Guía American Thyroid Asociación para Investigación de La Hormona Tiroidea Economía y Acción en Roedores y Modelos Celulares PDF

20/1/2015
GuaAmericanThyroidAsociacinparaInvestigacindelahormonatiroideaEconomayAccinenroedoresymodeloscelulares
TIROIDES
Tiroides.01deenero201424(1):88168.
PMCID:PMC3887458
doi:10.1089/thy.2013.0109
GuaAmericanThyroidAsociacinparaInvestigacindelahormonatiroidea
EconomayAccinenroedoresymodeloscelulares
InformedelGrupodeTrabajodelaAsociacinAmericanadeTiroidesEnfoquesyEstrategiaspara
InvestigarlahormonatiroideaEconomayAccin
AntonioC.Bianco, *, 1,deGrantAnderson, 2DouglasForrest, 3ValerieAnneGalton, 4BalzsGereben, 5BrianW.Kim, 1
PeterA.Kopp, 6XiaoHuiLiao, 7MaraJessObregn, 8RobinP.Peeters, 9SamuelRefetoff, 7DavidS.Sharlin, 10S.
WarnerSimnides, 11RoyE.Weiss, 7yGrahamR.Williams 12
1
DivisindeEndocrinologa,DiabetesyMetabolismodelaUniversidaddelaEscuelaMillerdeMedicinadeMiami,Miami,Florida.
2
DepartamentodePrcticadeFarmaciayCienciasFarmacuticasdelaFacultaddeFarmaciadelaUniversidaddeMinnesotaDuluth,Duluth,Minnesota.
3
LaboratoriodeEndocrinologayBiologadelreceptor,elInstitutoNacionaldeDiabetesyEnfermedadesDigestivasydelRin,InstitutosNacionalesde
Textooriginal
Salud,Bethesda,Maryland.
4
American Thyroid Association Guide to Investigating Thyroid
DepartamentodeFisiologayNeurobiologadelaEscueladeMedicinadeDartmouth,Lebanon,NewHampshire.
5
HormoneEconomyandActioninRodentandCellModels
DepartamentodeEndocrinologadeNeurobiologadelInstitutodeMedicinaExperimentaldelaAcademiaHngaradeCiencias,Budapest,Hungra.
6
DivisindeEndocrinologa,MetabolismoyMedicinaMolecular,yelCentrodeMedicinaGenticadelaFacultaddeMedicinaFeinbergdelaUniversidad
Sugiereunatraduccinmejor
Northwestern,deChicago,Illinois.
7
SeccindeAdultosyPeditricaEndocrinologa,DiabetesyMetabolismodelaUniversidaddeChicago,Chicago,Illinois.
8
InstitutodeInvestigacionesBiomdicas(IIB),espaolConsejoSuperiordeInvestigacionesCientficas(CSIC)ylaUniversidadAutnomadeMadrid,
Madrid,Espaa.
9
DivisindeEndocrinologa,DepartamentodeMedicinaInterna,CentroMdicoErasmus,Rotterdam,PasesBajos.
10
DepartamentodeCienciasBiolgicas,UniversidaddelEstadodeMinnesota,Mankato,Minnesota.
11
LaboratoriodeFisiologa,InstitutodeInvestigacionesCardiovasculares,VUUniversityMedicalCenter,Amsterdam,PasesBajos.
12
DepartamentodeMedicinadelImperialCollegedeLondres,HammersmithCampus,Londres,ReinoUnido.
Autorcorrespondiente.
Correspondenciadedireccionespara:,AntonioC.Bianco,MD,PhD,delaDivisindeEndocrinologa,DiabetesyMetabolismo,UniversidaddelaEscuela
MillerdeMedicinadeMiami,suite816DominionTowers,1400NW10thAve.,Miami,FL33136,Email:Email:abianco@deiodinase.org
DerechosdeAutor2014,AmericanThyroidAssociation
EsteartculohasidocitadoporotrosartculosenPMC.
Abstracto
Ira:
Antecedentes:Unconocimientoprofundodelosprincipiosfundamentalesqueregulanlahomeostasisdelahormona
tiroideaescrticaparaeldesarrollodenuevosenfoquesdediagnsticoytratamientoparalospacientescon
enfermedaddelatiroides.
Resumen:prcticasclnicasimportantesenusohoyendaparaeltratamientodelospacientesconhipotiroidismo,
hipertiroidismo,ocncerdetiroidessonelresultadodelosdescubrimientosdelaboratoriorealizadosporlos
cientficosqueinvestiganlosaspectosmsbsicosdelaestructuradelatiroidesylabiologamolecular.Eneste
documento,unpaneldeexpertosconvocadoporlaAsociacinAmericanadelaTiroideshaceunaseriede
recomendacionesrelacionadasconelestudiodelaeconomadelahormonatiroideaylaaccin.Estas
recomendacionesestndestinadasapromoverlanormalizacindeldiseodelestudio,quedebeasuvezaumentarla
comparabilidadylareproducibilidaddelosresultadosexperimentales.
Conclusiones:Seesperaquelaadhesinaestasrecomendacionesdelosinvestigadoresenelcampofacilitarel
avancehaciaunamejorcomprensindelaglndulatiroidesylahormonatiroideaprocesosdependientes.
INTRODUCCIN
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3887458/
Ira:
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OVERLOSLTIMOS150AOS,losinvestigadoresutilizanmodelosexperimentalesdeclulasanimalesylacultura
basados
enhaberlogradodescubrimientosemblemticosquehandadoformaanuestracomprensindelafisiologa
delatiroidesylaenfermedad.Apartirdelaidentificacindelestimuladortiroideodeaccinprolongadaparael
descubrimientodefrmacosantitiroideos,losestudiosdeinvestigacinbsicahanproporcionadolosfundamentos
sobrelosquesebasannuestrasherramientasdediagnsticoyteraputicosclnicos.Decenasdemilesde
publicacionesindexadasenPubMed(www.pubmed.gov)clulasdecaractersticasoanimalespequeoshicieron
hipotiroidismootirotxica.Lasgrandessimilitudesenmltiplesaspectosdelafisiologatiroideaentrehumanosy
roedorespequeoshanfacilitadolarpidatraduccindeloshallazgosexperimentalesalmbitoclnico.Almismo
tiempo,existendiferenciasentreespeciesfundamentalesydebensercuidadosamenteencuentasilosresultados
experimentalessontenerrelevanciaclnica.
Mientrasqueciertastcnicasexperimentaleshansidoampliamenteaceptadoyadaptadodespusdesuusoenlos
documentosgeneradosporloslaboratoriosinfluyentes,faltadeestandarizacin,sinduda,hapromovidola
heterogeneidaddelosresultados.Debidoaqueciertasvariablesexperimentalespuedentenernivelesumbrales
biolgicosdesconocidos,faltadenormalizacinpuedeconduciratenerresultadosmuydiscordantesendiferentes
estudiosqueexaminanelmismotema.
Parahacerfrenteaestafaltadeestandarizacin,laAsociacinAmericanadelaTiroides(ATA)convocaunpanel
deespecialistasenelcampodelainvestigacinbsicadelatiroidesparadefinirestrategiasdeconsensoyenfoques
paralosestudiosdelatiroidesenroedoresyenmodeloscelulares.Estegrupodetrabajoseencargaderevisarla
literaturaprimeroparadeterminarquprcticasexperimentalespodranbeneficiarsedelanormalizacinylasegunda
paraidentificarlasvariablesexperimentalescrticosqueexigenconsideracincuandolosestudiosdelatiroidesse
estndiseando.Lasconclusionesdelgrupodetrabajosepresentanenestedocumentocomo"GuadelaAsociacin
AmericanadeTiroidesdeInvestigacindelahormonatiroideaEconomayAccinenroedoresymodelos
celulares."Las70recomendacionesysuscomentariosqueacompaanaexaminartemasquevandesde"hacerque
lasclulashipotiroidismo"a"cmoparaestudiarelhuesotirotxica."Mientrasquelejosdeserexhaustiva,estas
recomendacionessetocanenciertosaspectosfundamentalesdelainvestigacindelatiroidespertinentesparatodos
losinvestigadoresenelcampo.
Cadarecomendacinenestaguapromueveunenfoqueexperimentalenparticularsobrelabasedecriteriosque
incluyenlaprevalenciadelenfoque,contcnicasampliamenteusadasserdadoprioridad,yenparticularsielenfoque
sehademostradoqueconducenaresultadosreproduciblesenlosestudiosrealizadosporinvestigadores
independientes.Debidoaquelascomparacionescientficasdecabezaacabezadelosmtodosexperimentaleseneste
camposonprcticamenteinexistentes,estasrecomendacionesnopuedenserclasificadosenfuncindelafuerzadela
evidenciaenlamodadelasguasclnicasdehecho,todosecalificaroncomo"laopinindeexpertos."Almismo
tiempo,adiferenciadelasguasclnicas,elobjetivoprincipaldeestasrecomendacionesysucomentariosacompaa
noesidentificarlamejorprcticanicaensmisma,sinoparaanimaralosinvestigadoresaelegirestndarenfoques
porejemplo,evitandolasdosisomtodosdeadministracindelahormonatiroideadetratamientoalazar,queslo
serviranparalimitarlacomparacinconestudiosanteriores.
Lanaturalezaprcticadelasrecomendacionesdebeserfcilmenteevidentesparaellector.Estedocumentopretende
servirdereferenciaparalosinvestigadores,ayudndolesatomardecisionesdediseoqueevitenpeligrosconocidos
altiempoqueaumentalanormalizacinenelcampo.Comopartedeesteenfoqueprctico,elcrditodereferenciase
daamenudoalosmanuscritosenlosquelosdetallestcnicossonmsclaramenteoexhaustivamenteexplicado,en
lugardelaprimerapublicacindeutilizarunatcnica.Adems,sehizohincapienlosenfoquescontemporneos,en
lugardelasestrategiashistricos,detalmaneraqueeldocumentoilustraloqueestactualmentedisponibleparael
estudiocontemporneodelahomeostasisdelahormonatiroidea,elmetabolismo,ylaaccin.Eslaposicindela
ATAquesedebenrealizarestudiosconanimalesdeacuerdocontodaslasnormasticasaplicablesylosprotocolos
deinvestigacinaprobadosporcomitsdeanimalesinstitucionaleslocales.
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MTODOSDEDESARROLLODELASRECOMENDACIONES
Ira:
Administracin
ElConsejoEjecutivoATAseleccionaaunpresidenteparadirigirelequipodetrabajo,yesteindividuo(ACB)
identificalosotros14miembrosdelgrupoespecialenconsultaconlajuntadirectivadeATA.Lamembresaenel
panelsebasenlaexperienciaylasaportacionesanterioresalcampodelatiroides.Losmiembrosdelpanel
declaradositenancualquierposibleconflictodeinteresesenelcursodelasdeliberaciones.Lafinanciacindela
guasederivadelaATAyporlotantoelgrupodetrabajofuncionsinapoyocomercial.
Elaborarundocumentotil,elgrupodetrabajodesarrolladoporprimeravezunalistadelostemasqueseranms
tilesylaspreguntasmsimportantesqueloscientficosquetrabajanenelcampodelatiroidespuedenplantearenla
planificacindeunexperimentoointerpretacindelosdatosexperimentales.Cadaunodelos10temassedistribuy
aunescritorprimariaqueutilizasuconocimientodelamateria,ascomounabsquedasistemticaenPubMedy
GoogleAcadmicoparalasreferenciasprimarias,opinionesyotrosmaterialesadisposicindelpblicoantesde
diciembrede2012,paradesarrollarunconjuntoderecomendaciones.Todoslosproyectosfueronrevisados
y
editadosporlasilladecoherenciaydevueltosalosautoresprincipalesdelarevisinenalgunoscasosmltiples
iteracionessellevaronacabohastaquesefinalizlarecomendacin.Unanteproyectodecadarecomendacinfue
revisadoporloscolaboradoressecundarioyterciariodentrodelgrupoquepreparentonceslascrticasadicionales.
Estosfueronabordadasporelescritorprimariayenviadosdevueltaalasilla.Todoslosproyectossefusionaronyse
publicarnenladireccinwebprotegidodisponiblesloparalosmiembrosdelgrupodetrabajoyoficinaATA.Este
documentoqueddisponibleparasurevisinperidicaporpartedelgrupodetrabajoengeneral,concrticasy
sugerenciasenviadasdenuevoalasillaqueactualizaeldocumento.Enunospocoscasos,elpresidentepidia
expertosexternospararevisarcrticamentelasrecomendacionesespecficasdadassusconocimientosenunrea
enfocada.Suscomentariosysugerenciasfueronluegotrabajaroneneldocumentomaestro,ylosaportesson
reconocidosalfinaldeesteartculo.
Elpanelestuvodeacuerdoenquelasrecomendacionessebasanenelconsensodelpanel.Deliberacionesdelequipo
detrabajosellevaronacaboprincipalmenteatravsdelacomunicacinelectrnica.Tambinhubounaseriede
reunionesdelosautoresylasllamadasdeconferenciatelefnica.
Presentacin,AprobacinyRatificacindelasRecomendaciones
LaestructuradenuestrasrecomendacionessepresentaenlaTabla1.Lasrecomendacionesespecficassepresentan
enelcuerpoprincipaldeltextoy,enmuchoscasos,desglosados
ensubtemasidentificadosporletras.Losnmerosde
pginaylatecladelalocalidadsepuedenutilizarparanavegarrpidamentealostemasyrecomendaciones
especficas.
TABLA 1.
ORGANIZACIN DE LASRECOMENDACIONESDEL GRUPO DE TRABAJO
Antesdelapresentacininicialdeestasdirectrices,quefueronaprobadasporlajuntadirectivaycomitejecutivode
laATAyposteriormenteenviadasalosmiembrosdelaATAaprincipiosde2013paracomentariosysugerencias.
Estaretroalimentacinfueconsideradoenlaelaboracinulteriordeldocumentoquefuepresentadoparasu
publicacin.Conposterioridadaldocumentoqueestsiendoaceptadoparasupublicacinenlatiroides,quefue
aprobadoporlajuntadirectivaycomitejecutivodelaATA.
EldocumentofinalfueaprobadooficialmenteporlaAcademiaAmericanadeOtorrinolaringologaCirugade
CabezayCuello(AAOHNS),laAsociacinAmericanadeCirujanosEndocrinos(AAES),elColegioAmericano
deMedicinaNuclear(ACNM),AsiayOceanaAsociacintiroides(AOTA),SociedadBritnicadeMedicina
Nuclear(BNMS),ThyroidAssociationBritnica(BTA),EuropeanThyroidAssociation(ETA),laAsociacin
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InternacionaldeCirujanosEndocrinos(IAES),ItalianoSociedaddeEndocrinologa(SIE),JapntiroidesAssociation
(JTA),SociedadCoreanadecabezayNeckSurgery(KSHNS),AmricaSociedadAmericanadelaTiroides
(LATS),SociedadCoreanadeMedicinaNuclear(KSNM)ylaSociedaddeEndocrinologa(TES).
RESULTADOS
Ira:
[A]Laevaluacindelaglndulatiroides
Visindeconjunto Estudiosdelafuncindeestructuraderelacindelaglndulatiroides,ascomolosestudiosdela
cinticadeyodurodetiroidesydeformacindeimgenesseempleantradicionalmenteparaevaluarlaglndula
tiroides.Caracterizacinestructuralesimportanteparaevaluarloscambiosfuncionalestalescomohipoe
hipertiroidismoyparaevaluarlatransformacindeclulasdetiroidesenunfenotipomaligno(13).Almismo
tiempo,elestudiodelaformacindeimgenestiroideaeconomayyodurodetiroidessonrelevantesnosloparalos
estudiosdelasntesisdelahormonatiroidea,sinotambinparalacomprensindelosefectosdelastoxinas
ambientales,talescomoelpercloratootiocianatoenlaeconomadelatiroides(47).
[A.1]relacionesestructurafuncin
Fondo Mientrasquelatiroideshumanaconsisteenunaizquierdayunlbuloderechoqueestnconectadosporun
istmo,roedorestienendoslbulostiroideosindependientes.Laglndulatiroidesestdivididaportabiquesdetejido
conectivoenlbulos,cadaunodeellosquecontienede20a40folculos,launidadfuncionalbsicadelaglndula
tiroides.Elfolculoesunarondaoestructurahuecoalargadorevestidoporunasolacapadeclulasfoliculares
cbicasoaplanadaspolarizadasquesellenaconcoloidequecontienetiroglobulina.Estrodeadoporunamembrana
basalyunaredcapilarricaconaltoflujodesangre(8).Losfolculosnormalmentevarandetamaoconsiderable,y
lamorfologadeclulasfolicularesesgeneralmentemontono.Laalturadelasclulasvaradeacuerdoconelestado
funcionaldelaglndula.
RECOMENDACIN1a
Morfometradelosfolculostiroideossepuedeutilizarcomounndicedelaactividadtiroidea.
Comentario Todalaglndulasiempredebeserdiseccionadomientrasqueestunidoalatrqueaeinmediatamentese
fijaronconformalinaal10%tamponadaneutraparaanlisishistolgicoeinmunohistoqumico.Hematoxilinay
eosina(H&E)tincinesampliamenteutilizadoparaevaluarlostirocitos,mientrasquelatincincidoperidicode
Schifftietiroglobulinaconavidezyseadaptabienaresaltarelcontenidodeprotenafolicularylaestructura
folicular(Fig.1)(8).Lasmodificacionesestructuralesreflejanloscambiosenlaactividadsecretoraqueresultande
ladeficienciadeyodo(9),exposicinalfrocrnica(10),otratamientoconfrmacosantitiroideos(11).Algunos
parmetrosdelasclulasfolicularescomolaalturasepuedenmedirconmicroscopadeluzusandounacuadrculade
micrmetroocular(porejemplo,enunaratade1mesdeedad,laalturadelasclulasepitelialessetratade10 micras)
(12).Unepitelioplanoeshipoactivo,mientrasqueunepiteliomayorseobservaenlasglndulasenelquese
estimulalatirotropina(TSH)ylava(10).Elusodeanlisisdeimagensemiautomticacomputarizadoesms
objetivoyampliamenteutilizado(13).Dichoanlisismorfomtricosdebecentrarseenunadelasseccionescentrales
delatiroides(13)queesrepresentativadetodoellbulo(14).Losdatosobtenidossereducenenmodelos
matemticospredefinidosqueasumenlosfolculostiroideostienenunaformaesfricaylasclulasfolicularesson
octgonosconunabasecuadrada.Estareduccindedatosseobtienenlossiguientesparmetros:media
circunferenciadelfolculosuperficieyvolumenvolumentotaldeepitelioydecoloidenmerodencleosde
clulasepitelialesvisiblesencadafolculoylaaltura,reasuperficial,yelvolumendelasclulasepitelialesde
tiroides,quepuedeserutilizadoparaestimarelestadofuncionaldelaglndulatiroides.As,elndicedeactivacin,
expresadaporlarelacindevolumendevolumen/coloideepitelial,aumentaamedidaquelatiroidessevuelvems
activo,loquereflejaunaumentoenelvolumenepitelialyunadisminucinenelvolumendecoloide(13).Medicin
delvolumentotaldeclulasencultivosdetirocitosprimariasolneascelularescultivadasinvitrosepuederealizar
utilizandomicroscopaconfocaldeescaneolserdespusdelasclulassecarganconoctadecilrodaminaB(15,16
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).
FIG.1.
Estructuramicroscpicadelaglndulatiroidesderatn.(A)conhematoxilina
yeosina(H&E)tincin.(B)cidoperidicodeSchiff(PAS)detincin.Los
ratonesfueronsacrificados,ylatiroidesdiseccionaron,fijaronenformalina
tamponada,yembebidosenparafina.Seccionesdelatiroides...
RECOMENDACIN1b
Laautorradiografasepuedeutilizarparacuantificarlaactividadglobaldelosfolculostiroideosypara
determinarlaubicacindeyodurodentrodelosfolculos.
Comentario Clulasfolicularestiroideasconcentranyodurodeacuerdoconsuactividad.Aunquelaactividaddelos
milesdeclulasfolicularesdebesersimilardentrodeunaglndulatiroidesdado,hayunagranvariacinentrelas
clulasdentrodelamismafolculoyentrefolculos.Asautorradiografaofreceunavisinnicadelaactividadde
lasclulasfolicularestiroideasindividuales.
125
Iseinyectaporvaintravenosa,tpicamentede48a72horasantesdematarelanimal.Glndulastiroidesse
disecaronyseprocesaronparalaautorradiografautilizandotcnicasestndar(17,18).Organificacindeyoduro
puedeserbloqueadaporeltratamientodelosanimalesconmetimazol(MMI).Experimentosconautorradiografa
humano,roedor,yeltejidobociofelinotambinsehanrealizadodespusdexenotrasplantesdetejidotiroideoen
ratonesdesnudos.Fragmentosimplantadosubcutneamentesemantienenenratonesreceptoresdurantevarias
semanasantesdesuposterioranlisis(19).
1cRECOMENDACIN
Ladistribucinultraestructuraldeyodurodentrodelosfolculosdelatiroidessepuededefinirconla
espectrometrademasasdeionessecundarios(SIMS).
Comentario SIMSesunatcnicautilizadaparaanalizarlacomposicindelaspelculasdelgadasporpulverizacin
catdicalasuperficiedelamuestraconunhazdeionesprimariocentradoyrecogeryanalizarexpulsadoiones
secundarios(Fig.2).Lasrelacionesdemasa/cargadeestosionessecundariossemidenconunespectrmetrode
masasparadeterminarlacomposicinelemental,isotpicoomoleculardelasuperficieaunaprofundidadde12 nm.
SIMSeslatcnicadeanlisisdesuperficiemssensible,conlmitesdedeteccinelementalesquevandesdepartes
pormillndepartespormilmillones.Esespecialmenteadecuadoparaelestudiodeladistribucindeionestrazaa
nivelultraestructural(20).
FIG.2.
MicroscopaelectrnicadetransmisindetiroidesMouse.Lbulostiroideos
sefijaronenglutaraldehdoal2,5%en0,1 Mtampncacodilatodurante1,5
horas,despusdelafijadaen1%detetrxidodeosmiodurante1hora,yse
embebieronenresinaLX112(LaddInvestigacinIndustries,Burlington,...
Imgenesinicosmuestranqueladistribucinanticipadadeyodoesheterogneadeunfolculoaotro,deuntirocito
aotrodentrodelamismafolculo,yqueestadistribucinvaracomounafuncindetiempo(21).Entiroides
normaleslonatural127Iistoposeencuentrapredominantementeenlaaberturafolicular.Laidentificacindelumina
desprovistade127Iy/olademostracindecantidadessignificativasde127Ienelcitoplasmadelasclulas
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epitelialesoenlamembranaapicalindicaundeteriorodelavadeyodacin.Paradefinirladistribucin
ultraestructuraldeyodurousandoSIMS,lbulostiroideosseprocesanenformasimilaracomoparamicroscopa
electrnica,incluyendolafijacinconglutaraldehdoypreparacindedelgadassecciones(20).
1dRECOMENDACIN
Lamicroscopaconfocalenconjuncincontcnicasdeinmunohistoqumica(IHC)puedeutilizarseparadoso
tresdimensiones(2Do3D)dereconstruccindeimagenparaestudiarlaexpresindeprotenasenlos
folculostiroideos,laredcapilarquerodea,yelestroma.
Comentario Losanticuerpossondisponiblescontralamayoradelasprotenasclaveenlabiologatirocito(22,23).
Porlotanto,lastcnicasdeIHCestndarseutilizancomnmenteenestudiosdetiroides(Figs.3y4)(24,25).La
visualizacinpuedeserrealizadoconmicroscopadeluzconvencional,microscopadeinmunofluorescencia,o
microscopaconfocalparaunamayorresolucinyreconstruccindelaimagenen2Do3D(26).Protenasy
procesosdelasuperficiecelularseinvestiganmejormediantemicroscopaelectrnicadebarrido(10).
FIG.3.
Ladeteccindetiroglobulinaytiroglobulinayodadaenlatiroidesratnpor
inmunohistoqumica.(A)Latiroglobulinasedetectenseccionesdeparafina
utilizandoanticuerpopoliclonaldeconejoantitiroglobulina(Dako)diluido
1/1500yseincubarondurantelanoche....
FIG.4.
Deteccindeladobleoxidasa(DUOX)ytiroperoxidasaenlatiroidesratn
porinmunohistoqumica.(A)DUOXsedetectenlasseccionescongeladas
conanticuerpopoliclonaldeconejodiluido1/3000yseincubarondurantela
noche.Lapositividadseobservenelpoloapical...
Laactividadperoxidasaendgenaesmuyaltaenlasclulastiroideasysedetectamediantelareaccindesecciones
detejidofijadasconsustrato3,3'diaminobencidinapretratamientoconperxidodehidrgenoantesdelaincubacin
conelanticuerpoprimarioeliminalaactividaddelaperoxidasaendgenaquepuedainterferirenlosestudiosdeIHC.
Elusodeprotenasfluorescentesetiquetadodebeserevitadosilaautofluorescenciaesunproblema(talcomose
evalumediantelavisualizacindeseccionesdetejidoconunmicroscopiodefluorescenciaantesdecualquier
incubacindelanticuerpo).EstudiosdedistribucinsubcelularBellassepuedenhacerconIHCymicroscopa
confocalmicroscopaelectrnicadetincininmunopermiteladeteccindeantgenosamuyaltaresolucinenlos
estudiosdedistribucinsubcelular(Fig.5)(20,27).
FIG.5.
Ladeteccindetiroglobulinaenlatiroidesratnpormicroscopaelectrnica
inmunooro.Despusdellavadoconalbminatamponadaconfosfatosolucin
salinadesuerobovino(PBSBSA1%),ultrafinasecciones(0,1 micras)se
incubarondurantelanocheconunconejo...
[A.2]cinticadeyodurodetiroides
Fondo Lasntesisdelahormonatiroidea,sutetrayodadoformatiroxina(T4),y3,3',5triyodotironina(T3)
requiereunaglndulatiroidesnormalmentedesarrollado,unaingestaadecuadadeyodo,yunaseriedepasos
bioqumicosreguladosenclulasfolicularestiroideas,queformanlosfolculostiroideosesfricas,launidadfuncional
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delaglndulatiroides(28).Enlasclulasepitelialesdetiroides,elcotransportadoryodurodesodio(NIS)mediaen
lacaptacindeyoduroenlasclulasfolicularestiroideas(29),ysuexpresinestpolarizado(esdecir,queslose
expresaenlamembranabasolateral).Enlamembranabasolateraldelostirocitos,Na+/K+ATPasageneraun
gradientedesodioquepermiteNISparamediarinhibirseperclorato,Na+dependientedelacaptacindeyodo(30).
Elyodurosetranslocaalamembranaapicalyalcanzaellumenfoliculartravsdelamembranaapical.Sibienseha
supuestoqueelyodurosemueveatravsdelamembranaapicalprincipalmentedebidoalagradienteelectroqumico,
losestudiosenlaseccindecongeladosdemostraronqueseacumulaprimeroenelcitoplasmayslomstardeenel
lumen,yyodurodeeflujoapicalseacelerarpidamenteenlasclulaspolarizadasdespusexposicinaTSH(31).
Losestudioselectrofisiolgicosusandoinvertidasvesculasdemembranadeplasmasugirieronlaexistenciadedos
canalesapicalesdeyoduro,perosuidentidadmolecularnosehadeterminado(32).Elaninmultifuncional
intercambiadordependrin(SLC26A4/PDS),quetieneafinidadporanionestalescomoyoduro,cloruro,bicarbonato
ysecreequerepresentanunadeestasentidades(33,34).TantoNISyexpresinylaactividadSLC26A4se
incrementanporlaTSH(30,33).Mientrasquelacaptacindeyodotrminopuedeserutilizadoampliamentepara
invitroeinvivoenfoques,interpretacindedatosdebetenerencuentalasdiferenciascrticasentrelosdosajustes,
conelanteriorreflejalacaptacindeyodocelularyelltimoprincipalmentelaconcentracindeyodoorganifieden
elcoloide.
RECOMENDACIN2a
Basolateralabsorcindeyodurodeeflujocelularyapicaldeyoduropuedenserestudiadosenmonocapasde
clulaspolarizadascultivadasenmembranaspermeablessemiqueformanunsistemadedoscmaras,oen
modelosdeclulasnopolarizadostalescomolaslneasdeclulasdetiroidesFRTL5oderataPCCL3.
Comentario Medicindelaabsorcindeyoduroydeflujodesalidaenlasclulasnopolarizadosesrelativamente
sencillo.Elestablecimientodesistemasdeclulaspolarizadasrequiereelaislamientodeclulasprimariaso
transfeccinotransduccindeclulasheterlogaspolarizadasyladocumentacindelaformacindemonocapa
intacta,quesontediosoyconsumemuchotiempo(31).Paralosensayosdecaptacindeyoduro,lasclulasse
incubaronenunasolucindeabsorcinquecontienetpicamente105MNa125Iporunperododetiempo
deseado.OrganificacinpuedeserbloqueadaporeltratamientodelasclulasconMMI.Elcontenidodeyoduro
intracelularsedeterminamediantelamedicindeyoduroderadiomarcadoenloslisados
celularesusandoun
contadorgammadespusdelalisiscelular.Losresultadosseexpresancomocuentasporminutoporpocilloo,
idealmente,pormicrogramodeADN.Lacantidadgravimtricadeyodurointracelularmenteacumulada(ADNpmol
/mg)tambinsepuedecalcularsobrelabasedelaactividadespecficadeltrazador.Losmtodosalternativosquese
hanutilizadoincluyenelusodeinactivadoresdehaluro.Unproblemaconesteenfoqueesqueestosinactivadoresno
sonespecficosparayoduro,perotambinreaccionanconotroshaluros.Ladisponibilidaddeunaumentodeprotena
fluorescenteamarilla(EYFP)modificadoH148Q/I152Lconaltaafinidadporelyodurohapermitidoelseguimiento
deafluenciayyodurodeeflujoconrelativamentebuenaprecisinyunaltogradodecorrelacinconlasmediciones
directasdeyoduroderadiomarcado(3537).Alternativamente,laespectrometrademasassehautilizadopara
estudiarlaabsorcindepercloratoenFRTL5clulas,quetambinestmediadaporNIS(38).
UnnmerodemodeloscelularesyconfiguracionesestndisponiblesparaestudiareltransporteNISmediadapor
yodurode(46,31,33,3941),incluyendomltipleslneascelularesheterlogasqueexpresantransitoriamente
NIS(29,42).TalesestudiossontilesparalacaracterizacindelafuncindeNISylasactividadesdeorigen
naturaloprotenasmutantesartificiales(29,42).Porejemplo,sontilesparamedirelestadodeequilibrioyla
velocidadinicialyodurodeabsorcin,ascomolosparmetroscinticosdetransportedeyoduromediadaporNIS.
Lacaptacindeyodurotambinhasidoestudiadoenlneascelularesdecncertransfectadasotransducidascon
construccionesenlasqueelADNcdeNISestbajoelcontroldepromotoresespecficosdetejidoconelobjetivode
promoverlacaptacinde131Iyparainducirlamuertecelularatravsdesuemisinbeta(43,44).Paralos
estudiosqueevaluaronelefectodelaTSH,elmediousadoparacultivarclulastiroideassecambiaalosmediosde
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TSHprivadoparavariosdasyluegopresentadoalasdiferentescondicionesexperimentales.
2bRECOMENDACIN
Yodurodeeflujodetirocitossepuedeevaluarenlneasdeclulastiroideasdepercloratotratados.
Comentario Paraestudiaryodurodeeflujoinvitro,lasclulassecargancon125Idurante12horasyposteriormente
tratadosconpercloratoelfindebloquearlacaptacindeyodurodeporNIS.Elflujodesalidapuedeentoncesser
estudiadoporlarecogidadelossobrenadantesenunoomltiplespuntosdetiempo(5).Elcontenidointracelularde
yodurotambindebedeterminarseenunoomltiplespuntosdetiempo.Otraestrategiaesutilizarunsistemadedos
cmaras,enlaqueelflujodesalidadeyoduroenlamembranaapicalsepuedemedirporrecogiendoelsobrenadante
enunoomltiplespuntosdetiempo(31,40).Medicindeyodurodirectamenteconelectrodosselectivosdeiones
enlossobrenadantesdelisados
celularesoesproblemticodebidoaqueestassondasnosonespecficosparayoduro
ytambinreconocenotroshaluros,talescomocloruro.
FlujodesalidadeyoduroradiactivoporelSLC26A4canaldeaniones(pendrin)ocualquierotrocanaldeaniones
tambinpuedeserestudiadoenmltipleslneascelularesheterlogasqueexpresantransitoriamenteNISquepermite
lacaptacindeyodoinicial(3,40).Estopuedeserdocumentadoporlamedicindelcontenidodeyoduro
intracelularenlasclulascoexpresindeNISyelcanaldeinteresesconlacomparacindirectadelasclulasque
sloexpresanNIS.Unsistemamodeloqueesadecuadoparatalesexperimentoseslalneacelularderincanino
MadinDarbypolarizado(40).Latransfeccindeestasclulasesmuyineficienteyestopuederequerirel
establecimientodelneascelularesqueexpresandeformaestableotransduccinviralconvectoresapropiados.Por
otraparte,eleflujosepuedeseguirusandoEYFPH148Q/I152Lcomounindicadordelaconcentracindeyoduro
intracelular(3537).
RECOMENDACIN3a
Cinticadelaglndulatiroidesyodurodeabsorcinsepuedenestudiaratravsdelaadministracinde
yoduroradiactivo.Lospuntosdedatossepuedenobtenerinvivoodespusdelareseccinenbloquedela
trqueaylatiroides.
Comentario Tiroidescaptacindeyoduroradioactivo(RAIU)yotrosaspectosdelacinticadeyodopuedenser
125
estudiadosenroedoresutilizandodiferentesistoposdeyodo,mscomnmente I,queseinyectaporva
intraperitoneal(210 Ci125I).Laglndulatiroidesestestudiposteriormenteendiferentespuntosdetiempo,yasea
conunasondagamma(utilizado,porejemplo,paralaidentificacindetejidoparatiroideoencirugamnimamente
invasiva)bajoanestesia(45,46)opostmortemdiseccionadoconlatrqueaenbloquebajounmicroscopioyse
procesaronpararadiometradurante1minutoenuncontadorgamma.Losresultadossepuedenexpresarcomouna
funcinde125Ienelsuero(47)ocomoporcentajedeladosisinyectadatotal(46).TiroidesRAIUalcanzaun
mximoaaproximadamente4horasdespusdelaadministracinde125Iymesetasenalrededorde12horas(48).
Estossonlospuntosdetiempoaproximadosquepuedenvariarsegnlaespecieylacepadelroedorbajo
investigacin.Momentodela125deinyeccinquepuedesercoordinadoconlainyeccindeTSHbovina(bTSH
10 mU)paraevaluartiroideaRAIUlainducidaporTSH.EnalgunoscontextosestilparasuprimirlaTSH
endgenaporelpretratamientodelosanimalesconT3durante4dasantesdelaadministracinderadioistopos(
48).EstominimizarlaposibilidaddequeTSHendgeno,quepuedeserdiferenteentredosgruposdeanimales,
estinterfiriendoconlarespuestaabTSH.Enparticular,unestudiocomparativoenratasyratonesutilizando
tirotropinahumanarecombinante(rhTSH)indicaqueesmuchomsimportanteparatratarpreviamenteconT3y
suprimirlaTSHendgenaenratasqueenlosratones(49).
3bRECOMENDACIN
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Tiroidesyoduroorganificacinsepuedecuantificaratravsdelapruebadedescargadeperclorato.
Comentario Lapruebadepercloratopermitelacuantificacindelacantidaddeyodurodequenormalmenteseuneala
tiroglobulina(50).LapruebasebasaenelhechodequeelyodurosetransportaalasclulastiroideasporNIS,
luegoseliberaenellumenfoliculardondeserpidamenteunidocovalentementearesiduosdetirosilodela
tiroglobulina(organificacin).LosanionestalescomopercloratoinhibenNIS,ycualquieryodurodeintratiroideoque
nohasidoincorporadoalatiroglobulinaseliberarpidamenteeneltorrentesanguneoenlamembranabasolateraly
nopuedensertransportadosdenuevoentirocitos.Enlapruebadepercloratoestndar,losrecuentostiroideasse
midenaintervalosfrecuentesdespusdelaadministracindeyodoradiactivoconelfindedeterminarlaabsorcinen
laglndulatiroides.Despusdedocumentarlaabsorcin,percloratoseadministraporvaintravenosao
intraperitoneal,ylacantidaddeyodoradiactivointratiroideosemideaintervalosfrecuentes.Encondiciones
normalesdeorganificacinyoduro,nohayunadisminucinsignificativaenelrecuentodeintratiroideos.En
contraste,unaprdidade10%indicaundefectoorganificacin,quepuedeserparcial(10%90%)ocompleta(>
90%).
Enratones,percloratodesodio(NaClO4)seinyectaporvaintraperitoneal1horadespusdelainyeccinde125I
porvaintraperitoneal,ylosanimalessematan1horamstarde(47).Laradiactividadquequedaenlaglndula
tiroidesdelosanimalestratadosconpercloratosecomparaconel125Icaptacinmedidoenlasglndulasdelos
ratonesdecontrolquenofueronexpuestosalapersecucinyoduroinducidaperclorato.Unidaaprotenas125I(es
decir,eltotaldelashormonastiroideasradiactivounidosaprotenasdetransportedesuero)sedeterminaentodaslas
muestrasdesangredespusdecidotricloroactico(TCA)precipitacin(47).Otroshansidocapacesderastrearla
captacindeyodoyladescargaenratonesutilizandodirectamentesondasgamma(45).Elpercloratodepotasio
(KClO4)sehautilizadoenratas618horasdespusdelainyeccinde125Iysemuestraparareducirel125I
tiroides/ratiodesangrecuandoseinhibelaperoxidasatiroidea(51,
52).124tomografaportomografadeemisin
depositronesI/computarizado(PET/CT)sehautilizadoparaevaluarlaabsorcinraravezyladescargadeyoduro
entiroidesderoedoresinvivo(53).
3cRECOMENDACIN
Cinticadelasecrecintiroideapuedenserestudiadosinvitroutilizandolareseccinenbloquedelatrquea
ylatiroides.
Comentario EstaestrategiaseutilizaparaevaluarinvitrolasecrecintiroideainducidaporTSH,loqueminimizala
interferenciadeotrosenvivofactores(20).Losratonesrecibenunainyeccinintraperitonealdeaproximadamente
30 Cide125Iy24horasdespusdelatrqueaylaglndulatiroidesseeliminanenbloqueyseincubdurante3
horasenunmediodebicarbonatodeKrebsRingerquecontienen0,5 gdealbminadesuerobovino/L(BSA),8
mMglucosay104MNaClO4paraevitarlarecirculacindeyoduro.Radiomarcadohormonatiroideasecretadain
vitroseextraeconbutanol(54).Lasecrecinseexpresacomounporcentajedelaradiactividadtotaleneltejidoal
iniciodelaincubacin.Hayunainduccindeaproximadamente10vecesenlasecrecintiroideaconlaadicinde5
mU/mldeTSH(20).
