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CRISTALIZAO DE MACROMOLCULAS
BIOLGICAS

Prof. Dr. Walter Filgueira de Azevedo Jr.


Laboratrio de Sistemas Biomoleculares.
Departamento de Fsica-Instituto de Biocincias, Letras e Cincias
Exatas-UNESP, So Jos do Rio Preto. SP.
www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br

2004

ndice
1. Introduo.......................................................................................................

2. Princpios gerais para cristalizao de macromolculas biolgicas........ 5


2.1. Pureza da macromolcula biolgica......................................................... 6
2.2. Pureza da macromolcula biolgica......................................................... 7
2.3. Nucleao, crescimento e cessao de crescimento................................ 7
3. Conceitos sobre solubilidade.......................................................................

4. Solubilidade de macromolculas biolgicas............................................. 8


5. Salting-in e salting-out.................................................................................. 11
6. Diagramas de fase de macromolculas biolgicas.................................... 14
7. Tcnicas de cristalizao de macromolculas biolgicas.......................... 16
8. O Mtodo da matriz esparsa ( Fatorial)....................................................... 17
8.1. Aplicao do mtodo da matriz esparsa................................................... 19
9. O Mtodo da matriz esparsa passo a passo................................................ 21
9.1. Regras gerais para aplicao do mtodo da matriz esparsa................... 21
9.2. Experimento inicial de cristalizao usando-se o mtodo da matriz esparsa
..............................................................................................................................

22

9.3. Melhoria das condies de cristalizao.................................................. 23


9.4. Protocolo para cristalizao da purina nucleosdeo fosforilase (PNP)
utilizando Hanging Drop (gota suspensa)................................................. 24
9.5. Protocolo para cristalizao da lisozima utilizando Hanging Drop (gota
suspensa).............................................................................................................

25

10. Referncias bibliogrficas........................................................................... 27

1. Introduo
A vida a reao qumica mais complexa da natureza e neste cenrio as
protenas desempenham o papel principal. O estudo estrutural de protenas
forneceu a base para comearmos a entender a vida em termos moleculares. Desde
da resoluo da primeira estrutura de protena em 1959 at os dias de hoje, onde
quase trinta mil estruturas de macromolculas biolgicas tiveram sua estrutura
tridimensional determinada e suas coordenadas atmicas esto depositadas no
banco de dados de estruturas (Protein Data Bank)( www.rcsb.org/pdb/), um
grande desenvolvimento nos mtodos de resoluo de estruturas tem permitido
que o tempo de resoluo de estruturas fosse reduzido de anos para meses e em
alguns casos dias e at mesmo horas. A principal tcnica para resoluo da
estrutura tridimensional de macromolculas biolgicas como um todo tem sido a
cristalografia por difrao de raios X, e at hoje a tcnica principal para
investigao da estrutura tridimensional de macromolculas biolgicas (Blundell
and Johnson, 1976; Drenth, 1994). Os principais passos na resoluo de estruturas
por cristalografia de difrao de raios X esto descritos na figura 1.
Entre os principais passos da resoluo de protenas descreveremos a
cristalizao no presente texto. O principal objetivo da cristalizao de uma
macromolcula biolgica, tal como protena, cido nuclico ou vrus, o estudo
estrutural destas macromolculas, por mtodos de difrao de raios X. Tal estudo
estrutural fundamental para o entendimento molecular de vrios mecanismos
biolgicos.
Os cristais de macromolculas biolgicas so diferentes dos cristais de
pequenas molculas em vrios aspectos. Eles diferem em tamanho, cristais de
macromolculas so, normalmente bem menores, dificilmente excedem 1mm3 em
volume. Uma outra diferena que cristais de macromolculas biolgicas so bem
mais frgeis e possuem um alto contedo de solvente. A fragilidade dos cristais de
macromolculas biolgicas uma conseqncia das fracas interaes entre as

macromolculas biolgicas dentro da rede cristalina e do alto contedo de solvente


nestes cristais (de 20% a mais de 75%). Cristais de protenas podem ter contedo de
solvente de at 75 % do volume em alguns cristais, como da Purina Nucleosdeo
Fosforila humana (De Azevedo et al., 2003). As ligaes fracas que mantm a
estrutura cristalina destas macromolculas biolgicas so do tipo hidrofbico e
ligao de hidrognio. Por esta razo, os cristais de macromolculas biolgicas
devem ser mantidos em um ambiente saturado de solvente, caso contrrio, a
desidratao conduzir quebra destas ligaes fracas e, conseqente, a destruio
dos cristais. O alto contedo de solvente, contudo, tem conseqncias teis, pois os
canais de solvente nos cristais de macromolculas biolgicas permitem a difuso
de pequenas molculas, uma propriedade usada na preparao de derivados
isomorfos e de complexos binrios de protenas e ligantes. Uma outra caracterstica
dos cristais de macromolculas biolgicas so as grandes dimenses de suas celas
unitrias, se comparadas com as dimenses das celas unitrias das pequenas
molculas. Cristais de macromolculas biolgicas podem ter parmetros de cela
unitria de at algumas dezenas de milhares de ngstrons (Ducruix and Gieg,
1992; Usha., et al, 1984).

