Você está na página 1de 15

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC

Centro de Engenharia, Modelagem e Cincias Sociais Aplicadas


EN2105 - -Microbiologia Ambiental

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS DO SOLO E OBTENO DE


CULTURA PURA

David vila Almeida RA 11011711


Gabriela Pena Massari RA 11031407
Natalia Alves Cordeiro RA 11045212
Noele de Araujo Falco RA 11080913
Trcila Oliveira de Miranda RA11032510
Victor A. S. Almeida RA 11009610
Prof. Dra. Lusa Helena dos S. Oliveira

Santo Andr
2015
Sumrio
1.Introduo

2.Objetivo
3.Materiais
4.Procedimentos
5.Resultados e Discusses
6.Concluso
7.Bibliografia

1. INTRODUO

Os

microrganismos

apresentam

uma

imensa

diversidade

gentica

desempenham funes nicas e cruciais na manuteno de ecossistemas, como


componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoqumicos [4], so
seres vivos muito pequenos que no podem ser vistos individualmente sem auxlio de
microscpio. Estes organismos so classificados como bactrias, archaeas, fungos,
protozorios, algas e parasitas [1]. Para este experimento, os microrganismos de
interesse so bactrias e fungos.
As bactrias so seres unicelulares e seu material gentico no est envolto por
uma membrana, ou seja, so procariotos. O material orgnico proveniente de
organismos vivos ou mortos so fonte de alimento para muitas bactrias. H ainda
bactrias que so capazes de sintetizar o prprio alimento atravs da fotossntese ou
ainda outras que podem obter alimento de matria inorgnica [1]. As bactrias
constituem o grupo mais numeroso, talvez o mais importante dentre os componentes
microbianos do solo. Num solo normal, obtido por mtodos comuns de anlise, podem
ser avaliados ao redor de vinte milhes de talos bacterianos por grama de solo. Essa
quantidade corresponde a aproximadamente 0,01% do volume do solo na sua camada
superior, ou, ainda, a cerca de trezentos quilogramas de talos bacterianos por hectare.
[5]
Os fungos podem ser unicelulares ou multicelulares e so seres eucariotos, ou
seja, possuem ncleo celular. O alimento obtido atravs de material orgnico em um
ambiente ou em um hospedeiro [1]. A quantidade de fungos, dentro da populao
microbiana do solo, acentuadamente inferior a das bactrias; seu nmero, num solo
nas condies do caso anterior, poderia variar entre quinhentos mil e dois milhes de
indivduos. [5]
O sucesso de um microrganismo em um determinado ambiente se d em funo
da extenso e rapidez de suas respostas fisiolgicas s condies ambientais, sendo,
portanto, encontrados em diversos ecossistemas terrestres, especialmente nos solos
[8]. A biodiversidade de solos tem um papel fundamental na regulao dos processos
biogeoqumicos formadores e mantenedores dos ecossistemas. Dentre estes, incluemse: a formao e estruturao de solos; a decomposio da matria orgnica; a

ciclagem de nutrientes; e a formao dos gases componentes da atmosfera terrestre.


[4]
A presena de um microrganismo em determinado solo funo das condies
ambientais dominantes e dos limites da sua bagagem gentica. Dessa forma, existem
fatores ambientais que limitam a sobrevivncia e a atividade dos microrganismos do
solo. Os principais fatores abiticos do solo so a temperatura, o pH, a salinidade, as
fontes de energia e substratos orgnicos, os nutrientes e os elementos txicos. [2]
Entre os principais componentes do meio, as fontes de nitrognio, fsforo e sais
minerais juntamente com os acares formam os nutrientes necessrios para o
desenvolvimento desses seres. A aplicao de estercos e compostos orgnicos ao solo
favorece a atividade e o desenvolvimento da microbiota. De outro lado, a aplicao de
compostos orgnicos como pesticidas e poluentes pode ocasionar prejuzos aos
microrganismos e ao processo bioqumico. [2]
Os microrganismos na natureza existem em culturas mistas, ou seja, vrias
espcies diferentes ocupam um mesmo ambiente. No entanto, para determinar as
caractersticas de um certo microrganismos necessrio que ele esteja em uma cultura
pura, o que significa que todas as clulas da populao tem as mesmas caractersticas
genticas. Para que esse estudo possa ser realizados existem procedimentos para a
obteno dessas culturas, chamados de isolamentos, e so essenciais para se ter o
microrganismo disponvel para estudos de morfologia, taxonomia, reproduo e
fisiologia.
Na fase do isolamento, ocorre a seleo de uma colnia atravs da observao
da produo de determinado produto ou da morfologia da colnia. Para fazer o
isolamento de um microrganismo, deve-se empregar o meio de cultivo mais adequado
para o seu desenvolvimento. O meio de cultura um material nutriente preparado em
laboratrio cuja utilizao importante para o crescimento, transporte e estocagem de
microrganismos [3]. As tcnicas de isolamento podem ser classificadas de acordo com
a consistncia do material e as operaes so executadas sob rigorosa assepsia, em
ambiente prprio, usando-se ferramentas e material desinfestados ou esterilizados
1.1 Isolamento em Cultivo Slido

