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Estructura de aminocidos y precipitacin de casena.

Erika Patricia Caicedo Yela1, Tatiana Patricia Valencia Murcia2

1Departamento de Ciencias, Facultad de Ingeniera y Administracin. Programa de Ingeniera Ambiental,


2
Departamento de Ciencias, Facultad de Ingeniera y Administracin. Programa de Ingeniera Ambiental.
Laboratorio de Bioqumica, Departamento de Ciencias Bsicas, Facultad de Ingeniera y Administracin,
Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira.
Marzo 14 de 2015
Resumen
Las soluciones que contengan protenas, en el caso de la prctica elaborada la leche y su protena la casena,
se someten a procedimientos en los que mediante ciertos reactivos podemos evidenciar los conceptos de pH
Isoelctrico, desnaturalizacin, presencia de calcio, presencia de carbohidratos, presencia de protenas o
presencia de rivoflavina, entre muchas otras que manifiestan las propiedades con las que cuenta la solucin y
la protena en cuestin.

Introduccin
Bien es sabido que las protenas son polmeros de aminocidos entrelazados por enlaces peptdicos entre el
grupo carboxilo de un aminocido y el grupo amino de otro. Dichos enlaces son covalentes, por lo que poseen
la caracterstica de ser muy fuertes.
Las sustancias en las cuales estn inmersas las protenas son muchas veces complejas; sin embargo, a pesar de
esto es posible separarlas mediante desnaturalizacin de la protena. Para desnaturalizar una protena
simplemente vasta con adicionar cualquier factor que modifique la interaccin entre sta y el solvente,
haciendo que disminuya la estabilidad de la solucin y por tanto induciendo la precipitacin de la protena ya
desnaturalizada.
Una forma de desnaturalizar una protena para precipitarla es alcanzar el denominado pH Isoelctrico de la
misma, el cual se logra cuando se llega a una carga neta de cero que se evidencia mediante la precipitacin de
la protena que posteriormente se separa de los lquidos sobrantes que contienen las dems sustancias.
Las protenas de la leche, por ejemplo, pueden separase mediante este mtodo; as pues, una de ellas, la
Casena cuenta con un pH Isoelctrico de 4,7, as que al cambiar el pH de la solucin hasta 4,7, para lo cual se
adiciona una sustancia cida, se consigue que la casena se precipite.

Materiales y mtodos
Reactivos
Materiales
50mLSuero
3mL
Reactivo
de Leche
dede
Fehling
leche A 2Vaso
tubos
1 de
Tubo
de
precipitados
ensayo
de ensayo
cido Actico
Casena
Reactivo
de Fehling
2M B Agitador
2mL Agua
1mL
de Suero de lecheMedidor de pH
Reactivo de Biuret

Parte 1: Extraccin de la Casena:

Materiales
Mtodos

En el vaso de precipitados agregar la leche, calentar a aproximadamente 40C y dejar reposar.


Adicionar gota a gota cido actico hasta que el pH sea 4,7, filtrar el precipitado y secar.

Parte 2: Verificacin de la presencia de protenas:

Materiales

Mtodos
Disponer el suero de leche en un tubo
de ensayo y la casena en el otro, a esta
ltima agregarle el agua.
Calentar al bao de mara.
Adicionar el reactivo y observar la
coloracin.

Parte 3: Determinacin de la presencia del carbohidrato lactosa:


Materiales

Mtodos
Colocar 0.5mL de reactivo Fehling A y
0.5mL de reactivo Fehling B y calentar
al bao de mara por 2 minutos.
Agregar el suero de leche.
Calentar nuevamente y observar la
formacin de un precipitado rojizo.

Parte 4: Determinacin de la presencia de Calcio:

Materiales

Mtodos

Reactivos
Materiales
1mL de
2mL
Suero
Suero
de de
leche
leche1 Tubo
1 Tubo
de ensayo
de ensayo
Oxalato de
Luz Ultravioleta
disolucin de
amonio al 4%

Disponer el suero de leche en el tubo de


ensayo y aadir 3 gotas de oxalato de
disolucin de amonio al 4%.
Observar la formacin de un
precipitado blanco

Parte 5: Determinacin de la presencia de riboflavina en la leche:


Materiales

Mtodos
Colocar 2 mL de suero de leche en un
tubo de ensayo, luego, con cuidado
acercar el tubo a una fuente de luz
ultravioleta y observar.
Resultados y Anlisis.