2. Princpios gerais para cristalizao de macromolculas biolgicas


Uma das partes mais crticas na resoluo da estrutura de uma
macromolcula biolgica a cristalizao da mesma. Os principais passos
envolvidos na resoluo da estrutura a nvel atmico de uma macromolcula
biolgica esto mostrados na figura 1.
(3)
(2)
(1)

(4)

Figura 1. Principais passos na resoluo de uma estrutura por biocristalografia. 1.


Cristalizao. 2. Coleta de dados de difrao de raios X. 3. Resoluo da estrutura. 4.
Anlise da estrutura.

E entre todos estes passos a cristalizao o menos entendido.


Biocristalizao, como qualquer cristalizao, um processo de mltiplos

parmetros, que envolve os trs passos clssicos da cristalizao, que so:


nucleao, crescimento e cessao de crescimento. O que faz com que o processo de
cristalizao de macromolculas biolgicas seja diferente que o mesmo envolve
um nmero de parmetros, muito maior do que aquele envolvido no crescimento
de cristais de pequenas molculas, e as propriedades fsico-qumicas peculiares
destes compostos. Por exemplo, a estabilidade tima das macromolculas
biolgicas em um meio aquoso est restrita a uma faixa estreita de pH. Mas a
principal diferena entre crescimento de cristais de pequenas molculas e cristais
de macromolculas biolgicas a flexibilidade conformacional e a versatilidade
qumica dessas macromolculas e, conseqentemente, sua maior sensibilidade s
condies externas. Para um planejamento racional das condies de cristalizao
necessrio o controle dos parmetros fsicos e biolgicos. A seguir descreveremos
trs dos principais parmetros a serem controlados num experimento de
cristalizao de uma macromolcula biolgica.

2.1. Pureza da macromolcula biolgica


Devido ao fato que as macromolculas so extradas de complexas misturas
biolgicas, tais como as clulas, a purificao um passo importante para a
cristalognesis. Pureza, entretanto, no uma condio primordial para a
cristalizao, visto que, cristais de macromolculas biolgicas podem ser obtidos
de misturas de macromolculas, onde temos uma ou mais macromolculas
biolgicas como contaminante. Mas, tais cristais, so na maioria das vezes bem
pequenos, ou ento, crescem como massas policristalinas, que no so adequadas
para estudos cristalogrficos por difrao de raios X. Para o uso de tcnicas de
difrao de raios X necessrio o uso de cristais com a menor dimenso por volta
de 0,2mm, contudo com uso de fontes de raios X bem intensa, tais com sncrotrons,
tem sido possvel a resoluo de estruturas de macromolculas biolgicas cujos
cristais apresentavam dimenses menores que 0,1mm. Como regra geral, pode-se

dizer que, a baixa pureza da macromolcula biolgica a causa mais comum da


falta de sucesso na cristalizao da mesma.

2.2. Solubilidade e supersaturao


Para crescer cristais de qualquer composto, as molculas ou ons tm de ser
trazidos a um estado de supersaturao, um estado que termodinamicamente
instvel, no qual pode se desenvolver numa fase amorfa ou cristalina quando este
retornar ao equilbrio. Supersaturao pode ser alcanada pela evaporao lenta do
solvente ou pela variao de alguns dos parmetros como temperatura, pH e fora
inica. Disto segue que, o conhecimento das solubilidades macromoleculares um
pr-requisito para o controle das condies de cristalizao. Assim, como as bases
tericas da solubilidade so ainda controversas, especialmente no que tange efeitos
dos sais, os dados sobre a solubilidade quase sempre se originam de determinaes
experimentais. Nos ltimos anos, mtodos quantitativos permitiram tais
determinaes, usando pequenas quantidades de protena (Mikol & Gieg, 1989;
Ries-Kautt & Ducruix, 1989). O principal resultado destes mtodos foi a
demonstrao experimental da complexidade do comportamento da solubilidade,
enfatizando a importncia da determinao de diagramas de fase para o
planejamento

racional

de

experimentos

de

crescimento

de

cristais

de

macromolculas biolgicas.

2.3. Nucleao, crescimento e cessao de crescimento


Devido ao fato que protenas e cidos nuclicos necessitam pH e fora inica
definidas para a sua estabilidade e funo, cristais de macromolculas biolgicas
tm de ser crescidos a partir de solues aquosas complexas. A cristalizao
comea com a fase de nucleao (i.e. a formao dos primeiros agregados
ordenados) que seguida pela fase de crescimento. As condies para se atingir a
nucleao so algumas vezes difceis de se repetir, e desta forma os procedimentos
de semeao com um material cristalino pr-formado se faz necessrio. Em muitos

casos este o nico mtodo para se obter resultados reprodutveis. A nucleao


requer um estado de supersaturao maior do que aquele da fase de crescimento.
A velocidade da cristalizao aumenta com a supersaturao, desta forma
nucleao e crescimento deveriam ser desacoplados, o que quase nunca realizado
concientemente.
A cessao de crescimento de uma macromolcula biolgica pode ter
diversas causas, desconsiderando as triviais, como remoo da macromolcula do
meio de cristalizao, temos causas tais como, defeitos de crescimento,
envenenamento das faces, ou envelhecimento da macromolcula.