1.1.1 Tcnica de Semeadura por Estrias


Esse mtodo tambm chamado de esgotamento de ala. Atravs de uma ala
de platina, de um fio de platina ou at mesmo um swab, coleta-se uma pequena
parcela do meio de inculo e o espalha sobre uma placa de Petri com gar fazendo
movimentos em zigue-zague, formando um caminho na forma de estrias. Existem
vrias possibilidades de fazer essas estrias, sendo ela descontnua ou contnua [6]. A
forma descontnua mostrada na figura abaixo, onde so feitas estrias na poro 1 da
placa e em seguida flamba-se a ala; aps, faz-se uma retirada de bactrias da regio
1 e espalha-se sobre a regio 2; flamba-se mais uma vez e espalha-se bactrias da
regio 2 na 3. As colnias presentes na regio 3 estaro mais isoladas [3].

Figura 1: Tcnica de Semeadura por Estriar


Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002; TORTORA et al., 2006.

1.1.2 Tcnica de Semeadura por Espalhamento


Nessa tcnica um pequeno volume da soluo de microrganismos contendo de
30-300 clulas transferido para o cento de uma placa de gar j solidificado com o
auxlio de uma pipeta estril. Em seguida, mergulha-se uma ala de Drigalski em lcool
e a flamba de modo a manter todo o material estril. Com o auxlio dessa ala,

espalha-se aquele volume depositado por toda a superfcie do gar. As colnias


cresceram espalhadas por toda a superfcie do gar [3].
1.1.3 Tcnica de Semeadura por Derramamento
O mtodo de semeadura por derramamento, ou tambm denominado de pour
plate muito utilizado para bactrias e fungos. A amostra original diluda de forma
que quando feita a placa consegue-se colnias bem separadas. Um pequeno volume
da melhor diluio ento derramado em uma placa de Petri sem gar. Em seguida,
derrama-se gar fundido na temperatura de 45C e mistura-se os dois com uma
agitao leve da placa e deixa-se o meio solidificar.
Esse mtodo permite o crescimento de colnias na superfcie e dentro do gar,
pois algumas clulas foram misturadas no gar durante a sua solidificao, onde h a
comparao do crescimento aps a semeadura por pour plate e por espalhamento [3].
1.1.4 Tcnica de Semeadura em Profundidade
Faz-se a utilizao da agulha de platina e semea-se o material contido nela
picando um gar slido contido num tubo. Com isso haver o crescimento de
microrganismos em anaerbio se no fundo e aerobiose perto da superfcie do gar [6].

Figura 2: Semeadura em Profundidade


Fonte: DROVAL, LIMA e HABU, 2001.

1.2. Isolamento em Cultivo Lquido


Os meios de enriquecimento que propiciam um grande aumento de determinada
populao microbiana so geralmente lquidos. Aps o crescimento avantajado ento

ocorre o isolamento de determinadas clulas. Isso pode ser feito como mostrado nas
tcnicas em estado slido ou atravs de uma srie de diluies em meio lquido.
Fazendo uma diluio em novo meio estril, espera-se que em certo momento
se obter culturas provenientes de somente uma nica clula. Srie de diluio para
isolamento de um microrganismo apresentado na figura abaixo.

