IMPREGNACIONES METALICAS

Se denominan Impregnaciones metlicas o argenticas a todas las tcnicas que utilizan

sales metlicas y la precipitacin del metal (plata principalmente) reducida sobre las
fibras reticulares y otros elementos determinados de los tejidos. El metal entra en
contacto con los tejidos bajo la forma de solucin salina; la reduccin es debida en parte a
la accin propia del tejido y a la de sustancias reductoras utilizadas en cada tcnica o a
agentes fsicos como la luz. El metal forma un compuesto metal-orgnico para sensibilizar
el tejido y luego la plata reemplaza ese metal. La plata amoniacal es la que impregna las
fibras reticulares. Ese metal sensibilizante puede ser una solucin de nitrato de uranilo
(Tcnica de Wilder), de nitrato de plata diluida (Tcnica de Gridley) o de aluminio frrico
(Tcnica de Gomori.
Dentro de sus aplicaciones destaca identificacin de tejido nervioso, en el tejidoreticular,
la aplicacin de tcnicas de impregnaciones con sales metlicas permiten un conocimiento
mas exhaustivo de las terminaciones nerviosas que las que se logran con mtodos de
coloracin histoqumicos; se logran identificar selectivamente colgenas tipo III, o
llamadas fibras reticulares las que han sido consideradas como precursoras de las fibras
colgenas, siendo denominadas anteriormente "precolgenas". Segn algunos autores
constituyen los haces finales deshilados de las fibras colgenas. Sin embargo, estn
rodeadas de histiocitos y no de fibroblastos. A la microscopa electrnica tienen una
estructura peridica axial como las de la colgena. Entre las colgenas y ellas vara el
contenido de aminocidos y no se tien con los tricrmicos para fibras colgenas. Estn
formadas por colgeno de tipo III asociado a glicoprotenas, en las paredes arteriales y
musculares, colgeno tipo V y IV en las membranas basales
Entre los mtodos de impregnacin, los ideados por Santiago Ramon y Cajal, son los
ms usados, en uno de ellos usando oro-sublimado (para la neurogla), que es
indudablemente el ms ingenioso, fcil y bello. El procedimiento creado por Robertson
para demostrar la oligodendrogla, basado en el empleo del cloruro de platino, aunque de
logro difcil, tiene notorio inters. En cuanto a la aplicacin de las sales de plata, las
tcnicas de Cajal, Bielschowsky y Achcarro, con sus incontables variaciones, y la nuestra
polimorfa al carbonato argntico, acreditan las posibilidades infinitas de las
impregnaciones metlicas, en las que puede basarse toda una tcnica histolgica general.
Gracias a las tinciones argnticas, la microgla, que es representante en los centros
nerviosos del sistema retculo-endotelial, ha podido ser estudiada en sus formas y
cualidades funcionales, descubrindose homologas seguras entre ella y los macrfagos
del tejido conjuntivo.

RECOMENDACIONES GENERALES PARA IMPREGNACIONES METALICAS

Las tcnicas de impregnaciones metlicas, especialmente las que utilizan sales de plata,
son notoriamente caprichosas, de manera que tomar ciertas precauciones en su
ejecucin, ayudar a obtener mejores resultados.

RECOMENDACIONES.
1. Portaobjetos: stos deben ser silanizados, pues las soluciones de plata suelen ser
alcalinas lo que favorece el desprendimiento de los cortes.
2. No utilizar pinzas metlicas (tipo pato para manipular las lminas), pues al contacto
con metal la plata se reduce. Mantener estas precauciones al momento de pesar.
3. Usar reactivos pro anlisis
4. Usar agua destilada de buena calidad. La calidad del agua se chequea agregando
un grano de plata al agua, si se vuelve lechosa desecharla.
5. Lavado de material de vidrio acucioso.
6. Para la utilizacin de reactivos como el amonaco, hacerlo siempre bajo campana,
no pipetear cidos ni bases fuertes.
7. Para las soluciones amoniacales eliminar INMEDIATAMENTE aquellas donde se ha
formado un cristal negro brillante.
8. Mantener las soluciones de plata simples (soluciones madres de nitrato de plata)
en frascos ambar, bien tapados y rotulados a 4c
9. Evitar luz directa en soluciones y polvos de plata.
10. Eliminar soluciones de plata precipitadas