3. Conceitos sobre solubilidade


Para se cristalizar uma macromolcula biolgica em um dado solvente,
necessrio levar a soluo a um estado de supersaturao. Uma macromolcula
biolgica segue as mesmas leis da termodinmica, como qualquer outro tipo de
molcula (inorgnica ou orgnicas) no que se refere supersaturao, nucleao, e
crescimento de cristais (Boistelle & Astier, 1988). Todavia, macromolculas
biolgicas apresentam peculiaridades, porque as interaes necessrias para
solubiliz-las num solvente so similares, e podem ser competitivas com as
interaes intermoleculares que so responsveis pela estrutura tridimensional da
macromolcula.

4. Solubilidade de macromolculas biolgicas


Em geral, a solubilidade de um composto qumico em um solvente, a uma
dada temperatura, definida como a quantidade de composto dissolvida em uma
soluo em equilbrio com um excesso de composto no dissolvido; e.g. 25oC, o
sal sulfato de amnia se dissolve at que sua concentrao atinja 4,1 moles por litro
de gua, o excesso permanece no dissolvido. Mais sal pode ser dissolvido quando
se eleva a temperatura, e quando a temperatura trazida de volta a 25oC, a soluo

atinge supersaturao. O excesso de sal cristalizar, at que a concentrao do sal


atinja seu valor de solubilidade 25oC (4,1 moles por litro de gua).
No caso de macromolculas biolgicas, a solubilidade definida tambm
pelas caractersticas do solvente. Como o solvente consiste usualmente de gua a
qual foram adicionadas diversas substncias qumicas para levar a soluo at um
dado pH (tampo), fora inica (sais), e eventualmente outros aditivos, estes
compostos podem afetar a solubilidade da macromolcula biolgica das seguintes
formas:
(a) diretamente, pela interao com diferentes grupos funcionais da
macromolcula e eventualmente modificando a conformao da
macromolcula. Trabalhar em diferentes condies de tampo e sais
como trabalhar como uma macromolcula diferente do ponto de vista
fsico-qumico.
(b) indiretamente, atravs da modificao das propriedades fsico-qumicas
do solvente; e.g. variao do pH modifica a carga lquida da protena e
desta forma a natureza do polieletrlito. Alm disso, se pontes salinas
esto envolvidas na estrutura tridimensional, estas podem se quebrar e a
macromolcula pode modificar sua conformao.
Uma macromolcula biolgica um polmero de aminocidos ou
nucleotdeos, os quais esto enovelados em uma estrutura tridimensional:
principalmente por interaes dipolo-dipolo, ligaes de hidrognio (e.g.
C=O+H-N), e por interaes de van der Waals;
por algumas ligaes covalentes ( pontes S-S);
eventualmente por pontes salinas ( e.g. -COO- +H3N-) entre resduos carregados.
Protenas apresentam as cadeias laterais hidrofbicas preferencialmente no
seu interior enquanto as cadeias laterais hidroflicas se localizam principalmente na

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sua superfcie. Desta forma as protenas podem sem consideradas como


polieletrlitos capazes de se dissolverem em gua.
A estabilidade das macromolculas biolgicas em soluo baseia-se na
competio das interaes solvente-soluto com interaes intramoleculares, as
quais so necessrias para manter a estrutura da macromolcula. O balano das
interaes que controlam a solubilidade e/ou a conformao de uma
macromolcula podem ser modificadas por (von Hippel & Schleich, 1969):
(a) Temperatura. Um aumento da temperatura aumenta a desordem das molculas
de solvente e permite tambm que conformaes da macromolcula de mais
alta energia livre total se formem.
(b) pH. Como a temperatura, variaes no pH afetam ambos soluto e solvente.
Todavia, alteraes das concentraes de H+ e OH- so minoritrias se
comparadas com a protonao e desprotonao de grupos da macromolcula.
(c) Sais. Sais podem agir de diferentes formas. (i) Eles so responsveis pela fora
inica, e desta forma afetam as interaes eletrostticas da macromolcula por
meio de blindagem de cargas. (ii) Eles podem formar interaes eletrostticas
diretas com resduos carregados na superfcie das macromolculas. (iii) Sais
podem agir atravs de interaes monopolo-dipolo com grupos dipolares da
macromolcula biolgica.
(d) Competidores de ligaes de hidrognio. Molculas que possuem um potencial
para formarem ligaes de hidrognio competem alta concentrao (>4M)
com ligaes de hidrognio da gua e ligaes de hidrognio intramoleculares
na protena.
(e) Aditivos hidrofbicos. Eles podem agir diretamente com partes hidrofbicas da
macromolcula e podem tambm alterar a estrutura do solvente. Detergentes
no-inicos agem desta forma (McPherson, et al., 1986).
(f) Solventes orgnicos. A adio de solventes orgnicos implica na modificao da
constante dieltrica e conseqentemente variaes em diversas interaes.