[A.3]imgenestiroides
Fondo Imgenesdelatiroidesenroedorespequeoshaseguidolastcnicasdesarrolladasparalossereshumanos,
comolaexploracinconistoposdeyodo,microPET,CT,yultrasonidodealtafrecuencia(HFUs).Sinembargo,el
tamaodelaglndulaminutossigueplanteandounretoimportanteparalaobtencindeimgenesdealtaresolucin
dealtacalidad,quehasidoparcialmentesuperadoporlanuevatecnologareciente.
RECOMENDACIN4a
Imagenfuncionaldelaglndulatiroidessepuederealizarutilizandoistoposradiactivosyyodurode
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adquisicindeimgenesenunacmaragammaoatravsdemicroPETCT.
Comentario 123Iy131Isepuedeutilizarjuntoconunacmaragammadeimgenesplanas,ascomolatomografa
131
poremisindefotones(SPECT)estudios. Itieneunavidamedialarga(8das),perosualtaenergaproduce
imgenesdemalacalidad.Encontraste,labajaenergaemisor123Iesideal,produciendogammagrafastilescon
unadosisbajaabsorbidalasprincipaleslimitacionessonelresultadodesucortavidamedia(13horas).La
gammagrafadetiroidesenratasanestesiadastambinsepuederealizar124horasdespusdeunainyeccin
intraperitonealde10 Ci125IusandoSPECT(46).Imagingsemejorasustancialmentemediantelacolocacinde
losanimalesenunadietabajaenyodo(LID)duranteaproximadamente3semanasantesdelosestudios(46).Esto
mejoralaRAIUtiroides4horasdesdealrededorde3,5%a27%yhacequelagammagrafadetiroides,entodoslos
tiemposdeadquisicin,msbrillanteymsdetallada(46).SPECTenratonesutilizando99mTco123Tambinhe
sidoinformado(55,56).
EstudiosdePETdelatiroidesusando124meproducenbuenacalidaddeimagen,conunavidamediarazonable(4
das).LasensibilidaddelaPETesmayorqueladeunacmaradecentelleo,ascomoelcontrasteylaresolucin
espacial(53).Paraimgenesdetiroidesprecisaenratas,lacombinacindemicroPETymicrotomografaaxial
computarizadacon124esnecesarioI(Fig.6)(57).Ratasadultasanestesiadasoratonesseinyectanatravsdela
venadelacolacon20a540 CideNa124IyescaneadosenelmicroPETdurante40minutosa24,48,y72horas
despusdelainyeccinbajoanestesia.Losdatosdeimagenresultantessenormalizaronalaactividadadministrada
entrminosdelporcentajedeladosisinyectadaporgramodetejidos(Fig.6B).Regiones2Dextradas
manualmentedeintersovolmenes3Ddeinterssepuedenutilizarparadeterminarelreayelvolumentiroideo.
Porejemplo,elvolumendelatiroidesdeunadulto400500 gratavaraentre35y70 l(57).Ademsdela
glndulatiroidesens,esteenfoquetambinsehautilizadoparametstasisdeimagendecncerdetiroidesenratones
(58).
FIG.6.
Imgenesdelatiroidesusando124Iyoduroinvivo.(A)biodistribucinde
124Iyoduroenlatiroidesderatonesmodificadosgenticamenteenlosquela
captacindeyododelatiroidessesuprimeporinduccindeuntransgn1
semanadespusdesupresinsealiviaylacaptacindeyodosenormaliza....
RECOMENDACIN4b
MicroImagingmorfolgicadelaglndulatiroidessepuederealizarporHFU.
Comentario HFUs(20100 MHz)esunametodologadeformacindeimgenesqueseextiendelainvivola
visualizacindelaresolucinmicroscpica(delordende100 micrasFig.7)(59,60).Laglndulatiroidesdeun
ratnpuedeserexaminadausandounsistemadeMicroImagingquetieneunasolasondaelementodelafrecuencia
centralyunrangodinmicode52 dB.HFUsserealizabajoanestesiageneral(porejemplo,1,5%2%deisoflurano
vaporizadoenoxgeno)enunescenariocalentado.Furseretiradelazonadeinters(cuelloylaaltatrax)para
obteneruncontactodirectodelgeldeultrasonidoalapieldelanimal,reduciendoalmnimolaatenuacinde
ultrasonido.Formacindeimgenesentiemporealsepuederealizarconunavelocidadde20 Hz(correspondientea
unaresolucintemporalde50milisegundos)elcentrodelatiroidesderatnsecolocaalrededorde6 mmdelazona
focaldeltransductor.Elestudio,queincluyemedicionesyadquisicindeimgenesprecisas,repetiblesydealta
calidad,sepuedecompletarenunos30minutosenlasmanosdeunoperadorbienentrenadoycapacitado(61).
FIG.7.
Ecografadealtafrecuencia(HFU)delatiroidesratn.(A)imagen
representativadelatiroidesderatnusandoHFUsysucorrelacinanatmica
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con(B)imgenestransversaleshistolgicasdelasregionessubhyoidy
traqueales.Estructurasvisiblesincluyen:1,...
Elvolumendecadalbulosepuedecalcularutilizandolafrmulaovoide(anchuraxprofundidadxlongitudx/6)(
61).ElvolumendelatiroidesdeunadultoratnC57BL/6oscilaentre2,1y4,9 l.En6npropil2tiouracilo
(PTU)tratadaconratonesnobociodifusoconvolmenesqueoscilanentre4,1y8,8 l.Losndulostiroideospueden
serdetectadosatravsdeestametodologa,as,conelndulodetectablemspequeoquepresentaundimetrode
0,46 mm.Caractersticassugestivosdemalignidadtambinpuedenidentificarsecomohipoecogenicidadrelacincon
eltejidonormaladyacente,losmrgenesmaldefinidos,microcalcificacionesinterna,formasirregulares,yla
extensinextraglandular(61).Estodeberasertilenlacaracterizacinfenotpicademodelosderatndecncerde
tiroides.
[B]Laevaluacindecirculacinydeltejidonivelesdehormonasdelatiroides
Visindeconjunto "Estadodelatiroides"deunorganismoeslasumadetodosloseventosdesealizacindela
hormonatiroideaydependetantodelosnivelescirculantesdelahormonatiroideaydefactoreslocalesqueinfluyen
enlaconcentracinnucleardehormonatiroideaentejidosespecficos.Latirotoxicosiseselsndromeclnico
asociadoconelexcesodehormonatiroidea,mientrasqueelhipotiroidismodedeficienciadelahormonatiroidea.Al
mismotiempo,lostejidosindividualespodrandicequetieneelestadodeltiroidesespecfica,esdecir,hipotiroidismo
otirotxica,relativamenteindependientedelosnivelessricosdehormonatiroideaestoesdebidoalasactividades
desyodasasespecficosdetejidoy/omecanismosdetransporte(Fig.8).Porejemplo,laisquemiaylahipoxia
hacenqueelcerebroyelcoraznparaponersemuyhipotiroidismoenunanimaldeotramaneraeutiroideodebidoa
lainduccindetipoIIIdeiodinasa(D3)expresin(6265).Almismotiempo,eltejidoadiposo(BAT)presenta
marrnlocalizadosaumentodelahormonatiroideadesealizacinpocodespusderoedoressemuevenalfro
debidoalainduccinagudadetipoIIdeiodinasa(D2)expresin(66).
FIG.8.
Suministroyelmetabolismodelashormonastiroideasafectannegativamente
ypositivamenteT3genesregulatedenelcerebro.Paraconstruirestafigura,
losautoresutilizaronlapolimerasadetranscriptasainversacuantitativa
reaccinindividualcadenadedatos(RTqPCR)deT3regulated...
Unaformacomndeevaluarelestadodeltiroidesdeunorganismo,elestadodeltiroidesakasistmica,esmediante
lamedicindelosnivelessricosdelahormonatiroidea(T4yT3)yTSH,asrevertirT3tambinsepuedemedir,
peroporlogeneralsereservaparasituacionesespecialesparaconfirmaranormalidadesenelmetabolismodela
hormonatiroidea.Estadodelatiroidesespecficadetejidosepuedecaracterizarmediantelamedicindirectadelos
nivelesdehormonastiroideastejido.Porlogeneral,lamedicindelaexpresindeT3responsivegenes(vasela
seccinI)y/oT3responsiveparmetrosbiolgicos(vaselaSeccinJ)estambinpartedeltrabajoparadefinir
elestadodeltiroides.
Aligualqueconlosensayosclnicosdesarrolladosparalospacientes,unnmerodeinmunoensayosparalaT4,T3
yTSHhansidodesarrolladosespecficamenteparalosroedores,quetienenencuentalasdiferenciasdetiposy
capacidaddeyodotironinasueroprotenasyespecificidaddeespeciedelamolculadeTSHvinculante.Engeneral,
estosensayosfuncionanbienypresentanlasuficienteprecisinparaevaluarlafuncindelatiroidesyelestadodel
tiroidessistmicaenroedores.Encircunstanciasexperimentalesodefectosgenticosespecficos,losnivelessricos
yodotironinanosiempresonrepresentativasdelahormonatiroideadesealizacineneltejidooelnivelcelular.En
estoscasos,elestadodeltiroidespuededeterminarsemediantelamedicindeT3concentracioneseneltejidoo
clulasespecficasmediantelaadaptacindelosinmunoensayosdesarrolladosparalasmedicionesdesuero.
[B.1]Suero
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Fondo Losnivelesdehormonastiroideasensueropuedenvariarsustancialmenteenfuncindelsexo,laedad,yla
cepadelroedorydebensercontabilizadoseneldiseodelestudio.Losniveleselevados(comosedefineentrelos
rangosnormalesajustados)suelenindicarhipertiroidismo,mientrasquedisminuyeronlosnivelessricosson
indicativosdehipotiroidismo.Ladeficienciadeyodo,alteracionesenelmetabolismodelahormonatiroidea,as
comolasensibilidaddelhipotlamoylahipfisisalahormonatiroideapuedealterarlarelacinrecprocacuantitativa
entresuerodeT4,T3,yTSHcomoesamenudoelcasoenlosmodelosderesistenciaalaTSHuhormona
tiroidea.
Losinmunoensayosfuerondesarrolladoshacedcadasyhanservidocomopiedraangularparamediryodotironinas
sueroyTSH.Sinembargo,estosensayosoriginaleshansidosustituidosengranmedidaporlosinmunoensayosms
recientes(porejemplo,enzimadeensayodeinmunoabsorcinligado[ELISA],ensayoradiomtricoinmune
[IRMA])estndisponiblescomercialmente,todosloscuales.Elusodekitsdisponiblesenelmercadoparamedir
yodotironinassueroenroedoresnoessencilladebidoaquemuchosdeestoskitssedesarrollanparaelsuerohumano
yhacenusodeunamatrizartificialparaimitarprotenasdeuninhumanosconmayorafinidadycapacidadquelos
delosratonesoratas.Estoskitsutilizan"agentesdedesplazamiento"paradesplazarelyodotironinasdelaglobulina
fijadoradetiroxinahumana(TBG,porejemplo,8anilinonaftalencidosulfnico,difenilhidantona,cidosaliclico)
queseutilizaconfrecuenciaenexceso(paraelratn).Aesterespecto,interfierenmsconT3aT4,yenparticular
cuandoelsueroT3valoressonbajos.Estoslosepuedecorregirapropiadamenteparamedianteelusodesuerode
ratniodothyroninedeficientecomoenblancoylaconstruccindeunacurvaestndarquecalibrarelensayopor
ejemplo,suerodeemparejadogencuadro8(Pax8)knockout(KO)losratonesnotratadosconT4oT3duranteal
menos2meses(67).LaslimitacionestcnicastambinrequierenlautilizacindesueroderatnTSHenblancoy
deficienteparalapreparacindeunacurvaestndarconTSHdesueroderatn,noTSHhipofisaria,comoestndar(
68).Lquidoespectrometrademasas/cromatografatndemtambinseestconvirtiendoendisponible,aunquesu
aplicabilidadparalosroedoreseslimitadaporquelosvolmenesdesuerorequeridossontodavademasiadogrande.
RECOMENDACIN5a
SricatotalT4yT3concentracionespuedensermedidosporradioinmunoensayo(RIA),ounaseriedeotros
inmunoensayostalescomoELISAoIRMA,siemprequelascurvasdecalibracinsepreparanconsuerode
roedoresdespojadodelahormonatiroidea.
Comentario Curvasestndartpicassepreparanenelrangode2,5a240 ng/mLparaT4y0,16 ng/mLparaT3.
Estosensayossepuedendesarrollarenlacasamediantelamodificacindekitsparausohumanoobtenidoapartirde
mltiplesfuentescomerciales.RIAshechasencasatienenunamayorsensibilidadconlasmedicionesenelrangode
0,053 ng/mL(67).Ensayosclnicosdesarrolladosparalospacientespuedenserutilizadossiempreycuandola
curvaestndarderoedoresesparalelaalacurvaestndarproporcionadoenelkityunfactordecorreccinadecuado
aplicadolacurvaestndarderoedoressedebeutilizarparacalcularlosresultados(67).Comercialmentedisponibles
kitsdiseadosparalamedicindesueroderatnT3yT4en10 muestrasmulsehandesarrolladoyutilizadocon
resultadosaceptables(69).
5bRECOMENDACIN
LosensayosparamedirTcirculantes4yT3serealizanmejorutilizandosueroenvezdeplasma,yaquela
formacindefibrinaafectapipeteo,yaditivostalescomolaheparinapuedeinterferirdirectamenteconla
determinacindehormonas.
Comentario Muestrasdesangrefrecuentespuedenserobtenidosduranteelcursodeunexperimentosiselimitaa
aproximadamente10%delvolumentotaldecada24semanasy1%cada24horas.Serumsepuedealmacenara20
Cduranteperodosdetiempolargos.Elusodelaanestesiapuedetenerefectosvariablesenlosnivelesdehormona
tiroidea,ycadainvestigadordebeevaluarlosefectospotencialesensusistemaconlaanestesiaqueestnutilizando.
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SueroT3yT4exhibenmnimasvariacionescircadianasalolargodelosciclosdedaynocheestospodranser
tomadosencuentaenfuncindelmomentodelarecogidademuestras.Lasmuestrasdesueroconaspectolechosode
lactantespresasodesuscraspuedendarresultadoserrneosdebidoasualtocontenidodelpidos.Enestoscasosla
extraccindelsueroylaeliminacindeloslpidosusandocloroformoesrecomendable(67).
5cRECOMENDACIN
Lasdeterminacionesdelosndicesyodotironinagratuitas(FT4IyFT3I)enelsuerosepuedenlograr
mediantelamedicindelaconcentracindehormonatotalensueroylacapacidaddeuninyodotironina
sueroutilizandounodelosmtodosderesinaocarbn.
Comentario Laexistenciadeprotenasenelsueroqueseunendeformareversiblelahormonatiroideaestablecedos
piscinascirculantesdeT4yT3(esdecir,unidoaprotenaylibre).Laprotenasdeuninprincipalcirculantedealta
afinidaddelahormonatiroideadifierenenroedoresysereshumanos,contranstiretinasiendolaprincipalprotenaen
laratayTBGenlossereshumanos.Eslahormonatiroidealibreenelplasmaqueestenequilibrioconlostejidosy
afectaalasealizacindelahormonatiroidea.Lamedicindelahormonalibreporprocedimientosdistintosde
dilisisdeequilibriopuededarresultadoserrneos,aunquemicrofiltracindelasmuestrassehautilizadocon
resultadosconfiables(70,71).Equilibriodedilisisdesuerocontrazadormarcadoyodotironinaenbolsasde
dilisissehautilizadoparamedirlaTlibre4yT3enlarata.Elmtodonoseutilizaparalosratones,debidoal
requisitodemsde1 mldesueroparalamedicinportriplicadoporqueamenudoseproducenfugas.Elusode
suerodiluidoyaplicarlacorreccinnoesaconsejable.Slo100 ldesueroserequierecuandoseutilizala
microfiltracindelasmuestras(70).
Alternativamente,unaestimacindelaFT4IoFT3Isepuedenobtenerusandounvolumenrelativamentepequeo
desueromedianteelusodelaresinaocarbnmtodos(72).Elsuerosediluyeensolucinsalinatamponadacon
fosfato(PBS,pH7,4)quecontena[125I]T3o[125I]T4.Lasmuestrassedejaronequilibrarymezclan
posteriormenteconunasolucindecarbnvegetalactivado0,0125%.Seobtienengrnulosdecarbnydespusse
contaronenuncounter.Lascondicionesdebenseroptimizadosdetalmaneraqueaproximadamenteel20%30%
deltrazadorseuneacarbnenlossuerosdelosanimalesdecontroleutiroideo.UnaestimacindelaTlibre4oT3
(FT4IoFT3I)sepuedecalcularmultiplicandoeltotaldeT4oT3concentracinsricadelaT4oT3captacin
decarbn.
5dRECOMENDACIN
DilucindeistoposdeespectrometrademasasentndemsepuedeutilizarparamedirT4yT3enmuestras
biolgicas.
Comentario Losinmunoensayosparalamedicindelahormonatiroideapuedensufrirdemalaespecificidad.Como
alternativa,lamedicinsimultneadeT4yT3sepuedelograrmedianteelusodeistoposdedilucin
espectrometrademasastndemdentrodeunasolacarrera(67,73).Elmtodorequiere100 ldesueroyimplicala
adicindepatrninterno,precipitacindeprotenasconmetanolylainyeccinenunacolumnaC18.T4yT3se
eluyenposteriormenteusandoungradientedemetanol.Estemtodoespreciso,especficoypreciso(coeficientede
variacinde3,5%9,0%).Unapreocupacineselvolumendemuestranecesarioparaladeterminacindela
hormonalibre,quetodavaesrelativamentegrandeparaaplicacionesqueimplicanratones,exceptoenelsangrado
terminal.Metodologasimilaraplicandocromatografalquidaespectrometrademasasentndemsehadesarrollado
paralamedicindeiodothyronamines,unayodotironinadescarboxiladopresenteenunacantidaddefluidos
biolgicos(74).
RECOMENDACIN6a
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RatayratnTSHensuerosepuedenmedirusandokitsdeensayoTSHderatacomercialmentedisponibles.
Alternativamente,RIAsespeciesespecficassepuedenrealizarutilizandolosreactivosdelProgramaNacional
dePptidosyhormonal,elInstitutoNacionaldeDiabetesyEnfermedadesDigestivasyRenales(Bethesda,
MD).
Comentario Engeneral,losacuerdosdeintegracinregionaldeTSHsonmssensiblesqueAMIR.Ensayos
comercialesnoproporcionanespeciesreferenciacruzadaespecficay,porlotanto,lascurvasdecalibracinson
raramenteparalelosalosvaloresobtenidoscondilucindelamuestrareal.Sinembargo,reactivoscomercialesse
puedenadaptarparamedicionesespecficasyprecisasdeTSHcomosedescribeacontinuacin.
CurvasestndardeTSHdebenconstruirseutilizandoespeciesespecficasdecirculacin(suero,nopituitaria)
estndardeTSH,diluidoensueroTSHdeficienteobtenidoapartirdelamismaespecie.EstndardeTSHsricase
obtienedeanimalesprestadoshipotiroidismo(vaselaSeccinE.1).ElcontenidodeTSHestcalibradocontraun
estndarbTSHenunbioensayo.SueroTSHdeficientesepreparahaciendoroedorestirotxicos(tratamientocon20
mgdelevotiroxina[LT4]/100 gdepesocorporal[BW]/dadurante1semana).Nonparallelismmuestraconlas
curvasdecalibracinsedebealasdiferenciasentreespeciesydereactividadcruzadaconsubunidadesdeTSHlibres
yotrasglicoprotenaspituitariasenextractosdepituitaria.ElusodelalactoperoxidasaparaetiquetarTSHcon125I
mejoralaestabilidaddelaTSHmarcadaylasensibilidaddelensayodeTSHhastatirotxicarangos(68).Medicin
delaconcentracindeTSHenlosextractosdelaglndulapituitariasepuedehacer,sinembargo,utilizandoel
mismoensayoaunadilucinde1:500a1:2000entampndeensayo.Lacurvaestndartambinsepuedeconstruir
usandotampn,enlugardesueroderoedoresTSHdeficiente,comodiluyente.EjecucindelosRIAsen
desequilibrio(adicindeltrazadorisotpicoduranteuntiempomscortodespusdelaincubacindelanticuerpo
TSHconlasmuestras)mejoralasensibilidaddelensayo.SinohaymedicinfiableTSHdesueroderata/ratnest
disponible,losnivelesdemRNATSHenlaglndulapituitariapuedenserutilizadoscomounaindicacindela
produccindeTSH(75).
6bRECOMENDACIN
ActividadbiolgicadeTSHpuedeserestudiadoporestandarizadoinvitroensayos,ascomoinvivoensayos.
Comentario ActividadbiolgicadeTSHesmoduladaporunnmerodefactoresincluyendosuestructura,
glicosilacinoramificacindehidratosdecarbono,ascomoporelreceptordeTSH.Laactividadbiolgicadela
molculadeTSHpuedeserdeterminadoporuninvitrobioensayousandoclulasdeovariodehmsterchinoque
expresanestablementeelreceptordeTSH(68,76).Elsubclncl213deJP2626esparticularmentesensibleabajos
nivelesdeTSH.Acercade50000clulassesembraronentubosdeensayoindividualesyseincubaroncon20 lde
suero,seguidodeextraccinconcAMP0,1 MHClylamedicinporRIA(77).Losespaciosenblancose
procesancomoyasehadescritoconsueroTSHagotadoobtenidoapartirdeT4tratadaconratones.laproduccin
decAMPesunafuncindelacantidaddeTSHendgenafuecontenidaenlamuestradeplasma(68).Dividiendo
elcAMPgeneradoinvitroporlosvaloresdeTSHenlamuestradeplasmaproporcionaunndicedelaactividad
biolgicadeTSH.Porsupuesto,estopuedevariardeacuerdoconlasmutacionesenlamolculadeTSHogradoy
tipodeglicosilacinoramificacindehidratosdecarbono.Sinembargo,estoscambiosnosiemprepuedenmostrar
diferenciasbiolgicasutilizandoinvitropruebas.Laalteracinenlaglicosilacindeprotenasolaestructuraterciaria
(hidratosdecarbonoderamificacin)delresiduodeazcar,alteralavidamediadeTSHinvivoyafectaasu
bioactividad.Sinembargo,estopuedenosersiempredemuestrainvitrobioensayo.Enalgunoscasossepuede
demostrarmedianteisoelectroenfoque,siunacantidadsuficientedeTSHpuedeserconcentradoydesarrolladopor
transferenciaWesternoporConcanavalinaAcromatografa(78).Otromtodoconsisteenpurificarporafinidadla
TSHestprobando,inyectarporvaintravenosaenratonesoratasconsupresindeTSH(tratadoscondosisaltade
T3),yseguirsuvidamediaporRIA,oseguirlaactividadbiolgicadeTSHmediantelamedicindeT4secrecin
enelsuero.DisminucindelabioactividadTSHtambinpuedesercausadapordefectosenelreceptordeTSHoel
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nmerodereceptoresdeTSHexpresados
enlasuperficiedelaclulafolicular(porejemplo,TTF1heterocigotos
ratonesKO)reduce.Estopuedeserconfirmadoporlarespuestaquemuestraintactaenuninvitrobioensayojunto
conalteracinenlarespuestadelanimalainyectarTSHautntica(79).
RECOMENDACIN7
Hormonaliberadoradetirotropina(TRH)TSHinducidaporlasecrecindelaspruebassepuedeutilizarpara
evaluarlacapacidaddelaglndulapituitariaparasecretarTSH.Thyroidalpruebassecrecininducidapor
TSHsepuedeutilizarparaevaluarlacapacidaddelaglndulatiroidesparaproducirysecretarlahormona
tiroidea.
Comentario ElejeTRHTSHpuedenserinterrogadosyaseaenlapituitariaonivelglandulartiroideamediante
pruebasdinmicasespecficas.LapruebadeestimulacinconTRHserealizaconunainyeccinintravenosao
intraperitonealdeTRH(5,0 g/kgBW).Serecogesangre30minutosdespusparalamedicindeTSHensueroy2
horasmstardeparalamedicindesuerodeT3,queindicalacapacidadderespuestaalaTSHtiroideainducida
porTRH.ElaumentoprevistodelaTSHsricaesdetriple,mientrasqueunaelevacindeaproximadamenteel50%
enelsueroT3seespera(80).
LapruebadeestimulacinconTSHserealizaconunainyeccinintravenosaointraperitonealdebTSH(2250 mU/
100 gBW).Doshorasmstarde,serecogesangreparalamedicindesuerodeT3,conunaelevacinesperadade
aproximadamente40%encomparacinconlosnivelesdereferencia(7981).Unenfoquealternativoespara
pretratarratonesdurante4dasconT3(1 g/d)conelfindesuprimirlaTSHendgenayluegoadministrarbTSH
(2,10,o30 mU)enlamaanadelquintoda.Enestecaso,larespuestatiroideaseevalaenfuncindelaelevacin
inducidaporTSHensuerodeT43horasmstarde,queesaproximadamente1 g/dl(81)otresvecesenlalnea
debase(82).Unenfoquesimilarsepuedeutilizarenratas,yelTinducidaporTSH4respuestavarabastante
sustancialmentedeacuerdoconlacepaderata.Todavaenratas,inducidaporlaTSHT4mesetasrespuestaauna
dosisbTSHdeaproximadamente100 mU,conunaumentodealrededorde2 g/dlporencimadelalneadebase(
79).EsdedestacarqueunaevaluacincomparativadelacapacidadderespuestadelatiroidesarhTSHenratasy
ratonesindicapobreonularespuestaenratasquenofueronpreviamenteconT3(49).
[B.2]Tissue
Fondo MientraselplasmaconstituyelamayorpiscinaextratiroideadeT4,aproximadamentedosterciosdetodoslos
T3seencuentraenelespaciointracelulareinicialaaccindelahormonatiroideamediantelauninareceptores
nuclearesdehormonastiroideas(TR).LaintensidaddelasealizacindependedelnmerodeTRsocupadosen
cualquierdadoT3responsivetejido.Debidoaqueloscompartimientosextracelulareseintracelularesestnen
comunicacinylahormonatiroideamolculasdetrnsitodentroyfueradelasclulasatravsdelosdiferentes
transportadoresdemembrana,enlamayoradelostejidosdemedicindelaconcentracinsricadelahormona
tiroideaproporcionaunaestimacindelaintracelularT3concentracin.Sinembargo,unainterrupcindelsistema
detransportepodraimpedirellibreaccesodeT3alcompartimientointracelular.Adems,elmetabolismo
intracelulardelahormonatiroidea,tantolaactivacincomolainactivacin,podraafectaralasealizacindela
hormonatiroideadeunamaneraquenosepuedepredecirapartirdetomademuestrasdelcompartimentodeplasma.
Porlotanto,losnivelessricosdeT3noreflejannecesariamentelacantidaddeT3entodoslostejidosola
intensidaddelasealizacindelahormonatiroidea.LamedicindirectadeltejidoT3contenidoproporcionaesta
informacinadicional.
RECOMENDACIN8
ContenidodetejidodeT3yT4puedemedirseporinmunoensayosdespusdelaextraccindetejido.
Comentario Extraccindesangreapartirdetejidosporperfusinesimportanteparticularmenteparatejidosmuy
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vascularizados.Despusdeobtenerlamuestradesangre,losratonessesometieronaperfusinconheparinaque
contienePBSatravsdeunaagujaquesecolocaenelventrculoizquierdo(VI)delcoraznseguidoporuncorte
abiertalavenacava.Lostejidosserecogenacontinuacin,secongelaroninmediatamenteenhielosecoyse
almacenarona80C.Yodotironinasseextraendetejidosutilizandometanolcloroformo(1:2).Lacantidadde
tejidoqueseextraedependedelestadodelahormonatiroideadelanimalylaabundanciadelahormonaenuntejido
especfico.Amododeejemplo,50 mgdecerebroy15 mgdehgadodeunratneutiroideogeneralmentedarn
resultadossatisfactorios,perolacantidaddebeseraumentadoenmuestrasderatonesoratasconhipotiroidismo.T
radiactivo3oT4,debeaadirseacadamuestraparadeterminarlaeficienciadelaextraccinunamezclade[125I]
T3y[131I]T4sepuedeutilizarcuandoambashormonassonobjetodeestudio.Dependiendodelprocedimientode
extraccin,cloroformodebeeliminarse,yaquecontienelpidosyotrassustanciasqueinterfierenenlosacuerdosde
integracinregional.Estoimplicaretroextraccinenclorurodecalcio,laconcentracindelosextractos,yla
evaporacin(83).Unavezquesehacompletadolaextraccin,sedisuelveelextractoseco,preferiblementeen
tampnosueroderoedoresconcarbnvegetal,yT3contenidomedidoporelinmunoensayoespecfico,siguiendo
lasrecomendacionesdadas.ARIAaltamentesensibleesdecisivaparaobtenerresultadosfiablesenmuestras
pequeasoenmuestrasdeanimaleshipotiroideos.ParaladeterminacindetejidoT4contenido,ensayos
comercialesnosonlosuficientementesensiblesyaltamentesensibleT4RIAentampndebenutilizarse(83).
Todoslosensayosdebenincluirtubosenblanco/decontrolapropiadas,quecontienetodoslosreactivosexcepto
paralamuestradetejido,paraserutilizadoparacomprobarelfondodelensayo.Validacindelensayotambin
incluyelademostracindeparalelismoentreunacurvadetejido(conmltiplespuntosprogresivamentemayores
cantidadesdeextractodetejido)ylacurvaestndarporencimadelrangodeinters.
[B.3]FuentesdetejidoT 3ylasaturacinTR
Fondo T3presenteenlostejidosextratiroideapuedederivarsededosfuentesdistintas:plasmaT3yT3generado
localmenteapartirdeT4(84,85).ElltimomecanismoseencuentratpicamenteenlostejidosqueexpresanD2
talescomoelcerebro,pituitaria,yBAT.LasestimacionessugierenquealmenoslamitaddelaT3presentesenlos
tejidosD2expresanesproducidolocalmentedesdedesyodacindeT4(8689).MsrecientementeexpresinD2
sehaencontradoenungrannmerodetejidosyclulas(9098),loqueilustralaimportanciadedefinirsu
contribucinalasealizacindelahormonatiroideaespecficosdetejido.Ladeterminacindelasfuentesde
intracelularT3esfactibleporqueplasmaT3seequilibrarpidamenteconlamayoradelostejidos(peronotodos).
Enelpuntodetiempodeequilibrio(Tm)sepuedeutilizarelplasmaT3laconcentracinylaproporcinnuclear/
plasmadetrazadorT3paraestimarlacantidaddeTnuclear3quesederivadeplasma.Unaestrategiasimilarpuede
aplicarseentoncesparaT4,devolviendoelTnuclear3quesederivadelaconversinlocaldelaT4aT3.
RECOMENDACIN9a
LacontribucindeplasmaT3altejidoT3sepuedecuantificarmediantetcnicasdetejidodeetiquetadoque
entraeninyeccionesintravenosasnicasobombaimpulsadaporlainfusincrnicadetrazador
radiomarcadoT3.
Comentario Losestudioshansidoestandarizadosenratas,peropodranenteoraseraplicadoenratones,as,a
condicindequelaslimitacionesdebidoaeltamaodelcuerpoylaanestesiasonsuperados.Lostejidospuedenser
estudiadoscomountodoofraccionarparaaislarlafraccinnuclearquecontieneTR(66,8689).Despusdela
administracinde[125I]T3,Tmsedefinecomoeltiempoenelquelacantidaddetrazador[125I]T3queentraen
eltejidoocompartimentonuclearesigualalacantidadde[125I]T3quesaledelmismocompartimiento.Tmse
alcanzaenhorasdelainyeccinintravenosaopocosdasdelarranquedelabomba.EnlaTm,el[125I]T3
proporcindetejidodeplasma/ylaconcentracinplasmticadeT3seutilizanparacalculareltejidoT3
concentracin.Clculossimilaresseutilizanentrazadoresradiomarcadoscasosseinfundenatravsdebombas(99,
100).Estosmtodossehannormalizadocon125IT3deseparacinporcromatografaenpapeldescendente.Hay
buenacuerdodequelacromatografalquidadealtorendimiento(HPLC)ycromatografalquidadeunrendimiento
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ultra(UPLC)sonexcelentesmtodosparasepararyodotironinasetiquetadosyenteorapodraserutilizadotambin.
9bRECOMENDACIN
TRmximacapacidaddeuninenuntejidosepuedeestimaratravsdeanlisisdesaturacinconT3yla
reduccindedatosmedianteelmtododeScatchard.
Comentario Laadministracincombinadadetrazador[125I]T3concantidadescrecientesdeTfro3satura
progresivamentelaaltaafinidadT3sitiosdeunin(TR)(8689,101).Enestecaso,losncleosseaslanyse
procesaronpara[125I]T3contenido.ElplasmaT3ylarelacindeconcentracindeplasma/nuclearenlaTmse
obtienenentoncesparacadadosisdeTfra3quefueinyectada.LosresultadosseexpresanpormiligramodeADN,
yelanlisisdeScatcharddelosdatospermiteelclculodelamximacapacidaddeTRylaafinidaddeunin
relativaencualquiertejidodado.ElplasmaT3Tfrentenuclear3curvahacequeseaposiblecalcularlasaturacinde
TRencualquierniveldadodeT3,incluyendolosnivelesplasmticosfisiolgicos.
9c
RECOMENDACIN
TcnicasdeetiquetadoDual,con[131I]T3y[125I]T4sepuedeutilizarparadeterminarlascontribuciones
relativasdeplasmaT3frenteproducidoslocalmenteT3atravsdeT4desyodacinaltejidoT3
concentracin.
Comentario Laadministracinde[125I]T4ylaposteriormedicindeplasmaytejido[125I]T3permitela
cuantificacindelaproduccinlocaldeT3enlostejidosensuconjuntooTRquecontienelafraccinnuclear(86
89).Aunquerelativamentegrandesactividadesde[125I]T4seutilizan,lascantidadesde[125I]T3producidosen
elTmsonmnimosenlosanimaleseutiroideos.As,tantoelplasmayeltejido(nuclear)[125I]T3debera
concentrarseusandounanticuerpoantiT3columnadeafinidadantesdelaseparacinporcromatografa.AlTm,la
relacindeplasma/tejidode[125I]T3/[125I]T4yelsueroT4concentracinseutilizanparacalcularla
produccinlocaldeT3.Losvaloresde[125I]T3semultiplicanpor2debidoaqueslohayun125Ienelanillo
fenlico(exterior)de[125I]T4ydesyodacinocurrealazarentrelasposiciones3'y5'.Lascorrecciones
pertinentessedebenusarcuandoeltrazadorcontieneyodoradiactivoentantofenlico(exteriores)ytyrosilanillos
(interior).Paratenerencuenta(ycondescuento)porlacontribucindeplasma[125I]T3(quesaledelostejidos)a
lostejidos[125I]T3,laadministracinde[125I]T4escoordinadaconlaadministracinde[131I]T3.Debidoa
quelaTm(T4)yTm(T3)sondiferentes,laadministracindelosdostrazadoresdeberprogramarseparaquetanto
Tmcoincidensentiempolosanimalesmueren.
[C]EvaluacindetiroidesHormonadeTransporteenclulas
Visindeconjunto Basndoseenlaestructuralipoflicadelashormonastiroideas,sepensdurantemuchotiempoque
lahormonatiroideaentraenlaclulaatravsdedifusinpasiva.Sinembargo,haquedadoclaroquelashormonas
tiroideassontransportadosatravsdelamembranaplasmticaatravsdeltransportemediadoporportador,
proporcionandolaclulaconunaherramientaimportantepararegularladisponibilidadintracelulardelahormona
tiroidea.Eltransportemediadoporportadordelashormonastiroideassevefacilitadaporinteraccionesespecficas
sustratodeltransportadoryconducidopredominantementeporgradientesdeconcentraciny,paraalgunos
transportadores,atravsdelacotransportedeotrasmolculas.Portadoresdesolutosconocidosparaeltransportede
hormonastiroideasincluyentransportadoresmonocarboxilato(MCT),Na+/taurocolatopolipptidocotransporte,
lostransportadoresdeanionesorgnicos(OAT),transportadoresdeaminocidos(porejemplo,detipoL
transportadoresdeaminocidos)yanionestransportarpolipptidosorgnicos(OATPs)(102106).Laimportancia
delostransportadoresdelahormonatiroideaseilustraporelhechodequelasmutacionesenretrasopsicomotor
causaMCT8humanaynivelesalteradosdeyodotironina(107,108).ConlaexcepcindeOATP1C1(T4y3,3',
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5'triyodotironina[rT3]sloeltransporte),lamayoradelostransportadoresdelahormonatiroideatransportartanto
T4yT3.EsimportantedarsecuentadequelosmiembrosdelafamiliaMCT,talescomoMCT8yMCT10,facilitan
noslolacaptacincelular,sinotambinelflujodesalidadeyodotironinas(109).Elpapelfisiolgicodelos
transportadoresesnoslodependedesusafinidadesrelativasparalashormonastiroideas,perotambindependede
lospatronesdeexpresinentejidosyespecficosdelaclula.Unfactordeconfusinenlasburlasacaboelpapel
funcionaldetransportadoresespecficoseslaposibleexpresindediferentestransportadoresenlasuperficiedeun
tipodeclulaindividual(porejemplo,hepatocitosyneuronas).Enestoscasoslaabundanciarelativadeunmiembro
delafamiliaespecficaprobablementedeterminarlajerarquadelasfuncionesdetransporteparauntipoespecficode
clula.Finalmente,lostransportadoresdelahormonadelatiroidesvariosnotransportanlashormonastiroideas
exclusivamente.Porejemplo,losOATPstransportarunaampliavariedaddeambosendobiticosyxenobiticosy
poseenmltiplessitiosdeuninasustrato(110,111).Estacomplejidadenlaexpresinyfuncinrevelaalgunosde
losretosasociadosconelestudiodetransportedelahormonatiroidea,tantoinvivoeinvitroquedebeser
consideradoporelexperimentador.
[C.1]transportehormonatiroideainvitro
Fondo Eninvitroestudiossongeneralmenteconsideradosparalacaracterizacinbioqumicadelostransportadores
individuales,elestudiodelosefectosdelasmutacionesespecficassobrelafuncindeltransportador,yla
elucidacindelafuncindelostransportadoresespecficosexpresaentiposdeclulasindividuales.Una
consideracinprincipaleslagarantadequeelexperimentoestdiseadoycontroladoparaprobarlafuncindelos
transportadoresespecficosfrentealaaccincolectivademltiplestransportadoresexpresadasenlamismaclula
correctamente.Losestudioscinticosrequierenlaconsideracindeposiblesfactoresdeconfusincomolagaranta
delalocalizacindelamembranaplasmticadelostransportistasexpresado,transportesustratobidireccional,la
eleccindeltipodeclulaexperimental,ytpicofrentecinticaatpicos.