Se denomina impregnacin a toda coloracin histolgica en la que se emplean sales de

metlicas como el Cloruro de Oro, sales de cromo o el Nitrato de Plata, para generar
precipitados metlicos sobre las estructuras a teir. Las tcnicas de impregnacin han sido
ampliamente usadas en el estudio de organizacin del tejido nervioso. Se conoce con
claridad el fundamento fisicoqumico de las impregnaciones argnticas, que es muy similar
al que ocurre en la exposicin y revelado de una fotografa, pero se desconoce el motivo
por el que no todas las estructuras de impregnan por igual.

FORMAS DE IMPREGNACIN ARGNTICA

Existen dos tipos:

1. Impregnacin por mecanismos predominantemente fsicos y fsico qumicos
La coloracin de las estructuras es por mecanismo puro de impregnacin, en el
que estructuras histolgicas determinadas electronegativas atraen, por mecanismo
electroesttico, a los iones de plata cargados + ; esta propiedad de los tejidos de
atrapar los iones argnticos existentes en una solucin recibe el nombre de
argirofilia. En general, la plata metlica en forma de finos precipitados tiene
especial apetencia por depositarse sobre estructuras fibrilares finas y por
superficies celulares dotadas de delgadas prolongaciones tales como clulas de la
glia, neuronas, fibras reticulares del tejido conjuntivo, etc las que por este motivo
reciben el nombre de argirfilas. El tejido no interviene activamente en el
mecanismo de liberacin de la plata metlica a partir de su sal soluble, adems no
todos los tejidos tienen idntica apetencia por la plata, la carga elctrica y la
textura de las clulas a teir intervienen de manera decisiva.

2. Impregnacin por mecanismos histoqumicos.

Se basa en la actuacin de algn componente del tejido sobre el nitrato de plata o
sus derivados a raz de la cual ocurre la precipitacin de plata metlica a partir de
sus correspondientes iones; por lo tanto, el tejido interviene activamente en el
deposito de plata metlica a travs de una reaccin qumica de reduccin.
Los protocolos de impregnacin argntica pueden dividirse en:
1. Impregnacin argntica en dos pasos
2. Impregnacin argntica en un paso

Ambas tienen en comn la reduccin del nitrato de plata a plata metlica, los mtodos en
dos tiempos lo hacen en fases sucesivas, mientras que los de un tiempo realizan una
reduccin ms severa.
IMPREGNACION ARGENTICA A DOS TIEMPOS
Impregnacin primaria: los tejidos son expuestos a una solucin ligeramente
alcalina en la que hay una concentracin no muy alta de AgNO3, que proporciona
iones plata en exceso. Este exceso se logra usando un volumen grande de AgNO3,