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5. Salting-in e salting-out
A dependncia da solubilidade da protena com a concentrao salina foi
estudada em termos dos fenmenos de salting-in e salting-out (Green, 1932). O
aumento da solubilidade de uma macromolcula biolgica a baixa concentrao
salina (<0,5M) chamada salting-in. Este fenmeno explicado pelas interaes
eletrostticas no especficas entre a macromolcula carregada e as espcies inicas
do sal. Segundo a teoria de Debye-Hckel para solues inicas, um aumento na
fora inica reduz a atividade dos ons em soluo e aumenta a solubilidade do
composto inico. Uma forma alternativa de se tratar este fenmeno considerar o
salting-in como o resultado da competio entre grupos carregados na superfcie da
macromolcula e os ons em soluo. Na ausncia de ons de solvente a
macromolcula precipita devido atrao de eletrosttica entre cargas opostas em
diferentes partes da macromolcula. Se os ons so adicionados soluo eles
blindam os grupos carregados na macromolcula e aumentam a sua solubilidade
(figura 2).
Outra forma de precipitar uma macromolcula pela adio de sal (saltingout), este serve para imobilizar as molculas de gua, desta forma aumentando a
concentrao efetiva da macromolcula, ou seja, diminuindo a sua solubilidade.
No fenmeno de salting-out a solubilidade da macromolcula biolgica
governada principalmente por efeitos hidrofbicos. De acordo com a equao
linear emprica de Cohn-Green a solubilidade da macromolcula numa situao de
salting-out decresce da seguinte forma:
log S = - KS m, ou log S = - KS

(1)

onde S a solubilidade da macromolcula biolgica, o intercepto para m=0,


uma constante para altas concentraes salinas e funo da carga lquida da
macromolcula e altamente dependente do pH da soluo ( no ponto isoeltrico
(pI), tende a zero). A magnitude de , bem como a distribuio de cargas, variam

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com a temperatura. KS KS so constantes de salting-out. So independentes da


temperatura e pH, mas dependem da natureza dos sais presentes na soluo. A
molaridade indicada por m. E a fora inica por , esta fora leva em conta a
valncia Zi de todos os ons presentes na soluo. A expresso da fora inica
dada por:
= ( mi Zi).

(2)

Figura 2. Fenmeno de salting-in. a) Macromolcula biolgica sem a presena de ons


dissolvidos na soluo. A atrao eletrosttica entre os grupos carregados em duas os mais
macromolculas causa a aglomerao e precipitao. b) ons blindam a interao
eletrosttica entre as macromolculas, aumentando a solubilidade.
Um composto adicionado a um sistema macromolcula biolgica + gua
(soluto+solvente) pode se ligar macromolcula (ligao preferencial) ou ser
excludo (excluso preferencial). A interao lquida do salting-out excluso
preferencial, mesmo que molculas possam se ligar macromolcula biolgica.
A variao da solubilidade das macromolculas biolgicas (S), na faixa
completa de concentrao salina, reflete o efeito de ambas interaes, eletrosttica e

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hidrofbica a primeira sendo predominante baixa concentrao salina, e a


segunda a alta concentrao salina como mostrado na figura 3. Isto expresso pela
seguinte equao (Green, 1932):
log S = log So + ki C1/2 - ko C,

(3)

onde ki e ko so as constantes de salting-in e salting-out respectivamente; So a


solubilidade da macromolcula biolgica em gua pura; e C a concentrao molar
salina.

Figura 3. Contribuio dos efeitos eletrosttico e hidrofbico sobre a solubilidade S,


normalizada em relao solubilidade em gua pura So.

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6. Diagramas de fase de macromolculas biolgicas


Como a solubilidade de uma macromolcula biolgica depende de diversos
parmetros podemos avaliar a importncia de um dado parmetro a partir de um
diagrama bidimensional. Este diagrama uma representao da solubilidade
(mg/ml ou mM de macromolcula em soluo) como funo um parmetro, com
todos outros sendo mantidos constantes. Um diagrama deste tipo est
representado na figura 4, e compreende as seguintes zonas:
(a) A curva de solubilidade (S) separa as zonas supersaturadas e hiposaturadas.
Em um experimento onde as concentraes do agente de cristalizao e da
macromolcula biolgica correspondem s condies da curva S, a soluo
saturada da macromolcula est em equilbrio com a macromolcula
cristalizada. Isto corresponde situao ao final do processo de crescimento do
cristal a partir de uma soluo supersaturada, ou da dissoluo de cristais em
uma soluo hiposaturada.
(b) Abaixo da curva de solubilidade (S) a soluo est hiposaturada e a
macromolcula biolgica nunca ir cristalizar.
(c) Acima da curva de solubilidade (S), a concentrao da macromolcula biolgica
maior que a concentrao no equilbrio para uma dada concentrao salina.
Isto corresponde a uma zona de supersaturao. Dependendo da cintica para
se atingir o equilbrio e do nvel de supersaturao, esta regio pode ser
dividida em trs zonas: (i) A zona de precipitao onde o excesso de
macromolcula imediatamente se separa da soluo em um estado amorfo.(ii)
A zona de nucleao onde o excesso da macromolcula biolgica se separa
sob a forma cristalina. Prxima zona de precipitao, a cristalizao pode
ocorrer com um chuveiro (shower) (uma grande quantidade de cristais) que
podem ser confundidos com precipitado amorfo, pois os cristais apresentam
dimenses bem reduzidas assemelhando-se, muitas vezes, a um p.(iii) Na
zona metaestvel uma soluo supersaturada pode no nuclear, ou seja, pode
no gerar cristais, por um longo perodo de tempo, a menos que a soluo seja