RECOMENDACIN10bis
Yodotironinatransporteenlasclulassepuedeestudiarenlasclulasqueexpresantransitoriamentedetipo
salvajeotransportadoresdelahormonatiroideamutantes.
Comentario Laevaluacindelafuncionalidaddeclonadodetiposalvajeotransportadoresdelahormonatiroidea
mutantesseconsiguefcilmentemediantelarealizacindeexperimentosdeabsorcin(110,112).Loscontroles
apropiadosincluyencomparacinconlasclulastransfectadasconelvectorvacoylainhibicindelaabsorcinde
lahormonatiroideamarcadoporlacoincubacinconunexcesodehormonafro.Elltimocontrolescrticapara
asegurarquelaclulaasociadacaptacindehormonatiroideaobservadoesunprocesosaturableynoest
simplementeasociadaconuninnoespecficadehormonamarcadaalaclula.Paralosensayosdetransporteen
general,lacaptacinseiniciaconlaadicindesustratomarcadoalasclulasyterminaenpuntosespecficosde
tiempoconlavadosrpidoscontampndetransportefro.Estasetapasdelavadosonesenciales,yaque
yodotironinastiendenaadherirsealasparedescelulares.Sedebeprestaratencinalaseleccindememoria
intermediadetransporte(porejemplo,tampnKrebsHenseleit,mediano/F12deEaglemodificadoporDulbecco,o
PBSregularcon/osinBSA).Esimportantedarsecuentadequediferentestamponesdetransportepuedencontener
grandescantidadesdeaminocidos,quetambinpuedensertransportadosporciertostransportadoresyporlotanto
influyenenlosresultadosdelosexperimentosdeabsorcin.BSAsepuedeaadiralmedioparamantener
yodotironinasensolucinyevitarlaadsorcinalosplsticos.Sinembargo,disminuyendolaconcentracin
yodotironinalibretambinpuedelimitarladisponibilidaddesustrato.
Memoriasintermediasdetransportecontienenpreferiblementenosueroenabsoluto,yaqueelsueroinclusoresina
despojadodeintercambioinicotodavapuedecontenerbajosnivelesdehormonastiroideasqueinterfierenconel
ensayodecaptacin.Comoconsecuencia,lasmedicionescinticas(porejemplo,lasconstantesdetransporte,las
velocidadesmxima)nosepuededeterminar.Lacaptacinsecalculaapartirdelaproporcinderadiactividad
asociadaconellisadocelularencomparacinconlaradiactividadtotalasociadaconeltampndetransporte
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isotpico.Laradiactividaddefondoenlasclulastransfectadasconelvectorvacoserestadetodaslasmuestras.La
captacinsecalculaapartirdelaproporcinderadiactividadasociadaconellisadocelularencomparacinconla
radiactividadtotalasociadaconeltampndetransporteisotpicayexpresadoenunidadesdepicomolesporminuto(
113,114).
Diferentesresultadossepuedenobtenerendiferentestiposdeclulas,dependiendodelosnivelesdeexpresin
endgenosdelostransportadoresdelahormonatiroideay/uotrosfactoresnecesariosparaeltransportedela
hormonatiroidea.Alestudiarlafuncindelostransportadoresdemutantes,puedesertilcompararlosresultadosen
clulasconnivelesdeexpresinendgenosdealtaversusbaja.
Transportadoresdehormonatiroideaexhibentransportebidireccional.Paraalgunostransportadorestalescomoel
OATPs,secreequeunsustratoantiportadoasernecesariaparaeltransportedelahormonatiroideaatravsdela
membranaplasmticaysedebeconsideraralelegirunamemoriaintermediadetransporte.Laacumulacinde
hormonastiroideastransportaenlaclulaesnecesariaparaevaluarlaactividaddetransporteypuedepresentarun
problemaparaalgunostransportadoresbidireccionalesporqueelsustratodeeflujopuederpidamentelashormonas
tiroideasdelaclula.Cotransfeccinconlahormonatiroideaintracelularprotenasdeunintalescomomucrystallin
proporcionaunmtodoparaasegurarlaacumulacindelahormonatransportado(109,115,116).Una
advertencia,sinembargo,esqueelusodetalesmtodosseoponeaestudioscinticosposterioresdebidoaqueel
transportedelahormonaprobablementenuncaalcanzarelestadodeequilibrio.
Paraestudiarlasconsecuenciasdelasobreexpresindeuntransportadorespecficodelahormonatiroideadela
disponibilidadintracelulardelahormonadelatiroides,lasclulaspuedensercotransfectadasconundeiodinasa
yodotironinayposteriormenteanalizadosparaelmetabolismo(114).Alternativamente,Xenopusovocitospueden
serutilizadosparaestudiosdetransporte(118).
10bRECOMENDACIN
Ladeterminacindelaespecificidadporelsustratoylascaractersticascinticasparalostransportadoresde
lahormonatiroidearequiereuncompromisodeprobarvariossustratosenunaampliagamade
concentraciones.
Comentario Laespecificidaddesustratodelostransportadores(putativo)delahormonatiroideapuedeserinvestigada
porincubacindelasclulascondiferentesligandosradiactivosputativo,incluyendolasdiferentesyodotironinasT4
,T3,Rt3,y3,3'diyodotironina(T2),ascomoanlogosdelahormonatiroideacidotalcomo3,5,3'
triyodotiroactico(tiratricol,tambinconocidocomoTRIAC)y/ovariosaminocidos,talescomoLeu,Phe,Tyr,y
Trp.EspecificidaddetransporteTHsepuedemedirmedianteladeterminacindelacaptacindeyodotironinas
radiomarcadosenlapresenciadecompetidoresputativo,incluyendolosderivadosdeyodotironinamarcadoscomoD
yLyodotironinas,tiratricol,cidotetraiodotiroactico(tetrac),yaminocidos.
Caracterizacindelosparmetroscinticosdeclonadodetiposalvajeymutantestransportadoresdelahormona
tiroidearequieredeterminarprimeroelcursodeltiempodeafluenciadesustratoenlasclulastransfectadas.Apartir
deestosdatosdeunpuntodetiemposeidentificacuandolacaptacindesustratoestcercademximos,peroel
transporteannohaalcanzadoelestadodeequilibrio.Todoslosestudioscinticosadicionalessellevaronacaboa
continuacin,mediantelamedicindelaacumulacindesustratoenlasclulastransfectadasydecontroleneste
puntodetiempoidentificado.
Paraelanlisisdemutantestransportadorseradeesperarquelosmutantespuedenposeeractividadescinticas
alteradas.Porlotanto,paraeltiempodeestudioelinvestigadordebeevaluarlaabsorcinenmltiplespuntosde
tiempoeneltranscursode120minutos.LosmutantessepuedensometeraanlisisdelacinticadeMichaelis
Mentenparacuantificarloscambiospotencialesenlacinticadetransportedelahormonatiroidea.
Paralosestudioscinticosposteriores,unpuntodetiempodebeserelegidoantesdeestadoestacionariocuandose
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observandiferenciasmximasentretransportadorexpresadofrentealacaptacinvectorvaco.Enestepuntode
tiempo,sepuedemedirlaabsorcinutilizandomltiplesdiferentesconcentracionesdesustratoqueabarcanelrango
dinmicodedeteccinparacadasustrato.Dadoqueestosgrandesexperimentossondifcilesderealizar,muchos
investigadoresoptanporlimitarelnmerodepuntosdedatosrecogidos,laaceptacindeunaestimacinmenos
precisadelacinticadetransporte.Notablemente,saturabilityyvaloresdeKmaparentespuedenestarinfluenciadas
porlaunindeyodotironinasaprotenastalescomoBSAenelmedio.
EvaluacindelafuncinOATPesanmsdifcil,yaqueestostransportadoresposeenmltiplessitiosdeuninde
sustratoyporlotantopresentanunacinticadetransporteatpicas(110,119).Paraevaluaradecuadamentecintica
detransporteOATPrenendatoscinticoscomolosdescritosanteriormenteyutilizarotrosmtodosparaanalizarlos
datos(110,120122).Estoscinticadetransportenopuedenserdeterminadosparalostransportistasconalta
capacidaddeflujodesalida,talescomoMCT8yMCT10,quepuedenrequerircotransfeccinconprotenasde
uninintracelulares(vaseladiscusinanterior).
10cRECOMENDACIN
Evaluareltransportedelahormonatiroideaencultivosdeclulasdisociadasprimariainvitrosloesdevalor
limitadosiseutilizancultivosdeclulasmixtas.
Comentario Unaprecaucincuandosetrabajaconclulasprimariasesposibleunarpidabajaregulacindela
expresindeltransportador(123).Seguimientodelaexpresindeltransportadormediantetransferenciao
inmunocitoqumicaoccidentalatravsdeltiempoenlaculturatanto,esfundamental.Adems,lapresenciadeuna
poblacindeclulasmixtasexigelaidentificacindetiposdeclulasqueexpresantransportadoresespecficos(124
).Sinembargo,lafaltadeespecificidaddelosanticuerpospuedeplantearproblemassignificativosparael
seguimientodelaexpresindedeterminadosmiembrosdelasgrandesfamiliasdeltransportadorconmltiples
miembrosestrechamenterelacionados.
RECOMENDACIN11
Laconfirmacindelacorrectalocalizacindelamembranadeplasmaesnecesarioparaestudiosqueutilizan
lasclulasqueexpresantransitoriamentelostransportadoresdelahormonatiroidea.
Comentario Asegurarquelostransportadoresevaluadosestnlocalizadosenlamembranaplasmticaesde
importanciaclaveparalainvitroestudios.CuandolosanticuerposadecuadosestndisponiblesanlisisdeWestern
primerosedeberealizarparaasegurarlaexpresindeprotenaseguidoporinmunocitoqumicafluorescentepara
evaluarlalocalizacinsubcelulardeprotenas.Alestudiarlasclulastransfectadas,esimportanteparaestudiarlas
clulasconbajosnivelesdeexpresinendgenadeltransportadordeinters.Porejemplo,lasclulasJEG3sonun
excelentemodeloparaestudiarlamembranaplasmticalocalizacindeMCT8mutadooMCT10debidoasusbajos
nivelesdeexpresinendgenadeMCT8y/oMCT10.Paraelanlisisbioqumico,transportadoresclonadoseptopo
deetiquetadoproporcionanunadianaantignicapreparadatantoparaWesternblotyanlisisinmunocitoqumico.
Localizacinsubcelularsedeterminapreferiblementepormicroscopaconfocalporquemicroscopafluorescente
tpicadecampoamplionodistinguirfcilmenteentrelasuperficiecelularyetiquetadointracelular.Apropiadamente
protenaexpresadoselocalizaprincipalmenteenlamembranaplasmticaconlatincinintracelularlimitado.Este
anlisisescrucialparaunaevaluacinadecuadademutantesgenticoscomolafaltadetransporteobservadoenin
vitroensayospodraserdebidoaunafaltadefuncindetransporteounaincapacidadparaeltrficocorrectamentela
protenaalamembranaplasmtica.Enambossupuestos,elensayodetransportedemostraraunaprdidadela
funcindeltransportador,aunquelaexplicacinbioqumicaparaesteresultadoseramuydiferente.Tengaencuenta
queestosestudiospuedenserdifcilesderealizarenlasclulastransfectadastransitoriamente,debidoaunaeficacia
relativamentebajadelatransfeccin.Paratalesestudios,elusodeclulastransfectadasdeformaestablepuedeser
mstil.
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[C.2]transportedehormonatiroideaenvivo
Fondo Invivoestudiodeltransportedelahormonatiroideaseconsideraparadilucidarlosrolesfisiolgicosy
fisiopatolgicosdetransportadoresespecficosyparadeterminarlacinticadelaafluenciadetejidoyflujodesalida
delashormonastiroideas.Losestudioscinticosrequierenunaconsideracindeposiblesfactoresdeconfusintales
comometabolismodeprimerpasodelahormonadeltrazadorinyectado,lapresenciademltiplesmiembrosdela
familiatransportadordelahormonatiroideaenunnicotejidooinclusotipodeclula,ycambioseneldesarrolloen
lospatronesdelaexpresindeltransportador.Consecuenciasdetransportedelahormonatiroideadefectuosoenla
sealizacindelahormonatiroideasepuedenanalizarusandoanlisisdelgenomadeancho(SeccinI.3)enel
materialdelpacientetalescomolosfibroblastos(125),mientrasqueconsecuenciasparadiferentesparmetros
biolgicossistmicospuedenseranalizadosusandodiferentesmodelosderatnknockout[verSeccionesI.5yJ
verHeueryVisser(126)paraunarevisin].
RECOMENDACIN12a
Porinvivoestudios,eltransportedelahormonatiroideanetotpicamenterepresentalasumadeunaseriede
diferentesactividadestransportadoras.Evaluacindelacontribucindeuntransportadordadoaltransporte
netorequiereelexamendetodoslostransportadoresexpresados
eneltejido.
Comentario Envivomedidasdetransportedelahormonatiroideaestnconfundidosporlaexpresindemltiples
transportadoresdehormonatiroideaenlamayoradelostejidos.Unaconsideracinclaveesdeterminarlosperfiles
deexpresindeltransportadorynivelesendeterminadostiposdeclulasentejidosespecficos.Desdelaafinidadde
T4yT3essimilarenlamayoradelostransportistas,lacontribucindeuntransportadorindividuogeneralmente
siguesusnivelesdeexpresin.Diseoexperimentaldeberatenerlaposibilidaddetantoinflujohormonalyflujode
salidaenconsideracin[verHeueryVisser(126)paraunarevisin].Consecuenciasdeltransportedelahormona
tiroideadefectuosoparalasealizacindelahormonatiroideapuedenseranalizadosutilizandoelanlisisdel
genomadeancho(verseccinI.3)dematerialdelospacientestalescomolosfibroblastos(125)odiferentestejidos
delosratonesknockout(127).
12bRECOMENDACIN
Elmetabolismodelashormonastiroideasevaluadosdebeserconsideradacuandosemideeltransportein
vivo.
Comentario Lashormonastiroideassonsometidosametabolismoinvivoincluyendodesyodacinyelmetabolismo
conjugativo.Esimportantedestacarquetalesimpactosmetabolismodeldestinodeltransportedelashormonasy
cuandolashormonastiroideassemetabolizansonsustratostrazadoresradiomarcados,interpretacindelosresultados
obtenidosesdifcil.Elcontrolsobreelmetabolismosepuedeejercersilasestrategiasindividualesdepasoseutilizan
comolacanalizacindirectadelosbuquesquellevaalostejidosdiana,seguidodeinfusincontinuadetampnde
transportedefinidoysustrato.Talesestrategiaslimitanelmetabolismodelsustratoylaprdidaalostejidosperifricos
ypermitenlamedicindirectadetransportedelahormonatiroideaeneltejidoevaluado.Comounejemplo,selogra
mejormedidadeltransportedelahormonatiroideaatravsdelabarrerasangrecerebrousandoelinsitumtodode
perfusincerebral(128).Estametodologapermitemedicionescinticasexactastalescomolastasasdetransportey
afinidadesdetransporteysepuederealizarenneonatalalosanimalesadultos.Comparacindelacinticade
transportedetiposalvajeytransportadorespecficoanimalesnulospermitiraladeterminacindelascontribuciones
especficasdelostransportistasindividualesenvivo.
[D]Laevaluacindelahormonatiroideadesyodacin
Visindeconjunto ElyodotironinacirculanteesT4.Sinembargo,T4puedeserconvertidoenlostejidosaT3,la
principalhormonadetiroidesqueseunealosreceptoresnucleareseiniciaunaaccindelahormonatiroidea(129).
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Enlostejidosextratiroidea,laconcentracindeT3enloscompartimentosintracelularesynuclearessedeterminaen
parteporlastasasdeT4aT3conversinyT3yT4degradacinenlaclula(84,130132).
LaformacinyladegradacindeT3enlostejidosdependenprincipalmentedelasactividadesdetresselenoenzimas
integraldelamembranaquecontienetiorredoxinaplegablesdeaproximadamente60 kDa(dmero)quecatalizanla
eliminacinselectivadeyododeyodotironinas(132135).EldesyodasadetipoI(D1)ylasenzimasD2estn
activandoenzimasquecatalizanelanilloexterioro5'desyodacin(5'd)deT4aT3.D3esunaenzimaquecataliza
lainactivacinanillointerioro5desyodacin(5D)deambosT4yT3ensusderivadosrelativamenteinactivos,rT3
yT2,respectivamente.ElD1tambinpuedeinactivarlashormonastiroideas,catalizandoladesyodacinanillo
interiordeconjugadosyodotironinasulfatados(130132).NivelesdeactividaddeD1,D2,yD3puedenser
estudiadosenpreparacionesdeclulascultivadas(136,137),rodajasdetejido(138,139),yhomogeneizadosde
tejido(140,141).
[D.1]deidentificacin,expresinycuantificacindedeiodinasas
Fondo Lapresenciadelosdeiodinasaspuedeseridentificadoenuntejidodadoysusnivelesdeactividadcuantific
usandoensayosbienestablecidosparalaactividadenzimticaypropiedadescinticas.EnloscasosdeD1yD3,
contenidodetejidodelaprotenadeiodinasase
puedeevaluarmediantetcnicasinmunohistoqumicasutilizando
antisueros/anticuerposdisponibles(142).Losnivelesdeexpresindelostresgenesdesyodasaspueden
determinarseusandomuestrasdeARNpreparadasapartirdetejidodeintersmediantereaccinencadenadela
polimerasadetranscriptasainversacuantitativaestndar(RTqPCR)tcnicas(127).
Ensayodelosnivelesdeactividaddeiodinasay/olacinticadereaccindelaenzimaenlaspreparacionesde
clulas/tejidosrotosrequierelapresenciadecompuestosquecontienengrupossulfhidrilolibrestalescomo
ditiotreitol(DTT).EnsayodelosnivelesdeactividadD1,D2,D3ysellevanacabogeneralmenteutilizando
yodotironinasradiactivoscomosustratosseguidodecuantificacindelosproductosradiactivosgeneradosporunidad
detiempo.Alternativamente,enelcasodelaD1yD2,losnivelesdeactividadsepuedendeterminarusandono
radiactivoT4ylacuantificacindelaT3generadaporRIA.
13aRECOMENDACIN
Deiodinasaactividadesysusperfilescinticosylaspropiedadesintrnsecas(porejemplo,Vmax,Km,la
actividadmediadevida,lasensibilidadacofactoresy/oinhibidores)sepuedendeterminarenpreparaciones
declulasotejidos.
Comentario Existenvariosprotocolosparaensayosdesyodasas,ytodosellossonaceptablessiemprequesesigan
ciertosrequisitos.Engeneral,laliberacindeyodurodetrazadorradiactivoogeneracindeunproductoespecfico
deiodinasasonloscriteriosdevaloracinexperimentalesmedidos.Siempreesmejorutilizaryodotironinas
radiomarcadosconlamsaltaactividadespecficadisponible.Inclusocuandosealmacenanenlaoscuridada4C,
haydesyodacinyodotironinaespontnea.Porlotanto,afindeminimizarlosnivelesdefondo,trazadoresdebenser
purificadosenSephadexLH50almenos24horasantesdelensayo.Todoslosensayosdebencontenercontrolesde
fondoenlosquenohaydesyodacinsustratodeiodinasamediada.Idealmente,duplicadosdelasmuestrasseejecutan
enparaleloentubosquecontenanungranexcesodesustratoqueoutcompeteslayodotironinaradiomarcado.
ElsustratopreferidoparaD1esrT3tomandolarelacinVmax/Kmcomounamedida
delaeficiencia,rT3realizatantocomo700vecesmejorqueT4comounsustratoparaD1.Adems,adiferenciade
T4,rT3esunsustratorelativamentepobreparaD3yporlotantoeselmejorsustratoconelcualensayarD1enlos
tejidosquetambincontienenactividadD3.Almismotiempo,laactividadD1tambinsepuededeterminarusandoT
4comosustrato.Eltampndereaccinvaraunpocoentreloslaboratorios,perolamayorasellevanacaboenun
PBSo2amino21,3propanodiolhidroximetilhidrocloruro(TrisHCl)tampnquecontenacido
etilendiaminotetraactico(EDTA12 mM),sacarosa(0,250,3 M),yDTT(1050 mM).Laconcentracinde
sustratoes0,12 mM.Lacantidaddetejidopresentedebeajustarseparaasegurarunporcentajedesyodacin
EnsayoparalaactividadD1.
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relativamentebaja(<30%)conelfindeevitarunaalteracinsignificativadelacinticadelaenzima.Con
preparacionesdeclulasrotas,eltiempodeincubacindebeserde1horaomenos.Cuandodeiodinasaactividadse
estudiaencortesdetejidooclulasenteras,eltejidooclulasdebenserhomogeneizadosenhieloensumediode
incubacinantesdelanlisisdelosproductos,yaqueyodotironinastiendenaadherirsealasparedescelulares.
Losproductosyodadossepuedencuantificardevariasmaneras.Posiblementeelmtodomssimpleeshacerpasarla
mezcladereaccinatravsdeunacolumnadeBioradAG50WX8(H+)deresinaempapadaencidoacticoal
10%.Losyodotironinassonadsorbidosenlaresina,yelyoduroinorgnicopasaatravsysepuedencuantificar
directamente.Otroshanutilizadoprecipitacindesuerodecaballo(portador)conTCAparasepararelyodurolibre(
143).Cualquieradeestosmtodosrequiereladeterminacindequecantidadesequimolaresde125Iy[125I]T3(o
[125I]T2si[125I]rT3seutilizacomounsustrato)seproducen,enparticularsielniveldeactividaddelaenzima
esbajaosinodeiodinativevasestnpresentes.Estoselogramediantelaseparacindela[125I]iodothyroninesy
125
Iporcromatografaenpapeldescendente,HPLC,oUPLC.Paraelclculodelaactividad5'd,elporcentajede
productogeneradosemultiplicapor2debidoalasactividadesespecficasdelosproductosetiquetadossonslola
mitadqueeldelsustrato.ActividadD1seexpresageneralmentecomopicomolesofemtomolesdeproductopor
unidaddetiempopormiligramodeprotena(144147).
EsteensayosellevaacabocomosedescribeparaelensayoD1conlassiguientes
modificaciones:elsustratopreferidoesT4(0,52 nM)ysiseutilizantejidosquetambincontienenactividadD1,1
mMPTUestincluidoenelmediodeincubacin.SiD3estpresente,debesersaturadomediantelaadicindeun
excesoapropiadodeT3(146149).
ElsustratopreferidoparaD3esT3(0,52 nM),ypuestoqueT3esunsustratomuy
pobreparaD1yD2,quepuedeserutilizadoconxitoparalaactividadD3ensayoenlostejidosquecontienen
tambinD1y/oactividadD2.LaadicindeEDTAaltampndeensayonoesnecesario.Enesteensayo,yaquelos
sustratosradiactivosestnetiquetadosenelanilloexteriorsolamente,elyodurogeneradanosepuededetectar,ypor
lotantolacuantificacindelareaccinrequierelaseparacindelaT2productodesdeelsustratodeT3porHPLCo
cromatografaenpapeldescendente.DadoqueelT2generadoestambinunbuensustratoparalaD3,esimportante
paradiluirlapreparacindelaenzimadetalmaneraqueelporcentajedesyodacinesrelativamentebaja(<20%)yT
2eselnicocompuestodetectableproducida(147,150152).
13bRECOMENDACIN
Estudiosdedeiodinasaactividadenpreparacionesdeclulasotejidosquecontienenmsdeundeiodinasason
factiblesperolasdisposicionesespecialesdebenserconsideradosdemaneraquecadaactividaddeiodinasase
midedeformaindependiente.
Comentario Muchasvecesnosloelsustratodeundeiodinasadado,sinotambinelproductodesyodacinpuede
servircomosustratoparaotradeiodinasacoexpresadaenlamismaclulaotejido.Porlotanto,paraobservarla
actividaddeundeiodinasaespecficarequiereelusodeinhibidoresdelaenzimaespecficaydiferentestiposde
sustratoy/oconcentraciones(Fig.9)(153156).Porejemplo,lamedicindelaactividadD1anilloexterioren
presenciadeD2esposiblesiT4oRT3seutilizanensuD1Km(esdecir,aproximadamente1 mMy0,5 mM,
respectivamente),quesaturaD2.MedicindelaactividadanillointeriorD1enpresenciadeD3esposiblesiT3oT
3sulfato(T3S)seutilizaensuD1Km(esdecir,aproximadamente5 mM),quesaturaD3.D1esinhibidade
maneraeficienteenpresenciade1 mMPTU,queslotieneunefectomnimosobrelaactividadD2.Estoeliminala
actividadD1decualquieractividadD2oD3,quenosevenafectadosporlaPTU.
FIG.9.
Estrategiasparamedirlaactividaddeiodinasaindividualizadaenlapresencia
deotrosdeiodinasas.(A)DosestrategiasparaevaluarlaactividaddetipoII
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deiodinasa(D2)enpresenciadedesyodasadetipoI(D1porejemplo,enla
tiroideshumana):(i)utilizar1 mM6npropil2tiouracilo...
NohayinhibidoresespecficossonconocidosporD2oD3.Sinembargo,tantoD2yD3actividadespuedenser
eliminadosmediantelaadicindeunexcesorelativodesusustratopreferido(esdecir,T4oT3,respectivamente),
lasaturacindelaenzimayoutcompetingeltrazadorradioactivo.Porejemplo,lamedicindelaactividadD2en
presenciadeD3esposiblemedianteelusorT3oT4comosustratoylaadicinde1001000 nMT3enlamezcla
dereaccin.AdicindelaT3saturaelexcesodesitiosdeunindeD3peronointerfiereconlaactividadD2.Sin
embargo,seprefiereunreactivodealtapureza,yaque,aaltasconcentraciones,inclusopequeascantidadesdeun
contaminanteyodotironinainterfieraconelensayo.
RECOMENDACIN14bis
LaVmaxdecualquieradelosdeiodinasasmedidosencondicionesptimasdesustratoycofactor
disponibilidadsepuedeutilizarcomounsustitutoparalacantidaddeenzimafuncionalpresenteenunaclula
otejidoencualquiermomentodado.
Comentario MientrasD1yD3seexpresanennivelesquepuedensermedidosporWesternBlotoimmunocyto/
histoqumicautilizandoantisueroscomercialmentedisponible(65,157,158),labajaexpresincombinadadeD2
conlafaltadedisponibilidaddeafinidadsuficientementealtaantisuerosD2hadeterioradocuantificacindeprotena
D2(159).Dehecho,noexisteunconsensoencuantoalavalidezdeantisueroantiD2/anticuerposparala
medicindelaprotenaendgenaLosresultadosdebenserevaluadossobreunabasedecasoporcaso.Sinembargo,
unaestimacindelosnivelesdeprotenaD2puedeobtenersedeformafiablemediantelamedicindeD2Vmax,
quereflejalacantidadmximadeenzimaactivaenunaclulaotejido.D1yD3puedenserevaluadosyaseaatravs
VmaxoWesternblot.Losnivelesdeprotenadelostresdeiodinasaspuedencuantificarsedespusdelmarcajedelas
clulasqueexpresancondesyodasas75Se,inmunoprecipitacin,ylaresolucinmedianteelectroforesisengelde
sodiododecilsulfatopoliacrilamida,peroestollevavariassemanasporensayodeD2(93).Notaquelaalteracin
biolgicadeKm(porejemplo,lasmutacionesdeaminocidos)podraalterarlarelacinentreVmaxylosnivelesde
protena.
14bRECOMENDACIN
Laexpresindelosgenesdesyodasaspuedeserdeterminadaenclulasotejidosmediantelamedicindelos
respectivosnivelesdemRNA.
Comentario MedirlosnivelesD1mRNAessencillo,ydadasuexquisitacapacidadderespuestaaT3,constituyeun
marcadorsensibledelestadotiroideoperifricaenroedores(72).D2esungendependientedecAMPysusniveles
demRNApuedeserreguladohastavariasvecesdurantelaestimulacinsimpticadeBAT(161).Almismotiempo,
D2exhibeunafuerteregulacinpostraduccionalatravsdelaubiquitinacinyladegradacinproteasomalpor
diferentescomponentesdelretculoendoplsmico(162165).Porlotanto,losnivelesdemRNAnoreflejan
necesariamentelaexpresindeprotenaoactividaddelaenzima(162,166,167).ElDio3genesintrones,ylos
controlesadecuadosporlotantoserequierendadoqueinclusolacontaminacindeADNmnimapodraafectarlos
resultadosdeRTqPCR.D3tieneunavidamediarelativamentelarga,yporlotantounaltoniveldeactividadD3
puedepersistirinclusodespusdeunaelevacinenD3mRNAsehadisipado(168,169).Ensituhibridacines
particularmentetilenelcerebrodebidoalacomplejidaddelospatronesdeexpresindeD2yD3(170172)(ver
seccionesI.2yJ.1deconsideracionestcnicas).
[D.2]desyodacinenclulasintactas
Fondo Desyodacinpuedeserestudiadoenclulasvivasintactas.Esencialmente,laslneascelularesestablecidaso
125
cultivosprimariosexpresan5'dy/oactividad5Destnexpuestosalaapropiada[
I]substrate(comosediscuti
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anteriormente)ylosproductosradiomarcadosdeterminadosenlosmediosdecomunicaciny/oenlacelda
sonicadoscomoyasedescribi.
RECOMENDACIN15
T4yT3metabolismoatravsdedesyodacinpuedenmedirseenclulasvivasconlaventajadequelos
estudiosserealizanconcofactorfisiolgico.
Comentario Lasclulasseincubaroncon[125I]T4o[125I]T3enpresenciademediosquecontienen0,1%1,0%
deBSAconadicindeT4y/oT3paraproducirunaconcentracinfisiolgicadelahormonalibreenelbajo
picomolarrango(Tabla2).Metabolitosenlosmediosdecomunicacinoenlasclulasseseparanporcromatografa
lquidaopapel(comoyasehadescrito).Eltiempodereaccinesnormalmentede24horasomenos.Mediosde
cultivosincolorsedebenutilizardebidoalainterferenciaconelensayo.Laconcentracindeseadadelsustratose
consiguemediantelaincubacindelasclulasenmediolibredesueroquecontienen0,1%deBSAeincluyendola
concentracinapropiadadeTnoradiactivo4y/oT3.Tiempodecursossepuedenestablecermedianteelmuestreo
delosmediosdecomunicacin,seguidodecuantificacindelosproductosdescritasanteriormente.Losresultadosse
expresaroncomopicomolesofemtomolesdeproductoporunidaddetiempocorreccinparaelnmerodeclulasse
puedelograrmedianteelrecuentodeclulasomedianteladeterminacindelcontenidodeADNodeprotenas.Los
estudiosenclulasquecontienenmsdeundeiodinasasonfactiblesydebenincluircontrolesapropiadosenlosque
unadelasvasdeiodinativeestsaturadoconunexcesodesustratonomarcado(136,137,152).
TABLA 2.
LASFRACCIONESLIBRESDE T4Y T3(x100Y EXPRESADO EN PORCENTAJE )DE
LOSTIPOSCOMUNESDE MEDIOSQUE CONTIENEN DIFERENTESPORCENTAJESDE
ALBMINA DE SUERO BOVINO /SUERO
Sistemasdecocultivoconmsdeuntipodeclulasehandesarrolladoenelqueeltransportedelahormonatiroidea,
elmetabolismo,ylaaccinsepuedeestudiardeformasimultnea(esdecir,D2expresindeclulasdeglioma
humanoH4yD3queexpresanclulasdeneuroblastomaSKNAShumanosFig.10)(173).Talsistemahasido
utilizadoparademostrarquelasealizacinparacrinaporderivadodeclulasglialesT3activalaexpresingnica
neuronal.
FIG.10.
Invitromodelizacindedesyodacinhormonatiroideayeltransporteenel
cerebro.(A)RepresentacinesquemticadelSistemaTranswellenelqueuna
piezadeinsercinsecolocaenunaplacadeseispocillosylasclulas(D2
expresindeclulasglialesH4)sesiembranenelinteriordelinserto...
[D.3]desyodacinenrganosperfundidos
Fondo Anilloexteriorydesyodacinanillointeriorsepuedenestudiarenrganosperfundidoscomoelrinyel
hgado.rganosEsencialmente,recincosechadasqueexpresan5'dy/oactividades5Dsonperfundidoscon
solucionestamponadasquecontienenBSAyradiomarcadoosustratosyodotironinafros.Elperfundidoserecogeen
eltiempoyseanalizaparaproductosdesyodacinutilizandoinmunoensayosoHPLC.Esteenfoqueesventajoso
porquepermiteelestudiodelasvasdedeiodinativeespecficosdetejidobajocondicionesfisiolgicaso
fisiopatolgicasdefinidos.
RECOMENDACIN16bis
T4aT3conversinylaexcrecinurinariayodotironinasepuedeestudiarenlaspreparacionesdeperfundido
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derataderinohgado.
Comentario EnlaspreparacionesdelosrionesperfundidosconT4entampnquecontieneBSAhayunaumento
revestimientoenT3produccinconelaumentoenelperfundidoFT4concentracinquedeterminaeltejidoT4
absorcin.FT4nivelessepuedenajustarmedianteelaumentooladisminucindelaconcentracindeTtotalde4o
laconcentracindeBSA.LaadicindePTUdisminuyerenalT3produccinenun60%sinafectareltejidoT4
captacin,queilustralapresenciadeD1.EnestecontextonohayrenalnetarT3produccindeT4,yla
degradacinyexcrecinurinariadeT3soninsignificantes(174176).
Similaralrin,elhgadodelarataperfundidoextraefcilmenteT4demediodeperfusinylaconvierteaT3.
ProduccindeT3esunafuncindeltamaodelhgado,lacaptacindeT4,yelniveldeexpresinD1.Produccin
deT3,peronoT4captacin,sedisminuyeporPTU(177,178).
16bRECOMENDACIN
Placentariodesyodacinanillointeriorsepuedeestudiarinsituutilizandounsistemadeperfusindeconejillo
deindias.
Comentario ConsiderandoquelasactividadesdelaplacentaD2yD3sepuedenmedirendispersionesdeclulasode
tejidossonicados(179182),insitupreparacionespuedenusarseparaestudiarlavaD3placentaria(183,184).En
unconejillodeindiasembarazadasanestesiado,laplacentaseexponequirrgicamenteyunasolaarteriaumbilicaly
lavenaumbilicalsecanul,mientrasqueseretiraelfeto.Elladofetaldelaplacentaesperfundidoatravsdela
arteriaumbilicalconunasolucintamponadaquecontieneBSAy[125I]T3.Fraccionesefluentesplacentase
recogenaintervalosdetiempo(hasta2horas)delacnuladelavenaumbilical.Elcontenidodeltampnde
perfusinylasdiversasfraccionesefluentesseseparanacontinuacinyseanalizaronporHPLCporsucontenido
yodotironina(183).EnestaconfiguracindesyodacinanilloexteriordeT4orT3esmnima(184),posiblemente
debidoalaplacentadesyodacinanilloexterioresmayorenlazonainmediatamenteadyacentealapareddeltero(
185),distantedelladofetaldelrgano.
[D.4]desyodacinenanimalesenteros
Fondo Elestudiodelasvasdedesyodacinentodoelanimalesdifcil,puestoqueunoesttratandocontres
deiodinasas,cadaunodeloscualespuededeiodinatenosloT4y/oT3,sinotambinlosproductosdeestas
reacciones.Ademsnohayagentesconocidosqueinhibenselectivamenteycompletamentedeiodinasasindividuales.
Porlotanto,hastaquelosratonesdeficientesenunoomsdelosdeiodinasasllegaronaestardisponibles,eramuy
difcilparainvestigarelpapeldelosdeiodinasasindividualesinvivo.
RECOMENDACIN17
Desyodacincorporaltotalpuedeserestudiadoenanimalesvivosdespusdelaadministracinde
yodotironinasradiomarcados(porejemplo,[125I]T4o[125I]T3).Yodotironinassepuedeninyectarde
formaagudaoalargoplazoatravsdeunaminibomba.Esteenfoquepermitealosestudiosquesellevana
cabobajocondicionesfisiolgicascontroladas.Informacinadicionalsepuedeobtenermediantela
administracindemsdeunayodotironinamarcadascondiferentesistoposdeyodo.
Comentario DesyodacinTotalanillofenlicocuerpopuedeserfcilmenteevaluadaenlosroedorestrasla
administracindeunadosisnicade[125I]T4o[125I]T3.Losroedoressecolocanenjaulasindividualesque
permitenlarecogidaseparadadeorinayheces.Despusdeunperodoadecuadodetiempo(42a72horas)la
fraccindelaradiactividadinyectadaseexcretaenlaorinasepuededeterminar,ylagranmayoradeestasernyodo
inorgnico(186).Esteprotocolosepuedeutilizarparaevaluarlosefectosdediferentescondicionestalescomoel
ayuno,laexposicinalfro,hiperohipotiroidismo,ylaausenciadeunoomsdelosdeiodinasasendesyodacin
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total.Estetipodeestudiosepuedellevaracaboutilizandounnivelrelativamentebajodelaradiactividad.Sin
embargo,laobtencindecualquierinformacinfiablesobrelamagnituddeT4conversinaT3oRT3poreste
mtodosecomplicaporelhechodequeamboscompuestosseborrandesueroaunritmomsrpidoqueT4ens.
Partedelainformacinrelativaalosproductosetiquetadosformadosapartirde[125I]T4o[125I]T3puede
obtenerseutilizandoanimalesimplantadosconminibombasosmticasquecontienenlashormonasmarcadas.Una
vezquelaexcrecindiariadelaradiactividadenlaorinaylashecessehaceconstante,loqueindicaquelosanimales
hanalcanzadoelequilibrioisotpico,losanimalespuedensersacrificados.Elsuero,tejidos,orinayhecespuedenser
obtenidosylaidentidaddesuscompuestosmarcadosdeterminan,despusdesuextraccinylaseparacinpor
HPLCocromatografa.Estudiosparalelosutilizandoratonesdeficientesenunoomsdelosdeiodinasasarrojarluz
sobrelaimportanciarelativadelasdiferentesvasmetablicas.Variosprocedimientosdeextraccinsehanpublicado
ysedebetenercuidadoparadeterminarycorregirlaeficienciadeextraccin(83,187).