Figura 3: Isolamento pela tcnica de diluio


Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN.

2. OBJETIVOS
O experimento foi dividido em duas etapas, onde cada uma possui objetivos
especficos. A primeira parte do experimento teve com objetivos isolar os
microrganismos no solo, quantificar a densidade de bactrias e fungos por Unidades
Formadoras de Colnias (UFC) e praticar a tcnica de diluio e semeadura. J na
segunda parte do experimento, de obteno de cultura pura, os objetivos foram
demonstrar prticas de assepsia e outros procedimentos necessrios para isolamento
de culturas e demonstrar os principais mtodos de obteno de culturas axnicas.
3. METODOLOGIA
3.1. Materiais
As duas partes do experimento utilizaram diferentes materiais. Na parte de
isolamento de microrganismos do solo foram utilizadas amostras de solo (areia da praia

e agapanto), 4 placas de petri, uma pipeta automtica de 1 mL, Luria Bertani Agar
(LBA), Meio Martin (previamente fundido e mantido a temperatura de 45C), 200 mL de
soluo salina 0,7% NaCl esterilizado, um frasco esterilizado com capacidade para 90
mL de soluo salina, Bico de Bunsen, estufa de incubao, caneta azul para
retroprojetor e 4 frascos para diluio contendo 9 mL de soluo salina 0,7% NaCl.
Na parte de obteno de culturas puras foram utilizados os seguintes materiais:
duas placas de Petri pequenas contendo o meio gar nutriente (j vertido e solidificado
nas placas), duas placas de Petri pequenas contendo o Meio Martin (j vertido e
solidificado nas placas), palito de dente, ala de platina e estufa de incubao.
3.2. Procedimentos
3.2.1. Isolamento de Microrganismos do Solo
Primeiramente, foram coletadas 50g de amostra de solo (areia da praia e
agapanto) em frasco estril. Utilizando a caneta para retroprojetor, foram marcados os
frascos para diluio com: 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4 . A seguir, as 50g de amostra de solo
foram diludas no frasco com 90 mL de gua de diluio.
Com o auxlio de pipeta, 1 mL de lquido foi retirado do frasco com amostra
diluda e, prximo ao bico de Bunsen foi transferido para o frasco marcado como 10 -2 e
ento o tubo foi agitado. O procedimento foi repetido transferindo 1 mL do frasco
marcado como 10-2 para o frasco marcado como 10-3 e depois transferindo 1 mL do
frasco 10-3 para o frasco 10-4.

Figura 4: Diluio em tubos de ensaio.

Uma placa de Petri foi marcada como 10-2 MM (Meio Martin), uma como 10-3 MM
(Meio Martin), outra como 10-3 LBA (Luria Bertani Agar) e a ltima como 10-4 LBA (Luria
Bertani Agar). Novamente com a pipeta e prximo ao bico de Bunsen, 1 mL do frasco
10-2 foi transferido para a placa de Petri 10-2 MM. Depois, 1 mL do frasco 10-3 foi
transferido para a placa 10-3 MM e 1 mL para a placa 10-3 LBA. Finalmente, 1 mL do
frasco 10-4 foi transferido para a placa de Petri marcada como 10-4 LBA.
Prximo ao bico de Bunsen, aproximandamente 10 mL de Meio Martin foram
vertidos nas placas de Petri marcadas como 10-2 MM e 10-3 MM. Nas placas de Petri
marcadas como 10-3 LBA e 10-4 LBA foram vertidos aproximadamente 10 mL de meio
Luria Berani Agar em cada.
Esperou-se a solidificao dos meios nas placas e ento estas foram invertidas
para evitar a formao de gua na superfcie do agar. Por fim, as placas foram
colocadas na estufa de incubao a 35 C. A contagem de colnias formadas nas