o a partir de un complejo de diamina de plata (solucin de nitrato de plata

amoniacal), o de un proteinato de plata o una solucin con plata poco soluble.
Estor iones plata con captados por el tejido de dos maneras; la mayor parte de los
cationes se unen mediante interacciones qumicas con las protenas del tejido.
Estos iones son eliminados en un paso posterior mediante el tratamiento del corte
con un agente que forma complejos con los iones Ag+, como por ejemplo cido
ctrico, sulfito de sodio, hidrxido de amniaco. Al mismo tiempo, hay pocos iones
Ag+ que se reducen a plata metlica en puntos muy concretos de los axones, las
dendritas o alguna otra estructura. La plata reducida forma pequeos ncleos de
plata metlica invisible al microscopio, incluso al microscopio electrnico. Estos
puntos son equivalentes a la imagen latente que se forma en un negativo
fotogrfico cuando es expuesto a la luz. Estos microscpicos ncleos de plata unida
al tejido no son eliminados por el hidrxido de amoniaco.
Impregnacin secundaria: los cortes son tratados con una solucin reductora
combinada con otra molcula que captura los iones de plata que se han unido
inespecficamente al tejido, por ejemplo por interacciones electroestticas. Una
interaccin tpica es la hidroquinona con el sulfito; otras tcnicas utilizan la
formalina como agente reductor. El sulfito se combina con los iones libre para
formar Ag(SO3)2
-3. La hidroquinona reduce estos iones y precipita plata
metlica sobre los puntos de nucleacin que se han formado en la impregnacin
primaria. En algunos mtodos este revelado se hace en dos partes. Primero la
retirada de iones plata mediante el sulfito, y luego un tratamiento controlado con
iones Ag+ en una solucin que contiene estabilizantes que controlen la reduccin
espontnea de los cationes Ag+.
IMPREGNACION ARGENTICA DE UN TIEMPO
En ella se suele partir del nitrato de plata, aunque en ocasiones se emplean otras
sales. Esta impregnacin se fundamenta en la reduccin severa y directa de la sal
de plata a sal metlica a travs de la accin de un agente reductor potente, que
suele ser el pirogalol o la hidroquinona. Es una tcnica ms lenta que la de dos
tiempos, ya que el nitrato de plata es ms estable que el xido diamino-argntico,
a partir del cual se precipita a plata metlica. Las tcnicas de Bodian para
neurifibrillas y la de Grimelius para argirofilia son impregnaciones argnticas de un
tiempo.
La impregnacin argntica se basa en la interaccin de determinadas estructuras
del tejido con los iones Ag+ y la capacidad de stas estructuras de formar puntos
de nucleacin de Ag metlica.

TECNICAS PARA FIBRAS DE RETICULINA DEL TEJIDO CONJUNTIVO.

1.- METODO DE GOMORI PARA FIBRAS RETICULARES

Es una tcnica de dos tiempos, usa como base fuerte de hidrxido de potasio y
como agente reductor el formol. Antes de la impregnacin se realiza una oxidacin
con permanganato de potasio seguida de un blanqueamiento con metabisulfito de
potasio y un mordentaje con alumbre frrico.
PROCEDIMIENTO TECNICO
FIJACIN : formalina 10%
CORTES: delgados, portaobjetos con silano
SOLUCIONES
A.
B.
C.
D.

Permanganato de potasio 1% acuoso

Metabisulfito de potasio 2% acuoso
Alumbre frrico acuoso 2% (preparar antes de usar)
Plata amoniacal. Se toman 10 ml de nitrato de plata al 10%, se aaden 2 ml
de hidrxido de potasio al 10%, se debe formar un precipitado el que se
disuelve agregando gota a gota amoniaco puro, agitar permanentemente y
bajo campana; despus de aade unas gotas de nitrato de plata hasta que
empiece a formarse un nuevo precipitado, diluir al doble con agua
destilada.
E. Formalina 10%
F. Hiposulfito de sodio acuoso al 2%
PROTOCOLO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Desparafinar e hidratar hasta agua destilada

Oxidar durante 1 a 2 min con permanganato
Lavar con agua corriente
Blanquear con metabisulfito
Lavar con abundante agua corriente
Tratar con alumbre por 1 minuto
Lavar con agua corriente 5 min
Lavar con agua destilada 2 veces