Losresultadosdeestosestudiosdeberninterpretarseconcuidadoyposibilidadesalternativasconsideradas.Por
ejemplo,esbienestablecidoquetantoT4yT3sepuedenconjugarconsulfatoinvivo,yestosconjugadosson
excelentessustratosparalaactividaddeiodinatinganillointeriordelaD1.Lashormonastiroideastambinestn
conjugadosconcidoglucurnicoylamayoradelaT4enelrinestpresentecomoT4glucurnido,quenose
detectaenunRIA(137).Adems,unafraccinsignificativadelosmetabolitosgeneradosapartirdeT4yT3,
incluyendolosconjugadosglucurnidos,seencuentranenlabilis,elcontenidointestinalyheces.
[D.5]vasnodesyodacindelmetabolismodelahormonatiroidea
Fondo Sustanciassinnutrientesquelleganalsistemagastrointestinalsontambinconocidoscomocompuestos
xenobiticosyseidentificanenelhgadoatravsdereceptoresespecficosporejemplo,elreceptordepregnanoX
(PXR)yreceptoresandrostaneconstitutiva(CAR).Launinaestosreceptoresdedeteccindexenobiticos,PXRy
/oCAR,inducelaexpresindeenzimasmetablicasincluyendolaFaseI(lafamiliadeenzimascitocromoP450)y
lafaseII(porejemplo,sulfotransferasas,glucuronosiltransferasas,ytransferasasdeglutatinS).Estasvasmodificar
molculasdexenobiticosmediantelaintroduccindegruposreactivosopolaresensusmolculasparaaumentarsu
solubilidadenagua,facilitandodeestemodosueliminacin.LasvasdeFaseIIincluyenglucuronidacin,
metilacin,sulfatacin,acetilacin,conjugacindeglutatin,ylaconjugacindeaminocidos.
Quizsdebidoalaltocontenidodeyodo,lasyodotironinastambinsonmetabolizadosporpartedelaFaseIIvases
decir,laconjugacindelgrupohidroxilofenlicoconcidoglucurnicoosulfatode(188).Dehecho,unaporcin
relativamentepequeadelaproduccindiariadehormonatiroideaseprocesaatravsdeestasvas,peropuedeser
muchomssiestasvasmetablicassoninducidosporcompuestosxenobiticostalescomoelsistemanervioso
central(CNS)actuandodrogas(porejemplo,fenobarbital,benzodiazepinas),bloqueadoresdeloscanalesdecalcio
(porejemplo,nicardipina,bepridil),esteroides(porejemplo,espironolactona),retinoides,hidrocarburosclorados(por
ejemplo,clordano,dicholorodiphenyltrichloroetano,tetraclorodibenzopdioxinaylosbifenilospolihalogenados
talescomobifenilospolicloradosybifenilopolibromado,entreotros)(189).
YodotironinassulfatadosnoseunenalosTRysulfatacinmedialadesyodacinrpidaeirreversiblede
yodotironinasporD1.Porlotanto,lasconcentracionesdeyodotironinassulfatadosensuerosonnormalmentebajos.
DesyodacinInneranillo(inactivacin)deT4yT3porD1sefacilitanotablementedespusdesulfatacin,mientras
quedesyodacinanilloexteriordeT4sebloqueadespusdelasulfatacin.Comoeradeesperar,lasexposiciones
ratnD1KOmarcadoaumentoenlaexcrecinfecalde[125I]iodothyroninesdurantelas48 hdespusdela
inyeccinde[125I]T4o[125I]T3,mientrasquelaexcrecinurinariade[125I]yoduroseredujonotablemente(
186).Notablemente,D2yD3nosoncapacesdedeiodinatingyodotironinassulfatados.Losnivelesenplasmayla
excrecinbiliardesulfatosyodotironinaseincrementanenlasangrefetalyelcable,enfermedadesnotiroideas
(NTI),elayunoyporlainhibicindelaactividadD1conPTUocidoiopanoico(190).Enestascondiciones,T3
SpuedefuncionarcomounreservoriodelahormonainactivadelaqueTactiva3puedeserrecuperadoporlaaccin
delassulfatasasdetejidoysulfatasasbacterianasenelintestino(188).
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Glucurnidosyodotironinaseexcretanrpidamenteenlabilis.Sinembargo,estonoesunavairreversibledela
eliminacindelahormona.Despusdelahidrlisisdelosglucurnidosdeglucuronidasasbacterianasenel
intestino,partedelasyodotironinasliberadassonreabsorbidos,resultandoenuncicloenterohepticode
yodotironinas(188).Sinembargo,aproximadamenteel20%deTdiaria4produccinapareceenlasheces,
probablementeatravsdelaexcrecinbiliardeconjugadosglucurnidos.Laglucuronidacinescatalizadaporla
UDPglucuroniltransferasas(UGT)queutilizancidoUDPglucurnico(UDPGA)comocofactor.UGTsse
localizanenelretculoendoplsmicopredominantementedehgado,elrinyelintestino.LamayoradeUGTson
miembrosdelaUGT1AyfamiliasUGT2B(191).
Engeneral,larelacinentrelasactividadesenzimticasdetejidoparalasdiferentesyodotironinasylaexpresinde
isoenzimasindividualesapenasseconoce,especialmenteparalossulfotransfereases(resultados).Muchosresultados
deexposicionessuperpuestasespecificidadesdesustrato.Adems,mltiplesresultadosenelmismotejidopueden
estarinvolucradosenlasulfoconjugacindelosmismosyodotironinas,resultandoenlaredundanciaclaro[vaseWu
etal.(192)paraunavisingeneral].Comoconsecuencia,laspropiedadesbioqumicasdelostejidosactividad
SULTreflejanelefectocompuestodediferentesisoenzimas.Expresindeprotenasonivelesdelasdiferentes
isoenzimaspuedenserestudiadosmedianteRTqPCRy/oWesternBlot,perononecesariamentereflejanlas
actividadesgeneralessulfoconjugacintejido(192,193).
18aRECOMENDACIN
Actividadessulfotransferasaysuspropiedadesintrnsecassepuedendeterminarenpreparacionesdeclulaso
tejidosusando3'fosfoadenosina5'fosfosulfato(PAPS)comoeldonadordesulfato.
Comentario YodotironinasulfatacinescatalizadaporresultadosutilizandoSAFPcomodonantedesulfato.Enlos
sereshumanos,resultadosmuestranespecificidadporelsustratodesuperposicin.Enlossereshumanos,quepueden
subdividirseendiferentesfamilias,SULT1,SULT2,SULT4ySULT6.TodoslosmiembrosdelafamiliaSULT1
humana(esdecir,hSULT1A1,1A2,1A3,1B1,1C2,1C4y1E1)catalizanlasulfatacindeyodotironinas(194
).hSULT1A13,1B1,y1C4ytambinenzimasnativasenelhgadotienenunapreferenciadesustratopara3,3'
diyodotironina(T2),queescatalizadamuchomsrpidoqueT3yrT3,mientrasqueT4sulfatacines
insignificante.hSULT1E1prefiereigualmenteT2yrT3sobreT3yT4,peroeslanicaconocidaRESULTAR
hastaahoratenersignificativoT4actividadsulfotransferase(194).Comoconsecuencia,T2seutilizageneralmente
paraestudiarlasactividadesdesulfotransferasaenlostejidoshomogeneizadosbajodiferentescondiciones.Diferentes
resultadoshumanostambinsehandemostradoparacatalizarlasulfatacindeiodothyronamines(195).
Hayvariosprotocolosaceptablesparaensayossulfotransferasa.Lomejoresusar
yodotironinasradiomarcadosconlamsaltaactividadyensayosespecficosdisponiblesdebencontenercontrolesde
fondoylasmuestrasseejecutanenparaleloentubossinPAPS.DebidoavaloresrelativamentealtosKm,puedeser
difcildedejarfueradecompetencialayodotironinaradiomarcadoporungranexcesodesustrato.SULTactividad
puedeseranalizadamedianteincubacinde0,1 mM[125I]iodothyroninedeintersdurante30minutoscon
homogeneizadodetejido,citosol,oSULTrecombinanteenpresenciaoausencia(enblanco)de50 mMPAPSen
tampnPBSEDTA(194).Lareaccinsedetuvomediantelaadicinde0,1 MHClylosproductosseparadospor
filtracinenSephadexLH20minicolumnasenyoduro,yodotironinassulfatados,yyodotironinasnosulfatados(196
).
Ensayodeactividadsulfotransferasa.
18bRECOMENDACIN
Actividadesdeglucuronidacinyodotironinasedeterminanenpreparacionesdeclulasotejidosutilizando
microsomalUDPGAcomouncofactor.
Comentario LaglucuronidacindeT4yT3escatalizadapordiferentesmiembrosdelafamiliaUGT1A(197).Por
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logeneral,estoimplicalaglucuronidacindelgrupohidroxilo,peroUGT1A3humanotambincatalizala
glucuronidacindelgrupocarboxilodelacadenalateral,conlaformacindelosllamadosglucurnidosdeacilo.
Curiosamente,TetracyTRIACsonmuchomsrpidamenteaglucuronidacinenelhgadohumanodeT4yT3,y
estoseproducepredominantementeporglucuronidacindeacilo(198).Glucurnidosacilosoncompuestos
reactivosquepuedenformarcomplejoscovalentesconprotenas.Sedesconocesiestoesunarutaimportanteparala
formacindecomplejosprotenayodotironinacovalentes.
Hayvariosprotocolosaceptablesparaensayosglucuroniltransferasa.
Yodotironinasradiomarcadosconlamsaltaactividadespecficadisponiblesdebenutilizarseylosensayosdeben
contenercontrolesdeantecedentes.Laactividaddeglucuronidacinyodotironinasepuedeanalizarmediantela
incubacinde1 Mdela[125iodothyronineI]deintersdurante60minutosconmicrosomasenTrisHClque
contieneclorurodemagnesio(pH7,8)tampn,enpresenciaoausencia(enblanco)de5 mMUDPGA(197,199).
Cuandoseanalizanlosmicrosomasdetejido,1 mMPTUsepuedeaadiralamezcladereaccinparaevitar
desyodacinyodotironinasinafectarasuglucuronidacin.Lareaccinsedetuvomediantelaadicindeetanoly
glucurnidoformacinenfriadoconhieloseanalizaenelsobrenadanteporcromatografaenSephadexLH20
minicolumnascomoyasehadescrito.
Ensayodeactividaddeglucuronidacin.
[E]ReemplazoInducirelhipotiroidismoylahormonatiroidea
Visindeconjunto Elhipotiroidismoesunestadopatolgicoenelquelasealizacindelahormonatiroidease
disminuyesistmicamenteolocalmenteenunoomstejidos.ComoresultadodelagotamientodeTnuclear3,no
haymodificacinenlaexpresindeT3responsivegenes,ladisminucindelosefectosbiolgicosdelahormona
tiroidea.LainduccindehipotiroidismohasidoutilizadotradicionalmenteparadefinirycaracterizarT3procesos
responsive,unenfoquequepuedeserutilizadoenanimalesoenclulascultivadas.Enroedoresestoselograporla
disminucindelosnivelessricosdeT3yenclulascultivadasmediantelareduccindelalibreT3concentracin
enelmedio,pordebajodelosnivelesfisiolgicos.Alternativamente,losantagonistasdeTRsehandesarrolladoy
utilizadoenlasclulas.
[E.1]Elhipotiroidismoenanimales
Fondo SueroT3concentracionesenroedoressepuedereducirquirrgicamentemediantetiroidectomatotalo
131
mdicamentealtratamientoconfrmacosantitiroideoso I.Adems,hayunaseriedecepasderoedoresenlos
quegenesclaveenlapituitariahipotalmicatiroides(HPT)ejeexhibenmutacionesespontneasohansido
modificadosgenticamente,enltimainstancia,interrumpiendolasntesisdelahormonatiroideay/osecrecin.El
enfoqueexperimentalparaellogrodehipotiroidismodebetenerencuentalaedaddelosanimales(esdecir,prenatal,
postnataltemprano,despusdeldestete).Porltimo,lainterrupciny/olainduccindeladeiodinasas
transportadoresdelahormonatiroideapuedenresultarenhipotiroidismoespecficadetejido.
RECOMENDACIN19
Lagananciadepesodebesermonitoreadadurantelainduccindehipotiroidismo.Paraunareferencia
cruzadaentrelosexperimentos,unamesetaobservadaenelaumentodepesocorporalsedebetomarpara
definirunestadodehipotiroidismosistmica.T3actividadesdeexpresindegenesyenzimasresponsive,en
particularD1expresinhepticaoactividad,puedenutilizarsecomomedidasadicionalesdeestadodela
tiroides.
Comentario UnagotaenelsueroT4yunaelevacindelaTSHensuerosonlosprimerosindiciosdeuntrastornoen
lafuncindelejeHPT.PorlogeneralsenecesitamstiempoparareducirelsueroT3.DadoqueT3eslahormona
tiroideabiolgicamenteactivo,enteora,unestadodehipotiroidismosistmicapodraconsiderarsedeexistirdespus
delasconcentracionessricasdeT3handescendidopordebajodelrangonormal.Sinembargo,dadoquelacadaen
elsueroT3podranoreflejartejidoT3concentracinenlospuntosdetiempotempranos,lamayoradelosestudios
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definenhipotiroidismosistmicadeexistircuandoseobservaunefectobiolgicodependientedehormonasdela
tiroidesimportanteesdecir,lasmesetasgananciadepesocorporal,oelniveldeexpresindeunT3responsivegen
olaactividaddeunaT3enzimaresponsivesereduce.Mientrasqueenlosestudiosenhumanos,TSHseraun
parmetroidealparadefinirelestadodelatiroides,enlosroedoresdatosnormativosfaltanparapermitirla
comparacincruzadaestudioutilizandoTSHcomomarcadorprimariodelestadotiroideo.
Debidoaquelosroedoressiguencreciendodurantetodalavidayporlasecrecindelahormonadelcrecimientoes
exquisitamentesensibleaT3enratas,elcrecimiento,segnlaevaluacindelagananciadepesocorporal,esun
marcadormuysensibledelaaccindelahormonadelatiroidesenratas(200,201).Unaproximadode100 grata
dejaponerenpesoaproximadamente3semanasdespusdelatiroidectomatotalenestepuntodeltiempo,los
nivelesdehormonastiroideassehanreducidoenun75%yelcontenidodelahormonadecrecimientohipofisariaes
casiindetectable(201).Unaausenciadecrecimientode2semanassehapropuestocomoelestndardeoroparala
definicindeunestadodehipotiroidismosistmicagrave(202)perodosmscortosdetiempo(porejemplo,5das
demesetacrecimientodocumentado)debenseraceptablestambin.Notablemente,detencindelcrecimientolineal
(comosedeterminaporlalongituddelacola),queesmuysensiblealahormonatiroidea,seraunindicador
excelenteydeaplicacinmsgeneraldehipotiroidismo,aunquelosdatospublicadosquedocumentan
especficamenteestesecarece.Estndisponiblesparalosratonesmenosdatos,enelquelahormonadelcrecimiento
esmenosT3sensible,porloqueunamesetaenlagananciadepesocorporalnoesunindicadorfiablede
hipotiroidismo.
Unenfoquemolecularparadefinirestadosintermediosdehipotiroidismosistmicaimplicaralaevaluacindela
expresindeT3responsivegenesolaactividaddeT3responsiveenzimastalescomonivelescardiacosdemRNA
delacadenapesadademiosina(MHC)isoformasohepticadeshidrogenasaglicerofosfato(GPD)actividado
actividadD1.SibiencualquierT3tejidoresponsivepodraexaminarse,tradicionalmenteelhgadohasidoelrgano
deeleccinparaevaluarelhipotiroidismosistmicadadosuelevadonmerodeTRybiendefinidasT3responsive
vas.ActividadD1hgadoseconsideraelndicegenticomssensibledelestadotiroideosistmicayporlotanto
puedeayudarenlacaracterizacindeestadosmuysutilesdeinterrupcinenlahormonatiroideadesealizacin(72
)(verSeccionesD.1yI.2).
20aRECOMENDACIN
Hipotiroidismosistmicapuedeserinducidaporlatiroidectomatotalquirrgicaenratasadultasoratones.
Hipotiroidismosistmicoseconsigueporlogeneralentre5y8semanasdespusdelaciruga.Ratas
tiroidectomizadosHemidesarrollanunaformalevedehipotiroidismosistmica.
Comentario Totalquirrgicaohemitiroidectomaenroedoresesunprocedimientoampliamenteutilizadodadalafcil
accesoalaglndulatiroides(Fig.11)(203).Engeneral,cuandoserealizatiroidectomatotalenun100 grataoun
20 gderatn,seconservanlasglndulasparatiroides.Dadoquelashabilidadesquirrgicasylaanatoma
paratiroideapuedenvariar,algunosinvestigadoresasumenqueelprocedimientodarlugarahipoparatiroidismo
posquirrgico,yporlotantoofreceralosanimalesconunasolucinde2%4%delactatodecalcioendextrosaal
5%adlibitumcomolanicafuentedefluidodurantealmenos10dasdespusdelaciruga.
FIG.11.
Ladiseccindelaglndulatiroidesderoedores.(A)delaincisinquirrgica,
(B)aislarlasglndulassalivales,(C)disociarlosmsculos,(D)liberarla
trquea,(E)laseccindelosmsculoslaterales,(F)deslizarunaagujadebajo
latrquea,revelandolaglndulatiroides....
RatasyratonesThyroparathyroidectomizedtambinsepuedenadquirirdeproveedorescomerciales.
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20bRECOMENDACIN
Hipotiroidismosistmicapuedeserinducidaporlatiroidectomaqumicacausadaporlaadministracinde
frmacosantitiroideos.Elmarcodetiempodeaparicindehipotiroidismoesvariableydependedeltipode
frmacoyrgimenutilizado.
Comentario LainhibicinqumicadelaglndulatiroidespuedeserinducidamediantelaadministracindeMMI,
PTU,KClO4,oNaClO4.Estosmedicamentossepuedenadministraratravsdeinyeccionesintraperitoneales
diarias(porejemplo,laPTU12 mg/100 gdepesocorporal,MMI15 mg/100 gdepesocorporal(204)),aade
alacomida(porejemplo,0,02%0,15%PTUo0,01%MMIoKClO41,25%(205))oelaguadebebida(0,01%
0,1%MMI,0,01%0,1%PTU,o0,1%1%KClO4oNaClO4).Unescolloimportantedeestaestrategiaesque
todosestosfrmacosantitiroideostienenunsaboramargoy,cuandoseaadealaguapotable,elconsumodebeser
monitoreado.Dehecho,PTUesunestmuloamargocomnmenteutilizadoenlosestudiosdelafisiologadelgusto(
206).Empricamente,sehaencontradoqueKClO4esmenosaceptablequeNaClO4.Debidoalasensibilidaddel
gustovaraentrelosratonesendogmicos,elconsumodeaguaseveafectadadeformavariable,yenalgunascepas
sepuedeproducirunadeshidratacinsignificativa.Almismotiempo,elconsumodedrogastambinpuedevariar
debidoalasratasylosratonespuedendejardebeberlquidosamargosypuedenresistirlafaltatotaldeaguadurante
variosdasantesdequeaparezcahiperosmolalidad(207).Lasacarosapuedeaadirsealaguaparapreveniresto,
perolasrespuestassonvariable(208).Porlotanto,sielaguapotableeselmtododeentregaelegido,elpeso
corporalyelconsumodelabebidadebensercontroladoscuidadosamenteylasconcentracionesdedrogasajustarn
debidamente.UnaconsideracinmenorenroedoresesqueeltratamientoconPTUoMMIelevalaconcentracinde
calcitoninaensueroy,conelusoprolongado,lasclulasCsemuestranhiperplasiafisiolgicaoreactiva.Estonoest
relacionadoconelestadodehipotiroidismosistmicalacausaesdesconocida.
SerumT3nivelescaerndebajodelonormaldentrode1015dasdependiendodelaconcentracindelfrmacoyla
vautilizada.Comounejemplo,hubounaumentode20vecesenTSHensueroenratastratadasduranteunmximo
de3semanascon0,05%MMIenagua(potable209).Eltratamientocon0,1%PTUenagua,quetambininhibela
conversinperifricadeTpotable4aT3,resultenunareduccinmsrpidaenelsueroT3yelaumentodeTSH
ensueroqueenlasratastratadascon0,1%MMI.Sinembargo,estasdiferenciasyanoseobservarondespusde3
semanasdetratamiento(209).UnestadodehipotiroidismosepuedelograrmsrpidamentesiPTUoMMIse
combinancon1%KClO4enelaguapotable,unpotenteinhibidordeNIS(210,211).Sinembargo,su
combinacintambinenmagnificarelefectoqueestasdrogastienensobreelconsumodeagua.
Unaalternativarazonableesusar0,15%PTUquecontienegrnulosdecomidabajaenyodo,queestdisponible
comercialmenteysehautilizadoconxito(212).Sehainformadodequeunestadosistmicodelhipotiroidismose
puedelogrardespusde4semanasenestadietaunenfoquemsrpidoincluyelacombinacindeagua0,01%
MMI,queesunaconcentracinquenopareceinterferirconelconsumodeagua.Enexperimentosalargoplazo
(meses),elcrecimientocompensatoriotiroidesTSHimpulsadapuedeelevarelsueroT4denuevoanivelescasi
normales,inclusomientrasquelosanimalesestnenladietaPTUbajaenyodo.Porlotanto,esimportante
documentarunestadodehipotiroidismosistmicadurantetodoelexperimento.
20cRECOMENDACIN
Hipotiroidismosistmicapuedeserinducidaporlaablacindeyoduroradiactivodelaglndula.Enlos
animalesadultosliberacindehormonatiroideasereducenotablementedespusde1semanade131
administracinI.Elcrecimientoenlosanimalesrecinnacidosmesetasdespusde34semanasde131me
administracin.
Comentario Laadministracinintraperitonealde131Iensolucinresultaenhipotiroidismotransitorioopermanenteen
ratasadultas(250 gBW),dependiendodeladosisutilizada(213).Unprocesodegenerativoprogresivotiroidease
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observadespusdelaadministracinde300o525 Ci131I,perolaregeneracinseproducedespusdevarios
meseslaregeneracinnosevecuando875 Ciseutiliza(213).Otrostejidospuedenserdaadosporlaradiacin:
sehaobservadofibrosisdelasglndulasparatiroidesal525o875 Cide131seutilizayo.Nopuedehaberdao
traquealyefectosrenalestransitorios(213).Nosehaobservadodaosenelhgado(213).Elindicadormetablico
tempranodedisminucindelafuncinglandularesunagotaenlaprotenaunida131I,queseobservalas24horas
despusdelainyeccinde875 Cide131I(214).Esteenfoquetambineseficazenratasrecinnacidasdespusde
laadministracinintraperitonealde80 Cide131I(215).Enun2025 gratn,laablacindirectasepuedelograr
con200 Cide131I(216).
20dRECOMENDACIN
Unestadodehipotiroidismosistmicasepuedeconseguirdeformarpidayeficazmenteporelusode
enfoquescombinados.
Comentario Cualquiercombinacindedietabajaenyodo,medicamentosantitiroideos,cirugayyodoradiactivose
podrautilizardeformarpidayeficazparalograrunestadodehipotiroidismosistmicagrave.Tpicamente,131Ies
precedidaporunadietabajaenyodo.Alternativamente,latiroidectomaquirrgicatambinpuedeserseguidopor
unadietabajaenyododurante2semanas,seguidoporlaablacinderestoscon131Iladosisablacinposquirrgica
de200a250 gderatapuedeser~80 Ci(217)pararatones,2550 Cihasidoutilizadoconxito.
RECOMENDACIN21
Hipotiroidismosecundariopuedeserinducidaenratasporlahipofisectomaquirrgica.
Comentario Hipofisectomaquirrgicaenroedoresrequierehabilidadyexperiencia.Elenfoqueparafarngeopara
extirparlaglndulapituitariaenroedoressehautilizadotradicionalmente(218,219).Esteenfoquesehasustituido
engranmedidaporelenfoquetransauricular(220,221).Esteprocedimientodejasordosanimalenunooambos
odos,loqueafectarasurendimientoenciertaspruebasdecomportamiento.Tpicamente,unanestesiados50300 g
derataseinmovilizaenuninstrumentohipofisectomaHoffmanReiter,quepermitelacolocacinestereotcticadela
puntadeunaagujadeaspiracinprximoalaglndulapituitaria,queseaspiracontinuacin.Elanimalseretira
entoncesdelinstrumentoyproporcionaloscuidadospostoperatorios.Laintegridaddelahipofisectomaseconfirma
porlaausenciadeaumentodepesoduranteunperodode4semanasdespusdelaciruga.Cuidadoperioperatorio
deestosanimalesesfundamental:losanimaleshipofisectomizadostienendificultadespararegularlatemperatura
corporalyporlotantorequierencondicionesambientalesconstantesunasalamscaliente(temperaturaentre72F
y76F)esideal.Esteprocedimientoaumentaladiuresisyasjaulasconcamadecontactosedebecambiarcon
frecuencia.Dadasufragilidadmetablica,losexperimentossellevanacabotpicadespusdelasprimera6a10das
delpostoperatorio.Todoslosanimaleshipofisectomizadassemantienenenelaguapotablequecontieneelectrolitos
adecuadosy5%deglucosa,adlibitum.Suplementosdeaguacomienzaneldadelacirugaydebencontinuar
durante14das.Paraproduciranimalesqueexhibenhipotiroidismosecundarioselectiva,animales
hipofisectomizadassontratadoscondosisdiariasdereemplazodelahormonadelcrecimiento,hormonaluteinizante,
hormonaestimulantedelfolculo,prolactina,testosteronapropionato,benzoatodeestradiol17,cortisonaovehculo
medianteinyeccionessubcutneas(222).
RECOMENDACIN22bis
ElhomeoboxNkx21(Nkx2.1T/ebp,TTF1)KOratnesunmodelodedisgenesiatiroidea.
Comentario ElNkx2.1ratnKOseprestaparaestudiosdedesarrollodelaglndulatiroidesfetal,ascomopara
estudiosenlosquenoexistelasecrecintiroideafetal.Tiroidesespecficaprotenadeuninalpotenciador(T/ebp)
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/Nkx2.1tiroidesratnnulldegeneranpordaembrionario(E)12a13porapoptosis,mientrasqueT/ebp/Nkx2.1
ratonesheterogyzgouspresentanhipotiroidismoconnivelesdeTSHelevados.ElfactordetranscripcinNkx2.1(T
/EBP,TTF1)regulatiroidesespecficalatranscripcindegenes,perotambinesimportanteparaeldesarrollodela
pituitaria,pulmn,ylasregionesdelcerebroventrales(223).ElhomocigotosNkx2.1ratnKOnoesadecuadopara
losestudiospostnatales,yaqueestosanimalesmuerenalnacerdebidoapulmonesprofundamentehipoplasia,un
hipotlamopresentangravescarencias,ylaausenciadeglndulastiroidesypituitaria.Porotrolado,Nkx2.1ratones
heterozygous,semostraexhibirhipotiroidismoconnivelesdeTSHelevadosytienenundefectoneurolgico,
aunqueparecenestarsanosysonfrtiles.Estefenotipotiroidessedebealareduccindeexpresindelreceptorde
TSHdebidoaT/ebphaploinsuficiencia.
22bRECOMENDACIN
ElPax8ratnKO,elreceptordeTSHKOratnyelratnhomocigotoparaelgenautosmicorecesivo
hipotiroidismo(hyt)presentanhipotiroidismocongnitogravedeaparicinfetal.
Comentario DadoqueelPax8genregulalatranscripcindetiroidesespecfica,suinactivacinresultaenunapequea
glndulatiroidesquecarecedelaformacindelfolculo(224).Pax8ratonesKOtienensueroindetectableT4yT3
niveles,elaumentodelamortalidadpostnatal,yretrasodelcrecimiento.EncontrasteconlaNkx2.1KO,elPax8KO
ratnsobrevivenacimientoperomueredespusdeldestete.TratamientopostnatalconT4oT3,rescataraestos
animales.Laretiradadeltratamientodurantelavidaadultaproduceunanimalgravementehipotiroidismoquepuede
sobrevivirdurante6mesesoms.
Eldefectomolecularenelhytratnesunpuntodemutacindeinactivacinenelgenquecodificaelreceptorde
TSH(TSHR).NeonatalesHYT/hytratoneshanreducidoelsueroT4quevandesde1/5a1/6delanormalidad,as
comoretrasadosignificativamenteeldesarrollosomticoyconductual.Elhyt/hytratnofreceunmodeloidealpara
explorarelefectodelaseverahipotiroidismoprimarioheredadoenelteroyenelperodoneonatalprecoz(225,
226).ElratnKOTSHResprofundamentehipotiroidismosinhormonatiroideadetectableenelsueroyTSHsrica
elevada,exhibiendoretrasoenelcrecimientoydesarrollo,ascomoinfertilidadsinosuplementadoconT4(227).
22cRECOMENDACIN
Elratnconunamutacinsinsentidoeneloxidasa2dual(DUOX2gen)yelCogratn(bociocongnito)son
modelosmenosgravesdehipotiroidismocongnito.
Comentario LosratonesconunamutacinenelDUOX2exhibicingendeunaformamslevedehipotiroidismo
congnito.ElDUOX2genestimplicadoenlageneracindeH2O2paralaperoxidasatiroidea,laenzimaque
catalizalaorganificacindeyodoenlatiroglobulinaparalasntesisdelahormonatiroidea.Unvalinaalasustitucin
deglicina(V674G)enDUOX2explicaladishormonognesistiroides(228).ElmutanteDUOX2homocigotos
desarrollahastalaedadadulta,peroexhibeenanismoysufrededeficienciaauditiva.SerumT4nivelesson10%de
losnivelesdetiposalvajeyestnasociadosconunaelevacindeaproximadamente100vecesenlaTSHensueroy
unpituitariaanteriordisplsico.Estemodeloderatndehipotiroidismocongnitopuedesermsgraveporla
orientacinsimultneadeDUOXA1yDUOXA2,quesonfactoresdemaduracinespecficasnecesariasparala
orientacindelasenzimasDUOXfuncionalesalasuperficiecelular.Machosyhembrashomocigotospresentan
bocioyelhipotiroidismocongnitoconindetectableTsuero4ylosnivelesdeTSHde500a2.500vecesms
elevados,respectivamente(45).
Elengranajedelratnexhibeunamutacinautosmicarecesivaquesehaasignadoalagentiroglobulina(230,231
).Jvenesadultosdentadasratonesmuestrantasareducidadecrecimiento,anemialeve,bajaTsuero4yT3,yTSH
sricaelevada.Tiroidesderatonesmutantessonhipertrofiado,deficienteencoloide,acumularmenosdeyodo
(parcialmentesusceptiblesaladescargadeperclorato),ytienenunamarcadadeficienciaenelcontenidodela
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tiroglobulina(230).
22dRECOMENDACIN
ElratnKOTRHesunmodelodehipotiroidismoterciario,enelquelainterrupcinenlafuncintiroideaes
sloleve.
Comentario LosratonesKOTRHsonviablesyfrtilesyexhibeneldesarrollonormal(80).Sinembargo,tienenuna
marcadadisminucinensuerodeT4(aproximadamente60%
delosvaloresdecontrol),laelevacindelnivelde
TSHensuero,yhadisminuidolaactividadbiolgicadeTSH.Lapituitariaanteriorhadisminuidoclulasinmunes
positivodeTSH,quesecorrigedereemplazohormonalTRH,peronodelatiroides.ElratnKOTRHexhibeun
ligeroretrasoenelcrecimientopor4semanasdeedadquesenormalizaalas8semanasdeedadoportratamiento
conT4(80).DebidoalpapeldesempeadoporTRHenlosislotespancreticos,losratonesKOTRHtambin
presentanhiperglucemia,queseacompaadelasecrecindeinsulinaalteradaenrespuestaalaglucosa.
23aRECOMENDACIN
Formasyporclulasespecficasdetejidodehipotiroidismorelacionadocondeiodinasaactividadessepueden
estudiarinvivoatravsdelainterrupcindelavaD2olainduccindelavaD3.
Comentario LaactividaddelosdeiodinasaspuedemodificarT3nivelesdeunamaneraespecficadelaclulasin
afectaralosnivelescirculantesdelahormonatiroidea(84).UnainterrupcinenlavaD2sehademostradoque
disminuyelaT3produccinlocalmenteyperturbarlahormonatiroideasealizacinenlasclulasqueexpresanD2(
92,173,232234).Estoseilustraporlareduccindeaproximadamenteel50%enT3contenidoenelcerebroD2
KO(187).InhibidoresD2sepuedenutilizar,peroconprecaucindebidoalosefectosfueradelameta.Por
ejemplo,lainhibicindeD2hasidoidentificadocomolacausasubyacentedelaTSHensueroelevadaasociadacon
eltratamientoconamiodarona(235),perotambininhibelaamiodaronaD1ypuedetenersuspropiosefectosTR
tambin.Existenpreocupacionessimilaresconcidoiopanoico,utilizadoparainhibirD2yperturbarlasealizacin
delahormonatiroideaenBAT(236,237).ElusodelosanimalesKOD2constituyeelmejormodeloparaestudiar
elhipotiroidismolocalizadadebidoalainterrupcindelavadeD2.
LostejidosqueexpresanD3handisminuidosealizacindelahormonatiroideacomoresultadodelarpidaT3
inactivacinaT2yporlotantoconstituyenunmodelodehipotiroidismolocalizada(62,63,238,239).Esto
puedeserexageradaduranteD3reactivacindurantelaenfermedad,isquemia,hipoxiaoqueconduceala
interrupcinlocalizadaenlasealizacindelahormonatiroideaendiferentestejidostalescomoelmiocardioyel
cerebro(6265,238,241).
23bRECOMENDACIN
HipotiroidismoCellyespecficadetejidorelacionadaconyodotironinatransportepuedeserestudiadoenvivo
atravsdelainterrupcindediversossistemasdetransporte.
Comentario InactivacindemutacionesenelgenquecodificaMCT8interrumpenT3transporteatravsdela
membranaplasmticaydisminuyendesealizacin(hormonatiroidea107,108).DadoqueD2seexpresaenlas
clulasglialesyTRprincipalmenteenlasneuronas,secreequelainactivacindelamutacinMCT8promover
hipotiroidismoneuronalmediantelainterrupcindelosefectosparacrinosdeglahechasT3enunmomentocrtico
paraeldesarrollodelsistemanerviosocentral.Dehecho,laexistenciadeestemecanismoparacrinoseverificen
cocultivosdeclulasglialesylaslneascelularesneuronales(173).Laevidenciaclnicaapoyandoestemecanismo
seobtuvoporprimeravezenpacientesconfenotiponeurolgicogravequepresentaelsndromedeAllanHerndon
Dudley(107,108).
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[E.2]Reemplazodehormonatiroidesenlosanimales
Fondo LarelacinmolardeT4aT3entiroidesderataes8:1(242)yelestimadoT4/T3proporcinenla
secrecintiroideaesde5:1(1000 pmol/ddeT4a190 pmol/ddeT3),loqueindicaunapequeacontribucin

detiroidesT4aT3conversinaldiarioT3produccinenlarata(132).Porlotanto,laprohormonaT4esla
yodotironinasecretadaimportanteenratasyodosuficiente.MientrastodoT4essecretadaporlaglndulatiroides,
alrededordel60%detodoslosdasT3esatravsdelaproduccindedesyodacinperifricadeT4,yel40%
restantesecretadadirectamentedelaglndulatiroides.Enparticular,laglndulatiroideshumanacontribuyeconslo
un20%deldiarioT3deproduccin(132).
Enteora,elreemplazodelahormonatiroideaenlosroedorespodraajustarsealosprotocolosaplicadosenlosseres
humanosesdecir,reemplazodehormonatiroideadepartidabasadoenTSHpesoymonitoreosueroyT4.Sin
embargo,enratasLT4monoterapianopuedenormalizarsimultneamentesueroT3,T4yTSH,presumiblemente
debidoalamayortiroideaT3produccinenroedores(243,244).As,paranormalizarT3yTSH,elsueroT4
debesersuperioralanormalenratas,ylomismoseaplicaaltejidoT3yT4contenido.Histricamente,los
investigadoreshanutilizadoelTdiaria4tasadeproduccin,aproximadamente10 ng/gBW,comounadosisde
reemplazoenLT4monoterapiaenratasporqueestadosisessuficienteparanormalizarlatasadecrecimiento(200).
Sinembargo,sisedeseanormalizacindeTSHensuero,unadosismsalta(aproximadamente20 serequiereng/g
BW).MientrasqueunenfoquesimilarparaLT4detratamientosehautilizadoenratoneshipotiroideos(esdecir,
dosisdetratamientoequivalentealatasadeproduccindiaria)datosnormativosfaltanparadeterminarsilaspruebas
delafuncintiroideaensueroytejidoT3yT4nivelesrespondendemanerasimilarcomoenratas.
24aRECOMENDACIN
ElTdiariamente4dosisdereemplazoenratasadultaspreviamenteprestadoshipotiroidismodebeaproximar
latasadeproduccindiariasilatasadecrecimientosemantienecomolavariableprincipalquedefineel
estadoeutiroideo.LasdosismsaltasdeLT4debenserutilizadossilaTSHsricaessernormalizados.Siotro
tiroidespuntosfinalessensiblesalashormonassehandeconsiderar,laapropiadaT4dedosificacindebe
determinarseempricamenteenunabasedecasoporcaso.
Comentario Engeneral,lanormalizacindesuerodeT3oparmetrosbiolgicostalescomoelcrecimiento,la
expresindeunaT3genresponsive,olaactividaddeunaT3responsiveenzimaenelhgadosonparmetros
aceptablescuandoseconsiderareemplazodehormonatiroideaenrataspreviamenteprestadoshipotiroidismo.
Entregadiariade~8 ng/gBWaratasadultaspreviamentehipotiroidismomostradahasidomostradospara
normalizarsueroT3niveles,tasadecrecimientoylaactividaddehgadoGPD,unndicemuysensibledelestado
tiroideosistmicaenratas(202).
Porrazonesprcticas,laadministracindeT4eselmtodoutilizadomsfrecuentementepararestaurarel
eutiroidismo(200,202,245,246).Sinembargo,acausadelasecrecintiroideadirectasustancialdeT3en
roedores,elidealrgimendereemplazodehormonatiroideacontaraconunamezcladeT4yT3.Algunosestudios
hanestablecidoladosificacinptimaparalaterapiadecombinacinenroedores(244).CuandoT4seutilizasolo
paraelreemplazo,tejidoT3contenidopuedevariaratravsdeungrannmerodetejidosdebidoalpapel
desempeadoporlosdeiodinasascomofuentelocaldetejidoT3(atravsdelaconversindeT4)(243,244).
LadiariacalculadaT3deproduccinesdeaproximadamente2,7 ng/gdepesocorporal(132).Enparticular,una
dosisligeramentemenordeT3,2,0 ng/gBW,sehademostradopararestaurarelcrecimientoylaactividadde
GPDhgadoenratasconhipotiroidismopreviamenteprestados(202).Sinembargo,laadministracindeT3pors
solanoessuficientepararestablecereleutiroidismoentodoslostejidos,particularmenteenaquellosconuna
contribucinsignificativadelavaD2(243,244).