Parte 1: Extraccin de Casena

Tabla 1: cambio de pH de la leche a 40 C al aadir cido actico.


Gotas de cido Actico 2M

pH

10

20

5.8

30

5.3

40

4.7

Peso del papel sobre el que se deposita la casena


Peso total del papel y la casena
Peso Casena

= 1,4gr
= 7,6gr
= 6,2gr

Despus de que se llega al pH 4.7 en el cual la protena casena se desnaturaliza y se precipita, se procedi a la
filtracin del producto por medio de separacin del suero de leche y posteriormente se realiz secado de la
casena. El paso en el cual se lavaba el precipitado con 20mL de Etanol y ter etlico en mezcla 1:1 fue omitido
del procedimiento.
Se puede observar que aunque quien realiza el experimento trate de recoger totalmente la Casena y separarla
correcta y totalmente del suero de leche, pequeos restos de esta an permanecen en el suero de leche.
Adems del anterior hecho se observ que pequeas cantidades de la protena se perdan o separaban de la
masa compacta de casena, muchas se lograban recuperar, pero otras quedaban unidas a las toallas y pasaban
desapercibidas para quien realizaba el experimento.
Los hechos anteriores provocan que cambie el peso de la casena y por lo cual no se sepa con exactitud la masa
total de casena presente en el volumen de leche usado para el experimento; el resultado de masa que se logra
obtener es aproximado a la cantidad de protena que se logra recolectar.
Tambin es importante destacar que el proceso de secado de la protena mediante toallas no permite expulsar
en su totalidad el suero de leche, aunque se seque lo ms posible esta antes de su pesaje, aun despus de
finalizado el experimento an segua la protena eliminando suero.
Tambin hay que tener en cuenta otra anomala o error que podra presentarse al momento de obtener la masa
correspondiente a la presencia de Casena en el volumen dado de leche, y es el margen de error que presenta la
balanza utilizada para medicin, a fallas de calibracin del instrumento y en general a fallidas mediciones del
realizador del experimento.
En resumen, cuando se alcanza el punto isoelctrico de la casena se neutralizan sus cargas, lo cual impide que
esta protena interactue con las dems molculas presentes en la solucin. Al no interactuar con alguna otra
molcula, la protena termina precipitndose, lo que hace fcil su aislamiento del resto de la solucin. Pero en
este punto es importante considerar que la casena es la nica protena de la leche que alcanza su punto
isoelctrico a un pH de 4.8, lo que garantiza que es la nica protena que se est aislando.
Parte 2: Verificacin de la presencia de protenas.

Tabla 2: Cambios fsicos y observaciones durante el experimento.


Tubo de ensayo con suero de leche
y R. de Biuret.
-

Se observa la formacin del


precipitado

La mezcla se torna de un leve


tono violeta/morado muy
tenue.

Tubo de ensayo con casena + 2mL


de agua y R. de Biuret.
-

Se observa la formacin de
precipitado pero en este tubo
fue en menor cantidad.

La mezcla se torna de un leve


tono violeta/morado an ms
tenue que el del otro tubo.

Para esta prueba se usa reactivo de Biuret, el cual contiene CuSO4 en solucin acuosa alcalina (gracias a la
presencia de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color violeta, debido a
la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos
del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos. As pues la prueba da positiva puesto que ambas
cuentan con presencia de protenas.

REACCION
CON BIURET

Parte 3: Determinacin de la presencia del carbohidrato lactosa.

El resultado de la prueba fue fsicamente la formacin de un precipitado rojizo y visiblemente la mezcla se


torn amarillo anaranjado tendiendo a rojo, siendo una prueba positiva para el carbohidrato en cuestin.
Para explicar esto se debe tener en cuenta que los reactivos de Fehling son usados para identificar la presencia
de azucares reductores mediante un mecanismo en el que el catin cprico Cu++ reacciona con el azcar
pasando a xido cuproso que se refleja mediante un precipitado rojizo. De esta manera, nuestra prueba da
positivo debido a que la lactosa, protena que se quiere identificar, es un disacrido formado por glucosa y
galactosa. La galactosa no tiene carcter reductor pero la glucosa si, por lo cual la lactosa tiene caracterstica
de azcar reductor.

Parte 4: Determinacin de la presencia de calcio.