9. Tratar por 1 minuto con plata amoniacal

10. Lavar con agua destilada 10 segundos
11. Reducir con formol
12. Lavar con agua corriente
13. Hiposulfito algunos segundos
14. Lavar con agua corriente
15. Deshidratar, aclarar y montar
Si las fibras estn muy claras, lavar con agua destilada despus del paso 12 y re impregnar
por 20 segundos ms en la plata amoniacal, seguir con el resto del protocolo.
Puede realizarse una impregnacin con cloruro de oro (Variante de Cajal), despus del
paso 12, lavar con agua destilada, cloruro de oro por un minuto, lavar con agua destilada y
seguir el resto del protocolo; en sta caso las fibras se tornan de una tonalidad ms
purpura. Se recomienda utilizar el cloruro de oro cuando han quedado algo sobre teidas
las fibras. Si el corte est suelto, se recomienda evitar el Cloruro de Oro.
RESULTADOS
Fibras reticulares
Fibras colgenas y fondo

negras
amarillo

2.- METODO DE GORDON SWEET PARA FIBRAS RETICULARES

Es una impregnacin argntica en dos tiempos, usa como base fuerte el hidrxido de
sodio y como agente reductor el formol. Antes de la impregnacin se realizan
manipulaciones similares a la tcnica de Gomori, se reemplaza el metabisulfito por cido
oxlico. Finalmente se contrasta con cloruro de oro.

PROCEDIMIENTO TECNICO
FIJACIN : formalina, carnoy, etc
CORTES: delgados, portas silanizados
SOLUCIONES
A. Bao argntico de Wilder.
-nitrato de plata 1% acuoso
-hidrxido de sodio 3% acuoso
Se toman 5 ml de nitrato de plata; aadir gota a gota amoniaco puro hasta que
desaparezca el precipitado formado; agregar 5 ml de hidrxido (se forma un nuevo

precipitado) y volver a agregar amoniaco puro gota a gota hasta disolver el

precipitado, completar hasta 50 ml con agua destilada.
B. Cloruro de oro 0,02gra en 10 ml de agua destilada.
C. Acido oxlico 5% acuoso
D. Alumbre de hierro 2% acuoso
E. Tiosulfato de sodio 5% acuoso
F. Mezclar 47,5 ml de permanganato de potasio al 5% acuoso con 2,5 ml de
cido sulfrico 3% acuoso.
G. Formalina 10%
PROTOCOLO
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada
2. Oxidar con solucin F por 5 min
3. Lavar con agua destilada
4. Blanquear con C por 1 min
5. Lavar en tres cambios de agua destilada
6. Tratar con D por 30 min
7. Lavar en dos cambios de agua destilada
8. Solucin A durante algunos segundos
9. Lavar en agua destilada
10. Formalina 10 min
11. Lavar en agua
12. Cloruro de oro 5 min
13. Lavar en agua destilada
14. Fijar con hiposulfito
15. Agua destilada
16. Deshidratar, aclarar y montar
Si quedan dbilmente teidas, repetir desde el paso 7.
RESULTADOS
Fibras reticulares
Resto

negras azuladas
sin teir

3.- TECNICA DE MASSON FONTANA PARA ARGENTAFINIDAD

Es una impregnacin argntica en dos tiempos, en la cual el amoniaco realiza LA
primera reduccin el nitrato de plata a xido diaminoargntico y el tejido la
segunda, precipitando la plata metlica sobre las granulaciones con capacidad
reductora. La principal dificultad de la tcnica se encuentra en la preparacin de las
soluciones, dado que es importante encontrar el punto en que la plata esta apunto
de precipitar sin que llegue en realidad a hacerlo.

PROCEDIMIENTO TECNICO
FIJACIN : formalina, evitar fijadores alcoholicos.
CORTES: en portas silanizados
SOLUCIONES
A. Solucin de Fontana
A 95 ml de nitrato de plata al 5%, aadir hidrxido de amoniaco hasta
obtener una solucin clara sin precipitados. Luego aadir gota a gota los
restantes 5 ml de nitrato de plata al 5% hasta que la solucin se torne
ligeramente turbia. Dejar reposar por 1 a 2 horas antes de usar.
B. Cloruro de oro 1%, tomar 10 ml y completar hasta 50 ml con agua destilada.
C. Tiosulfato de sodio 5% acuoso
D. Rojo nuclear rpido
PROTOCOLO
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada
2. Incubar en solucin de plata a 56c por 1 hora o bien 24 a 48 horas a
temperatura ambiente a la oscuridad. Los cortes toman un color marrn
claro.
3. Lavar en agua destilada
4. Cloruro de oro 5 min
5. Lavar tres veces en agua destilada
6. Tiosulfato 5 min
7. Lavar
8. Contraste 5 min
9. Lavar
10. Deshidratar, aclarar y montar.
RESULTADOS
Sustancias reductoras de plata
Ncleos y fondo