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24bRECOMENDACIN
Seprefierelavaparenteralparaentregarhormonatiroideapararoedoresporejemplo,intraperitoneal,
subcutnea,obombasosmticasimplantadassubcutneamenteogrnulos.
Comentario T4yT3solucionessepreparanen40 mMdehidrxidodesodioysediluyeronensolucinsalinapara
inyeccin.Alabrigodelaluz,lassolucionesmadrepuedenseralmacenadasa20Cduranteunassemanas.Las
inyeccionesdiariasevitanpreocupacionessobreadmisinvariablesilahormonaseadministraenlosalimentosoel
agua(vasemsadelante).Sinembargo,debetenerseencuentaquelasinyeccionesproducenunpico
supraphysiologicalrpidaensistmicosT4oT3niveles.MtodosdeentregaalternativosparalaT4oT3
administracintalescomobombassubcutneosopelletspuedenserpreferiblessisedeseantasasrelativamente
constantesdelaentrega.T4yT3sepuedenmezclarconaguaoalimentos,peroestosmtodosllevanlavariabilidad
intrnsecadealimentosoaguadeconsumoquepuedenimpedirsuusoenalgunosexperimentos.Laduracindel
tratamientopuedeabarcarvariosdas,semanasomeses.Preferiblemente,lasdosisdebenserdivididasalda(cada12
horas),dadalarelativamentecortavidamediadeT3yT4enroedores(2y8horas,respectivamente).Lasmuestras
desangreparamedirlosnivelesdehormonatiroideadebetenerencuentalacronologadelaltimainyeccin.
24cRECOMENDACIN
RegmenesapropiadosparalaedaddeT4dereemplazodebenserutilizadospararatonesrecinnacidoscon
hipotiroidismo.
Comentario Enlosmodelosdehipotiroidismocongnitooneonatal,T4sustitucindebeiniciarsedesdeelnacimiento
(da0)ycontinuadiarioatravsdealmenos10dasdespusdelparto,unperodocrticodelatiroidesdependiente
dehormonaseneldesarrolloenratones(247).SueroT4nivelesenratonesseveramentehipotiroidismopuedeser
restauradoalosnivelesdecontroldelamismaedadatravsdeinyeccionessubcutneasdeT4enlosdas05(4 ng
/g),68(5.8 ng/g)y10.9(9,1 ng/g)paraelratn(248251).Lasinyeccionessepuedenrealizarutilizandoun
0,5 mljeringaconunaagujatratadoconsolucinsalinadecalibre30.
24dRECOMENDACIN
Clulasmadreembrionariasderatnpuedenserconducidosadiferenciarseenclulasfolicularestiroideas
funcionalesinvitro,larestauracindeeutiroidismosistmicacuandosetrasplantanenratoneshipotiroideos.
Comentario LasobreexpresintransitoriadelosfactoresdetranscripcinNKX21(anteriormentellamadoTTF1)y
Pax8dirigealasclulasmadreembrionariasderatnparadiferenciarseenclulasfolicularesdetiroides.Cuandose
trataconTSHestasclulasseorganizanenestructurasfoliculares3Dyactivangenestiroidesfuncionalincluyendo
NIS,TSH,tiroglobulinaytiroperoxidasagenes(252,253).Estosinvitrofolculosderivadosmuestranactividad
organificacinyoduroycuandoinjertadoinvivoenratonesathyroidsoncapacesderestaurarlosnivelessricosde
hormonatiroideaypromovidolarecuperacinsintomticaposterior(252).
[E.3]Elhipotiroidismoenclulascultivadas
Fondo Elmediodecultivocontienegeneralmentedesueroanimal,ylasclulasascultivadasestnexpuestosa
yodotironinaconcentracionesquedependendelafuentedelsuero.Porejemplo,sisuerobovinofetal(FBS)seutiliza
paraapoyarelcrecimientocelular,elambienteT3yT4concentracionesenelmedioreflejarnlosnivelesde
hormonatiroideadelosternerosutilizadosparaproducirelsuero.Histricamente,suerotomadasdeanimalesodelos
animalestratadosconfrmacosantitiroideostiroidectomizadossehanutilizadoparagenerarlosmediosde
comunicacinhipotiroidismo(254).Debidoalafaltadedisponibilidadcomercialdetalessuero,decapadoqumico
havueltomscomn,yaseaconcarbnvegetal,resinasAG1X8deintercambioaninico,oambos(255,256).
Dependiendodeltipodeclulaenestudio,elusodemedioslibresdesuerotambinpuedeserunaopcin,aunquela
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mayoradelasclulassepropaganmejorenmediosquecontienensuero.
25aRECOMENDACIN
Lasclulasencultivosepuedenhacerhipotiroidismousandomediossuplementadoscon(i)elsuerocon
carbnvegetal,(ii)desuerodespojadoderesina,(iii)sueroobtenidodeanimaleshipotiroideos,o(iv)mediono
suplementadoconsuero.
Comentario Elusodelosmediosdecomunicacin"definidos"parainducirhipotiroidismotieneunaseriede
advertencias.Mientrasquemuchosinformesindican">99%"deT3yT4seeliminanatravsdeprotocolos
estndardeagotamiento,existeciertavariabilidadenelgradodeT3yT4remocinalcanzadoporlosdiversos
procedimientos.Estavariabilidadpuedesurgirtantodefactoresrelacionadosconeltipodesueroydelmtodode
extraccin(257,258).Adems,losmtodosdecapantesqumicosactualesnopermitenelagotamientodela
hormonadelatiroidessinozonotambinotrosfactorescirculantes.Muchaspequeasmolculastalescomofactores
decrecimientouhormonas(incluyendoesteroidessexuales,esteroidessuprarrenales,ylavitaminaD)tambin
puedenserremovidosdurantelaextraccin,yporlotantoloscambiosbiolgicosobservadoconeltiemponose
puedendescribircomoquerepresentaaisladohipotiroidismo(257).Diseoexperimentaldebecomparargruposcon
hormonatiroideareemplazado(frentealvehculosustituido)parapermitirlaatribucinespecficadelosresultadosa
ladeficienciadelahormonatiroidea.SiunagotamientomsaisladadeT3yT4esnecesario,lapreparacinde
sueroanimalhipotiroidismohasidodemostradoserpotencialmenterentable,apesardeunaaparienciainicialde
impracticabilidad(254).
Elusodesueroagotadosehademostradoqueinducehipotiroidismocelular,evaluadaporelniveldeexpresindeT
3responsivegenes,entanpococomo24horas(259).Enteora,eltiemponecesarioparaalcanzarelhipotiroidismo
podraacortarsecambiandoconfrecuencialosmediosdecomunicacin(porejemplo,cadapocashorasenlugarde
diaria)EstoaceleraraelagotamientodeintracelularesT3tiendas.Delmismomodo,eltiempodecultivoprolongado
enT3Ty4seradeesperaragotadasmediosparainducirunestadomsprofundodehipotiroidismocelular.
Independientementedelenfoque,elgradodehipotiroidismoparacadacondicinexperimentalsedeterminamediante
lamedicindelaT3responsivepuntosfinales(porejemplo,laexpresindeT3responsivegenesoT3responsive
enzimas)parafacilitarlacomparacinentreensayos.
25bRECOMENDACIN
LasclulasencultivosepuedenhacerhipotiroidismousandounantagonistadeTR.
Comentario NH3esunantagonistadeTRqueinhibefuertementelaactivacintranscripcionalporT3(260265).El
tratamientoconestecompuestosehademostradoquebloqueanlahormonatiroideaprocesosdependientestales
comoespontneaXenopuslaevisrenacuajometamorfosis.Enteora,estefrmacopodraserutilizadoparainducir
hipotiroidismoenotrosvertebrados,peroestoannosehaestablecidoexperimentalmente.
[F]ElaumentodelahormonatiroideadeSealizacin
Visindeconjunto Clsicamente,tirotoxicosisseconsideracomounestadofisiopatolgicoenelquelasealizacinde
lahormonatiroideaseincrementasistmicamente(esdecir,alolargodetodoslostejidosdelorganismo)como
resultadodelaumentodelaT3deuninconsusreceptoresnucleares.Experimentalmente,tirotoxicosissistmica
puedesermodeladainvivoatravsdeltratamientodelosanimalesconlahormonatiroidea.Invitro,lasclulas
puedensertratadasconlosmediossuplementadosconhormonatiroideaporencimadelasconcentraciones
observadasenlasangre.Sinembargo,enesteltimocaso,losefectosdeladiafonaentrelostejidostirotoxicosis(es
decir,losefectosinteractivos,indirectomediadoatravsdesegundosmensajeros,estnausentes)elestadode
"tirotoxicosisdirecta"creadoes,pues,distintadelatirotoxicosissistmica."Aumentoespecficadetejidoenla
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sealizacindelahormonatiroidea"esunconceptomsreciente,quesurgecomoresultadodelaactividad
deiodinasalocalqueaumentarnuclearT3concentracindeciertostejidossinalterarnecesariamentelaconcentracin
dehormonadelatiroidesplasma(66).
[F.1]tirotoxicosisenanimales
Fondo Administracindelahormonatiroideaaunroedordeotromodoeutiroideoconduceatirotoxicosissistmica,
laintensidaddeloscualesestdirectamenterelacionadaconlamagnituddelaelevacinensuerodeT3
concentracin.Unnmerodeenfoquessehanutilizadoparalogrartirotoxicosissistmica,incluyendolainyeccin
intraperitonealdelahormonatiroidea,ademsdeChowoaguapotable,ypelletsubcutneooinsercinminibomba.
26aRECOMENDACIN
Tirotoxicosissistmicaagudapuedeserinducidaporlaadministracinparenteral(intraperitonealo
intravenosa)de1,0 gT3/gBW,unadosissaturantedeTRT3.Efectosgenmicossepuedenvertanpronto
como60minutosyefectosfisiolgicosapartirdeaproximadamente6horas.
26bRECOMENDACIN
AlargoplazotirotoxicosissistmicapuedeserinducidaporeltratamientocrnicoconT3oT4sobredas,
semanasomeses.Lasvasdeadministracinincluyenparenteralolasuplementacindealimentosoagua.
Paralosestudioscrnicos,lasdosisTRsaturacindebenserevitadosdebidoalacaquexiaylamuerte.Para
permitirlacomparacinentrelosestudios,T3dosisdebenadministrarsecomomltiplosdeldiarioT3oT4
dosisdereemplazo.
Comentario LavidamediadeT3enroedoresdespusdelainyeccinsehamedidoenaproximadamente4horas,y
paraT4alrededorde11horas(132).Dadasestascortasvidasmedias,enlosexperimentosyaseaagudaocrnica,
elmuestreoparalamedicindeT3oT4nivelessricosdebentenerencuentalacronologadelaltimainyeccin,
enparticular,paraT3.Ademsdemltiplesinyeccionessedebenconsiderarsilosefectosbiolgicossevanamedir
despusdehaberpasadovariasvidasmedias.DespusdemltiplesinyeccionescondosisclsicosdeT3(100 mg/
100 gBW),elintensoestadodetirotoxicosisprovocaprdidadepesocorporalyaumentalamortalidad,detal
maneraqueladuracindeltratamientoexperimentalnodebeextendersemsallde45das.LasdosistpicasdeT4
oT3bientoleradoenexperimentosalargoplazo(23meses)sonde10a25veceslatasadeproduccindiaria.Si
bienlosmtodosdeadministracindefrmacosporlosalimentosyalaguaestnsujetosalaalimentacindela
variabilidad,estopuedenosercrticoparalosestudiosdetirotoxicosiscrnicaporejemplo,ladietaderoedoresen
polvoquecontiene3 mgdeT4y1 mgdeT3porkilogramohasidoutilizadoconxitoparainducirtirotoxicosis
crnica(205).Sedebeconsideraralosmtodosmsconsistentes,comolasbombassubcutneosopellets(243,
244).
Dependiendodelcriteriodevaloracinaserestudiado,laeleccindeyodotironinaesimportante,yaqueT4se
convierteenT3atravsdeD1yD2.PacientesGravesvecespuedenexhibirunaT3formapredominantedela
tirotoxicosis,mientrasquelospacientesconcncerdetiroidessongeneralmentetratadoscondosisfarmacolgicasde
T4paralograrlasupresindeTSH.Dichoesto,enlosestudiosnosecentraenlasfuncionesdelosdeiodinasas,T3
seprefiere,yaquenorequiereactivacinadicionalyporlotantoeliminalosdeiodinasasactivadorascomouna
variable.
Clsicamente,grandesdosisdeT3sehanutilizadoenlosexperimentosconroedores,diseadosparasaturarelT
nuclear3receptoresrpidamenteyporlotantomaximizarloseventosfenotpicasestudiadascomopuntosfinales,
mientrasqueminimizaeltiempoexperimentalyporlotantoelcosto.Porejemplo,unadosistpicaparalasrataso
ratonessera100 g/100 gBW,produciendocambiosgenmicosyfisiolgicasmensurablesdentrodeunaspocas
horas(266).CabesealarquelasdosisdeT3clsicamenteutilizadosparaexperimentosconroedoresson
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claramenteenelrangofarmacolgicaysonmuchomsaltaquelagamafisiopatolgicovistoenlanaturaleza.
Algunosautoressepreguntansitalesdosisaltaspuedenproducirartefactosfueradeobjetivooexcesivamente
aumentarlosefectosnogenmicosdeT3.
RECOMENDACIN27
InvivoactivacindelavaD2oinactivacindelavaD3puedeserutilizadoparaestudiaraumentopor
clulasyespecficadetejidoenlasealizacindelahormonatiroidea.
Comentario D2activacininducidaporcAMPinBATllevaaunarpidasaturacindeTRcongeneradalocalmente
T3ylainduccindeT3responsivegenesylaactividaddeT3responsiveenzimas,sinafectaralosniveles
circulantesdelahormonatiroidea(66,86,233,237,267269,271).Estotambinseobservenmodelos
animalesdelaexpresintransgnicaDio2enelcorazn(273,274).Encambio,D3inactivacinresultaen
aumentolocalizadoenlasealizacindelahormonatiroideacomoseevidenciaenelratnKOD3(64,239,275
279).
[F.2]tirotoxicosisenclulascultivadas
Fondo Paralosexperimentosbasados
enelcultivodeclulas,tipodeclulasespecficasdetejidoespecficooms
propiamentetirotoxicosispuedesermodeladamediantelaadicindeT3almedio.Lasconcentracionesdehormona
tiroideaMediumpuedendeterminarsedirectamente,peroenlamayoradecasosseestimaconbaseenlosvalores
publicadosparalasfraccioneslibresenunsuerodado.
28aRECOMENDACIN
TirotoxicosisagudasepuedelograrenuncultivocelularmediantelaadicindeT3enlosmedios.Lafraccin
libredeT3multiplicadoporlaconcentracintotaldeT3daunaestimacindelaconcentracindehormona
libre.Sifraccioneslibresnosedeterminandirectamente,lasestimacionesdeconcentracindehormonalibre
sepuedenhacersobrelabasedelosvalorespublicadosdelasfraccioneslibres.
Comentario Silasconcentracionesexactasdehormonastiroideasenmediosdecultivocelulardebenserconocidas,
entoncesserequeriranmedidasdirectas.Enlamayoradecasos,sinembargo,secreequeestimacionesaproximadas
sersuficiente(Tabla2).Cabedestacarquelashormonastiroideasseadhierenarecipientesdeplstico,porloquees
importanteaadirunaprotenavehculoadecuadoconelfindemodelarlasfraccionesdehormonatiroideauniday
libreenuncultivocelular.SueroograsoStrippedseutilizannormalmentelibredecidoBSA,conT3(y/oT4)
sustituidolasmismasadvertenciasacercadelaprdidadeotrashormonastodavaseaplicancuandoseutilizaeste
enfoqueexperimental.
Pocosestudioshaninformadodemedicinbasadoenladilisisdeequilibriodelasfraccioneslibresensuero
despojado,perounestudioencontrqueparaFBSessimilaralagamaestimadadeFBSsinpelar(0,4%4%paraT
3)(281).BSAconcidosgrasospuedetenerT3,porlotantograsoBSAlibredecidosedebeutilizar(282).
TambinhayquesealarquelamayoradelasformasdisponiblesenelmercadodeT4tienenalmenosrastroT3
contaminacinquedebeserconsiderado.EsimportantedestacarquerecordarquelafraccinlibredeT3(oT4)
aumentaamedidaqueelporcentajedesueroenlosmediosdecomunicacindisminuye.Porlotanto,la
concentracindehormonalibresemantienerelativamenteconstanteamedidaqueelporcentajedesuerodisminuye.
Comoenelcasodelosroedores,ladosificacinfarmacolgicadelaT3sehautilizadohistricamente,conaltas
concentracionesdiseadosparalograrlasaturacindelosreceptoresnuclearesrpidamente.Porejemplo,100 nM
totaldeT3en0,5%BSAdaraunestimadodeTlibre3concentracindealrededorde3.500 horasparala
comparacin,lalibreT3concentracindesuerohumanoeutiroideoestaramscercade38 pM(alrededorde1000
vecesmenor).NoseesperaqueinclusolospacientesseveramentetirotxicosparalogrartalesaltaTlibre3
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concentraciones,sloalcanzandovaloresdeaproximadamente20 horas(283),otanaltocomo35 horas,enelcaso

deunaingestinaccidentaldeunadosismasivadeLT4(284).Algunosinvestigadoreshansugeridoqueladosis
farmacolgicapuedemejorarartificialmentefueradeobjetivoefectosnogenmicosyhipotticasdeT3Sistosno
sonunapreocupacin,ladosispuedesermaximizadaparaelefecto.Idealmente,T3sedebenutilizardosisqueestn
dentroocercadelrangofisiolgico.
28bRECOMENDACIN
Mientrasquelainduccindelatirotoxicosisencultivoscelulares,laposiblepresenciadedeiodinasasdebeser
consideradoparacadatipodeclulaqueseestudia.
Comentario Conocerlasactividadesdesyodasasdeunalneacelularparticular,puedeserimportante
experimentalmente.Amenosquelosefectosdeladesyodacinsondeparticularinters,tirotoxicosisdebeser
inducidamediantelaadicindeT3solamente,NotT4.EstoesporqueD1activaT4(laconversinat3
),detal
maneraquelasclulastratadasconT4tendrnTmediosvariablede3concentracionesdependiendodelnivelde
actividadD1yelvolumendemediosdecomunicacinyfrecuenciadecambiosdelosmediosdecomunicacin.Se
esperaqueesteefectoseamsintensaenlasclulasD2expresin,dadasumuchomayoreficienciacataltica.En
contraste,laactividadD3reduciralaconcentracindelosmediosdeT3(laconversinat2),aumentandoel
requisitodedosificacinparasostenertirotoxicosis.
[F.3]Elusodeanlogosdelahormonadelatiroides
Fondo LaexistenciadedosisoformasTR(esdecir,TRyTR)indicaquelasdiferentesvasdesealizacin(y
quizsconjuntosdeefectosbiolgicos)sonaguasabajodecadaunadeestasmolculas.Estosevereforzadoporla
observacindequeladistribucindeisoformasTResheterogneaentrelosdiferentestejidos/clulas(285,286).
Porejemplo,elhuesoesuntejidopredominantementeTRmientrasqueelhgadoesuntejidopredominantemente
TRAs,elfundamentoparaeldesarrollodemolculasqueexhibenespecificidadTRisoforma.
Dosadvertenciasdebenserconsideradosdurantelaseleccindelaconcentracinyladosisdeestasmolculas:
(I)Losdatosfarmacocinticos:TRselectividaddependedelaconcentracindeligandoylaabsorcin
selectivadetejido.Porejemplo,laeprotiromaparecetenerslounaselectividadmodestaparaTRinvitro,
sinembargo,susefectosprofundosparareducirloslpidosyelcolesterolresultadodedisponibilidad
selectivaenelhgado,posiblementedebidoalaabsorcinselectiva.Nohayinformacinsobrela
selectividadtransportadorparadiferentesligandososiestosligandosutilizanlosmismosodiferentesen
comparacinconlostransportadoresdeT3yT4.Elusodedosisrelativamentealtasoconcentracionesde
mediosdealtaminimizaoeliminalaselectividadTR.Hayestudiosfarmacocinticoscompletosactualmente
ningunaoslolimitadoparalamayoradeanlogos,porloqueesdifcildefinirlaconcentracinyladosis
enexperimentoscomparativosconT3uotrosanlogos.
(Ii)transportedelligandoenlaclulayclulancleo:losmecanismosqueconducenalacaptacincelulary
concentracinnucleardelosanlogosnohansidodefinidos.Porlotanto,inclusocuandoseutilizan
concentracionesequimolaresdelosmediosdecomunicacindosdetalesmolculasdesuconcentracinen
elncleo,alrededordelaTR,podraserdiferente.Estopodramejoraroeliminarcualquierventajabiolgica
deselectividadTR
expuestoinvitro.
RECOMENDACIN29
Sealizacindelahormonadetiroidespuedeseractivadoinvivoyinvitroporanlogosdelahormona
tiroidea,algunasdelascualestienenselectividaddetejidooselectividadparaisoformasTR(esdecir,TR1,
TR1,TR2).UnnmerodeTRaltamenteselectivoanlogosdelostejidosdianaqueexhibenpredominiode
TR(porejemplo,hgadoylaglndulapituitaria).Lautilizacindedosisequimolaresyconcentracionesde
diferentesanlogosyT3serecomiendacomopuntodepartidaenlosestudioscomparativos.
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Comentario cido3,5Diiodothyropropionic(DITPA)esunanlogodelahormonatiroideadecidocarboxlicoque
seuneTRyTRconafinidadescasiidnticos(287).LosestudiosenratasyconejosindicanqueDITPAtiene
efectosinotrpicospositivos,perocronotrpicomnimoyefectosmetablicosfueradelsistemacardiovascular(287,
288).Suusocombinadoconcaptoprilmejoraelrendimientoventricularyreduccindelapresindiastlicafinalen
elmodelodepostinfartoderatadeinsuficienciacardiaca(289).Efectosadicionalesincluyenatenuacindela
respuestainflamatoriaagudaylareduccindeltamaodelinfartodemiocardio(290),ylamejoradelpotencialde
perfusinmximadelmiocardiohipertrofiadosobrevivirauninfartodemiocardio(291).Sinembargo,otros
estudiosinformaronefectossecundarios(292,293)onoobtuvieronresultadospositivosconDITPAenentornos
similares(294,295).
Tiratricolesunanlogodelahormonatiroideacidoacticoqueexhibealrededorde3,5vecesmayorinvitro
afinidadporTRy1,5vecesmayorafinidadporTRcomparacinconT3,conunaselectividadaproximadamente
tresvecesparaTR(296,297).Sinembargo,slohayselectividadTRmoderadaenestudiosdecultivocelular(
298).Enratas,tiratricolhademostradotenerefectosantidepresivos(299),efectostermognicosenlaBAT(300,
301),yciertogradodeespecificidadderganosdebidoasumejoradahgadoyefectosesquelticosylareduccin
deefectoscardacos(302).Elusodetiratricolenunaseriedeentornos,incluyendopacientesconhipersecrecin
TSHylospacientesathyrotic,reduccinTSHsrica(303305)ylosnivelesdecolesterolsricobajossinafectarel
ritmocardaco,perolosmarcadoresbioqumicoselevadosderecambioseo(306,307).
UnanuevageneracindeagonistasTRaltamenteselectivostienemuchamenosafinidadporTRconservando
afinidadporTR(308).LasmolculasenlafamiliaGC(esdecir,GC1yGC24)soncompuestosnoniodinated
quefuerondiseadossobrelabasedelosdatosexperimentalesobtenidosparalaestructuraTR(309).Elusode
estasmolculashasugeridolaposibleexistenciadeuna"ventanateraputica"atravsdelcualpredominantemente
TRmediadaporefectosbiolgicos(porejemplo,reducirelcolesterolsricoylaaceleracindelgastodeenerga)se
puedenactivarconrelativamentepocaactivacinvasTRdependientes(310316).Sinembargo,esinciertosila
especificidaddetejidoinvivosedebealaselectividadparalauninTRoconcentracineneltejidodeestas
molculasoambos.Porejemplo,elagonistaselectivoTRGC1seconcentrapreferentementeenelhgadoenlugar
decorazn,msculoesqueltico,oenelcerebro(310).LafamiliaKBdemolculas(esdecir,KB141yKB2115)
sehautilizadoconxitoenanimales(317320)yenpacienteshipercolesterolmicosmantenidoconestatinaspara
reducirelcolesterolsricoanmssinafectarelcoraznyloshuesos(321,322).Enestospacienteshubo
alteracionesslomnimosenpruebasdefuncintiroidea.Sinembargo,losestudiosclnicosconestasmolculas
fueronsuspendidasdebidoalcartlagoindeseablesefectossecundariosobservadosenlosperros(323).
LaestructurageneralKBseutilizposteriormentecomounandamioparadisearunafamiliadecompuestos
(hidrocarburos)indanoderivadosquepresentanactividadtiromimticopotenteyselectivo(324).KTA439,un
derivadodeindanorepresentante,muestralamismaaltaselectividadTRhumanoenunensayodeunincomo
KB2115ymayorselectividaddehgadoenunmodeloderataalimentadosconcolesterol(324).
Unaestrategiaalternativaparaobtenerselectividaddeltejidoesusarmolculasqueseconcentranentejidos
especficosenvirtuddesometersealaactivacinlocal,talescomolaactivacindelcitocromoP450deun
profrmacoqueesunagonistadeTRquecontienefosfonato.EstamolculapresentaunamayoractivacindeTRen
elhgadoconrelacinalostejidosextrahepticosyunndiceteraputicomejorado(319).MB07811sufredeprimer
pasodeextraccinhepticaylaescisin,generandoelagonistaMB07344TRquedistribuyemalenlamayorade
tejidosyseeliminarpidamenteenlabilis(319).MB07811reduceelcolesterolensueroenhipercolesterolmicos
ratas,conejos,monosysereshumanosmsalldeloqueselogrconestatinassolas(325),essuperioraun
agonistaTRselectivoenelmodeloderatnobesoinducidaporladieta(319),yreducelaesteatosishepticaen
ratasyratonesmodelos(326).
AnlogosselectivosparaTRTambinsehandesarrollado(327)yhademostradosereficazenlapromocindela
neurognesisTRdependienteenX.laevis(328).Sinembargo,TRselectividadseperdicuandoelmismo
compuestoseensayenratas,conlaactivacindelatiroidesCO23genessensiblesahormonasenelhgadoyel
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corazn(329).
[G]DeficienciadeYodoytransferenciamaternofetaldelahormonatiroidea
Visindeconjunto Elyodoeselconstituyenteprincipaldelahormonatiroidea.Enpocaspalabras,laformamsactiva
delahormonatiroidea,T3,puedeservistocomotrestomosdeyodounidosaunandamiofenoxifenilo.El
posicionamientoespacialnicadelostomosdeyodoconfiereunaaltaafinidadporelTR,unregulador
transcripcionaldependientedeligando.Esnotablequelosvertebradosevolucionadoparatenerunelemento
ambientalescaso,yodo,juegaunpapeltanimportanteenlaembriognesis,elcrecimiento,elmetabolismo,la
cognicinylaadaptacinalosestadosdeenfermedad.Elmareslaprincipalfuentedeyodoytalvezelpapel
biolgicoimportantedesempeadoporelyodoreflejalaideadequelavidacomenzaexistiryevolucionadoenel
ocano.Nubesquecontienenyodoseformansobrelosocanosysopladashaciaelinterior,conlalluviadepositar
yodosobrelatierra.Dependiendodeltipodesuelo,elyodosemantienedurantealgntiempoorpidamentelava
losrosydevueltaalosocanos.Enconsecuencia,elcontenidodeyododelasplantas,cultivosyanimalesenuna
regingeogrficaespecficadependedelcontenidodeyodoenelsuelo.Alrededorde1,5millonesdepersonasviven
enreasgeogrficasdeinsuficienciadeyodo,loquerequierealgntipodesuplementosdeyodoparaprevenirlas
consecuenciasdelhipotiroidismoperinatal.
ElyoduroseabsorbeenelintestinodelgadoyvidamenteabsorbidaporlatiroidesatravsdeNISlocalizadaenla
membranabasallateraldetodostirocitos.Unavezdentrodelasclulas,yodurodifundehaciaellumenrelativamente
cargadospositivamentedelfolculotiroideo,quesaledelatirocitoatravsdecanalesPendrinsituadosenla
membranaapical.Adyacentealasmicrovellosidadesdelamembranaapical,elyoduroseoxidayconjugadocon
residuosdetirosinaespecficosenlamolculadetiroglobulina,unprocesocatalizadoporlaperoxidasatiroidea.
Posteriormente,lasmolculasdetiroglobulinayodadossonreabsorbidosatravsdepinocitosisysedigirieronenlos
lisosomas,laliberacindeT4,T3,ypequeascantidadesdetiroglobulina,ascomootrasmolculasyodadosenla
circulacin.
Ladeficienciadeyodopuedesuponerunagraveamenazaparalacapacidadtiroideaparasintetizarhormonas
tiroideas.Engeneralseaceptaqueladisponibilidadlimitadadeyodoactacomounapresinevolutivaquefavorece
eldesarrollodemecanismosdecompensacin,queminimizanelimpactodeladeficienciadeyodoenlaeconomade
latiroides.Descifrandoestosmecanismosescrticonosloparanuestracomprensindelafuncindelaglndula
tiroidesylaeconomadelahormonatiroidea,perotambinparaformularestrategiasquesepuedenutilizarparatratar
yprevenirlasconsecuenciasirreversiblesdehipotiroidismofetalyneonatalresultantedeladeficienciadeyodo.La
condicinmsgraveeselcretinismoneurolgicodebidoaladeficienciagravedeyodoyhipotiroxinemiadurantela
primeramitaddelembarazoqueresultaendaocerebralirreversible(330).As,losmodelosexperimentalesdela
deficienciadeyodohansidoampliamenteutilizadosparaanalizarlosmecanismosadaptativosdesarrolladosen
modelosanimalesyelimpactodelosdiferentesgradosdedeficienciadeyodoenlaeconomadelatiroides.
[G.1]Ladeficienciadeyodoenlosroedores
Fondo Lasprincipalesconsecuenciasdeladeficienciadeyodosonelbocio,hipotiroxinemia(242),elaumentodela
expresindeNIS(331),elaumentodemonoyodotirosina(MIT)/diyodotirosina(DIT)yT3/T4relacionesdentro
delatiroglobulina(332,333),Tpreferencial3sntesisysecrecinporlatiroides(242,332),elaumentodelas
actividadesdeD1yD2enlatiroidesylaactividadD2enBAT(334,335),bajaT4enelplasmaylostejidos(71,
336,337),yunaconcentracindeTSHqueesligeramentemselevada,juntoconunanormalodisminuy
ligeramenteT3nivelensueroyvariostejidos(71).LacaptacintisulardeT4yT3aumenta.Sloalgunosdelos
criteriosdevaloracindelaaccindelahormonatiroideasevenafectados,peroenmenorgradoqueenel
hipotiroidismomanifiesto(71,338).Ladietadepiensoalimentadoalosroedoresenlasinstalacionesdeanimales
acreditadoscontienesuficienteyodo(0,41 mg/g)parapermitirunaingestanormaldiariadeyodo(~510 g/d)yla
funcintiroidea.Dosestrategiassepuedenutilizar,deformaindependienteoencombinacin,parapromoverla
deficienciadeyodo:(i)laalimentacinconunadietabajaenyodo(<0,02 mg/g)quereducelaingestadeyodo(a
0,20,4 g/d)o(ii)eltratamientoconfrmacosqueinhibenlaabsorcindeyodoNISyastiroidea.
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30aRECOMENDACIN
Unestadodedeficienciadeyodosepuedelograrmediantelaalimentacindelosroedoresconunatapa(que
contiene<0,02 mgdeyodo/g).Gradosmslevesdeladeficienciadeyodosepuedelograrcondietasmenos
restrictivas.Efectossobrelaeconomadelatiroidessepuedenveryaalos10das,peroparalamayorade
losparmetrosdeefectosclarosrequierenporlomenos1mesdeLID.
30bRECOMENDACIN
Ladeficienciadeyodoenlosanimalespuedeserdocumentadamedianteelcontroldelaexcrecinurinariade
yodo,loquedeberaseraproximadamentede5a10vecesmenorenlosanimalesLID.
30cRECOMENDACIN
DeficienciadeyodointratiroideosepuedelograratravsdelainhibicindelaNIStraslaadministracinde
1%KClO4enelaguapotable.Tiendasdeyodotiroideaspuedenagotarseen1semanautilizandoeste
enfoque.Tratamientosmslargosconducirahipotiroidismosistmico,quedebesertenidoencuenta.Debido
KClO4esamargo,advertenciasseaplicanaestaestrategiacomosediscutianteriormente(vasela
Recomendacin19b).
31aRECOMENDACIN
Elimpactodeladeficienciadeyodoenlaglndulatiroidesenspuedenserevaluadosmediantelamedicin
detamaodelaglndula(almenosundobleaumentodebeservisto)ehistolgicamente,contapaquellevaa
gradosvariablesdehiperplasiaehipertrofia.Lacantidaddecoloideenlosfolculossereduce,ylasclulas
epitelialesquerecubrenlosespaciosfolicularesestrechadasconstandeclulascolumnaresenlugardeclulas
cbicasnormales.
31bRECOMENDACIN
Elimpactodeladeficienciadeyodoenlaeconomadelatiroidessepuedecontrolarmediantelamedicinde
suerodeT4,ylaT3/T4enrelacintiroglobulina.ElevacindeTSHnoesunhallazgotemprano.Del
mismomodo,elsueroT3seconservahastaladeficienciadeyodoesgrave.
Comentario LIDestdisponiblecomercialmentedediferentesproveedores,perocomprobarelcontenidodeyododela
dietaesmuyrecomendableyaquenoesraroencontrarmayorqueelcontenidodeyodoreportado.Detipo
Remingtondietahasidoutilizadoconxitodietassintticasquecontienencasenauotrasprotenasquesonuna
fuentedeyododebeserevitado.Enlasinstalacionesdeanimalesacreditados,roedoresbebenaguadestilada
desionizada,quenocontienecantidadessignificativasdeyodo.
Entodoslosentornos,losanimalesdecontrolsedebensuministrartambinLIDperobebenaguaquecontieneKIad
libitumparaproporcionaraproximadamente510 mgdeyodo/da.LacombinacindeLIDyKClO4resultadosen
ladeficienciagravedeyodo,unareduccinenelsueroT3,yelhipotiroidismomanifiesto.CuandoKClO4se
empleadebeserutilizadoenporcentajesbajos(0.005%)paraevitarlacontaminacinambientalindeseable(71,
339).
RECOMENDACIN32
Deficienciadeyodogestacionaloneonatalsepuedelograrmediantelaalimentacindepresasconlatapa.
Dadalacortaduracindelagestacinenlosroedores,laspresasdebensertratadospreviamentecontapa
paraqueselograhipotiroxinemiaantesdeliniciodelembarazo.
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Comentario EstaestrategiaconduceaunaprofundahipotiroidismofetalporquelatransferenciamaternadeT4se
disminuyenotablemente,yT4eslanicafuentedeT3paraelcerebrofetal(340,341).Despusdelnacimiento,la
madreT4seconcentraenlalecheydadoaloscachorrosantesdeldestete,loqueresultaenlamejoradesu
hipotiroidismo(341).
Deficienciagravedeyodoantesydurantelagestacinenlosresultadosdeunmodeloderatadecretinismo
neurolgico(330)conalteracionescerebralessimilaresalosdescritosenlaspoblacionesafectadashumanos(342
344).TeniendoencuentaquesealimentandeLIDpuedepotencialmentedisminuirlafertilidad,particularmentesiel
estadodeladeficienciadeyodoeslosuficientementegravecomoparareducirelsueroT3,LIDsolapodrano
actuarconlasuficienterapidezparacrearunestadodedeficienciadeyodoenelfeto.Enestecaso,KClO4osu
combinacinconLIDpuedenserutilizadosconxitoparapromoverladeficienciadeyodofetal.
[G.2]Latransferenciaplacentariadelahormonatiroidea
Fondo Losplacentafuncionacomounainterfazentrelascirculacionesmaternayfetal,loquepermiteelintercambio
denutrientes,gasesymuchosotrostiposdemolculas.Lashormonastiroideasnoslosonmetabolizadosporclulas
delaplacentaatravsdeD2yD3,perotambinhayunflujonetodelashormonastiroideasdetransporteparael
feto,loqueaseguralapresenciadeT4yT3enlacirculacinfetalantesdelatiroidesfetalestcompletamente
desarrollado.Hormonastiroideastransportepuedeserestudiadoenlaratamediantelainhibicindelatiroidesfetal
conMMIdadoalamadre.Enestaconfiguracin,losdiferentesnivelestantodeT4yT3seencuentranentejidos
fetales.
RECOMENDACIN33
Latransferenciaplacentariadelashormonastiroideasdelamadrealfetopuedeserestudiadoenlaspresas
embarazadasMMItratadasysustituidashormonatiroideamediantelamedicindeT4yT3contenidosenlos
tejidosfetales.
Comentario Presasembarazadasreciben0,02%MMIenelaguapotable,apartirdelda14delagestacin.MMI
atraviesalaplacentaysehademostradoparainhibirlafuncintiroideafetalypromoverhipotiroidismofetalgrave
conTSHsricaelevadaynivelesbajosdehormonastiroideasenlasangreylostejidos.Lasmadressontratadoscon
lahormonatiroidea(T4,T3,oambos)y,encualquiermomentoduranteelembarazooinmediatamentedespusde
laentrega,losfetossedisecanysangre/tejidosobtenidosparalaextraccinyladeterminacindeT4yT3
contenidos(345,346).Administracindetrazador[125I]T4apresasembarazadasysudeteccinenlostejidos
fetalestambinsehautilizadoparaestudiarlatransferenciaplacentariadelahormonatiroidea(347).
[H]Modelosdeenfermedadnotiroidea
Visindeconjunto Economatiroidesestnotablementeafectadaporlaenfermedad,elayuno,uotrasimportantes
condicionesqueamenazanlavida.EstoseconocecomosndromedeNTI,elsndromedeleutiroideoenfermo,o
bajoT3sndrome(348).NTIpuedeservistocomopartedelarespuestadefaseagudaaenfermedadolesin,un
mecanismodedefensapredominantementemediadaporcitoquinas(349).Unnmerodemodelosanimalesy
celularessehandesarrolladoparaestudiarlapatognesisylasconsecuenciasfisiopatolgicasdeNTI,incluyendoel
ayuno,lesinoenfermedad,ylipopolisacrido(LPS)delaadministracin.