placas foi realizada um dia aps o preparo das placas, 4, 5, 6 e 7 dias aps o preparo
das culturas.
3.2.1. Isolamento e Obteno de Cultura Pura
Antes de cada etapa do experimento, a ala de platina foi esterilizada na chama
do bico de Bunsen e resfriada atravs da imerso em tubo contendo gua destilada e
as placas de Petri foram marcadas como 10-2 MM, 10-3 MM, 10-3 LBA e 10-4 LBA.
Prximo ao Bico de Bunsen, a placa de Petri 10 -3 LBA contendo os
microoganismos isolados na parte 1 foi aberta e a ala de platina foi inserida nesta
cultura. Fechou-se a placa e ento, na nova placa de Petri tambm marcada como 10 -3
LBA foram desenhadas trs estrias com a ala contendo microganismos retirados da
outra placa. Aps esterilizao da ala de platina, o mesmo procedimento foi realizado
retirando microrganismos da placa 10-4 LBA da parte 1 e transferindo-os para a nova
placa de Petri com a mesma marcao, 10-4 LBA.
Ainda prximo ao bico de Bunsen, a placa contendo microrganismos marcada
como 10-2 MM da parte 1 foi aberta e o palito de dente foi inserido em uma colnia. A
placa foi fechada e o palito de dente contendo microrganismos foi inserido no centro da
nova placa de Petri marcada como 10-2 MM. A placa de Petri marcada como 10-3 MM
da parte 1 no apresentou crescimento de colnias, portanto uma segunda colnia da
placa 10-2 MM foi utilizada na segunda nova placa de Petri contendo Meio Martin.
4. RESULTADOS E DISCUSSES
O solo um recurso natural vital para o funcionamento do ecossistema terrestre
e representa um balano entre os fatores fsicos, qumicos e biolgicos.(ARAJO;
LEITE, 2007) Bactrias e fungos compe a frao biolgica de microrganismos no solo,
realizando diversas funes importantes para a manuteno do solo, tais como
degradando substncias txicas, fornecendo nutrientes responsveis pelo crescimento
da flora e decompondo a matria orgnica. Esses microrganismos podem viver tanto
em simbiose quanto isolados. A distribuio dos mesmos no solo depende de muitas
variveis, dentre elas a temperatura, pH, umidade e disponibilidade de oxignio.

A temperatura afeta diretamente a fisiologia dos microrganismos e altera


tambm o ciclo de nutrientes e a atividade da gua. Observa-se uma taxa mais alta de
crescimento tanto bacteriano quanto de fungos ao passo que estes chegam sua
temperatura tima, que varia de espcie para espcie. Diferentes grupos de bactrias
possuem diferentes temperaturas timas, as bactrias Psicrfilas possuem uma
temperatura tima de aproximadamente 15 C, j as Mesfilas possuem uma
temperatura tima de 37C, as Termfilas so bactrias que aguentam temperaturas
extremas e possuem uma temperatura tima na faixa de 85C.
As bactrias podem crescer em meios cujo o pH esteja entre 6,5 a 9, faixa
normalmente observada na natureza. Elas podem ser classificadas em Neutrfilas,
Acidfilas e Alcalinfilas, com a faixa de pH respectivamente entre 5,4 a 8,5; 0,1 a 5,4 e
8,5 a 11,5. Como toda clula metabolicamente ativa necessita de gua, a umidade
essencial para o crescimento bacteriano, sendo apenas possvel para o endsporo da
bactria viver na sua ausncia.
Para os fungos, a temperatura tima de proliferao ocorre por volta dos 25 C,
porm existem espcies que se adaptam a temperaturas mais baixas. Eles so
essencialmente aerbicos, ou seja, dependem do oxignio para sobreviverem. Fungos
crescem em meio ao pH que pode variar de muito cido (pH 2) at levemente cido,
prximo a 6.
Os solos arenosos so caracterizados por possuirem gros largos e numerosos
poros, o que facilita a rpida penetrao da gua em camadas profundas do solo,
levando com ela, todos os nutrientes e sais necessrios para o desenvolvimento da
vida vegetal, resultando em um solo pobre em matria orgnica. Por outro lado, nos
solos de Agapanto, utilizam-se fertilizantes e adubos orgnicos para o crescimento da
flor, que deve ser cultivada e regada em abundncia na primavera e vero, o que indica
um alto teor de umidade deste tipo de solo.

Figura 5: Microrganismos e processos biolgicos afetados pelo pH do solo.