negras
rosado

4.- TECNICA DE GRIMELIUS PARA ARGIROFILIA

PROCEDIMIENTO TECNICO
Se trata de una impregnacin argntica de un tiempo, con reduccin del nitrato de
plata con hidroquinona. Se recomienda post fijar las muestras en Bouin.

FIJACIN : las muestras fijadas en formol, se recomienda post fijarlas en Bouin

SOLUCIONES
A. Tampon acetato 0,1M pH 5,8 (ver gua de TH)
B. Solucin de impregnacin.
Nitrato de plata 0,5% en tampn acetato
C. Solucin reductora de Bodian.
Sulfito de sodio anhidro 5g + hidroquinona 1+ en 100 ml de agua destilada
D. Solucin fijadora
Tiosulfato de sodio 2%
PROTOCOLO
1. Desparafinar e hidratar hasta en agua destilada
2. Lavar 4 veces en agua destilada
3. Solucin de impregnacin por 3 horas a 60c
4. Solucin reductora de Bodian por 5 min a 60c. Debe aparecer color negro.
5. Lava r en agua destilada
6. Fijar por 30 segundos
7. Solucin de impregnacion 30 min a T. ambiente
8. Transferir a Solucin Bodian por 5 minutos (recin preparada)
9. Lavar
10. Fijar 20 segundos
11. Lavar
12. Deshidratar, aclarar y montar.
RESULTADOS
Clulas argirfilas
Clulas alfa 2 de islotes de pancreticos

negro
negro

ESTRUCTURAS ARGIROFILAS
La capacidad de atraer iones plata e impregnarse con plata metlica en los protocolos se
denomina argirofilia. Estos iones plata atrados al tejido son posteriormente precipitados a
plata metlica por reductores externos (hidroquinona por ejemplo).
Se demuestran en tincines de Bielchowsky, Sevier-Munger y Grimelius
ESTRUCTURAS ARGENTAFINES

La capacidad de algunas estructuras de precipitar la plata metlica en un paso nico sin

necesidad de agentes reductores externos se denomina argentafinidad. Son argentafines
la melanina y algunas clulas endocrinas (granulaciones entero cromafines) .El mecanismo
preciso que desencadena esta reaccin no est del todo claro, pero parece depender de la
presencia de 5-hidroxitriptamina la que es convertida a terahidro-4-carbonila por el
formol. Todas las estructuras argentafines son argirfilas, pero no al revs Se demuestran
con tinciones como Masson- Fontana. Es importante tener la precaucin de no utilizar
fijadores con alcohol, pues estos disuelven las granulaciones argnticas.
RECUPERACIN DE LAMINAS SOBRETEIDAS.
Si despus de diferenciar las lminas, se ven sobre teidas, se puede diferenciar y eliminar
total o parcialmente la impregnacin argntica. Las lminas se sumergen en cianuro de
potasio 0,1 o 0,5% durante 5 a 10 minutos o bien en una solucin de permanganato de
potasio al 2 a 5%, luego un lavado en abundante agua destilada. Se someten a re
impregnacin las lminas.

Bibliografa

Sheehan, Dezna; Hrapchak, Barbara. Theory and practice of Histotechnology (2 Ed.

edicin). The C.V. Mosby Company.
ARP, ed. Mtodos Histotecnolgicos. Instituto de patologa de las Fuerzas Armadas
de los EEUU (AFIP).