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mecanicamente pertubada ou uma semente (um pequeno cristal) seja


introduzida, processo conhecido como semeadura (seeding). Classicamente este
processo se divide em macrossemeadura (macroseeding), onde um cristal de
dimenses macroscpicas introduzido uma soluo na zona metaestvel,
e microssemeadura (microseeding), onde normalmente vrios cristais bem
pequenos so inseridos numa soluo na zona metaestvel, contudo esta
diferenciao entre macro e micro um tanto arbitrria, sendo que o principal
que se tem uma ou mais sementes inseridas numa soluo com a
macromolcula biolgica na zona metaestvel. Esta zona corresponde,
idealmente, ao crescimento de cristais sem a nucleao de novos cristais.
Uma soluo saturada contm uma quantidade de soluto tal que no pode
haver crescimento ou dissoluo se cristais so adicionados soluo, ou seja,
qualquer ponto sobre a curva (S) no diagrama de fases esquemtico mostrado na
figura 4. Isto corresponde ao equilbrio termodinmico entre as duas fases (lquido
slido). O potencial qumico () de cada espcie qumica, i, a mesma em ambas
fases (cristal e soluo):
ic = is = io + RT ln ci

(4)

onde io o potencial qumico padro, o coeficiente de atividade, e ci a


concentrao da espcie qumica i. Isto verdadeiro para qualquer espcie qumica
( macromolcula, gua etc). A supersaturao alcanada quando o potencial
qumico do soluto em soluo maior que o do cristal. Isto pode ser atingido
atravs da variao de alguns dos parmetros que afetam a solubilidade. A
supersaturao a fora motriz para a cristalizao; e definida como a diferena
do potencial qumico entre a soluo e o cristal. Entretanto, as aproximaes mais
comuns so as relaes c/cs e (c-cs)/cs onde c a concentrao da protena e cs a
concentrao do soluto em uma soluo saturada, ou seja, um ponto sobre a curva
de solubilidade(S) da figura 4. Estas quantidades tm a vantagem de serem

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adimensionais. Deve-se notar que o valor da supersaturao (definido como a


relao entre a concentrao de macromolcula biolgica c e a solubilidade cs )
realmente encontrada nos experimentos de cristalizao de macromolculas
biolgicas fica na faixa de 2 a 10. Esta faixa bem mais alta que aquela encontrada
para crescimento de cristais de pequenas molculas.

Figura 4. Descrio esquemtica de um diagrama bidimensional da solubilidade de uma


macromolcula biolgica.

7. Tcnicas de cristalizao de macromolculas biolgicas


Existem muitas tcnicas para a cristalizao de macromolculas biolgicas,
todas tm como objetivo trazer a soluo da macromolcula biolgica a um estado
de supersaturao. As tcnicas mais utilizadas so difuso de vapor e dilise. Ns
descreveremos aqui a tcnica de difuso de vapor que atualmente a mais
utilizada. Esta tcnica foi utilizada pela primeira vez na cristalizao da tRNA

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(Hampel et al., 1968). Uma gota contendo a macromolcula biolgica a ser


cristalizada em tampo com o agente de cristalizao e aditivos equilibrada
contra um reservatrio contendo a soluo do agente de cristalizao a uma
concentrao mais alta do que na gota. O equilbrio prossegue por meio da difuso
das espcies volteis (gua e solventes orgnicos) at que a presso de vapor na
gota se iguale quela do reservatrio. Se o equilbrio ocorre por meio de troca da
gua (da gota para o reservatrio), isto leva a uma diminuio do volume da gota,
e conseqentemente a um aumento na concentrao de todos os constituintes da
gota de cristalizao. Para espcies qumicas com presso de vapor maior que a
presso de vapor da gua, a troca ocorre do reservatrio para a gota. Os mesmos
princpios se aplicam para gotas suspensas (hanging drops), gotas sentadas (sitting
drops) e gotas sanduches (sandwich drops).

Figura 5. Representao esquemtica da gota suspenda ( hanging drop), gota sentada (


sitting drop) e gota sanduche (sandwich drop).

8. O Mtodo da matriz esparsa ( fatorial)


Com o aumento do nmero de macromolculas biolgicas cristalizadas com
sucesso, tornou-se bvio que muitas das condies de cristalizao se
assemelhavam, ou seja, havia uma concentrao de resultados positivos de

