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DESARROLLO DE MEDIOS DE
CULTIVO CROMOGNICOS Y
FLUOROGNICOS
CUBA
TECNOLOGA
BIOQUMICA
MICROBIOLOGA
QUMICA
EMPLEO DE MEDIOS DE
CULTIVO QUE CUMPLAN
CON LAS NUEVAS
EXIGENCIAS DEL
DIAGNSTICO MODERNO
MAYOR
RAPIDEZ
ELEVADA
ESPECIFICIDAD
ALTA
SENSIBILIDAD
!AUMENTO
!MINIATURIZACIN
!EMPLEO DE NUEVOS
SUSTITUYAN EL AGAR
MANIPULADOS
GENTICAMENTE, O PARA MICROORGANISMOS ANTES NO ESTUDIADOS O
CULTIVADOS
!NUEVOS
INDUSTRIAL
MEDIOS DE CULTIVO
CROMOGNICOS Y FLUOROGNICOS
ETIOLOGA
Medio
Medio
DEFINICIN No. 1
DEFINICIN No. 2
Pueden considerarse aquellos medios
de cultivo que estn destinados a
identificar los microorganismos sobre
la base de reacciones enzimticas
tpicas, dando lugar a la rotura del
enlace entre el sustrato de la reaccin
enzimtica y un grupo cromforo o
fluorforo unido a dicho sustrato y
provocando con ello un cambio de
color o emisin de luz.
COMPONENTES FUNDAMENTALES
9Agua
9Sustratos cromognicos y/o fluorognicos
9Sustancias opacantes o contrastantes
9Indicadores
9Bases nutritivas
9Fuentes de carbono (azcares, alcoholes, etc.)
9Agar
9Sales minerales
9Inhibidores selectivos (sales, antibiticos, etc.)
9Otras sustancias (protenas, aminocidos, etc.)
PRINCIPIOS
ENZIMAS CARACTERSTICAS
degradan
SUSTRATOS CROMOGNICOS
Y/O FLUOROGNICOS
liberando
GRUPOS CROMFOROS Y/O
FLUORFOROS
provocan cambios en
caractersticas cromticas de:
INDICADORES
SUSTRATOS
COLONIAS
Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB
HIDROLIZAN
SUSTRATO SINTTICO
CAUSAN
1. INCREMENTO EN LA FLUORESCENCIA DE
LOS SUSTRATOS
2. INCREMENTO DE LA
ABSORCIN DE LUZ DE LOS
SUSTRATOS
HIDROLIZAN
SUSTRATO SINTTICO
CAUSA
1. INCREMENTO EN LA FLUORESCENCIA DE
UN INDICADOR
2. INCREMENTO DE LA
ABSORCIN DE LUZ DE UN
INDICADOR
Clula bacteriana
ABSORBE
COLORANTE
FLUORESCENTE
DENTRO DE ALGUNO DE
SUS COMPONENTES
NTES
A
R
O
L
EJ. CO
CAUSA
INCREMENTO EN LA
FLUORESCENCIA
Citometra de flujo
Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB
Difusin activa
Clula de
bacteria Gram permeasa u otros
(ej. sales biliares)
sustrato
osmosis
sustrato
Clula de bacteria
Gradiente de iones
Inactivo en la fase estacionaria
Amplia especificidad
Baja sensibilidad
Requiere altas concentraciones
Se inactiva con el estrs celular
+
Permeasa
Inductor
lac-operon
Ejemplo:
Precipitado azul
indicadores fluorescentes
con diferentes pH ptimos
4-MU como
indicador para la
deteccin de un
incremento en el
pH
quinina para la
deteccin de
una
disminucin
del pH
Actividad de
ureasa
Formacin de
cido de mono y
disacridos
Descarboxilacin
de la lisina y
ornitina
Color de los
precipitados
Absorbcin,
max (nm)
Azul turquesa
615
Azul
680
Magenta (5-bromo-6-cloro-3-indolil)
Magenta
565
Salmon (6-cloro-3-indolil)
Salmn
540
Iodo (5-iodo-3-indoxil)
Prpura
575
Green (N-metil-indolil)
Verde
665
X (5-bromo-4-cloro-3-indolil)
Y ( indoxil)
o p-nitrofenoles
Amarillo
p-nitroanilina
Amarillo
390
Negro
Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB
Color de los
precipitados
Negro
Azul
Rojo
Azul
Naranja
7-N-(-alanil)amino-1-pentilfenoxazina-3-unotrifluoroacetato sal
Rojo
Sustratos
Cl
CH2OH
O
OH
OH
OH
N
H
Br
-o -p nitrofenoles
Difosfato de fenolftalena
Fosfatasa
Difosfato de fenolftalena
pH>7
Fenolftalena
530 nm
Mecanismo de la reaccin
Fosfatasa alcalina
H3PO4
4 Nitrofenil fosfato
sal disdica
4-Nitrofenol
Sustratos de nitroanilina
Quelatos de metales
Enzima (ej. -galactosidasa)
Sustrato (ej. esculina)
Grupo activo
+ Iones en el medio
Precipitado negro
Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB
Quelatos de metales
Precipitado negro
Sustratos Indoxilo
Color de los
precipitados
Absorbcin, max
(nm)
Azul turquesa
615
Y (indoxil-)
Azul
680
5-Bromo-3-indolil
Azul
Sustratos
X (5-bromo-4-cloro-3indolil)
Magenta (5-bromo-6-cloro3-indolil)
Magenta
565
Salmon (6-cloro-3-indolil)
Salmn
540
Iodo (5-iodo-3-indolil
Prpura
575
Green (N-metilindolil)
Verde
665
Sustratos de indoxilos
Se oxidan con facilidad
Insolubles en forma de glucsidos o steres,
aunque algunos pueden ser solubles (SLPA)
No apropiados para anaerobiosis
oxidacin
-galactosidasa
X-Gal
Precipitado azul
Alfa-glucosaminidasa
Beta-D-celobiosidasa
Beta-glucosaminidasa
Alfa-L-fucosidasa
Beta-glucosidasa
Beta-D-fucosidasa
Alfa-glucosidasa
Beta-L-fucosidasa
Beta-D-glucuronidasa
Alfa-galactosaminidasa
Beta-lactosidasa
Beta-galactosaminidasa
Alfa-maltosidasa
Alfa-galactosidasa
Beta-D-maltosidasa
Beta-galactosidasa
Alfa-mannosidasa
Beta-xylosidasa
Beta-mannosidasa
Beta-ribosidasa
Colinesterasa
Butirasa
Palmitasa
Caprilasa
Fosfodisteres (Inorgnicos) Fosfatasas, sulfatasas (Inorg.)