Fonte: ARAJO; LEITE, 2007

Na primeira etapa, observamos as culturas depois de 1, 4, 5, 6 e 7 dias, fizemos as


contagens de UFCs e tiramos fotos. Como a turma foi dividida, temos apenas as fotos das
culturas de Agapantos. So elas:

Imagem 1: aps 1 dia de cultura.

Imagem 2: aps 4 dias de cultura.

Imagem 3: aps 5 dias de cultura.

Imagem 4: aps 7 dias.

Foram observados os seguintes resultados:

Imagem 4: aps 6 dias de cultura.

Solo

Bactria

Bactria

Fungo 10-

Fungo 10-

10-3

10-4

Massa do
Solo
mido

pH

Agapantos

86

48

82

69

11,52%

6,0

Areia da
Praia

70

42

10,45%

7,0

Tabela 1: Quantidade de Unidades Formadoras de Colnia (UFC) por microrganismo, nos dois tipos de
solo.

Observando-se a tabela 1, nota-se que a melhor diluio para ambos


microrganismos foram as de 10-3 LBA para bactrias e 10-2 MM para fungos, onde se
obteve uma homogeneidade maior entre o nmero de microorganismos contados, ou
seja, nessas concentraes as condies para o desenvolvimento dos mesmos foram
otimizadas em comparao com as outras diluies propostas. O solo de Agapantos foi
o que se mostrou mais favorvel aos dois microrganismos.

5. CONCLUSO
Nesse trabalho utilizamos a tcnica de semeadura e diluio a fim de isolarmos
microrganismos, como bactrias e fungos os quais foram quantificados por Unidades
Formadoras de Colnias (UFC), como apresentadas nos resultados. A contagem de
fungos na areia da praia no apresentou uma quantidade de colnias esperada,
justificada pelo valor do pH. Observou-se que houve um crescimento muito mais
acentuado de microrganismos nos solos de agapanto, uma vez que estes so ricos em
matria orgnica e possuem melhores condies fsicas para o desenvolvimento dos
mesmo.Cada grupo em seu respectivo meio de crescimento, meios LBA e Meio Martin,
respectivamente para bactrias e fungos.
J sobre a assepsia, aplicamos a flambagem ou esterilizao por calor seco sob bico
de bunsen da ala de platina utilizada no experimento, para obteno da cultura pura
aplicado de maneira satisfatria.

6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1 TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, A. L. Microbiologia. 8 edio, 1


reimpresso, Artmed, Porto Alegre, 2006, 894 p.
2 ARAJO, A. S. F.; LEITE, L. F. C. Ecologia Microbiana do Solo. Sapincia, Teresina,
v. 4, n. 12, p 3. jul. 2007.
3 PRESCOTT, L. M.; HARLEY, J. P.; KLEIN, D. A. Microbiology. 5 th edition. The
McGraw-Hill Companies, 2002, 1139 p.
4 MINISTRIO DO MEIO AMBIENTE. Microorganismos e biodiversidade dos
solos.Verso de 28/10/98. Disponvel em :
<http://www.mma.gov.br/estruturas/sbf_chm_rbbio/_arquivos/Microrganismos%20e%20
Biodiversidade%20de%20solos.pdf>
5 UNIVERSIDADE DE SO PAULO. Microrganismos do solo. Disponvel em :
<http://www.revistas.usp.br/aesalq/article/viewFile/38761/41645>.
6 DROVAL, A. A.; LIMA, D. P.; HABU, S. Manual Prtico de Microbiologia de
Alimentos. Curso de Microbiologia de Alimentos, Manual do Participante. CEFET/PR
Unidade de Medianeira, 2001.
7 MENDES, I. de C.; REIS JUNIOR, F. B. d. Microrganismos do solo e a
sustentabilidade dos agroecossistemas. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2010.
Disponvel em: <http://www.cpac.embrapa.br/noticias/artigosmidia/publicados/188/>.
8 SIQUEIRA, J. O.; MOREIRA, F. M. S. Biologia e Bioqumica do Solo. Universidade
Federal de Lavras.
9 GALLI, Fernando. Microrganismos do Solo. Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz. Vol XXI, 1964.