Engeneral,duranteNTIhayunasupresindenivelesmltiplesdelejeHPTyladisminucindelasecrecintiroidea
(350).Unacadaenlosnivelessricosdeleptinajuegaunpapelcentralenloscambiosinducidosporelayunoenla
economadelatiroidestravsdelasupresinmediadaTRHneuropptidoY(351),conlaadministracindeleptina
restaurarelestadoinducidoporelayunodehipotiroidismocentral(352).Tambinhaygrandesmodificacionesen
lasvasmetablicasdelahormonatiroidea,comoaceleradoinactivacinextratiroideadelahormonatiroideaatravs
desyodacin(353),laglucuronidacinysulfatacin(351)todavanoestclarosiextratiroideaT3produccinse
disminuir(354).Sinembargo,esbienaceptadoqueelhipotiroidismocentraleslaprincipalfuerzaimpulsoradelos
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cambiosenlosnivelescirculantesdelahormonatiroideaylaeconomadelatiroidesrelacionadosconelayunooel
hambre.TambinesimportanteentenderqueloscambiosenlaeconomadelatiroidesduranteNTIpuedensermuy
diferentesenlaagudafrenteaunafasemscrnica(355).Ladefinicindeestosmecanismosylasconsecuencias
fisiopatolgicasdeestoscambiosesfundamentalparanuestracomprensindelaNTI,queafectaalamayoradelos
pacientesingresados
encualquierhospitalgeneral.
RECOMENDACIN34
ElayunoseutilizaampliamentecomounmodelodeNTIparaestudiarsuimpactoenlaproduccindela
hormonatiroidea,elmetabolismo,ylaaccin.
Comentario Elayunopromuevehipotiroidismocentral,lareduccindelosnivelessricosdelahormonatiroideasin
unacorrespondienteelevacindeTSHsrica.Losratonesylasrataspuedenestarenayunasporperodosdehoraso
das,dependiendodelasnormasyprotocolosestablecidosporelcomitdeanimalesinstitucionallocal.Porlo
general,lasratasadultasyanoestnenayunasde23dasylosratonesadultos1da.Enratas,elayunoseasocia
conunacadadeaproximadamenteel50%75%ensuerodeT4yT3quetienelugarenlasprimeras48horas(356
).Enratones,lacadaenelsueroT3esdeaproximadamente50%ysellevaacabopor36horasdeayuno(357).El
ayunotambinconduceaunareduccinenelhgadoD1yaumentodelasactividadesD3(358,359).Sin
embargo,lareduccinenelsueroT3observadaenlarataenayunasesprincipalmentesecundariaaunareduccin
enlasecrecintiroidea(360).
35aRECOMENDACIN
Insultoscorporalimportanteoenfermedadgraveenroedorestalescomocirugaextensa,quemaduras,dolor
inflamatorio,infeccinbacteriana,oinmovilizacinprolongadapuedenserutilizadoscomomodelosanimales
deNTI.
Comentario UngrannmerodemodelosanimalessehandesarrolladoparaestudiarNTI(361370).Esencialmente,
eltipoyelalcancedelalesincorporalquedesencadenaNTIenratas,ratones,conejosydeterminalamagnitudde
lasalteracionesenlaeconomadelatiroides.Estosmodelosanimalesdiferentespresentancaractersticasnicasen
cuantoalalneadetiempodelacadaenelsueroT4y/oT3concentraciones.
Sehandesarrolladodiferentesmodeloscelularesparaestudiarlasmodificacionesenlaexpresindeiodinaseyla
accindelahormonatiroideaduranteelNTI.Bsicamente,losdiferentestiposdeclulasqueexpresandesyodasas
estnexpuestosalascitoquinasproinflamatorias(porejemplo,lainterleucina1)yluegoevaluadosparala
expresindelosdiferentescomponentesdelahormonatiroideadesealizacintalescomoTR,TR,ylaactividad
deiodinasa(361).
35bRECOMENDACIN
LaadministracindeLPSbacterianosepuedeutilizarparapromoverelhipotiroidismocentral,similarala
observadaduranteNTI,conlareduccindeTRHhipotalmicayunacadaenlosnivelessricosdehormona
tiroidea.
Comentario LaadministracinintraperitonealdeLPSaratas(371373)oratones(173)sehautilizadoampliamente
parapromoverelhipotiroidismocentralyNTI(374).Apesardelacadaenlosnivelesdehormonastiroideasen
suero,tantolaexpresinTRHenelncleoparaventricularyTSHsricaseredujoenratastratadasconLPS,se
asemejaalsndromedelenfermoeutiroideo(371,373).EstoscambiosinducidaporLPSseasocianconuna
elevacinentanycytesquepuedeserclaveparalareduccinenlaexpresinTRHatravsdelainhibicinpor
retroalimentacin(373,374)esteefectosepierdeenlosratonesKOD2(173).LPSlotesvaraneneficienciase
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recomiendautilizarunacepapreviamentedemostradosereficazporejemplo,O127:B8Escherichiacolicepainvivo
enratasyratones(372374.)Invitro,eltratamientoconLPSaumentalaactividadD2enelmesoteliomahumana
(MSTO211H)clulas(375)yenastrocitosderataencultivo(376).
[I]LaevaluacindelahormonatiroideaSealizacinentejidosynivelescelulares
Visindeconjunto TRsmediarrespuestasbiolgicasalahormonatiroideamedianteelcontroldelaexpresingnica(
377,378).TRsonreceptoresnuclearesyseunenelementosderespuestaespecficosdeADNenregiones
reguladorasgenmicas(elementospotenciadores)degenesdiana(379381).ElTRunidoalADNpuedemodificar
laactividaddeloscomplejosderemodelacindelacromatina,laARNpolimerasaII,ylamaquinariatranscripcional
basalparaactivarosuprimirlaexpresindeungendiana.Larespuestatranscripcionalessensiblealaconcentracin
deligando(T3)yaladuracindelaexposicinaT3.Estopuedeserestudiadoenanimalesoenmodeloscelulares
usualmentemedianteelcontrastedeexpresindeunT3genresponsiveentreelhipotiroidismoytirotoxicosis(ver
lasseccionesEyF).
LastresisoformasTRcannicasTR1,TR1yTR2enmamferosposeenpropiedadesdetransactivacinmuy
similaresenmuchos,peronotodosloselementosderespuestainvitro.Estasisoformasmedianambasfunciones
biolgicassuperpuestasydistintasenratonesinvivo(286,382,383)quereflejalospatronesespecficosdela
cluladeexpresin,lasdiferenciasenlosnivelesdeexpresinisoforma,ylasposibleslimitacionesestructurales
isoformaespecficaenelreconocimientoobjetivogenointeraccincofactor(Tabla3)(385389).
TABLA 3.
T 3 GENESDE RECEPTORESY GENERAL PATRONESDE EXPRESIN DE TEJIDO DEL
RECEPTORDE ISOFORMAS
ElanlisisdelaT3genesderespuestaestilparahacerfrenteadiferentestiposdepreguntasdeinvestigacin.T3
genesderespuestasonmarcadorestiles,opuntosfinalesdelatranscripcin,delestadodelashormonasdela
tiroidesdeuntejidoenmodelosanimalesoenlneasdecultivocelularinvitro.Losanlisispuedenserrelativamente
simple,conunenfoqueenunospocosgenesdianaconocidaquerepresentandemanerafiableelestadodelostejidos
enrespuestaaT3.AgranescalaExploratorio("todoelgenoma")pantallasdelaspoblacionesdeARNmsepueden
utilizarparabuscarnuevaT3responsegenes.Anivelmolecular,ungendianaespecficopuedeserinvestigadoen
profundidadparadilucidarlosmecanismossubyacentesdelatranscripcinT3accin,loqueimplicaelanlisisdel
elementodeADNqueseuneelTRyelanlisisfuncionaldeestoselementosusandoensayosdetranscripcin,porlo
generalenelcultivocelularheterlogasistemas.Enltimainstancia,larelevanciafisiolgicadeunelementodeeste
tiporequerirainvivobasadaenlaevidencia,porejemplo,enelanlisisdegenesreporterostransgnicosquellevael
promotory/opotenciadorelementosdelgendiana.
[I.1]Laexpresindegenescomounmarcadordelahormona
tiroidea
Fondo T3genesdianapuedeserpositivaonegativamenteregulado.Pantallasdeexploracindelneascelulareso
tejidosindicanque,enpromedio,aproximadamenteel50%delaT3responsivegenesIndicaraumentodelos
nivelesdeARNmylapantalla50%disminucindelosnivelesenrespuestaaT3(127,390394).Paralamayora
deestosgenes,quesiguesiendodesconocidoquerespondendirectamenteyqueindirectamenteaT3,yaqueen
muchostejidosrelativamentepocosgenessehandefinidocomoobjetivosdirectosporcriteriosrigurososque
incluyenlaidentificacindelossitiosfuncionalesdeunindeTRenelgen.LosnivelesdemRNAmedidostambin
representanelresultadonetodeotrasvariablestalescomolaetapadedesarrollodeltejidoylamezcladetiposde
clulasenlamuestra(395a397).Noobstante,inclusocuandosetienenencuentaestaslimitaciones,elnivelde
mRNAdelosgenesseleccionadosproporcionaunindicadortildelaestadodelarespuestadeltejido.Mtodos
independientestalescomoanlisisdetransferenciaWesternseutilizanparacorroborarlosdatosaniveldeprotenas,
yinsituanlisisdehibridacinpuedendefinirmsprecisamentelostiposdeclulasenlasqueseproducencambios
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enlaexpresingnica.Cualquiermtodoutilizadoparaconfirmarlosdatosdeexpresingnicarequiereanlisis
controladosadecuadamente.Porejemplo,enelanlisisdetransferenciaWestern,laevidenciadelaespecificidadyla
sensibilidaddelanticuerpoutilizadoesesencial.Tambin,comocontrolcualitativoparalacantidadylaintegridadde
lamuestradeprotenacargada,labandaespecficadeprotenadetectadapuedesercomparadoconuncontrolinterno
(referencia)protenatalcomolaactinaolaARNpolimerasaII,siestasmismasprotenasnovaransustancialmente
enrespuestaaalteradoT3estestudiandooTRestadoeneltejido(82,398).Siesnecesario,labandaespecfica
protenadetectadatambinpuedesercuantificadaenrelacinalabandadeprotenadecontrolinterno.
RECOMENDACIN36
ParalaevaluacingeneraldelasituacindeltejidoenrespuestaaT3,elanlisisdelosgenesderespuesta
representativosconocidosproporcionadatosinformativos.
Comentario LossiguientessonejemplosdegenesT3genesderespuestaysirvencomomarcadorestilesdetejidoT3
estado:(i)elhgado:Me1,THRSP,DI1,GPD2,Cyp27ayFasn(390)(Ii)elcerebro:NRGN,MBP,Hr,y
Trh(ncleoparaventricularsolamente)(400,401)(Iii)delcorazn:MYH6,MYH7yAtp22(402)y(iv)BAT:
UCP1(403).DeterminacindelosnivelesdemRNAdelosgenesseleccionadossellevaacabopormtodos
directostalescomoelanlisisdetransferenciadeNorthern(Fig.12)oporanlisisindirectosbasados
enla
amplificacindeADNcmedianteRTqPCRsisetomanprecaucionesparadeterminarlaespecificidadylavalidez
cuantitativadelensayodePCR(404).Sinembargo,debetenerseencuentaque,aunqueestosgenespuedenser
tiles,losindicadoresrepresentativosdeT3estadodeuntejido,diferentesgenesenelmismotejidopuedereflejar
unaseriedemecanismosdirectosoindirectosderespuesta.OtrosfactoresqueinfluyenenlarespuestadeunARNm
dadoaT3enuntejidoespecfico.Porejemplo,Me1essensibleatiroideaestadoenelhgado,peronoenelcerebro.
Adems,Me1enelhgadosloestreguladaporlahormonatiroideatrasdapostnatal15(405).Tales
consideracionesespecficasytemporalesdetejidodebentenerseencuentaalahoradedisearexperimentosque
cuantificanARNm.
FIG.12.
DI1(tipo1deiodinasa)esunrepresentantedeT3genresponsiveenel
hgado.ElanlisisNorthernblotmostrandoDI1nivelesdemRNAen
respuestaaladietanormal(ND),hipotiroidismo(LID,dietabajaenyodoy
agentesantitiroideos),yelhipertiroidismo(0.5 T3...
[I.2]PCRanlisisdelosnivelesdeexpresindeARNm
Fondo PCRanlisisdelosnivelesdemRNAdeT3responsivegenessiguelosmtodosestndar.PCRes
extremadamentesensibleytieneelpotencialparagenerarsealesostensiblementepositivosdemuypocasmolculas
demRNA.Porlotanto,esimportanteparallevaracaboreaccionesdecontrolnegativoquecarecendemoldesde
ADNc.ParaladeteccinvlidadeARNmtranscritoapartirdegenesintrnmenos,latranscripcininversase
debe
tambinacaboenausenciadelaenzimatranscriptasainversa(controlmenosRT)paraexcluirfalsospositivos
ampliconesgeneradosapartirdeunaplantilladeADNgenmicocontaminante.Dadasestaslimitaciones,los
resultadosdebenserapoyadosdeformaindependienteconlosensayosmsdirectos,comoNorthernblot,Western
blot,oinsituanlisisdehibridacin.
RECOMENDACIN37
UnmtodoactualdeeleccinparaelestudiodelaexpresindeT3responsivegenesesRTqPCR,que
proporcionaunacuantificacinprecisadelosnivelesdeARNm,sisevalidaadecuadamente.Sedebetener
cuidadoparaasegurarquelosgenesdecontrolinterno(esdecir,genesdereferencia)nosonellosmismosT3
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sensibleenelsistemaenestudio.
Comentario SedebetenercuidadoparaasegurarsedequelacalidaddelARNdeentradaeslaadecuada.PoorRNA
calidadpuedelimitarlaeficaciadelatranscriptasainversaylosrendimientosdeADNc(406).
Engeneral,lasnormasestndardediseodecebadoresseaplicanaRTqPCRexceptoquedebelimitarsea50200
tamaodeamplificacin pbconuntamaodeamplificacinpreferidoalrededorde100 pbparamaximizarla
eficiencia(407).Cuandoseaposible,primerparesdebeabarcarunionesexnexnencDNAparaevitarla
amplificacindeADNgenmicopotencialmentecontaminantes.Sitioswebdediseodecebadores(porejemplo,
Primer3,http://frodo.wi.mit.eduowww.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast)ybasesdedatosdeconjuntosdeprimer
validados(porejemplo,http://pga.mgh.harvard.edu/PrimerBank)sondelibreacceso.
DosmtodosdedeteccincomunesenRTqPCRutilizanelADNSYBRGreenensayosdetinteo5'nucleasa(es
decir,lasondaTaqMan)(unindelaFig.13).Enelestadonounido,lafluorescenciaSYBResinsignificante,pero
traslauninaADNdedoblehebraaumentasufluorescencia.Elensayode5'nucleasase
aprovechadelaactividad
intrnsecade5'exonucleasademuchosTaqpolimerasasparadegradarunasondadeoligonucletidoligadoala
transferenciadeenergaderesonanciadefluorescenciadiseadosparahibridarsedentrodelamplicn.Lasondade
escisinseparaelfluorforo3'extintordesdeelfluorforo5'reportero.AtiemporealPCRmquinamidela
acumulacindeproductofluorescentereporteroliberado.Elensayode5'nucleasaofreceposiblementemayor
especificidadsobreladeteccindeverdeSYBR,yaqueevitalascomplicacionespotencialesconlaformacinde
dmerodecebadores(408).Paravalidarelensayotambinesnecesarioparaconfirmareltamaodelabandade
PCRy/olapresenciadeunsolopicoenlacurvadedisociacin(Fig.13C).
FIG.13.
UnejemplodelusodeRTqPCRparaanalizarunaT3genresponsive.Las
grficasdeamplificacinqPCRindicanelcambioenelniveldeARNmpara
laT3responsivegenOPN1LW/MW(rojo/verdeopsina)enlalnea
celularderetinoblastomaWERIhumanodespusdeltratamientoconel
aumento...
LacuantificacindeARNmporRTqPCRporlogeneralrequierelanormalizacinaungendereferenciadecontrol
interno.Sedebetenercuidadoenlaseleccindegenesdereferenciaparalainvestigacindelatiroidesdebidoaque
variosinformeshanindicadoquelosgenesdereferenciacomnmenteutilizados(porejemplo,Actb,Gapdh)son
algosensiblesalahormonadelatiroidesenalgunostejidosespecficos(409412).LosgenesRn18SyPpia
(cyclophillinA)parecenadecuadosparavariostejidos,incluyendoelcerebro,lahipfisisyelhgado(351,413).
LaabundanciadeunARNmdianasecalculaporcualquieradecuantificacinrelativaoabsoluta(406,414).En
cuantificacinrelativa,elumbralcrticoPCR(Ct)deunamuestradeARNdeensayo(porejemplo,setratconT3)
secomparaconunamuestradereferencia(esdecir,elcontroldelvehculo).Dosmtodosdecuantificacinrelativa
sonampliamenteutilizados:Ctmtodoyelmtododelacurvaestndarrelativa.
ElCtmtododenormalizacinhaceusodeungendereferencia,talcomounmantenimientodelacasa(Actb,
Gapdh)uotrasformasadecuadasdegendereferencia,queseexpresademanerasimilarentodaslasmuestrascon
unavariacinmnima.ElCtsecalculacomosigue:
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dondeCteselnmerodecicloPCRenelqueelreporterodefluorescenciaesmayorquelasealdefondo(414).
Enelmtododelacurvaestndarrelativa,ADNcapartirdeunamuestraindependienteseutilizaparacrearuna
curvaestndarrelativautilizandolamasaconocidadeARNdeentradacontraelcualmuestrasdesconocidas,tales
comomuestrasdereferenciaydeprueba,puedensercuantificados.ParacontrolarlavariacinpotencialenARNde
entradaRT,lasmasascalculadospuedensernormalizadosporlamasacalculadadeuncontrolendgeno(408).
Enlacuantificacinabsoluta,elCtparaelARNmdeungendadosemontaenelCtpartirdeunacurvaestndar
generadautilizandodilucionesseriadasdelasmuestrasquecontienencantidadesconocidasdelgendiana(esdecir,
ADNdeplsmidooinvitroARNtranscrito)(406).
LaabundanciadeunARNmtambinpuedeserdeterminadaporelllamadosemicuantitativa,odepuntofinalRT
PCR,enelqueampliconessevisualizaronporelectroforesisengeldeagarosadespusdeunnmeropredefinido,
arbitrariodeciclosdePCR(404).AunquearbitrariapuntofinalRTPCRpuededetectarcambiosobviosenla
expresingnica,quesufredebajaprecisin,yamenudoimplicalavisualizacindelosproductosdePCRenlafase
demesetadelareaccin,cuandolosdatosnoreflejanconexactitudlacantidaddemRNAdepartidainicialel
material(407).
[I.3]elanlisisdetodoelgenomadelatiroidesARNmsensiblea
hormonas
Fondo Microarraysoanlisisdetodoelgenomadeotrosmtodos,comolasecuenciacindeprximageneracinde
poblacionesdeARNexpresadas(esdecir,secuenciasdeARN[RNAseq]),generangrandesconjuntosdedatosque
exigenmayorinvestigacincomputacionalparaextraerdatossignificativosdegenesrelevantes.Tpicamente,miles
desecuenciasdeARNmmuestranalgngradodecambioenlosniveles.SerequiereSeguimientoanlisisporotros
mtodosparadeterminarsilosgenescandidatossonblancosdirectosdeT3accin.
38aRECOMENDACIN
MicroarrayuotrosmtodosdecribadodetodoelgenomadelospatronesdeexpresindeARNmsepueden
utilizarparaelanlisisagranescaladeloscambiosdeexpresingnicaenrespuestaalasmanipulacionesde
lasvasdesealizacindelahormonatiroidea.Transcripcionescandidatosdeintersdebernser
corroboradospormtodosindependientes,comoRTqPCR,Westernblot,oenelanlisisdehibridacinin
situ.
Comentario MuchosestudiossehanpublicadoconelanlisisdemicroarraysdeuntejidooclulalneadespusdeT3
tratamientodeunorganismointactooclulascultivadas.Lastcnicasespecficasparaelanlisisdeexpresindetodo
elgenomaestnevolucionandorpidamente,yexistenvariossistemasdemicroarraysymineradedatosdepaquetes
desoftwareysepuedeutilizarsilodeseas.Lamayoradelasplataformasdesoftwaredeanlisispostarraypermiten
lamanipulacindelosparmetrosdeexigenciaqueestablecenunumbralparalosgenescambiadodemanera
significativa,comoelplieguedecambio,tasadefalsodescubrimiento(paracorregirparacomparacionesmltiples),y
pvalor.Engeneral,almenostresrplicasbiolgicasporgrupodetratamiento(porejemplo,T3exposicin)ygrupo
control(porejemplo,vehculos)sonnecesariosparalasdiferencias"estadsticamentesignificativos"paraser
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detectadosisetomalasignificacinestadsticaenelsentidodeunpvalor<0,05,latasadefalsodescubrimientode
<0,05,ydoblecambio>2(417).Dadalaaltaprobabilidaddequelasdiferenciasdefalsospositivos,losresultados
delosestudiosdemicroarraysmejordebenservistoscomo"losdatosparagenerarhiptesis"enlanaturaleza,ylos
cambiosenlastranscripcionesclavesdebenserconfirmadosporPCRyotrosmtodos.
38bRECOMENDACIN
RNAsequtilizalatecnologadesecuenciacindeprofundidadypuedeproporcionarunamedicinmsprecisa
demRNAylosnivelesdemRNAdelaisoformavarianteencomparacinconmicroarrayscomolosdatos
derivadosdeRNAseqnoestsesgadaporanlisisutilizandogenesysondaspredeterminados.
Comentario RNAseqrequieremayoranlisisbioinformticodelasecuencialee(418).Lainclusindetiposde
clulasextraasenunamuestradetejidodebeserminimizada,comovariacionescualitativasentremuestras
aumentarn"ruido"experimentalyreducirlaresolucindeanlisis.Muestreodetejidopuedeserrefinadoutilizando
microdiseccinporlserparaaislarpiezasdefinidasdetejidodeseccioneshistolgicasofluorescenciadeclulas
activadasporlaclasificacinparaaislarpoblacionesdeclulasenriquecidasbasadoenmarcadoresdeclulas
especficas(419,420).LoscambiosobservadosenlospatronesdeexpresindeARNmpodranrepresentar
alteracinindirectaenpoblacionesdeclulasmixtasenlostejidos(421,422).Unalneacelularencultivo,aunque
nounamuestrafisiolgica,puedeproporcionarunapoblacindeclulasmshomogneaparaciertosanlisis.
[I.4]Mecanismosderegulacindegenesdelahormonatiroidea
Fondo ElTRseuneaelementosdeADNconocidascomoT3elementosderespuesta(T3alquileres)(423).En
general,TRseunelaT3REcomounhomodmerooheterodmeroconlosreceptoresderetinoidesX(RXRs).Estos
complejosdereceptoresatraencorepresoresocoactivadoresdependiendodesielTRseencuentraenunaT3
boundestadoonounido(424426).LosanlisisdelasinteraccionesdeADNTRamenudoutilizandosenfoques
generales:(i)larespuestadelatranscripcin("transactivacin")ensayos,tpicamenteenlasclulastransfectadasen
cultivo,y(ii)ensayosparainvestigarTRuninaADNenloselementosderespuestadeADNaislado(movilidad
electroforticacambiodeensayo[EMSA])oenelADNgenmicoenunestadodelacromatina(cromatina
inmunoprecipitacin[CHIP]).
RECOMENDACIN39
LaregulacindeungendianaporTRpuedeinvestigarseenclulasdecultivodetejidoscotransfectadascon
unplsmidodegeninformador,msunplsmidoqueexpresaTR.Latransactivacindelreporteroseevala
enrespuestaaTaadido3adosisvariablesenunrangofisiolgicoysepuedeprobarendiferenteslneasde
clulasyaquelasrespuestaspuedenestarinfluidosporfactoresespecficosdelaclulahusped.
Comentario ElcandidatoT3REopotenciadordelaregindelgendianaconsupromotornaturalounpromotor
artificialseligaungenindicadorfcilmentedetectable,porlogenerallaluciferasadelucirnaga.Laactividadde
luciferasageneraluz,quesedetectausandounluminmetro(427).Promotordemenosylosreporterosdeluciferasa
potenciadormenosseutilizancomocontrolesparaexcluirlaposibilidadderespuestasespuriasprocedentesde
"secuenciasdesigilo"fortuitamentepresentesenelgendelaluciferasaoesqueletodelvector(428).
Laeficaciadetransfeccinseevalumediantecotransfeccindeunplsmidoreporterodecontrolinternoporlo
generalconRenillaluciferasadirigidoporunpromotorconstitutivamenteactivo.Lalecturaespecficadeunensayo
deindicadorsenormalizacomolaactividaddelaluciferasadelucirnaga(gendeprueba)sobrelaactividadde
luciferasadeRenilla(gendecontrolinterno).Esimperativoestablecerquelosreporterosdecontrolinternono
respondenalascondicionesexperimentalesyaqueestopuededistorsionarindebidamentelarelacindelectura(429
).
Sedebeconsiderarquesielvectorreporteroeslacromatinadeformacinonodelacromatinadeformacin.
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Plsmidosestndaro"ADNdesnudo"comoreporteropGL4menudocedendatostilesenlasclulastransfectadas
transitoriamente.Alternativamente,losvectoresquellevanunorigendereplicacinepisomal,talescomopREP4,
puedenformarlacromatinaenlasclulastransfectadastransitoriamente.AlgunoselementosderespuestadeDNA
requierenunvectordeformacindelacromatinaparamostrarlaactividad(430).
Laubicacindelpromotordeungendianadeintersdadadebeserverificada.Notodoslosgenesrepresentadosen
lasbasesdedatosdelgenomarepresentanuna'estructuradelosgenes,loquerequierelacartografaexperimentalde
5'5precisadelosARNmdediferentestejidos.Losexonesmsaguasarribadeungen(traducidoonotraducida)
puedenseridentificadosporensayosdeproteccindeARNasao5'amplificacinrpidadeextremosdeADNcde
anlisis(431,432).Lafuncindeunpromotordepresuncindebedemostrarseusandoensayosdeluciferasaen
clulastransfectadasotransgenesreporteroenunmodeloanimal.Lapreconcepcindebeevitarsequelos
potenciadorespertinentesresidensloaguasarribadelpromotordeungendiana.Muchospotenciadoresresiden
dentrodeintronesoaguasabajodelgen(433).
40aRECOMENDACIN
EMSApuededemostrarlaunindirectadelaTRaunelementodeADNproporcionandoasevidenciadeque
ungenesunblancodirectodeTR.EMSAsebasaenlaobservacindequeelADNunidoaprotenamigraa
unritmomslentoqueelADNnounidocuandosesometeaelectroforesis.ElelementodeADN(lasonda)es
generalmentemarcadoradiactivamenteparapermitirladeteccinsensibledeprotenas:loscomplejosde
sondasdeADN.
Comentario SitiosdeunindeTRestntpicamenterelacionadosconelmotivodeconsensoparaunsitiodeuninal
receptornuclear,5'AGGTCA3'y,amenudoseproducenenlasconfiguracionesderepeticindimrica(423,434
).SondasptimasEMSAsonoligonucletidosdedoblecadenacorta(~2030 pb).Sondasmslargas(osondas
degradados)puedenaumentarlauninnoespecfica,queaparece,sealesuntadascomoindistintosdespusde
EMSA.Sondasmarcadosenelextremoradiactivamenteofrecenunagransensibilidadypermitenladeteccindelos
complejosdeprotenasdeADNutilizandounapelculaderayosXophosphorimaging.Alternativamente,lassondas
puedenmarcarsenonradioactively(porejemplo,conbiotina),seguidoporladeteccinsecundariaconestreptavidina
ysustratosenzimticossimilaresalosutilizadosparaelWesternBlot(435).
ExtractosdeclulasnuclearesoenterosdetejidooclulalneadeintersproporcionanunafuentedeprotenadeTR.
Loslisados
declulascultivadastransfectadasconunplsmidoqueexpresaTRsonotrafuentecomndeprotena
TR(381).Alternativamente,laprotenadeTRsepuedegenerarusandounlibredeclulasinvitroenelsistemade
traduccin(436,437).
LaespecificidaddelainteraccinsondadeADNTRseconfirmapordospruebasdecontrolestndar:(i)elusode
unanticuerpoantiTRquesupershiftsointerrumpelabandaretardada(uncontrolnegativoparalelousandoun
anticuerponoespecficanodebeperturbarelTRespecficaADNcomplejosonda),y(ii)laespecificidaddelaTR
uninalasondadeADNmarcadadebenserconfirmadosporlacompetenciaenlapresenciadeunexcesodesonda
deoligonucletidonomarcado"fro".Haydostiposdesondadeoligonucletidocompetidorseutilizanenlas
muestrasparalelas:lasondadetiposalvajeylasondaquecontienemutacionespuntualesdentrodelsitiodeuninde
TRpropuesto.Seesperaunareduccindosisdependienteenlaintensidaddelasealdebandadesplazadoalutilizar
lasondadetiposalvajefroperonosondamutante(436).Tpicamente,seaadecadacompetidorfroendosotres
dosis,loquerepresentaunagamadeaproximadamentede2a100veceselexcesosobrelasondamarcada.
40bRECOMENDACIN
ChIPsepuedeutilizarparaindicarquelosasociadosTRconungendianaensucontextonaturalenel
genomaenuntejidoolneacelular.ElrequisitomsimportanteparaCHIPesunanticuerpoespecficodealta
calidadparalainmunoprecipitacin,conlaespecificidadquesedeterminarmedianteexperimentosde
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control.
Comentario Chipseutilizaparaprobarlaunindefactoresdetranscripcindegenesdianaconocidosoparala
exploracindesitiosdeuninpreviamenteindefinidos.UnresultadopositivoindicaChIPunaasociacinconuna
regindeADNdelacromatinaperonodiferenciaentrelaunindirectaalADNeindirectadeuninauncomplejo
deotrosfactoresqueseunenalADN.
Actualmente,haypocaevidenciadequelosanticuerposdisponiblescontraTRgeneranresultadosdechip
consistentementereproduciblesparalostejidosdemamferos,aunquealgunosdatosdechipshansidoreportados
paralaslneascelularesytejidosdeanfibios(438442).Lasdificultadesenlageneracindedatoschipentejidos
naturalespuedenserunaconsecuenciadelaconcentracinrelativamentebajadeTRenlostejidosdemamferosen
comparacinconotrostiposdefactoresdetranscripcinmsabundantementeexpresado.
Lascondicionesptimasparalareticulacinylacromatinasonicandodebenestablecerseempricamentepara
cualquiertejidoocluladelalnea(443).UncontrolnegativoparaelchiputilizapurificadanoespecficaIgG,
sueropreinmune,oanticuerposcontraprotenasextraasquenoestnpresenteseneltejido.FragmentosdeADN
genmicoaisladodechipseidentificanporPCRutilizandounaseriedeconjuntosdecebadoresqueabarcanla
regingenmicadeinters,ascomolasregionesnegativasdeelgenoregionesgenmicasdistantes(444).Todos
loscontrolesnegativospuedengenerarunasealdefondoydebeserprobadoempricamente.
40cRECOMENDACIN
Lasaplicacionesmsavanzadasdechip,exigiendotcnicarigurosayanlisiscomputacional,implicanla
combinacindechipconmicroarrays(chipchip)osecuenciacindeprximageneracinparaidentificarsitios
deunindetodoelgenomaparaunfactornuclear.
[I.5]LosmodelosderatnparaindicarlahormonatiroideayTR
sealizacinenlostejidos
Fondo NumerosascepasKOyratonesknockinobtenidospormanipulacingenticahanproducidounagrancantidad
deinformacinsobrelasfuncionesfisiolgicasdeisoformasTRinvivo.Lamanipulacingenticatambinseha
utilizadoparagenerarmodelosqueproducenideassobredndeycundoT3oprotenasespecficasTRestn
presentesenlostejidosinvivo.Haymargenparaunmayordesarrollodeestetipodeenfoques,paradilucidaranivel
celular,labasedelaT3accionesenvivo.
DebetenerseencuentaquelafaltadereceptorenratonesKOpuedeproducirciertasdiferenciasenelfenotipoen
comparacinconlafaltadelahormona.Porejemplo,losratonesquecarecendetodoslosT3receptores(TR1,
TR1,TR2)muestranmltiplesfenotiposdetejido,peronosontanpequeootanretrasados
comoratonescon
hipotiroidismosevero,congnita(75).Puedehabervariasexplicacionesparaestasdiferencias.Unaexplicacinque
hasidoapoyadaporelestudiodelcerebeloinvivo,esqueenelhipotiroidismo,laTRejercecrnicadesregulacin
independientedeligandodelaexpresingnicaparaproducirunresultadomsgravequelaausenciadeunTR.En
ausenciadeTR,estadesregulacinindependientedeligandodelaexpresingnicanopodraocurrirdetalmanera
queelfenotipoesmenosgrave(445).Sinembargo,pocostejidosypocosgenesdianahansidoestudiadosen
detalleparaindicarcmosepuedeaplicarampliamenteestaexplicacin.Enresumen,lasupresindelasisoformas
TRproporcionainformacinprecisasobrelasfuncionesespecficasdetejidodeisoformasTR.Sinembargo,los
fenotiposnosiempresereflejanenlosmodelosdehipotiroidismo.Porelcontrario,losfenotiposconhipotiroidismo
nosereflejenplenamenteenlosmodelosTRdeficiente.
41aRECOMENDACIN
RatnconcepasKOobjetivoomutacionesknockinenlasendgenasthrAythrBgenesproporcionarmodelos
paraestudiarlasfuncionesdeTRenvivo.
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Comentario NumerosasmutacionesenlosthrAythrBgenes(tambinconocidoscomoNr1a1yNr1a2,
respectivamente)sehanderivado,peroslosedaunabrevemencindefenotiposaqu.Paracomentariosms
detalladossobrethrAythrBmutaciones,loslectorespuedenconsultarenotrolugar(286,382,383)ylapgina
webdelGenomaInformticaMouse(www.informatics.jax.org).OtrorecursotileslalneaNuclearReceptor
SignalingAtlas(www.nursa.org).
ElgeninicialdirigidoestudiosestableciqueThrbeselprincipalresponsabledelaregulacindelejeHPT(446,
447),eldesarrollodelossistemasvisualesyauditivosdecolor(448,449),ylamayoradeT3accionesenel
hgado(390,393,450).ElThragenesprincipalmenteresponsabledeladeterminacindefuncionestermognicos
ycardiacas(386,451)ylamaduracindelintestino(452),hueso(453),yciertostejidoscerebrales(445,454).
EncontrasteconlosmodelosKO,knockinmutacionesenlasecuenciadecodificacindelosThraothrBgeneshan
generadomodelosderatnqueexpresanTR1dominantenegativoylasprotenasTRconpocaoninguna
respuestaaT3(456).Estasmutacionescreanmodelosdelocalizadahipotiroidismo"restringidodetejidos"
selectivosparatejidosenlosqueTR1oTReslapredominanteT3isoformadelreceptorexpres.
41bRECOMENDACIN
LosratonesdesprovistosdeconocidosT3receptores(TR1,TR1,yTR2)puedeserutilizadoparamodelar
laausenciacompletadelasealizacinmediadaporTR.
Comentario LosratonesquecarecenespecficamenteTR1,TR1yTRsonviablesperotienendefectoscelularesy
funcionalesenmltiplessistemasderganos,loqueindicaqueenmuchostejidos,TR1yTRisoformassirven,
funcionescomunesadicionalesquenoeranevidentesenlosmodelosconmutacionesdelgenreceptorindividual(75
,457).
41cRECOMENDACIN
CodificacincambiosdesecuenciaintroducidosenambosthrBythrAgeneshanproporcionadomodelosde
ratnparalossndromeshumanosderesistenciaalahormonatiroidea.
Comentario Elsndromehumanodelaresistenciaalahormonatiroideaesgeneralmentecausadapormutaciones
heterocigotasdecodificacinenelTHRBgenquegeneranprotenasdominantesnegativasconpocaoninguna
respuestaaT3(458).Recientemente,lasmutacionessimilaresenelserhumanoTHRAgeneshansidoidentificados
quegeneranprotenasTR1negativasdominantes(459,460).LosthrByThramodelosderatnknockinexhiben
unagamadefenotiposselectivadetejidosyofrecenlaoportunidaddeinvestigarlosdefectoscelularesymoleculares
quesubyacenalossntomasdelaenfermedadentejidosespecficos(456,461465).
41dRECOMENDACIN
ReporteroratonestransgnicosqueexpresanunaT3responsiveprotenaquimricaproporcionanunainvivo
modeloquepermitelamonitorizacindelapresenciadeT3endiversostejidos.
Comentario TradicionalmentehasidodifcildedetectarT3anivelcelularenlostejidosnaturales,especialmenteen
poblacionesdeclulasespecializadas.RIArealizadosenhomogeneizadosdetejidosnoproporcionaninformacin
sobrequtiposdeclulascontienenT3.LatransgnicoFINDT3modeloderatnofrecelaventajadeladeteccin
deT3enregioneslocalizadasdentrodelostejidoscomplejos(278,467).Estosratonesexpresanunaprotena
quimricaqueconsisteenunalevaduraGal4ADNdedominiofusionadoaundominiodeuninaligandodeunin
TR1.LaexpresindelreporteronorequiereTRendgeno.LapresenciadeT3sedetectavisualmenteensecciones
detejidoenbasealaactivacinporlaprotenaquimricadeunpromotorfusionadoaunGal4sensibleLacZgen
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reportero(Fig.14).
FIG.14.
T3desealizacinrepresentadoporlatincindegalactosidasa(azul)enlas
seccionescerebralescoronalesendapostnatal5ratonesquellevanelFINDT
3transgnreportero.(A,D)FINDT3reporteroendetiposalvaje(/FINDT3
ratonesWT)(B,E)FINDT3reporteroenratonesquecarecen...
EsteenfoquepuedeserutilizadoparadetectarT3actividadenvariostejidos,perolosinformes,halimitadola
sensibilidadenciertasregionesdelcerebro(278).Elusodebetagalcomolalecturaenratonestransgnicos,T3de
sealizacinestabaausenteenelembrintempranoyluegosedetectaalrededordeE11.5E12.5endiferente
primordios(esdecir,CNS,intestino,etc.).Dadoqueenestetiempo,lafuncintiroideafetalenelratnsiguesiendo
inactivo,yestassealestempranaspuedereflejarmaternaT4oT3actividad.TTemprana3desealizacinse
observenelcerebro(esdecir,losprimordiosdienceflica,bulboraqudeo)yrganosdelossentidos(primordios
vescicletica,epitelioolfativo,laretina),mientrasqueenlasetapastardas(E15.5E17.5)expresindebetagalfue
localizadaenotraprimordios(esdecir,enloshuesos,nerviosfolicularesdelasvibrisas,ascomoenelpequeo
primordiosdelgado,sinotambinenelbulboraqudeo)(468).