El tubo de ensayo dispuesto en su interior con 1mL de suero de leche al cual se agregaron 3 gotas de Oxalato
de amonio al 4% se torn blancuzco al instante, su coloracin blanca da como resultado una prueba positiva, lo
cual significa la presencia de calcio en la mezcla en cuestin.
El Oxalato de Amonio ((NH4)22C2O4) en contacto con un compuesto que contenga calcio reacciona dando
lugar a Oxalato de Calcio (CaC2O4), de ah que se obtenga un precipitado blanco ms otros productos de la
reaccin, que determina una prueba positiva para Calcio.

OXALATO DE AMONIO

OXALATO DE CALCIO

Parte 5: Determinacin de riboflavina en la leche.

Estructura de la riboflavina
Fuente: Es.wikipedia.org

En la presente prueba se dispuso en un tubo de ensayo 2mL aproximadamente de suero de leche, posterior a
esto se apagaron las luces del laboratorio y se acerc a la muestra una lmpara fluorescente de luz negra que
emite luz ultravioleta (la longitud de onda lo determina el equipo que haya sido usado), al acercar dicho
artefacto al tubo el contenido del mismo se torn de un color reflexivo verdoso fluorescente con el cual se
concluye fue una prueba positiva a la presencia de riboflavina en el suero de leche extrado.
La fluorescencia se puede explicar desde varios ngulos.
Inicialmente hay que mencionar ciertas caractersticas de la riboflavina, esta es una vitamina hidrosoluble
conformada bsicamente por un grupo de 3 anillos, dos de los cuales son heterocclicos, y estos a su vez estn
unidos a una cadena lineal ribosa, la fluorescencia se asocia en este caso y en general en las flavinas (grupo de
bases nitrogenadas que poseen pigmentos amarillos fluorescentes cuando se encuentran oxidadas) se debe a la
gran cantidad de dobles enlaces presentes en la riboflavina y adems a las diferentes estructuras que se
producen debido al movimiento de los electrones dentro de las estructuras cclicas, los cuales actan en
resonancia con los dobles enlaces externos con el oxgeno.

Cuestionario
1. Cmo pueden clasificarse los aminocidos? Examine las caractersticas comunes de cada grupo,
compare los diferentes radicales de cada aminocido y familiarcese con su estructura.
Segn Bohinski (1991) la clasificacin a la que podemos llegar segn las caractersticas del grupo R de los
aminocidos esta inicialmente constituida por aquellos que son neutros (no presenta carga, es decir, no puede
ionizarse), los que son cidos (se puede cargar negativamente-cido de Brnsted) y los que son bsicos (se
pueden cargar positivamente-base de Brnsted)
Tabla 3. Carcter de ionizacin de los grupos R de los aminocidos.

Otra clasificacin que nos aporta este autor es la que toma en cuenta la polaridad de los grupos R, que
determina, entre otras caractersticas, la afinidad con el agua, para la que se tiene la siguiente tabla:
Tabla 4. Carcter polar de los grupos R de los aminocidos.

Sin embargo, hay una clasificacin ms especfica para los aminocidos, basada en la composicin qumica de
los grupos R, la cual arroja siete grupos, as:
Tabla 5. Clasificacin determinada por composicin qumica de los grupos -R
Alifticos

Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina (tambin podra incluirse la Prolina)

Hidroxilados

Serina Treonina (podra incluirse la Tirosina)

Sulfurados

Cistena Metionina

Aromticos

Fenilalanina Tirosina Triptfano (podra incluirse la Histidina)

cidos (y su Acido asprtico Asparagina


amida
Acido Glutmico Glutamina
correspondiente)
Bsicos

Arginina Histidina Lisina

Imnicos

Prolina

A continuacin se presentan las estructuras de los 20 aminocidos para familiarizarnos con sus grupos R y
comprender el porqu de sus clasificaciones:

2. Qu se entiende por pH o punto isoelctrico de un aminocido o una protena? Por qu, en


dicho punto, las especies precipitan? Qu es lo que permite que los aminocidos acten como
reguladores de pH de los fluidos biolgicos?
Por pH Isoelctrico o punto Isoelctrico se entiende como el pH al cual la carga neta del aminocido o de la
protena es cero, es decir donde la concentracin del Zwitterin es mxima por lo que la concentracin de
especies protonadas y desprotonadas se iguala.
En el punto isoelctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la
protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad, esto se justifica
debido a que las molculas que estn cargadas igual se repelen entre s, y as forman una dispersin estable en
el agua. La eliminacin de la carga elimina la fuerza repulsiva y permita interactuar a las molculas entre si y
precipitar en la mayora de los casos.
Los aminocidos tienen carcter anftero, es decir, pueden ceder protones y tambin captarlos, gracias a que
cuentan con el grupo amino y el grupo carboxilo. A pH fisiolgico, el cido carboxlico existe como in
carboxilato (COO-) con una carga negativa y el grupo amino existe como in NH3 +. Cuando el pH es cido,
el grupo carboxilo ocupa el exceso de iones de hidrgeno para volver de nuevo a la forma de cido
carboxlico. Si el pH se vuelve alcalino, se produce una liberacin de un protn desde el in NH3 +, que toma
la forma de NH2. As vemos como esa capacidad de captar o ceder protones le confiere a los aminocidos la
caracterstica de ser amortiguadores del pH.
3. Experimentalmente, Cmo diferenciara usted entre un aminocido aromtico y otro que no lo
es? Indague al respecto y disee un breve protocolo de laboratorio para la respectiva
experimentacin.
Reaccin Xantoproteica
La reaccin se basa en la nitracin del anillo bencnico con acido ntrico, produciendo derivados del
nitrobenceno de color amarillo. Estos derivados amarillos se tornan anaranjados a la alcalinidad de la solucin

N H 4 OH

con

o NaOH. En las condiciones de la reaccin la fenilalanina es difcil de nitrar por cuanto se

requiere la presencia de un catalizador.


Materiales:
- 4 tubos de ensayo
- Pipeta
- Triptfano 0.1%
- Metionina 0.1%
- Albumina de huevo al 1%
- Solucin problema
HN O3
Procedimiento
1. Tomar cuatro tubos de ensayo
2. Colocar 1mL de cada aminocido en tubos de ensayo diferentes
3. Agregar a cada tubo de ensayo 0.5mL de

HN O3

concentrado en cada tubo

4. Calentar al bao de mara los tubos por 10 minutos usando la campana de extraccin
5. Retire los tubos de ensayo y djelos enfriar a temperatura ambiente
6. Observe la coloracin, la prueba es positiva para aromticos si se presenta una coloracin de color
amarillo.
NOTA: si se desea comprobar la veracidad del experimento se puede continuar desde el punto 6 con esto.
7. Agregue lentamente 1mL de

N H 4 OH

o de NaOH concentrado en la campana de extraccin.

8. Observe el cambio de coloracin de amarillo a anaranjado en la interfase.


Conclusiones
-

Los Aminocidos los compuestos orgnicos que debido a la presencia de dos grupos funcionales
presentan caractersticas anfipaticas, esto les atribuye caractersticas qumicas muy diversas en las
cuales influye, el pH de sus dos grupos funcionales, el tamao del R, la complejidad de la estructura.
Adems, tiene gran importancia el medio en el que se encuentre el aminocido, ya que dependiendo de
este el aminocido puede tender a generar estructuras inicas.

Conociendo el punto isoelctrico de una determinada molcula antiptica, es posible aislarla. Por lo
que alcanzando el punto isoelctrico de la casena, esta se precipita, lo que hace posible su aislamiento
del resto de la leche.

Es posible el aislamiento de la casena de la leche utilizando la poca solubilidad que esta protena tiene
cuando se lleva hasta su punto isoelctrico y la rapidez de sedimentacin de la misma.

La leche es una mezcla de protenas, lpidos y glcidos en un medio acuoso (coloide en el que la grasa
es la partcula dispersa y el agua es el medio dispersante), dichas molculas pueden ser aisladas
teniendo en cuenta su punto isoelctrico y sus caractersticas qumicas.
Referencias Bibliogrficas

1. Annimo. Quimitube. El Comportamiento Acido-Base de los Aminocidos. Recuperado de:


http://www.quimitube.com/el-comportamiento-acido-base-de-los-aminoacidos. Consultado el 14 de
febrero de 2015
2. Bohinski, R., Bioqumica, Quinta Edicin, editorial Pearson Educacin, Mxico, 1991, Pg. 63-75
3. Calvo,
Miguel.
Bioqumica
de
los
alimentos.
Riboflavina.
Recuperado
de:
http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/vitamins/riboflavina.html Consultado: 14 de marzo de 2015
4. Hicks, Juan. Bioqumica, segunda edicin, editorial Mc Graw Hill, Mxico, 2007. Pg. 54-59
5. Vaclavik V., Fundamentos de ciencia de los alimentos, Editorial ACRIBIA, Espaa (Zaragoza), 1998,
Pg. 141-142.

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