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cristalizao de macromolculas biolgicas usando-se nmero limitado de


precipitantes, tampes e aditivos. Isto levou proposio de diversos mtodos de
cristalizao (Carter & Carter, 1979), onde um nmero limitado de condies de
cristalizao eram tentados, usando-se pequenas quantidades da macromolcula
biolgica, geralmente por volta de poucos miligramas. A partir da observao dos
resultados preliminares destes experimentos era possvel determinar que tampo,
aditivo e agente precipitante seriam os mais favorveis e a partir da proceder-se a
sucessivos melhoramentos at se conseguir cristais adequados, ou ainda, em casos
favorveis, obter-se cristais adequados j na primeira tentativa com as condies
padres. Dentro deste raciocnio a Dra. Jaru Jancarick da UC Berkeleley props o
mtodo da matriz esparsa ( Jancarick & Kim, 1991) onde diversas condies
diferentes so tentadas para se cristalizar a macromolcula biolgica.
Visto que, o nmero de variveis que afetam a cristalizao, tais como,
concentrao, temperatura, pH, fora inica, aditivos especficos e precipitantes,
grande e combinatria, o nmero total de possveis condies de cristalizao a
serem testadas to grande que uma procura completa com todas as condies de
cristalizao em potencial seria invivel.
Tabela 1. Parmetros da matriz de cristalizao (Jancarik & Kim, 1991)
Agentes precipitantes
Volteis

No-Volteis

Sais

MPD
PEG 400
PEG 4000
PEG 8000

Tartarato de Na,K
Fosfato de NH4
Sulfato de NH4
Acetato de Na
Sulfato de Li
Formiato de Na
Fosfato de Na,K
Citrato de Na
Formiato de Mg

2-Propanol

Mistura
Sulfato de NH4 + PEG
2-Propanol + PEG

Faixa de pH:
4,6; 5,6; 6,5; 7,5 e 8,5
Aditivos: Cloreto de Ca, Citrato de Na, Cloreto de Mg, Acetato de NH4, Sulfato de NH4, Acetato de
Mg, Acetato de Zn e Acetato de Ca.

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No mtodo da matriz esparsa foram escolhidas trs categorias de


parmetros que afetam a cristalizao como varveis principais, so estes: pH e
materiais tampes, aditivos e agentes precipitantes. Para a varivel pH e tampes
foram escolhidos cinco diferentes pHs: 4,6; 5,6; 6.5; 7,5 e 8.5, e para cada valor de
pH foi escolhido o tampo qumico que tinha provado ser o mais adequado para a
cristalizao de protenas no passado. A escolha de aditivos tambm foi baseada na
experincia passada de muitos laboratrios. Para os agentes precipitantes foram
escolhidos quatro tipos: 2-propanol como agente voltil, 2-metil-2,4-pentanediol
(MPD) e polietileno glicol (PEG) como agentes no-volteis e vrios agentes de
salting-out. Todos esto listados na tabela 1.
Por tentativa e erro a matriz multimensional foi simplificada eliminando-se
as condies que podem ser parcialmente representadas por resultados de outras
condies, a proposta original apresenta 58 condies. Comercialmente a empresa
Hampton Research, (USA) simplificou o mtodo original, e disponibiliza um kit
com 50 condies de cristalizao. Comercialmente h outros kits usando-se como
princpio a variao de pH, fora inica e agentes precipitantes.

8.1. Aplicao do mtodo da matriz esparsa


Aps preparar as 58 diferentes solues, ns usamos o mtodo de hanging
drops, para testar as condies de cristalizao. Colocamos 0,7ml de cada uma
destas solues em cada um dos reservatrios de uma caixa plstica Linbro (Linbro
modelo 76-033-05). Estas caixas foram originalmente desenhadas para cultura de
clulas e possuem 24 reservatrios. necessrio o uso de trs caixas Linbro, sendo
que a terceira ter s 10 reservatrios so usados, o restante dos reservatrios da
terceira caixa podem ser usados em experimentos futuros. Teremos ento 58
reservatrios com 0,7 ml de cada uma das solues de cristalizao. O volume da
soluo do poo pode variar, ficando normalmente na faixa de 0,5 a 1,0 ml.

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Figura 6. Seqncia de eventos para a montagem de uma gota de cristalizao: a)


Coloca-se 1-2l da soluo da macromolcula biolgica sobre a lamnula de vidro. b)
Adiciona-se 1-2l da soluo do reservatrio gota com a soluo da macromolcula
biolgica. c) Ao final temos uma gota (2+2) com a soluo de macromolcula biolgica mais
a soluo do reservatrio.
Colocamos, em seguida, 1-2 l da soluo da macromolcula biolgica em
uma lamnula de vidro de 22 x 22 mm que foram siliniconizadas com 1% Prosil-28
( PCR Inc., Gainseville, Florida. U.S.A) e 1-2 l da soluo do reservatrio listada
no apndice 1 (figura. 6). Cobrimos cada um dos reservatrios das caixas Linbro
com as respectivas lamnulas de vidro onde temos 1-2l de soluo da
macromolcula biolgica mais 1-2l de soluo do reservatrio, usando uma graxa
de vcuo para vedar os reservatrios com as lamnulas de vidro. Este tipo de
composio o que convencionou chamar-se de gota (2+2). Nesta situao,
teremos uma concentrao menor de precipitante na gota, do que no reservatrio.
E a difuso de vapor dgua se proceder da gota para o reservatrio. No caso em
que as espcies qumicas do reservatrio possuam presso de vapor menor que a