41eRECOMENDACIN
InsercionesespecficasenlasendgenasThraythrBgenesgeneranprotenasTRfusionadosaetiquetasde
protenasquesepuedenutilizarparacontrolarlaexpresindeisoformasTRenpoblacionesespecficasde
clulasinvivo.
Comentario LaetiquetafundidopermiteladeteccindeTRisoformaexpresinporinmunohistoqumica(IHC)o
inmunofluorescenciaenseccionesdetejidoodemontajeenenterospreparadosyofrecelaposibilidaddedeteccin
enlaresolucindeunasolaclula.THRA1GFPratonesllevanlaprotenaverdefluorescente(GFP)fusionadaen
marcoaelCterminaldelaprotenaintactaTR1(469).LadeteccindelaprotenaTR1GFPhasidoreportada
enlostejidoscerebralesespecficasytiposdeclulas.LacZinsertaenelThrbgenpermiteladeteccindeisoformas
TR(430,449,457)yhapuestodemanifiestolaexpresinTR2enpoblacionescelularesrestringidasenla
cclea,laglndulapituitariayconos.
[J]EvaluacindelahormonatiroideadeSealizacinporCaminodelosparmetrosbiolgicossistmicos
Visindeconjunto Lashormonastiroideasejercendiversasaccionesenprcticamentetodoslostejidosduranteel
desarrollo,lainfancia,laadolescenciaylaedadadultaenreastalescomoelcrecimiento,lacognicin,la
homeostasisesquelticomuscular,lafuncincardiocirculatorio,lahomeostasisdelaenergayelmetabolismo
intermediario.Esesencialadoptarunenfoqueanimalcompletamentefisiolgicoparalainvestigacindelaaccinde
lahormonatiroideaenvivo.Pornecesidad,estorequiereestudioslongitudinalesdeT3responsiveparmetros
biolgicosy/omarcadoresbioqumicos.
Losestudiossecentrangeneralmenteenlatransicindehipotiroidismoaeutiroidismoytirotoxicosis.Dosestrategias
complementariaspuedenseradoptados:(i)recopilarmedicionesbiolgicassecuencialesdelosmismosanimalesenel
momentobasalylosintervalosduranteelperododeestudio,o(ii)controldeejecucinylosgruposexperimentales
enmedicionesbiolgicasparalelasyrecogerenlospuntosdetiempoespecficosEstemodelotienelaventajadeque
losanimalespuedensermatadosendiferentespuntostemporalesylostejidosrecogidosparalosanlisisestructurales
obioqumicos.
Engeneralsellevanacaboestosestudiosenlascepasderatasoratonescomunes.Modelosanimalesmsavanzados
incluyenmodificadosgenticamenteratonesenlosquelasealizacindelahormonatiroideasehainterrumpidoo
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modificadosporcualquieradelosgenesglobaloespecficadetejidodiana.Contalesmodelosderatnquees
importanteparaasegurarexperimentosestndiseadosparaevitarlainfluenciadeconfusindemezclade
antecedentesgenticossiesposible.Idealmente,lascepasmutantesdebenbackcrossedhastahomogeneidadsobreun
fondoadecuado,talcomoC57BL/6.Siestonoesrealista(porejemplo,siCREcruceylneasfloxeddediferentes
orgenesgenticos),compaerosdecamadadebencompararseyclculosdepotenciaadecuadosrealizan.Hombresy
mujerespuedennecesitarserestudiadoporseparado,porquelasrespuestasalashormonastiroideaspuedenser
dimorfismosexual.
T3parmetrosbiolgicosdependientestambinpuedenserestudiadosutilizandoexvivo,talescomopreparaciones
declulasrecinaisladas,cultivosdeclulasprimariasolneascelularesestablecidas.Engeneral,talesinvitro
sistemastienenpobrecapacidadderespuestaaT3,conslounospocosestnbiencaracterizados.Sinembargo,los
modelosbasados
enclulashansidoinvaluablesenladeconstruccinylacomprensindelosmecanismos
molecularesquesubyacenaloscomplejosefectosbiolgicosdelaT3.
[J.1]Sistemanerviosocentral
Fondo Seobservanmayoradelosefectosdelahormonatiroideaenelcerebroduranteeldesarrollo.Endmicas
resultadoscretinismoneurolgicodeladeficienciadeyododelamadreylahipotiroxinemiamaternaconsiguiente,en
elquecirculaT4nivelessonbajosparalaetapadelembarazo.Hipotiroxinemiamaternacausaladeficienciadela
hormonatiroideaneurolgicodelfetoendesarrollopuederesultarenretardomental,diplejaespstica,sordomudez,
yentrecerrarlosojosantelaausenciadesignosgeneralesdehipotiroidismo.Apesardequeelcretinismoendmico
puedesermitigadoporlasuplementacindeyodoparaprevenirohipotiroxinemiamaternaprimertrimestrecorrecta,
ladeficienciadeyodosiguesiendolacausamscomnderetrasomentalprevenible.Porotrolado,lascaractersticas
neurolgicasdehipotiroidismoneonatalpuedensermenosprofunda,yaquedependendelagravedadde
hipotiroidismo.Lasanomalassonengranmedidapreveniblesmediantelasustitucininmediatadelahormona
tiroidea,aunquedficitsenlamemoriayelcoeficienteintelectualpuedenpersistir.Sinembargo,losrecinnacidos
notratadostienenretrasoenelcrecimientoylascaractersticasgeneralesdelhipotiroidismoconretrasomental,
temblor,espasticidad,yhablaydefectosdelenguaje.Lasdiferenciasentreelcretinismoendmicoyelhipotiroidismo
congnitoilustranqueelmomentodelaaccindelahormonatiroideaesfundamentalparaeldesarrolloneurolgico(
470,471).
Hipotiroidismodesarrollotambincausaundeteriorosensorial,incluyendosorderapermanente,queenmodelosde
roedoressehademostradoquelaparticipacindeformidadenlamembranatectorialodointernoydeterioroenla
maduracindelepiteliosensorial(247).Tambinhayunfenotipovisualyaquelahormonatiroideaafectael
desarrollodelavisindelcolor.Enlosadultos,losactosdelahormonatiroideaenelestadodenimo,el
comportamientoylafuncincognitiva,ysofisticadaspruebashansidovalidadasparainvestigarlosefectosdelas
hormonastiroideasenlosfenotiposdecomportamientoenratones.Lahormonatiroideatambinafectalafuerza
muscularylafatiga,ascomoelmotorylossistemasdecerebelosos.Laspersonasconhipotiroidismosonlentosy
fatigadocondebilidadmuscularyreflejoslentosrelajante,mientrasqueenlatirotoxicosishaytemblores,prdidade
masamuscular,hiperreflexiayfatiga.
Elcerebroadultotambinessensiblealahormonatiroidea.Unaevaluacindecribadodeobservacinestandarizada
delcomportamientoylafuncinenlosroedoressehadescrito(SHIRPA)quepermiteaunneurolgicagenerale
integral(msculoylaneuronamotorainferior,espinocerebelosa,sensorialylafuncinautonmica)y
neuropsiquitrico(actividad,elaprendizaje,laexcitacin,elmiedo,agresin,alimentacin,irritabilidad,etc.)anlisis
arealizarunainvestigacinpreviaamsdetalladadelosparmetrosanormalesyvasneurolgicas(472).Una
evaluacinSHIRPAmodificadoyestandarizadohasidoadoptadoporelConsorcioInternacionalFenotipificacin
Mousecomopartedelapantallafenotipoinicialcaracterizacinprimariaderatonesmutantesgeneradosporel
ConsorcioInternacionalKnockoutMouse(473,474).Esteenfoqueestsiendoadoptadoparaincluirelanlisis
fenotipodetodoslossistemasfisiolgicosyfacilitarlanormalizacinylaeventualgeneracinderepositorios
completosygrandesdedatosdelfenotipo.
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RECOMENDACIN42
Modelosderoedoressepuedenutilizarparaestudiarcmolahormonatiroideaafectaeldesarrollodel
cerebroylafuncin.Lacorrelacinentreeltiempodeiniciodelafuncintiroideafetalylaedadcronolgica
esdiferenteenroedoresqueenlossereshumanoslaetapadedesarrolloneurobiolgicoenlugardelaedad
cronolgicadelanimaldebeserconsiderado.
Comentario Elhipotiroidismocongnitopromueveprofundodeteriorodeldesarrolloyfuncindelcerebro.Por
ejemplo,losproblemascognitivosselectivosypersistentessepuedenobservarenlosniosquenacieroncon
hipotiroidismocongnito.Imagensofisticada,comolaresonanciamagntica(RM),hademostradoquelosniosy
adolescentesconhipotiroidismocongnitohanreducidoeltamaodelhipocampoylospatronesdecrecimientodel
hipocampoanormalesrelacinasuspares.Msimportantean,losvolmenesdelhipocamporeducidopredicenel
rendimientodememoriapobres(475).
Modelosderoedoresdehipotiroidismocongnitosehanestudiadoextensamente,dadoquelamayoradelos
componentesanatmicosyfuncionalesdelcerebrodelosmamferossonsimilaresentreelhombreyotrasespeciesde
mamferos(476).Sinembargo,enmuchosaspectos,noconstituyenunmodeloanimalidealparaelestudiodela
economafetaltiroideadelamadredurantelagestacin.Lasprincipalesdiferenciasserelacionanconlaaparicinde
lafuncintiroideafetalyelcalendariodeeventosdeldesarrolloneurolgicoenrelacinconelnacimiento.La
cuestinescuntoespeciesvaranenrelacinalhombreconformealamedidadelaaceleracindelcrecimientodel
cerebroqueespostnatal(476).Aesterespecto,lashormonastiroideasnoinfluyeneneventosmuytempranastales
comolainduccinneuralyelestablecimientodelapolaridadduranteeldesarrollodelcerebro.Ensulugar,modulan
losprocesosposteriores,incluyendolaneurognesisylaproliferacindelasdendritas,lamielinizacin,yla
formacindesinapsis.Elmomentodeiniciodelaaccindelahormonatiroideaenelcerebroendesarrolloescrucial
yporlotantofisiolgicamenteimportante.Alternativamente,lasovejassehanutilizadoampliamentecomoun
modeloanimal.Lacobayaesdeinterspotencial,asporquesuinuteromaduracindetiroidesesmuchoms
cercanoaldelahumana(477).
Muchosestudiosenroedoreshancentradoenelcerebeloderataporquesudesarrolloneurobiolgicoes
predominantementepostnatalyporlotantomsfcilmenteexpuestaalamanipulacinexperimental(476).Sin
embargo,otrasregiones,incluyendolacortezacerebral,losgangliosbasales,elcerebeloyelhipocampotambinse
hanestudiadoutilizandoenfoqueshistolgicasestndar.Estastcnicastambinsehanadaptadoparaestudiarla
mdulaespinalylasracesnerviosasdorsalesyventrales(478).Porejemplo,lasneuronasdeclulasdePurkinjey
desuorganizacinespacialsonesencialesparalafuncindelcerebelo.Seformanjustoantesdelnacimientoenla
rataysunmeronoseafectanporelhipotiroidismoalnacer,perosumigracinymaduracinsedeteriora
severamente(476).Elefectodeladeficienciadelahormonatiroideaenlamaduracindelacortezacerebelarde
ratatodavapuedeobservarsielhipotiroidismoseinducehastalasegundasemanapostnatal(476).Delmismo
modo,lamayoraneurognesiscerebroanteriorderatasecompletaenelnacimiento.Sinembargo,elanlisis
estructuralindicaquehayunamarcadahipoplasiadelneuropil(476).Porlotanto,parececlaroquelahormona
tiroideaafectaalamaduracindelcerebrodirectaatravsdelosefectosespecficossobreladiferenciacincelular.
Lahormonatiroideaseralentizaladivisincelular,mientrasqueconcomitantementeestimulareliniciodela
diferenciacincelular.
RECOMENDACIN43
DadaladiversidadfuncionalylacomplejidadestructuraldelosestudiosdelsistemanerviosocentraldeT3
responsivegenesenelcerebrosehanmejoradoengranmedidasiseestudiaatravsdeinsituhibridacino
IHC.
Comentario Anlisisdemicroarrays,transferenciaNorthern,RTqPCR,lasecuenciacindeARNdeprxima
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generacin,yensituhibridacintodossehanutilizadoparaestudiarT3regulatedlaexpresindegenesenel
cerebro(392,401,479).ProtocolosparainsituhibridacinyIHCsehandescrito(445,480484).Estospueden
realizarseenseccionesincluidasenparafinaofijocongeladostejidosilapreservacindelaarquitecturahistolgica
detalladaesdeimportanciasignificativa(485).Sinembargo,lainclusinenparafinainterfiereconlacalidaddel
ARN,porlotantounamejorrelacinsealruidoyelanlisisdelaexpresingnicaseobtienenusandotejido
congeladofijo.Porejemplo,insitulahibridacinsehautilizadoparadefinirTRHcomonegativamenteT3gen
regulatedenelhipotlamo(486489)yparaestudiarlaexpresingyruscorteza/dentadodelRC3/neurogranina,
queestreguladapositivamenteporT3(396).
Alutilizarmtodoscuantitativos,ladiseccincuidadosamuestraesnecesariodebidoalanaturalezaaltamente
compartimentadadelcerebro.Enalgunoscasos,seagruparonserequierenmuestrasapartirde510ratonespara
obtenersuficienteARNparatalesestudios(485).Unaformamsadecuadadelaobtencindemuestrasdecerebro
esatravsdelserdemicrodiseccindecaptura,quepermiteelaislamientoexactadetiposespecficosdeclulas
incrustadasenunmicroambientedeltejidoheterogneo.Lasermicrodiseccindecapturatrabajabajovisualizacin
microscpicadirectamicromanipuladorasistidaylasmuestrasobtenidasacontinuacin,puedeserprocesadoparael
aislamientodeARN(491).
Unanlisisdemicroarraysderatnhipotiroidismocortezacerebralidentific316genesreguladospositivamentey
318genesreguladosnegativamenteporT3(127).LacapacidadderespuestadesubconjuntosdeestosgenesaT3
fueconfirmadaporRTqPCRenunmodeloderatngravementehipotiroidismoespecficadelcerebro,elratndoble
MCT8/D2KO(127)yenelcerebroderatonessistmicamentetirotoxicosisoratonesKOD3(492).Atravsdel
estudiodehipotiroidismosistmicaotirotoxicosis,T3genesregulatedtambinhansidoidentificadosenregiones
especficasdelcerebro(porejemplo,cerebelo,corteza,elhipocampo).Enelcerebeloendesarrollo,hipotiroidismo
sistmicadiolugaralaexpresinalteradade2.940genes,deloscuales1.357fueronhastareguladasy1.583
reguladoshaciaabajosegnlaevaluacindeanlisisdemicroarrays(493).Sinembargo,elnmerodegenes
cerebelososdirectamentereguladaporT3esprobablequeseamuchomspequeacomoseevidenciaencultivos
primariosdeclulasneuronalesdelcerebeloestudiadosatravsdelahibridacindemicroarraysdeARN(494).En
cualquierpantalla,criteriosestadsticosrigurososdeberanutilizarseparareducirelnmerodecandidatosT3
regulatedgenesparanuevosanlisisconfirmatorios.
ExpresindelaprotenadelcerebroseanalizanormalmentemediantetransferenciadeWesternoIHCdecerebros
adherenciadeperfundido(postfijadurantelanochea4Cycryoprotecteden30%desacarosa).IHCesadecuado
paralosenfoquescuantitativosslosielsistemadedeteccinsemantieneinsaturadoNoserecomiendala
cuantificacindeprotenasypptidosporestemtodosecretadas.Losestudiossepuedenrealizarenseccionesde
criostatodelibreflotacindelasregionesespecficasdelcerebro(478).Elenfoquefueutilizadoparaestudiarlos
efectosdehipotiroidismocongnitoenlaexpresindelaprotenaasociadaamicrotbulos2enelcerebelodelarata
(495)ylaexpresindelostransportadoresdelahormonatiroideaenlacclea(496).Adems,IHCtambinse
utilizparaestudiarlaregulacindereelinyDAB1porlahormonatiroideaendiferentesregionescerebrales(497),
mientrasqueWesternBlotyinsitudehibridacinseutilizparaestudiartenascinC(498).Estastcnicastienen
ventajasydesventajasdistintas.Porlotanto,inmunocitoqumicaproporcionalacapacidaddeidentificarconprecisin
dondeenelSNCelantgenoseencuentraenlasclulasindividualesoenelnivelsubcelularenelncleoo
citoplasmaoanmsprecisasiseusamicroscopaelectrnica.Tambinproporcionaunexcelentemtodopara
verificarlaprdidaoreexpresindeunantgenoenparticularenmodelosderatonestransgnicosodespusdela
manipulacinanatmicacomolesioningelectrolticootranseccin.Debidoaqueelcontenidodeunantgenoen
cualquierclulaparticularsepuedeverafectadoporlavelocidaddesntesis,eltransporte,ladegradacin,yla
secrecin,insituhistoqumicadehibridacintiendeaserunenfoquemuchomejorcuantitativadeIHC.
Alternativamente,lastcnicasdemicrodilisisespecializadassepuedenutilizarparamedirlasconcentracionesde
protenasecretada.ElanlisisdeWesterntambinpuedeserobjetodealgunasdelasmismaspreocupacionescon
respectoalacuantificacincomoinmunocitoqumica,perotienelaventajadesercapazdeidentificareltamaodel
antgeno(s)seridentificado.
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44aRECOMENDACIN
Dficitsauditivosfuncionalesresultantesdeladeficienciadelahormonadelatiroidespuedenserestudiados
mediantelamedicindelasrespuestasevocadasauditivasdeltroncocerebralparadeterminarlosumbralesde
laintensidaddelestmulo.
Comentario Anlisisdelaanatomadelodomedioimplicalainspeccinhistolgicadelhuesecillodedeformidades(
499).EvaluacindelaosificacinrequieretincinconazulalcinyVanGiesonparavisualizarelcartlagoy
formacindehueso.Anatomacoclearseexaminaenlasseccionesdelodointerno.Muestrasincluidasenplsticode
metacrilatodeparaformaldehdo/coclearrendimientotejidoglutaraldehidofijobuenaconservacindelaestructura
celular3alassecciones4micrasdeespesorsepuedeteirconazuldetoluidina(448,501)otionina(499,502)
ohematoxilinaacuosa(277).
Unmediorelativamenterpido,noinvasivoparaevaluarlafuncinauditivaeslamedicindelarespuestaauditiva
deltroncocerebralevocada(277,448,501,502).Investigacindeotrascaractersticasdelafuncincoclearola
funcindelnerviococlearpuedeincluirladeterminacindelpotencialendococlear,potencialdeaccincompuesto,y
otrosparmetrosfisiolgicos(277).
44bRECOMENDACIN
Losdficitsdelafuncinvisualqueresultandeladeficienciadelahormonatiroideasepuedenestudiar
midiendolasrespuestasevocadosvisualesenelectrorretinogramasparadeterminarlasensibilidaddelongitud
deondaylosumbralesdeintensidaddeluz.
Comentario Elanlisishistolgicodelaretinasellevaacaboen2 micrasseccionesobtenidasapartirdemuestras
incluidasenplsticodemetacrilato.Elejedorsoventraldelgloboestmarcado.Ensitueinmunohistoqumicade
hibridacinseusanparaevaluarlaexpresindelosgenesdianacandidatosytpicamenteserealizanen1016 micras
cryosectionsparaformaldehdofijo(279,398,503,504).Losanlisisdeexpresindelaprotenasepuederealizar
enextractosproteicospreparadosapartirderetinadiseccionadoparainvestigardiversasprotenasopsinayrodopsina
medianteWesternblotylosestudiosinmunohistoqumicos(279,398,503,504,506).
Funcionesdeconoyfotorreceptorasvarillapuedenserevaluadosporanlisisdelaelectrorretinograma,quese
registratpicamenteenratonesadultosjvenes.Dadaslasfuncionescrticasdelahormonatiroideaendiferentestipos
deconos,esimportanteanalizarfotpicasrespuestadelosconosdeluz(adaptado)enrespuestaalongitudesdeonda
deluzespecficasquesonselectivosparalasdiferentespoblacionesdecono,esdecir,losquetienensensibilidad
mximaamediolargo(M,o"verde"~520 nm)ycorto(S,o"azul"~367 nm)longitudesdeondadelaluz.
Escotpica(adaptadaalaoscuridad)lasrespuestasdelabarratambinsedebendeterminar(279,398).
RECOMENDACIN45
Efectosdelahormonatiroideaenloscanalesinicosdelasneuronasylaconduccinnerviosapuedenser
investigadosporelanlisisdepatchclampograbacindemicroelectrodos.
Comentario Elanlisisdetalladodelafuncinneuronalrequieredetcnicasespecializadasrealizanmejoren
colaboracinconlaboratoriosdeneurocienciaestablecidos.Porejemplo,elanlisisdepatchclampdeneuronas
enterasencortesdetejidoodegrabacinmicroelectrododecortesdetejidosehanutilizadoparaestudiarlosefectos
delashormonastiroideassobrelafuncindelaneurona(478).Grabacionesdeclulasenteraspatchclampdelas
neuronasindividualespuedenrealizarseutilizandoinstrumentosespecializadosen300 micrasrodajasdecerebro
parasagitalobtenidosderatones.Lasneuronassonvisualizadosporinfrarrojosdiferencialmicroscopadecontraste
deinterferenciaparapermitirlaseleccindelasclulasagrabarse(478).Procedimientosdegrabacinavanzadas
puedenmedirloscambiosinducidosporelhipotiroidismo,enlapotenciacinalargoplazoenlaspoblacionesde
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neuronasdelhipocampo,unmecanismocelulardelaplasticidadsinpticaquesecreequeestinvolucradoenla
memoria(507a510).
46aRECOMENDACIN
Pruebasneurolgicasestandarizadaspuedenutilizarseparainvestigarcmolahormonatiroideaafectael
controlneuromuscularentantomotorylosnivelesdelcerebelo.Serecomiendaelusodemtodos
complementarios.
Comentario Protocolosdeensayoencampoabiertosehanutilizadoparacuantificarlaactividadlocomotoradela
distanciarecorridaylavelocidadduranteunperododefinido(187,483,511)conelfindeinvestigartantolos
aspectosdecomportamientoyresistenciadelafuncinneuromuscularenrespuestaaalteracionesenelestadodel
tiroides.Motorylafuncinmuscularpuedenserinvestigadosmediantepruebasestandarizadasdelafuerza,
incluyendolafuerzadeagarresedeterminausandounmedidorautomticodelafuerzadeagarre,unmedidorde
tensindetraccinelectrnico,ounapruebadesuspensindelacuerda(478).Acelerarlaspruebasrotaroddel
equilibrioylacoordinacinmotoraserealizamedianteladeterminacindeltiempodeunratnindividualescapazde
permanecerenlabarradurantesurotacindespusdeunperododeformacindeterminadoantesdelaprueba(187
,483).Vigapielapruebautilizandounaseriedevigaselevadosdediferentesanchurassepuedeutilizarpara
determinarelequilibriomediantelamedicindedeslizamientoyeltiempodepieparacruzarlalongituddelaviga(
478).Alternativamente,seutilizanpruebasposteverticalparainvestigaragilidadyequilibriomediantela
determinacindeltiemponecesarioparaqueunratnparainvertiryejecutaralabasedeunpostecuandosecoloca
cercadelapartesuperior(187).Anlisisdelahuelladelamarchapuedeserevaluadaenratonesentrenadospara
caminaralolargodeunpapeldefiltroconlospiespintadascondiferentescoloresdepinturasnotxicasaplicadasa
miembrosanterioresyposteriores.Determinacindelalongituddelazancada,delanteraytraseraanchuradelabase,
ladistanciainterstep,elusodetaln,yelngulodelapatatraserasepuedeutilizarparaevaluarelequilibrioyla
coordinacin(478).
46bRECOMENDACIN
Estadodenimo,laconducta,elaprendizajeylamemoriasonsensiblesalahormonatiroideaypuedenser
investigadosmediantepruebasdecomportamientoestablecidas.Serecomiendaelusodemtodos
complementarios.
Comentario Caractersticasdedepresinsoninvestigadosporlaspruebasdelaindefensinaprendida.Enesta
situacin,unsistemadeaprendizajeoperante,quecomprendeunacmaradeacondicionamientoconungeneradorde
shock,permiteelanlisisdelcomportamiento"evitacinactiva"aldiscriminarlaevitacindeescape(511).Afinde
investigarlaansiedadsedebeutilizarunsistemade"evitacinpasiva".Unaluz/cajaoscuraseempleapara
determinareltiempodepermanenciaenlaluzcontralaoscuridadduranteunperododetiempototaldefinido(511
513).Unlaberintoelevadoenformadesigno,queconsisteendosbrazosabiertosopuestosydosbrazoscerrados
opuestos,sepuedeutilizarcomounaevaluacinalternativa.Enestasituacin,eltiempodepermanenciaenel
comportamientoexploratorioenlosbrazosabiertosfrentealtiempocomportamientononexploratoryenlosbrazos
cerradossedetermina(187,483).Sobresaltorespuestascomootrosindicadoresdeansiedadeinquietudtambin
puedenserinvestigados(511).
Parainvestigarlosefectosdelestadodelatiroidesalteradosobreelaprendizajeyparamedirlosefectossobrela
memoriadereconocimiento,losestudiosenuncampoabiertoconobjetosfamiliaresylosnuevossepuedenemplear
entareasnovedosasdereconocimientodeobjetos(187,483).Laspruebasdecampoabiertotambinsepuede
utilizarparainvestigarlascaractersticasdeladepresinporqueevalalatendenciadelosratonesparaexplorar
abiertamenteopermanecercongeladoenlosbordesdelcampooparapresentarelcomportamientodecra.Las
pruebasadicionalesparainvestigarelaprendizajeylamemoriaimplicanelusodeunlaberintodeaguadeMorris
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llenodeaguaopacayquecontieneunapequeaplataformasituadaenuncuadrantejustodebajodelasuperficiedel
agua.Elratnsecolocaenlapequeaplataformadurante10segundosyluegosecolocaenelagua.Eltiempo
necesarioparaencontrarytreparalaplataformaseregistra.Latareaserepiteendassecuencialesparainvestigarel
aprendizajeylamemoria.Lapruebadereferenciavisiblereplicaelexperimentoexceptoquelaplataformaes
claramentevisible(187).Lapruebadeescapedeaguainvestigalapercepcinvisualmediantelacolocacindeuna
escaleradeescapevisibleenelladodelaembarcacinylagrabacineltiemponecesarioparasubiralaescalera(
187).
RECOMENDACIN47
Losefectoshipotalmicosdelahormonatiroideaenlosparmetrosdecomportamientoymetablicaspueden
serestudiadosdirectamentedespusdeintracerebroventricular(ICV)laadministracindeT3.
Comentario Lahormonatiroideapresentaunaseriedeefectosqueestnmediadasdirectamenteenelhipotlamobasal
medial.UnejemploeselaumentodelaingestadealimentosquesiguerpidamentelaadministracindeT3
directamenteenelncleoventromedial(514516).UnenfoquerelacionadoesimplantarT3cristales
estereotxicamenteenreashipotalmicasdiscretos.Estemtodohasidoutilizadoparadefinirelpapeldirecto
desempeadoporT3enelmecanismoderetroalimentacinnegativaTRH(487,488)yparaestudiarlaregulacin
mediadaporfotoperiododebalancedeenergaestacionalyreproduccinenelhmstersiberiano(517).Adems,el
papeldirectodesempeadoporunnmerodeneuropptidosenelejeHPTsehaestudiadoutilizandolarutaICV
porejemplo,AMHS,neuropptidoY,ylaprotenarelacionadaconagouti(518522).
48aRECOMENDACIN
ModelosdeclulascerebralesquerespondenalahormonatiroideainvitrosepuedenutilizarparamodelarT
3efectosenelSNC.
Comentario LoscultivosprimariosdeneuronasdelhipocampoylneascelularesneuronalesrespondenaT3invitro.
Enlasneuronascultivadas,laexposicinaT3aumentasignificativamenteeltamaoylalongituddelasneuritas,as
comolaactividaddelaacetilcolinesterasa(523).Adems,T3afectadirectamenteeldesarrollodeprocesos
dendrticosdeclulasdePurkinjedelcerebelocultivadastravsdelaactivacindeTR1(524).T3tambinpuede
mejorarladiferenciacinneuronalinducidaporeltratamientoconcidoretinoicodeclulasmadreembrionarias(
525).LasclulasglialessontambinsensiblesaT3(526).Porejemplo,laactividaddelamaduracindeclulas
glutaminasintetasamarcadoraumentosenastrocitoscerebelosascultivadasenrespuestaaT3(527).Enparticular,
loscambioshormonalesevocadadelatiroidesenlafuncinneuronalamenudoimplicanaccionesglialesmediada(
526).Porejemplo,lahormonatiroideahastaregulalacorrientedesodioactivadosporvoltajeenlasneuronasdel
hipocampocultivadaspostnatalesatravsdeT3secrecindependientedelfactordecrecimientodefibroblastos
bsicoapartirdeastrocitosdehipocampo(528).LosoligodendrocitossontambinsensiblesaT3yla
mielinizacinesprobablementelamejorcaracterizadaT3mediadaefectosobrelafuncindelasclulasgliales(529
),conT3estimulandobsicademielinaexpresindegenesdeprotenasencultivosdeoligodendrocitos(530).
Clulascerebralescultivadasamenudoexhibenactividaddeiodinasasustancial,D2y/oD3,yporlotantoeltipoy
laconcentracindelahormonatiroideaaplicadosenlosgruposdetratamientodebenserconsideradasy
experimentosplanificadosenconsecuencia.Cambiosenlosmediosfrecuentespuedensernecesariosparagarantizar
laconcentracinyodotironinaestabledurantetodoelexperimento.Aadiendocantidadestrazadorasderadiomarcado
T4oT3conelposterioranlisisdelosmetabolitosenlosmediosdecomunicacinindicasutasametablica(173).
Enlosmodelosdecocultivo,T3producidoporD2enlasclulasdegliomaH4afectaalaexpresindegenesen
clulasdeneuroblastomaSKNAS(vecina173).Enestesistema,lasconcentracionesdeT4tanbajascomo20 pM
evocadosT3mediadaporlaexpresindegenesenlasclulasneuronales.
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48bRECOMENDACIN
ModelosclulapituitariarespondenalahormonatiroideainvitroysepuedenutilizarparaestudiarT3efectos
enlaglndulapituitariaanterior.
Comentario Lneasdeclulaspituitariassontpicamentesensiblesalahormonatiroideadebidoalaaltaexpresinde
TRenlaglndula(101).LalneacelularsomatotrophGH1fueunodelosprimerosmodeloscelularesmostrados
pararesponderalosnivelesfisiolgicosdelahormonatiroideamonitorizadaporelcrecimientocelularylautilizacin
deglucosa(531).EnlalneacelularsomatotrophGH3,laexposicinaT3aumentalaexpresindelahormonade
crecimientodeunamaneramediadaporTR2(532),mientrasqueenclulassecretorasdeGHGC,T3disminuye
losnivelesdemRNAD2(143).LalneacelulartirotrpicosderivadosTT1tambinrespondealosniveles
fisiolgicosdeT3disminuyendoTSHyexpresinD2(259,533).
[J.2]coraznyelsistemacardiovascular
Fondo Desarrollodelcoraznylatransicindeunfetalalprogramadeexpresindegenescardiacosadultosesen
granmedidadependientedelahormonatiroidea(534).Elcoraznsiguesiendounodelosprincipalesrganosdiana
delahormonatiroideaenlavidaadultayefectoscardiovascularesestnentrelasmanifestacionesclnicasms
pronunciadosdehipotiroidismoytirotoxicosisenelhombre(535).Corazonesroedoressonigualmentesensibles,y
prcticamentetodoslosaspectosdelabiologacardacaseveafectadaporlahormonatiroidea,incluyendo
electrofisiologa,lahomeostasisdeiones,lacontraccin,elmetabolismodelaenerga,ylasealizacinadrenrgica(
402).Lasumadeestosefectosesevidenteenelaumentodelafrecuenciacardacaylastasasdecontracciny
relajacinenlatransicindebajaalosestadosaltotiroideshormonal.Juntoconlareduccindelaresistencia
perifricainducidaporlahormonatiroidea,estoresultaenlasalidacardiacamsaltarequeridaporelorganismo
hipermetablico.Crecimientoventriculartambinesestimuladaporlahormonatiroidea,casieldobledelpesodel
coraznenlatransicindehipotiroidismoatirotoxicosis.Sinembargo,lahormonatiroideatienepocoefectodirecto
sobreelcrecimientodeloscardiomiocitosylahipertrofiaventricularescasiensutotalidadenrespuestaalaumento
delacargadetrabajocardiacainducidaporlahormonatiroidea(537).Porlotanto,apesardelasconsecuencias
funcionalesdelosnivelesdehormonastiroideasalteradassonrelativamentesencillosybiendocumentado,separar
losefectosdirectosdelossecundariospuedenserunreto.Estoseaplicainclusoaaquellosgenescardiacosquehan
sidoidentificadoscomoblancosdirectosdeT3,yaqueenmuchoscasossontranscripcionalmentecoregulatedpor
factoresqueellosmismosestninfluidosporelestadodelatiroides(porejemplo,atravsdevasdetransduccinde
sealesdependientesdelacarga).
LacomprensindelosmecanismosdeaccindelahormonadelatiroidesenelcoraznylaevaluacindeT
cardaca3actividadesrelevante,enparticulardadalasospechadepapeldelaalteracindelasealizacindela
hormonadelatiroidescardiacaenlaprogresindelaenfermedadcardacayelpotencialusoteraputicodela
hormonatiroidea.Estoestrelacionadoconlosnivelesdelahormonadelatiroidessricosbajosobservadosenla
insuficienciacardaca(esdecir,elsndromeNTI),ascomoaloscambiosenelmetabolismocardiacohormona
tiroideaTRylaexpresinendiversasformasdeenfermedadesdelcorazn.Lasrecomendacionesdeestaseccin
describenlosenfoquesymtodosqueseutilizanparadeterminarelefectodelestadodelatiroidesenparmetros
cardacos.Estasmetodologasseutilizantambinparaevaluarelpapeldelasealizacindelahormonadelatiroides
cardacaenratonesmodificadosgenticamente,talescomoTRmodelosknockout(451),yenmodelosde
remodelacincardiacapatolgicaeinsuficienciacardiaca.ModelosparalaremodelacindelVIincluyenelmodelo
deratasespontneamentehipertensas(539)induccinquirrgicadeinfartodemiocardioporligaduratransitoriao
permanentedelaarteriacoronariadescendente(238,540)LVsobrecargadepresinporbandasquirrgicadela
aorta(constriccinarticatransversal)(541544)yisoproterenolinducidaporlahipertrofiadelVIenelcontexto
delmodeloD3rondaratn(64).Participacindelasealizacindelahormonadelatiroidesenelventrculo
derecho(RV)remodelacinsehaestudiadoenlaratausandoelmodelodehipertensinarterialpulmonarinducida
porunasolainyeccindemonocrotaline(62,63).LosmtodosparainducirlaremodelacindelVIseutilizanen
ratasyratones,peromonocrotalinenosepuedenutilizarparainducirlaremodelacinRVenratones.
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RECOMENDACIN49
Losefectosdelahormonatiroideasobrelafuncincardacaylamorfologasepuedenevaluardeformano
invasivaporecografaoresonanciamagntica.
Comentario Losmtodosnoinvasivosseutilizanparaestudiarlosefectosdelahormonatiroideasobrelafuncin
cardacaylamorfologa(540,545,546).Estosmtodossonidealesparalosanlisislongitudinalesdeanimales
individuales.Laecocardiografaeselmsampliamenteutilizadoquepermiteevaluar,deunaseriedeparmetros
funcionalesdelcorazn(frecuenciacardaca,elvolumensistlico,elgastocardiaco,fraccindeacortamiento,
fraccindeeyeccin),ascomolosvolmenesventricularesygrosordelaparedduranteelciclocardaco(540,546
).Serequierendispositivosdeultrasonidosconunaaltaresolucinespacialytemporalalaimagendelcoraznde
ratnconprecisindebidoasupequeotamaoyaltastasasdecorazn(esdecir,>400 bpm).Conunmanejo
adecuado,esposibleanalizaranimalesdespiertos,perolaecocardiografaserealizanormalmenteenanimales
ligeramentesedadosutilizandoisofluranootribromoetanolcomoanestsicos.Estoscompuestostienenefectos
cardiodepresormnimos,adiferenciadeotrosanestsicosdeusocomn.Mantenimientodelatemperaturacorporal
duranteelprocedimientoesesencial.
CiertosaspectosdelafuncincardacafetalpuedenevaluarsemedianteecografaDopplerespectralguiadapor
Dopplercolor(534).EstatcnicaespecializadasehautilizadoenratonesTRmutanteparaestudiarlosefectosdela
interrupcindeT3deaccineneldesarrollocardiacofuncionaleneltero(534).
Cuandolaresolucindelaecocardiografaesinsuficienteparadetectarlosefectos,laRMofrecedelineacin
superioresdelasestructurasalolargodelciclocardacoconaltaresolucintemporal(546,547).Lasmismas
consideracionesconrespectoalaanestesiaycontroldetemperaturasonvlidosparaelanlisisdeultrasonido.
Coleccindeimgenessedesencadenaporelelectrocardiograma(ECG)yelprocesamientodeimgenesadquiridas
permitelareconstruccindelcoraznatravsdeunciclocompleto.Apartirdeestosdatos,parmetroscardacos
funcionalesyestructuralessepuedencalcularconmayorexactitud.
50aRECOMENDACIN
Anlisisdelosefectosdelahormonatiroideasobrelafrecuenciacardiacaylapresinarterialrequiereun
anlisislongitudinalenanimalesconlibertaddemovimiento.
Comentario Serequieredetelemetraparamonitorizarloscambiosenlosparmetrosvitalesconprecisinsinla
interferenciadeestrs.Estemtodohasidoutilizadoenelanlisisdetratamientodelatiroideshormonaderatas
despusdeinfartodemiocardio(540),enratonesdetiposalvaje(548),yenratonestransgnicosquellevan
mutacionesTR(451,549).Lafrecuenciacardaca,ECG,latemperaturacorporal,lapresinsanguneaarterial(
550),ylaactividadfsicaseregistransimultneamenteporsondasconectadasauntransmisorimplantadoenla
cavidadperitonealconunreceptordetelemetrasituadodebajodelajaula.Telemetracontinualecturaesposiblepara
unmximode3meses.Lostemasclavesonelcostoylashabilidadesnecesariasparallevaracabolaimplantacin
quirrgica.Unserviciotelmetropreimplantacinestdisponibledeproveedores,incluyendoTheJackson
Laboratories(http://jaxmice.jax.org/preconditioned/surgical/telemetry.html)yCharlesRiver(
www.criver.com/productsservices/basicresearch//deldispositivodeimplantesroedordelaciruga).
