo da 10
000 cpias por ml considerada um nvel baixo
de carga viral, enquanto que valores acima das
100 000 cpias por ml so considerados altos.
Isto em relao ao HIV-1 pois no HIV-2 as cargas virais so sempre muito inferiores, mesmo
em doentes com sintomatologia e com nveis de
linfcitos CD4+ baixos.
A principal utilizao da determinao da carga viral tem a ver com a monitorizao da teraputica. Um esquema teraputico eficaz dever
fazer baixar a carga viral para valores indetectveis e manter esses valores. Caso essa tendncia se inverta, significa que esse esquema
teraputico deixou de ser eficaz, devido emergncia de variantes resistentes aos frmacos
usados (a um ou a mais do que um desses frmacos).

42

Prticas de Virologia

J. Miguel Azevedo Pereira

Anexos
Perfil serolgico de uma infeco crnica pelo VHB

Perfil serolgico de uma infeco aguda pelo VHB

43