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presso de vapor dgua, isto far com que a concentrao da soluo de


macromolcula biolgica bem como das outras espcies qumicas presentes na gota
aumente, o que em casos favorveis levar a macromolcula biolgica a uma
condio de supersaturao favorvel formao dos primeiros agregados
cristalinos (zona de nucleao). Tal composio (2l + 2l) pode ser mudada, bem
como o volume inicial da gota, contudo em um experimento de cristalizao devese ter em mente o uso racional da macromolcula biolgica, principalmente nos
experimentos preliminares de cristalizao, de forma que, grandes volumes de
gotas de cristalizao devem ser evitados nos experimentos preliminares.
Na proposio original do mtodo recomenda-se que a macromolcula
biolgica a ser cristalizada seja dissolvida em gua ou no seu tampo original e
trazida a uma concentrao de aproximadamente 10 mg/ml. Um parmetro que
pode causar problemas a concentrao inicial de 10mg/ml, pois muitas
macromolculas biolgicas no conseguem atingir tal concentrao sem precipitar,
neste caso recomenda-se usar a mais alta concentrao possvel prxima a
10mg/ml.

9. O Mtodo da matriz esparsa passo a passo


O uso constante do mtodo da matriz esparsa no Laboratrio de
Biocristalografia da UC Berkeley levou confeco de um conjunto de regras
bsicas utilizadas nos experimentos de cristalizao de uma nova macromolcula
biolgica. Tais regras e procedimentos foram desenvolvidos pela Dra. J. Jancarick,
as quais descreveremos a seguir, pois podem ser de grande utilidade em qualquer
projeto de cristalizao de uma nova macromolcula biolgica.

9.1. Regras gerais para aplicao do mtodo da matriz esparsa


a) Nunca deixe qualquer gota de cristalizao clara, ou seja, sem precipitado
amorfo ou cristais, aps a aplicao do mtodo da matriz esparsa, pois tal
procedimento no lhe fornece qualquer tipo de informao. Assim, uma

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semana aps ter-se preparado o primeiro experimento de cristalizao usandose as condies descritas anteriormente (seo 8), aumente a concentrao do
precipitante no reservatrio de todas as gotas que no apresentaram cristais
nem precipitado. Isto deve ser feito em passos de 5% a cada trs dias, ou seja,
aumenta-se a concentrao do precipitante no reservatrio 5% acima da
concentrao anterior a cada trs dias, at que se consiga cristais ou precipitado
amorfo. O aumento da concentrao de precipitante no reservatrio causa uma
quebra do equilbrio termodinmico que foi provavelmente atingido aps uma
semana de feito o experimento de cristalizao. Tal procedimento pode levar a
macromolcula biolgica condio de supersaturao e nucleao.
b) O procedimento de Esperar e Ver funciona melhor que o procedimento Use
todo o material (macromolcula biolgica) agora, porque no primeiro
procedimento voc obtm um retorno do primeiro experimento de cristalizao
o que permite o uso de menores quantidades de material nos prximos
experimentos. Por esta razo sempre espere uma semana antes de fazer um
outro experimento de cristalizao com a mesma macromolcula biolgica.

9.2. Experimento inicial de cristalizao usando-se o mtodo da


matriz esparsa
Passo 1) Se a macromolcula biolgica tiver de ser transportada mantenha-a em
gelo (sem congel-la) e adicione glicerol at 50% em volume e armazene-a em 20oC. Use o necessrio para o experimento de cristalizao inicial, geralmente entre
1 e 2 mg o suficiente, e coloque o restante de volta a -20oC. A fim de eliminar o
glicerol da soluo estoque, toma-se o volume desejado da macromolcula
biolgica em glicerol e adiciona-se um volume igual do tampo, ento dialisa-se
contra o tampo.
Passo 2) concentre a protena no mesmo tampo e acrescente DTT, ou EDTA se
necessrio. Se existe NaCl no tampo melhor elimin-lo, desde que o NaCl no
seja necessrio para a solubilidade da macromolcula biolgica.

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Passo 3) Faa o fatorial 4oC e a temperatura ambiente, se houver material


suficiente.
Passo 4) Examine a gotas imediatamente aps montado o experimento de
cristalizao e anote:

a) o nmero das gotas com precipitado.

b) h presena de sujeiras.
c) h presena de microcristais.
Passo 5) Confira as gotas diariamente por uma semana, fazendo as mesmas
anotaes do passo 4. E verifique tambm o surgimento de algum bom cristal.
importante verificar como a macromolcula biolgica se comporta com o tempo
em cada gota de cristalizao.
Passo 6) Supondo que pequenos cristais se formaram em uma ou mais gotas do
experimento inicial de cristalizao, deve-se concentrar esforos nos melhores
cristais e tentar a melhoria das condies de cristalizao dos mesmos. Os
procedimentos para a melhoria das condies de cristalizao sero mostrados a
seguir.