FOSFATASAS y SULFATASAS
Fosfatasa alcalina
Fosfatidilinositol fosfolipasa
Sulfatasas varias
Dipeptidil-aminopeptidasa II
G-glutamil-transpeptidasa
Piroglutamil-peptidasa
Otras peptidasas
SUSTRATOS CROMOGNICOS
Sustrato
Enzima
Microorganismos a
diferenciar
Orto-nitrofenil--Dgalactopiransido
(ONPG) (ONP- -D-gal)
-D-galactosidasa
Diferenciacin de
coliformes
Para-nitrofenil--Dgalactopiransido
(PNPGAL)
(PNP- -D-gal)
6-bromo-2-naftil- -Dgalactopiransido
(BNGAL)
5-bromo-4-cloro-3indoxil- -Dgalactopiransido
(X-gal) (X- -D-gal)
SUSTRATOS CROMOGNICOS
Sustrato
Enzima
Microorganismos
a diferenciar
Colores
Para-nitrofenil--Dglucurnido (PNPGLR)
-Dglucuronidasa
E. coli
Amarillo
Azul
Magenta
SUSTRATOS CROMOGNICOS
Sustrato
Enzima
5-Bromo-3-indoxil- D-glucurnido
-D-glucuronidasa
6-Bromo-3-indoxil- D-glucurnido
3-indoxil- -Dglucurnido
Enzima
-D-Fucopiranosidasa
5-Bromo-4 cloro-3-indoxil-N-acetil--D-celobiosido
-D-Celobiasa
(neuraminidasas,
acilneuraminil hidrolasas)
hidrolasas
Amilosa
Xilosa
Hidroximetil-celulosa
Colgeno
(Fenoxazinona)
SUSTRATOS FLUOROGNICOS
Metilumberiferil (4-MU-) sustratos
4-Metilumbeliferil--D-cido glucurnico (MUG)
(4-MU--D-glcUA)
-D-glucuronidasa
6-cloro-4-metilumbeliferona (CMUG)
-D-glucuronidasa
4-Trifluorometilumbeliferona (4-TMU)
-D-glucuronidasa
-DGalactosaminidasa
4-Metilumbeliferil-N-acetil--D-glucosaminidina
(4-MU- -D-glucosaminidina)
-D-glucosidasa
4-Metilumbeliferil palmitato
(4-MU-palmitato)
Esterasas
Fosfatasas
Sulfatasas
4-trifluorometilumbeliferona
Sustrato fluorognico
Indicadores de pH
fluorescentes
Mecanismo de reaccin
Aminopeptidasa B
Lisina
Lisina-7-amido-4-metilcumarina
7-amino-metilcumarina
Sustratos Bioluminiscentes
ATP + Luciferina + O2 (en presencia de
Luciferasa y Mg2+) emisin de luz en
forma de destello o incandescencia
amarillo-verdosa.
La cantidad de luz es directamente
proporcional
a la cantidad de ATP
presente en la muestra, y esta cantidad
de ATP, a su vez, depende de la cantidad
de clulas.
Mecanismo de reaccin
Mg 2+
ATP + O2+Luciferina
Oxiluciferina+AMP+PPi+CO2
560 nm centelleo
EN 1962, LeMinor Y Hamida DEMOSTRARON QUE LA ENZIMA GALACTOSIDASA DE LOS MICROORGANISMOS DEGRADABAN UN
SUSTRATO (-nitrophenyl--D-galactopIranosido)
EN LOS AOS 70 MARCADORES DE TRANSFORMACIONES
GENTICAS
EN LOS AOS 80 SUSTRATOS FLUOROGNICOS (MUG) PARA
E. coli (MERCK)
EN LOS MEDIADOS DE LOS 80- SUSTRATOS CROMOGNICOS PARA
E. coli (MANAFI M.)
EN LOS 90- PRIMEROS MEDIOS PARA OTROS m.o. (ALAIN
RAMBACH- Salmonella)
FINALES 90-ACTUALIDAD- COMBINACIONES DE CROMOGNICOSFLUOROGNICOS- SUSTRATOS TRADICIONALES
Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB
CROMOCEN AGN
SOLUCIN
FLUOROGNICA QUE SE
ADICIONA A LA CEPA
SOSPECHOSA
Y LA LECTURA SE
REALIZA DIRECTAMENTE
POR LA APARICIN DE LA
FLUORESCENCIA
FINALMENTE
VENTAJAS
MS RPIDOS
MS
ECONMICOS
MS
ESPECFICOS
MS PRECISOS
MS CONFIABLES
MAYOR
CONFIANZA