9.3. Melhoria das condies de cristalizao


Consideremos o seguinte cenrio onde temos pequenos cristais obtidos nos
experimentos iniciais, com ou sem precipitado amorfo acompanhando-os. Para a
melhoria dos cristais e eliminao do precipitado amorfo seguimos os seguinte
passos:
Passo 1) Abaixe a concentrao da macromolcula e tente as mesmas condies em
que obteve os primeiros cristais. Tente varias concentraes, por exemplo, se os
primeiros cristais foram conseguidos com a concentrao de 10mg/ml tente 9, 8, 7,
6 e 5 mg/ml.
Espere por uma semana e se no houver melhora nos cristais,
Passo 2) Mantenha a concentrao da macromolcula biolgica constante e abaixe
a concentrao do agente precipitante.
Espere por uma semana e se no houver melhora nos cristais,

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Passo 3) Adicione 0,2M NaCl ao reservatrio. Se a gota de cristalizao ficar


completamente clara (sem precipitado ou cristais) aps uma semana, aumente a
concentrao do precipitante em incrementos de 5% a cada 3 dias. Se a gota
continuar sem cristais ou precipitado 0,2M de NaCl foi demasiado, tente
novamente com 20mM NaCl o mesmo procedimento.
A eliminao do precipitado, se presente, importante visto que o mesmo
age como stio de nucleao e complica a manipulao futura do cristal.
Se no houve melhoria nos cristais pode-se tentar microssemeadura
(microseeding) caso tal tentativa no funcione pode-se tentar variar a temperatura,
caso o experimento foi realizado a 4oC, deve-se tentar em temperatura ambiente e
vice-versa.

9.4. Protocolo para cristalizao da purina nucleosdeo fosforilase


(PNP) utilizando hanging drop (gota suspensa)
O protocolo descrito a seguir visa a cristalizao da PNP humana.
Equipamentos e reagentes:
-

Placa Linbro;
PNP (De Azevedo et al., 2003) a 12mg/mL em tampo fosfato de potssio a
10 mM, pH 7,1 (soluo A);
40 % de sulfato de amnio em tampo citrato de sdio a 0,05 M, pH 5,3 (soluo
B);
Microfiltro de 0,22 m;
Graxa de vcuo;
Lamnula.

Mtodo:
1. Prepare a solues estoques de 40 % de sulfato de amnio em tampo
citrato de sdio a 0,05 M, pH 5,3 e PNP a 12mg/mL em tampo fosfato de
potssio a 10 mM, pH 7,1. Filtre a soluo com um microfiltro de 0,22 m;
2. Prepare uma placa Linbro;
3. Abastea os reservatrios da fileira A da placa Linbro com soluo B
variando de 15-40 % em passos de 5 %;

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4. Em uma lamnula, misture 1 L da soluo A com 1 L do reservatrio.


Rpido e em srie engraxe a borda dos reservatrios e cubra com a
lamnula;
5. Abastea os reservatrios da fileira B com soluo B variando de 19-29 % em
passos de 2 %;
6. Abastea os reservatrios da fileira C com soluo B variando de 15-20 %
em passo de 1 %;
7. Use a fileira D para duplicar ou testar parmetros particulares (por
exemplo, volume da gota para observar se a influncia nos efeitos cinticos
ou no crescimento);
8. Mantenha os experimentos a 18 C;
9. Observe os experimentos no dia seguinte;
Resultados.
Os cristais da PNP humana apareceram aps 24 horas e apresentam
dimenses aproximadas de 0,5 x 0,5 x 0,6 mm. A figura 7 mostra fotomicrografia
dos cristais na gota de cristalizao.

Figura 7. Fotomicrografia dos cristais da PNP humana.

9.5. Protocolo para cristalizao da lisozima utilizando Hanging


Drop (gota suspensa)
O protocolo descrito seguir visa a cristalizao da lisozima.
Equipamentos e reagentes:

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Placa Linbro;
lisozima 40mg/mL em acetato a 50 mM, pH 4,5;
NaCl 3 M ;
Microfiltro de 0,22 m;
Graxa de vcuo;
Lamnula.

Mtodo:
1. Prepare as solues estoques de NaCl a 3 M e lisozima a 40 mg/mL (2,74
mM) em acetato a 50 mM, pH 4,5. Filtre todas as solues com um
microfiltro de 0,22 m;
2. Prepare uma placa Linbro;
3. Abastea os reservatrios da fileira A com solues de NaCl variando de
0,5-1,5M em passos de 0,2 M;
4. Em uma lamnula, misture 4 L da soluo estoque com 4 L do
reservatrio. Rpido e em srie, engraxe a borda dos reservatrios e cubra
com a lamnula;
5. Abastea os reservatrios da fileira B com soluo de NaCl variando de 0,81,8 M em passos de 0,2 M. Repita o experimento na fileira B depois de diluir
a soluo estoque de protena metade para obter uma nova concentrao
de 20 mg/mL (1,37 mM);
6. Abastea os reservatrios da fileira C com solues de NaCl variando de
1,5-2,5 M em passo de 0,2 M. Repita o experimento depois de diluir a
soluo estoque de protena pela metade;
7. Use a fileira D para duplicar ou testar parmetros particulares (por
exemplo, volume da gota para observar se h influncia nos efeitos cinticos
ou no crescimento);
8. Mantenha os experimentos a 18 C;
9. Observe os experimentos durante 2 dias;
Resultados:
Os cristais de lisozima apareceram aps 24 horas e apresentam dimenses
aproximadas de 0,5x0,5x0,5mm.

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Figura 8. Fotomicrografia dos cristais da lisozima.

10. Referncias bibliogrficas


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