50bRECOMENDACIN
LosefectosdelahormonatiroideasobrelafuncincontrctilLVpuedenserevaluadosporinvivola
grabacindelaspresionesLV.
Comentario Losparmetroshemodinmicossedeterminanenexperimentosdeterminalesenratonesanestesiadosy
ventilados(238,551)oratas(540)porelavancedeuntransductordepresindemicropuntaouncatterde
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presinvolumencombinadoatravsdelaarteriacartidacomnderechaenlaaortaascendenteyposteriormenteen
laLV.Lastasasdepositivosynegativosdedesarrollodelapresinylaspresionessistlicaydiastlicafinalpueden
serutilizadoscomoindicadoressensiblesdelatiroidescambiosdependientesdehormonasenlaexpresindelas
protenascontrctilesyprotenasimplicadasenlahomeostasisdelcalciointracelular.
51aRECOMENDACIN
Anlisisdelosefectosdelahormonatiroideasobrelafuncincontrctilcardiacarequiereexvivo
experimentosusandocorazonesintactasaisladasopreparacionesdetejido.
Comentario Lapreparacindecoraznperfundido(mtododeLangendorff)seutilizaparaanalizarunaampliagama
deparmetrosdelafuncincardiaca,conlaventajadesercapazdecontrolarlascondicionesexperimentales(por
ejemplo,lafrecuenciadelestmulo,laperfusincoronaria,elvolumenventricular,ylapresin).UnglobodePVC
llenodelquidoseinsertaenlacavidadLVyunidoaunsistemadeadquisicindesensordepresinydatos,loque
permitelagrabacinylamanipulacindelaspresionesyvolmenesdelVI.Elmtodosepuedeaplicarparaevaluar
losefectoscardacosdelahormonatiroideaentantorata(552554)ymodelosderatn(555,556).Unaventaja
adicionaldeestemodelodecoraznesquepermiteelanlisisdelosefectosimportantesdelahormonatiroideaenel
metabolismodesustratocardiacoylafuncinmitocondrial(552,556,557).cidosgrasosetiquetadosyglucosa
se
utilizanparaanalizaroxidativoyelmetabolismoglucolticomediantetcnicasestndar(3sustratosHetiquetados)
(552)oporespectroscopadeRMN(13sustratosCetiquetados)(556).Estopuedecomplementarseconanlisis
deltejidoposteriordelasenzimasmetablicasclaveylafuncinrespiratoriadelasmitocondriasaisladas(552,556
).
Unanlisismsdetalladodelosefectosdelahormonatiroideaencontrctilylaspropiedadesmecnicasdeltejido
cardiacoselograutilizandoaisladotrabculas(558,559)omsculospapilares(560).Fuerzayacortando
velocidadesdelosmsculosestimuladoselctricamenteseregistranutilizandounmedidordedeformacin.
Preparacionespapilarestambinsehanutilizadopararegistrarelefectodelahormonatiroideaenlaspropiedades
electrofisiolgicas(porejemplo,elacortamientodeladuracinpotencialdeaccin)(561).Serequieren
preparacionesfinasy/otemperaturasreducidasparaevitarlahipoxiatisulardelaspreparacionessuperfuseddurante
laestimulacinrepetitivatalescomolahoradedeterminarlasrelacionesdefuerzafrecuencia.Porestaraznse
prefierenpequeatrabculas,queseobtienenmsfcilmentedelaRVquedelaLV.
Preparacionesauricularesderechosquecontienenelnodosinoauricularsepuedenutilizarparalagrabacindela
fuerzaisomtricaylafrecuenciadelatidoespontneo.EstosehahechoparaevaluarelefectodeunamutacinTR1
enelcontrolautnomodelafrecuenciacardacaenratones(549).
51bRECOMENDACIN
LosefectosdelahormonatiroideaencardacaCa2+homeostasispuedenserevaluadosenlosmsculos
papilaresotrabculas,ascomoenloscardiomiocitosindividualesaisladas.
Comentario Losefectosinotrpicosylusitrpicospositivosdelahormonatiroideadetectadausandotrabculaso
msculospapilaresreflejancambiosenlaexpresindeisoformasdemiosinadecadenapesada,ascomocambiosen
laexpresindelasprotenasdemanejodecalcio.EstosltimosincluyenlarianodinaCa2+canal,elretculo
sarcoplsmico/endoplasmticoCa2+ATPasa(SERCA2aoAtp2a2)ysufosfolambanprotenareguladora(536).
ElefectosobreellatidoalatidointracelularesdeCa2+flujossepuedeevaluarenlosmsculospapilarestrabculaso
usandoCa2+indicadores(560,562,563).Fura2eselindicadorfluorescentemsutilizadoquepermitela
determinacindelibresintracelularesdeCa2+concentracionesporunenfoquededoblelongituddeonda.Sin
embargo,lagrabacindeCa2+transitoriosconresolucindetiempodemilisegundosrequiereunapticadealta
velocidadsofisticados.Montajesdedicadosestndisponiblesparaelanlisiscombinadodelaspropiedades
2+
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contrctilesyCa2+fundentes(563).
ElmismoenfoqueexperimentalsepuedeutilizarparaanalizarlosefectosdelahormonatiroideasobreelCa2+
homeostasisenloscardiomiocitosindividuales,estimuladoselctricamenteaisladasderatn(564)ocorazonesde
rata(565,566).Elanlisisdelasclulascultivadasindividualestieneventajasobvias,peroelrendimientodelos
cardiomiocitosviables,enformadebastoncillosesvariable.Esespecialmentebajaenelcasodeloscorazonescon
hipotiroidismo,creandoelriesgodesesgodeseleccin.
52aRECOMENDACIN
Larespuestadeltejidocardacoalahormonatiroideasepuedeevaluarusandomtodoshistolgicosyporlos
estudiosdetiroidesexpresingnicasensibleahormonas.
Comentario Elpesodetodoelcoraznoindividualesventrculosdeberdeterminarse,preferentementecomouna
relacinalalongituddelatibia,yaqueelpesocorporalpuedevariarconsiderablementeenfuncindelasituacinde
latiroides.TincinH&Edeseccionesdeparafinaseutilizatpicamenteparalamedicindeloscardiomiocitosrea
deseccintransversal(238,567).Cabesealarquesehandesarrolladolascondicionesdefijacindetejido
cardacopuedeafectaralamorfologadeloscardiomiocitosymtodosadicionalesparadeterminarconprecisin
miocitosreadeseccintransversalascomolalongitud(539).TincindeTricrmicodeMassondelassecciones
seusaparaevaluarlafibrosisencombinacinconlamorfologadeloscardiomiocitos(542),ylafraccinde
volumendecolgenopuedesercuantificadamediantetincinrojopicrosirioymicroscopadeluzpolarizada(568).
LaexpresindeT3genesdiana,incluyendoHCN2,KCNE1,Kcnb1,KCNA1,Kcnq1,Thra,Thrb(534),
Atp2a2,MYH6,MYH7(62,238),yNPPA(238),sellevaacabomedianteRTqPCRenARNmextradotanto
detodocoraznodesdecmarasoregionesindividuales(verseccinI.2deconsideracionestcnicas).Expresinde
lasprincipalesisoformasdemiosinacardiacapesados
cadenaMHCyMHC(esdecir,MYH6yMYH7,
respectivamente)sepuededeterminarenhomogeneizadosdetejidoportransferenciaWesternutilizandoanticuerpos
policlonalesdisponiblesenelmercado(238)omonoclonal(542)anticuerpos.IHCdeT3responsivegenesrara
vezsehaceenelsupuestodequetodosloscardiomiocitosrespondendemanerasimilaralahormonatiroideaoel
estrs.Sinembargo,estudiosrecienteshandemostradounaheterogeneidadinesperadadeexpresinreguladade
MYH7(569,570),yestodebesertenidoencuentaalevaluarlosefectosdelaT3.
Tambinesimportantedarsecuentadequeningunaprotenacardacaestreguladaexclusivamenteporlahormona
tiroidea.LaeficaciadelaT3tratamientopuedeserevidenteapartirdeloscambiosenlaexpresindelosgenes
mencionadosanteriormente,enparticularloscambiosrecprocosenMYH6yMYH7expresin,peroloscambiosen
laexpresindeestosgenesensituacionespatolgicasnoimplicanecesariamenteTalterada3desealizacin.Por
ejemplo,muchasdelasrutasdetransduccindesealesimplicadasenlaremodelacinventricularylainsuficiencia
cardiacapatolgicatambinconvergenenlaT3responsivegenes,conefectosopuestosalosdeT3.Como
resultado,elfenotipodelacorazninsuficienteparecealadeuncoraznhipotiroidismo,almenosparaunnmero
deprotenas(535).Sinembargo,laevaluacindetejidoT3niveles(63,238)(vaselaseccinB.2,
Recomendacin8)ylosnivelesdeTRS(571),o,idealmente,ladeterminacindeT3transcripcindependiente(
63,238)esnecesarioparaestablecercambiosenTcardiaca3desealizacin.
52bRECOMENDACIN
MiocardioContratanteocupacodificacindeADNplsmidoT3genesindicadoresresponsive,permitiendoT
cardiomiocitosespecfica3actividaddetranscripcindependientedequesedetermineenvivo.
Comentario LoscardiomiocitosenelcoraznpalpitantetienenlacapacidadnicaparacaptarADNplsmidose
inyectaenlaparedventricular.Elmecanismodeabsorcinesdesconocido,perodebidoaquenootrasclulas
presentesenelmiocardiosetransfectan,laregulacindeloscardiomiocitosespecficodegenesinformadores
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fluorescentespuedeserestudiadainvivo.Lasmismasconsideracionessealadasparainvitroanlisisdegenes
indicadoresseaplicanconrespectoalanormalizacinyelcontroldelosefectosfueradelametadelahormona
tiroideauotrasintervenciones(vaselaseccinI).Sinembargo,elanlisisdeT3transcripcinregulatedno
requierecotransfeccindeunplsmidoqueexpresaTR.DurantelacirugatoracotomalaparedlibredelVI(ratn)
oLVy/oRV(rata)seinyectaconunpequeovolumendesolucindeplsmido(Fig.15).Porlogeneral,varios
milesdecardiomiocitossontransfectadas,ylaexpresintieneunaduracindevariassemanas.Anlisisdelreportero
ylaexpresindeluciferasanormalizacin(generalmentelucirnagayRenillaluciferasa)serealizaentejido
homogeneizado.EstametodologasehautilizadoparainvestigarlaT3regulacindependientedelaMYH7promotor
(572)yparaevaluarlaT3transcripcionaldependientedeactividadenmodelosderatayratndeinsuficiencia
cardaca(63,238).DebidoaqueenesteltimoenfoqueunpromotormnimoquecontienesolamenteunT3RE
comocisactuandoelementoseutiliza,seproduceelresultadonetodetodoslosfactorespotencialmentecontribuira
laTalterada3desealizacinenelcardiomiocito(porejemplo,laabsorcindelahormonadelatiroides,el
metabolismo,ylaexpresindelosTRycofactores).
FIG.15.
Invivotransfeccindecardiomiocitosderatamedianteinyeccindirectade
ADN.ElanimalseanestesiaconunamezcladeN2O(0,2 L/min),O2(0,2
L/min),yelsevoflurano(2%3%),yelcoraznseexponeatravsdeuna
toracotomaderechalateral....
RECOMENDACIN53
Loscultivosprimariosdecardiomiocitosderatayratn,ascomolalneacelularH9c2,sepuedenutilizar
paraestudiarlosefectosdelahormonatiroidea.
Comentario LoscultivosprimariosderataadultaocardiomiocitosseobtienenporLangendorffperfusindelcorazn
aisladoconunasolucindecolgenoquedigieren.Enformadebarra,loscardiomiocitosviablesseseparande
permeabilizada,redondeadocardiomiocitosyotrasclulasyplateado.Elrendimientodeloscardiomiocitosviables
vara,peropuedesertanaltacomo80%.Estodependeprincipalmentedelacalidaddelapreparacindecolagenasa
utilizado,yvarioslotesdelaenzimapuedenecesitarserprobado.Aunqueloscultivosprimariospuedendurarmsde
1semana,loscardiomiocitoscomienzanadedifferentiategradualmentedesdeelmomentodeaislamiento.En
consecuencia,losanlisisdelosefectosdeestadodelatiroidesalteradoenlosparmetroscelulares,talescomola
grabacindepotencialesdeaccin(573)yCa2+transitorios(564566),ascomoinvitroefectosdelahormona
tiroidea(574),serealizantpicamenteenculturasrecinpreparados.
Debidoalaslimitacionesdeloscultivosprimariosparaadultos,lamayoradelosestudiossobrelosefectosdela
hormonatiroideaencardiomiocitosinvitroserealizanusandorataprimarianeonatal(541,575577)oelratn(
578)culturas.Unoalascrasdetresdasdeedad,seutilizanyclulassecolocandespusdeladigestincon
colagenasadeventrculospicados.CultivosprimariosNeonatalesmuestrancontraccionesespontneasyculturasy
sncronospuedenmantenersepormsde1semana.Lainteraccindelahormonatiroideaylaactividadcontrctil
puedeseranalizado,yaseamediantelainhibicindelascontraccionesespontneas(576)oporlaestimulacin
elctricadelasclulas(575).LalneacelularH9c2,derivadoderatatejidodelcoraznembrionario,seutilizacomo
unaalternativaacultivosdecardiomiocitosprimariosydiversosaspectosdelaaccindelahormonadelatiroidesy
elmetabolismosehanestudiadoenH9c2clulas(579581).Aunqueestalneacelularsehaconservadounnmero
decaractersticasdecardiomiocitos,exhibemuchasdelaspropiedadesclavedemsculoesqueltico.Enparticular,
losmioblastosH9c2sernfcilmentefundirparaformarmiotubosmultinucleadosyresponderalaestimulacindela
acetilcolina.Porlotanto,debetenercuidadoalextrapolarlosdatosaloscardiomiocitosnormales.
RECOMENDACIN54
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Losefectosdelahormonatiroideasobrelafuncinvascularsepuedeevaluarmedianteelanlisisdeanillos
arterialesyclulasmusculareslisasvascularescultivadas.
Comentario Elmecanismodelareduccindependientedehormonatiroideaenlaresistenciavascularsistmicaes
investigadaporexvivodeterminacindelaspropiedadesvasomotoresdelasarteriasderata.Anillosvascularesse
preparanapartiraortasexplantadasoarteriasderesistenciaderatashipotiroideo,eutiroideootirotxicosyse
montaronenunmyograph(582585).Larespuestacontrctilaagentesvasodilatadoresovasoconstrictoresse
registra,loquepermiteladiferenciacinentreloscambiosenlosefectosmediadaporelendotelioyloscambios
intrnsecosalasclulasdelmsculolisovascular(CMLV).LoscultivosprimariosdeCMLVseutilizanparaestudiar
losefectosrpidosdelahormonatiroideaenlasCMLVderelajacin(586)ydelosprocesosdetransduccinde
sealesimplicados(587).
[J.3]metabolismointermediarioylahomeostasisenergtica
Fondo Todoslosprincipalesrganosytejidosmetablicamenterelevantes(porejemplo,elcerebro,eltejidoadiposo,
elhgadoyelmsculoesqueltico)sonelblancodelahormonatiroidea.Enlamayoradelostejidos,lahormona
tiroideaactivamltiplesvasmetablicas,loquellevaaunarotacinmsrpidaATP(descomposicinylasntesis
deATP)yelconsumodeoxgenoacelerada(588,589).Latransferenciadeenergaesunprocesoinherentemente
termodinmicamenteineficienteesdecir,elcaloresunsubproductoobligatoriacuandolaenergasetransfiere(i)de
laoxidacindesustratosenATPy(ii)apartirdeATPeneltrabajobiolgico.Porlotanto,laaceleracindela
rotacinATPconducealaproduccindecalor(termognesis),queeslavaaceptadaporelcuallahormonatiroidea
activalatermognesis.Especficamente,lahormonatiroideaacelerafacturacindeunnmerodeciclosinicosode
sustratorequieredeATPincluyendoNa/KATPasa,CaATPasa,lalipognesisylaliplisis,yelciclodeCory(
590).Tantolatasametablicabasal(esdecir,laenergagastaparamantenerlavidaenunestadodereposo)yel
gastodeenergadeadaptacin(porejemplo,enfroinducido)estnreguladosporlahormonatiroidea.Laactivacin
directadelatranscripcindelgenUCP1enlaMTDeselmecanismosubyacenteporelcuallahormonatiroidea
aceleralatermognesisinducidaporelfro(267,269,592)noesttanclaroquelahormonatiroideajuegaun
papelenelgastodeenergadeadaptacininducidaporladieta(211,593).Ademsdeestasaccionesdirectasenla
homeostasisenergtica,lahormonatiroideatambinactaenelSNC(porejemplo,hipotlamo)queinfluyenenlas
principalesvashomeostticosporejemplo,laactividadsimptica,elapetitoylaingestadealimentos(594,595).
As,losestudiosdelosefectosmetablicosdelahormonatiroidestambinpuedenrequeriruncontrolestrictodelos
alimentosylaingestadelquidos,laactividadmotora,larespiracinylafrecuenciacardiaca.
55aRECOMENDACIN
TirotoxicosisSistmicoyelhipotiroidismopuedensermodeladosenrataspuntosfinalesexperimentalesa
considerarincluyenelconsumodeoxgeno(VO2),cocienterespiratorio(RQ),elcomportamientode
alimentacin,consumodealimentosyagua,yelmovimiento/actividad.
Comentario Hayunaaceleracindeaproximadamentecuatrovecesenlatasadegastodeenergadurantelatransicin
dehipotiroidismoatirotoxicosisenratas(596,597).VO2sereducea~50%unavezqueselograel
hipotiroidismosistmica(597).LaadministracindelahormonatiroideaacelerarpidamenteVO2enratas
eutiroideosohipotiroidismo,concambiossignificativosobservadostanprontocomo18a24horasdela
administracin(597,598).UnacadasignificativaenRQde~10%seobservadentrodelos2dasdela
administracindelahormonatiroideapararatas(599).LaadministracindeT3arataseutiroideostambinresulta
enunaaceleracinrpidaenVO2(~60%),quecomienzaalas24horasymesetasalos7das(600).
Elcosteenergticodevidaparaelratnesaproximadamentedosvecesmayorqueeldelarata(601).Porlotanto,
existendiferenciassustancialesentrelosratonesyratasconrespectoasucapacidadderespuestametablicaala
hormonatiroidea.RatoneshipotiroideosnomuestranunadisminucinenelVO2atemperaturaambiente,slo
despusdelaaclimatacinalatermoneutralidad(211).Sinembargo,elgastototaldeenergadiariasereduceenel
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ratnhipotiroidismoaclimatadoalatemperaturaambiente,unparmetroquetieneencuentaelVO2yelRQ.El
gastoenergticototaldiariosostenidoenelratnhipotiroidismosedebeaunamayorestimulacinsimpticadeBAT
(211,602).Estoindicaquelareduccinenlasealizacindelahormonatiroideaescompensadaporunaumento
delaactividadsimptica,elmantenimientodeVO2atemperaturaambiente(211).
Lacalorimetraindirectasepuedeestudiarmsde30a120minutos,conresultadosconfiables(597,598,603,604
).Elestrspuedeserunfactorimportanteenestosestudiosacortoplazoysedebetenercuidadoparaevitaro,al
menos,elcontroldeesavariable.Enalgunoslugareslosanimalessonanestesiadosparaminimizarlosmovimientosy
elestrs(597),perolosagentesanestsicospuedeninterferirconlatermorregulacinylahomeostasisenergtica.
Unametodologadelestadodelatcnicaconsisteenlaadmisindelosratonesaunsistemadecontrolcontinuo
integradoquepuedealbergaralosanimalesdurantedasosemanasatemperaturacontrolada(Fig.16)(232).Esto
minimizalosefectosdelestrsademsdepermitirlaadquisicindelosperfilesdedatos24horas.Otraventaja
importanteeslaobtencindepuntosdedatosduranteelda(quereflejanlatasametablicabasal)ynoche(que
incluyenlaaceleracindelatasametablicacausadaporlaalimentacin).
FIG.16.
ElusodelSistemadeMonitoreoIntegraldeAnimalesdeLaboratoriopara
realizarlacalorimetraindirectacontinuaenratones.(A)Dosjaulas
metablicasindependientesqueestnconectadosaunacomputadoraparala
grabacinyanlisisdedatos(B)VO2duranteunperododetiempode24
horas...
Idealmente,VO2seexpresacomounafuncindelamasacorporalmagradeterminadoenoalrededordelmomento
delacalorimetraindirecta.Lagrasaylamasacorporalmagrasepuedenmedirporanlisisdecomposicindela
canaldestructivooportcnicasdeimagennoinvasivasmsrecientes,incluyendolaabsorciometradeenergadual
derayosXoresonanciamagnticacuantitativa.Estosmtodoshansidocomparadosypuedenproducirresultados
diferentes,indicandoademslaimportanciadeuncuidadosodiseoexperimentalyelusodemtodos
complementariosparaelanlisisdelosfenotiposmetablicos(606,607).
Latemperaturacentralenlosroedoressepuedemediratravsdeunasondatrmicarectalconectadoaun
termmetrodigital(608).Sinembargo,elestadodelatecnologamsavanzadaimplicaimplantarquirrgicamente
radiotransmisoresenlacavidadabdominalparacontrolarlatemperaturacentral(609,610).Laadministracinde
frmacosantitiroideosaratasresultadosenlareduccinrpidadelatemperaturadelncleoqueesevidentedespus
de3dasdetratamientoporelfinaldelaprimerasemanadetratamiento,hayunareduccindeaproximadamente0,5
Cenlatemperaturacentralquesemantienedurantetodoeldaylanoche(609).Almismotiempo,lasratas
tratadasconhormonatiroideapor1semanaexhibenunaumentodealrededorde1Cenlatemperaturadelncleo
comoseevaluconunasondarectal(611).
55bRECOMENDACIN
Losefectosdelhipotiroidismosistmicaotirotoxicosisenuntejidoparticularpuedenserestudiadosatravsde
tejidoodeaislamientodeclulasdeanimalestratadosadecuadamente.
Comentario LahormonatiroideaesbienconocidoporinfluirenlatasametablicadelosorganismosintactosSin
embargo,ladistribucindelefectoentrelosdiversostejidosnoesttanbienentendido.Elhgadosehaestablecido
claramentecomounimportantemediadordelosefectosmetablicosdelahormonatiroideasobrelabasedeunaserie
deestudiosqueutilizanhepatocitosaisladosderatasconhipotiroidismoohipertiroidismo(inducida
experimentalmente612),revisadoporHarperyBrand(613).Elconsumodeoxgenodeloshepatocitosse
correlacionpositivamenteconelestadohormonaldelatiroidesdelosanimalesanlisisdelarespiracinindicaque
lafugadeprotonesmitocondrialbasaltambinsecorrelacionapositivamenteconelconsumodeoxgeno(614).Al
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mismotiempo,otrosmecanismoscelularesdifierenensurespuestaahipotiroidismoytirotoxicosis:hipotiroideosen
lasclulas,disminuyeelconsumodeoxgenonomitocondriales,mientrasqueenlasclulastirotoxicosisreacciones
queimplicanrotacindeATPseincrementan(613).Cabesealarquedebidoaqueloshepatocitossehicieron
hipotiroidismootirotxicainvivo(mientrastodavapartedeunhgadointactoenunanimaltratado
farmacolgicamente),estosefectossobrelarespiracinnopuedenserasumidasestardirectamenterelacionadocon
losefectosdeT3enhepatocitos,peropuedenincluirefectoshepticoscausados
porsegundosmensajerosderivados
defuentesextrahepticos,talescomoelsistemanerviososimptico(SNS).
Histricamente,elgastodeenergadelasclulasaisladassehacuantificadomidiendoelconsumodeoxgenousando
unelectrododeClarkoaparatosimilar(234).Alternativamente,elconsumodeoxgenoylaacidificacindelos
mediosdecomunicacinsepuedenmedirdeformanodestructivaen24oformatode96pocillosutilizando
instrumentosmodernosbasados
ensensoresdeestadoslidodefluorforo/pticas(Fig.17)(615,616).
FIG.17.
MedicindeO2consumoylatasadeacidificacindelmedioenlasclulas
cultivadas.AnlisisdeflujoextracelularserealizautilizandoanalizadoresXF
(SeahorseBioscience,Billerica,MA).Lasclulassecultivanenmonocapade
24oformatode96pocillos.Elconsumodeoxgeno...
55cRECOMENDACIN
Paraaislarlosefectosdirectosdelahormonatiroideaenelgastodeenergacelularylasvasmetablicasen
undeterminadotipodeclulas,invitroestudiosdebenrealizarseconeltratamientoconhormonatiroideade
lasclulascultivadas.
Comentario Estudiosenlosqueclulascultivadasestnexpuestosadiferentesconcentracionesdelashormonas
tiroideasenelmedioexcluyenlaposibilidaddesegundosmensajerosderivadosdeotrostejidos,yporlotantopuede
revelarefectos"directos"delahormonatiroideaenuntipodecluladado.Porejemplo,elanlisisdelaexpresin
gnicadeclulasdecarcinomahepatocelular(HepG2)expuestosaconcentracionesfarmacolgicasdeT3ha
demostradocambiosenlosgenesmetablicamenterelevantes(617).Alternativamente,cultivosdehepatocitos
primariosderatasoratonespuedenserutilizadosparaestosestudiosdebidoaquerepresentanexcelentesmodelosde
efectosdelashormonastiroideassobreelhgado(618,619).Adems,laactividadD3sehademostradoquese
correlacionainversamenteconelconsumodeoxgenoenlasclulascultivadas,sugiriendounefectodirectodelaT3
enelgastodeenerga(aunqueT3concentracionesnofueronmedidosenelcompartimientointracelular)(63).
55dRECOMENDACIN
EstudiosqueutilizanmitocondriasaisladassepuedenutilizarparainvestigarlosefectosdeT3sobrela
biologamitocondrial.
Comentario Losefectosdelasistmica,alteracinfarmacolgicadelestadotiroideoenratasenlasmitocondrias
hepticassehaninvestigadotrassuaislamientodelosanimalestratadosfugadeprotonesmitocondrialylacadena
respiratoriafueronidentificadoscomositiosimportantesdeT3decontrol(620,621).Mientrasquetalesestudios
presentanventajasenquelasmitocondriaspuedensidointerrogados,apartedeotrosmecanismoscelulares,el
fenotiporespiratorioesdiferentedelaobservadaenclulasaisladasporqueelcontextofisiolgicosepierdePor
ejemplo,elaumentodelasreaccionesqueconsumenATPinducidasportirotoxicosisnosevedadalafaltadevas
queconsumenATPextramitocondriales(613).
56aRECOMENDACIN
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Lacapacidadderespuestaagudaycrnicaalaexposicinalfro(4C5C)sepuedeutilizarparaestudiar
losefectostermognicosdelahormonatiroidea.
Comentario Defenderlatemperaturacentraldurantelaexposicinalfrodependedeunaseriedemecanismosde
adaptacinensumayorainiciadosporelSNS.Sinembargo,debidoamodificacionesenelsistemadetransduccin
desealesadrenrgico,animaleshipotiroideosrespondenmuchomenosalascatecolaminas,ylocontrarioseobserva
enanimalestirotoxicosis(622624).Porlotanto,roedoreshipotiroideospresentanhipotermiaprofundaysucumben
encuestindehorascuandoseexponealfro(4C5C)(625,626).Alas2horasdehabersidomovidoalfro
todoslosroedoresexhibenundescensotransitoriodelatemperaturarectal(alrededorde1C),peroserecuperana
losvaloresbasalesde4horasdeexposicinalfrocontinua(610).Enratasyratoneshipotiroideos,temperatura
rectalsiguedisminuyendo,yparaevitarlamuertedelosanimalesdelexperimentodebeserinterrumpidoen
temperaturasdelncleodealrededorde30C.
56bRECOMENDACIN
TermognesisBATestreguladapositivamenteporlahormonatiroideaypuedeserestudiadoenla
almohadillaBATinterescapular(IBAT)durantelainfusinconagonistasadrenrgicosenratasoratones.
Comentario BATesunsitioimportantedelatermognesisysehautilizadoampliamentecomounmodelopara
estudiarlasealizacindelahormonatiroideaysusinergiaconelSNS.LaproduccindecalorenelBATseinicia
porlaestimulacindelSNS.Porlotanto,laevaluacinfinaldelatermognesisBATdebeincluirlamedicindela
temperaturaBATenrespuestaalaestimulacinadrenrgica.Estosepuedeobtenermediantelamedicindela
respuestatrmicadeIBATalaestimulacinconunagonistaadrenrgico(porejemplo,norepinefrina)deunamanera
dosisydependientedeltiempo(627).Laconfiguracinincluyelacolocacinquirrgicadeunpequeotermistor
bajolaIBAT(Fig.18).Debidoaltamaocorporalpequeo,losratonesdebenmantenerseenunacamatrmica
ajustadoa30Centodomomento(311).Lasvenasyugularesofemoralessecanularonyconectadoaunabomba
yseutilizancomopuertosparalainfusindelfrmaco.Unsegundotermistordebeserinsertadoenelrectopara
controlarlatemperaturadelncleo.respuestatrmicaIbatpuedeobservarapocosminutosdeliniciodelainfusin.
ElaumentodelatemperaturadeIBATesnormalmentede1C2Cenlaprimerahora,ypuedealcanzarhasta4
C,dependiendodesilosanimalessealimentaronpreviamenteunadietaaltaengrasaocrnicamenteexpuestosalfro
(593).Latemperaturacentraldebeaumentarmenosmarcadayenlosltimostiemposcomounaindicacindeque
elMTDseestcalentandoelcuerpoynoalrevs.Estaconfiguracinpermitelaevaluacindirectadelosefectosde
lahormonatiroideaenelMTD,sinpasarporlosefectosindirectos.Porejemplo,elhipotiroidismoIBATesslo
mnimamentesensibleaunainfusinconnorepinefrina(627,629).
FIG.18.
Estudiodeladeltejidoadiposomarrn(IBAT)interescapularrespuesta
trmicaalanorepinefrina(NE)deinfusin.(A,B)Unarata(oratn)es
anestesiado,ylaalmohadilladeIBATseexponeatravsdeunaincisin
quirrgica.UntermistorsecolocadebajodelaalmohadilladeIBATy
asegurado...
57aRECOMENDACIN
Estudiosdelosefectosmetablicosdelahormonatiroideapuedennecesitarserrealizadobajocondicionesde
termoneutralidadesdecir,latemperaturaambientealaquelatemperaturacentralesmantenidaporla
termognesisobligatoria(termognesisproducidaporlosanimalesensutasametablicabasal).
Comentario Temperaturaambiente(21C)esunestrstrmicosignificativoparapequeosroedores,especialmente
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losratones.Porlotanto,inclusoenlosanimalesaclimatadosatemperaturaambiente,losefectosmetablicosdela
hormonatiroideaestninfluenciadosporunsinergismosignificativaconlaactividadsimptica.Laaclimatacina30
Cminimizalaactividadsimpticayporlotantolainterferenciaenelmetabolismo.Efectosmssimpticosobreel
metabolismosereducenalmnimodentrodelasprimeras2448horasdeaclimatacina30C(232).Sinembargo,
puedetardarhastavariassemanasparauncierresimpticocompletaabajoylosinvestigadorespuedendeber
determinarexperimentalmenteenfuncindelosparmetrosaestudiar(232,608).Estoesparticularmente
importantesilosestudiosimplicananimaleshipotiroideosotirotoxicosisdadoquelaactividaddelSNSse
correlacionainversamenteconelestadodeltiroides(630,631)seincrementduranteelhipotiroidismoy
minimizadodurantetirotoxicosis(632,633).
57bRECOMENDACIN
Elusodelaobesidadinducidaporladietacomounmodeloparaestudiarelefectotermognicodelahormona
tiroideadebetenerencuentalatiroidesadicionallasvariablesdependientesdehormonasporejemplo,la
secrecindehormonadecrecimientoyelcrecimientolineal,elapetito,laactividadsimpticaylatemperatura
ambiente.
Comentario BATestambinunsitioprincipaldelatermognesisinducidaporladietaenpequeosroedores,que
puedeseractivadoporlaalimentacinconunadietaaltaengrasa(634).Sinembargo,encontradelatermognesis
inducidaporfro,elpapeldesempeadoporlahormonatiroideaenlatermognesisinducidaporladietaesmenos
clara.Ratasoratoneshipotiroideosnosonobesoscuandosemantienenenunadietadepienso(211,593),pero
cuandosecolocanenunadietaaltaengrasas,larespuestaesdiferenteentrelasratasylosratonesydependedela
temperaturadelmedioambiente(211,593).Atemperaturaambiente,lasratasconhipotiroidismocolocadosenuna
dietaaltaengrasassevuelventanobesoscomoratascontroleutiroideos(593),mientrasquelosratonesestn
protegidoscontralaobesidadinducidaporladieta(211).Sloentermoneutralidadhacenlosratonescon
hipotiroidismosevuelvenobesoscuandosecolocaenunadietaaltaengrasa(211).Paraestostiposdeestudios,se
prefierendietasdisponiblescomercialmenteparalaconsistenciaypuedencontenerde20%a50%degrasa.Tales
dietascontienenaproximadamente4,73 kcal/genlaque45%delaenergasederivadelagrasaysepuede
compararconlasrespuestasenratonesalimentadosconunadietaestndarqueconstade3,85 kcal/genlaque10%
delaenergasederivadelagrasa(608).Engeneral,losanimalesestnexpuestosadiferentesregmenesdietticos
duranteperodosquevaranentre30y60das.
RECOMENDACIN58
Tiroidesprocesosmetablicosdependientesdehormonaseneltejidoadiposopuedenserinvestigadosen
preparacionesdetejidos,enlosadipocitosblancosomarronesrecinaisladas,yenlosadipocitosblancoso
marronesdiferenciadosinvitro.
Comentario Elanlisisestructuralobioqumicadelasalmohadillasdegrasaenratonesoratasconhipotiroidismoo
tirotoxicosisconstituyeunenfoquebsicoparaestudiarlosefectosdelahormonatiroideaeneltejidoadiposo.La
hormonatiroideaafectaelpesodelosdepsitosdelaalmohadilladegrasaespecficos(porejemplo,epiddimo,
inguinal,yinterescapular)(635),quesiempredebeserexpresadocomounafuncindelpesocorporaltotalola
longitudfemoral(464).Lipognesisesestimuladaporlahormonatiroideaenlostejidosadiposoblancoymarrn(
237,268,637).Almismotiempo,lahormonatiroideatambinpromuevelaliplisismediantelaamplificacindela
vadesealizacinadrenrgica.Elsaldonetodeestasvasantagnicasesunareduccindelaadiposidad,
alcanzando~50%en6das(600).Aunqueunointuitivamenteespeculanqueenlosanimaleshipotiroideosdebe
haberunaumentodelaadiposidad,lagrasacorporalenratasconhipotiroidismonoseveafectado(593),mientras
queseredujoenratoneshipotiroideos(211).
EneltejidoadiposoyBAThormonatiroideablancoestimulalalipognesisylaliplisissloenBAThaceT3
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estimularlatermognesis.UCP1laexpresingnica(ARNmyprotena)eselmarcadorcrticoparalatermognesis
BAT,yesmuysensiblealahormonatiroidea(267,269,592,638).Existenotrasvassensiblesalashormonas
tiroideaseneltejidoadiposoquesepuedeevaluarmidiendolaVmaxdeenzimasdeltipodelimitacinclave(268,
269,640).LosejemplosincluyenlosensayosdeactividaddelaacetilCoAcarboxilasamedianteunensayode
NADHacoplada(237),malonilCoAdescarboxilasaactividadutilizandounensayodeacetiltransferasaligado
carnitina(641),ylaactividaddeGPDenpreparacionesmitocondriasusandounaLglicerofosfatocomo
sustrato(464),aunquelosinvestigadoresdebenserconscientesdequelaactividaddeGPDpuedenoser
dependientedelahormonatiroideaentodaslasespeciesdemamferos.Lipognesisesparticularmentesensibleala
hormonatiroideaysepuedeevaluarmediantelamedicindenovolasntesisdecidosgrasosenlosdepsitosdela
almohadilladegrasadespusdelainyeccinintraperitonealointravenosade3H2Oseguidodeextraccinde
lpidosendiferentespuntosdetiempo(600,642).
Adipocitosblancosomarronesaisladospreparadosapartirdeladigestinconcolagenasadealmohadillasdegrasa
especficospuedenestudiarseensuspensinduranteslounashoras,yaquelasincubacionesprolongadassonpoco
estables(237,622,643).Unaventajadeesteenfoqueesqueelmetabolismocelularpuedeserestudiadoen
condicionesdefinidasdeladisponibilidaddesustratoporejemplo,/altodeglucosabaja,cidosgrasos,ycarnitina(
644).Losresultadosobtenidosreflejanelestadodeestasclulasinmediatamenteantesdesercosechadas.Vas
metablicasespecficassepuedenestudiarmidiendolaVmaxdelasenzimaslimitantesdelavelocidadclavebajo
condicionesbasalesyenrespuestaalosagentesdeprovocacincomolanoradrenalina,laforskolina(activadordela
adenilatociclasa),dibutirilAMPc(unanlogodecAMPfosfodiesterasaresistente),terbutalina(2selectivoagonista
adrenrgico),ydobutamina(1selectivoagonistaadrenrgico)(464).Ejemplosincluyenlamedicindelatasade
gastodeenerga(VO2),lipognesis,lipolisis,obetaoxidacin,todaslasvassensiblesalashormonastiroideas(
237).Lipognesistambinpuedeestudiarsedespusdeunimpulsocon3H2Oyextraccindelpidos(237).La
liplisistambinseestudiamidiendolaliberacindeglicerolcatecolaminasestimulada(645647).
Adipocitosaisladoshanlimitadoinvitrolacapacidadderespuestaalahormonatiroidea(237,648,649).En
contraste,loscultivosprimariosdeadipocitosblancosomarronessonsensiblesalahormonatiroideayporlotanto
constituyenunaalternativaventajosasistema(69,651).Obviamentecultivosprimariosdeadipocitosnoreflejarel
estadometablicodeunanimal,perotienenlaventajadegenerarclulasquesonestablesyporlotantoadecuado
paraexperimentosprolongados.Adipocitosmadurosseobtienendespusdepreadipocitosblancosomarronesson
empujadosinvitrohacialadiferenciacinporlaexposicinadiferentescctelesyestrategiasduranteunperodode8
a12das(652).Lneasdepreadipocitosblancosomarronestambinsehanestablecidoyutilizadoconxito(653
).
59aRECOMENDACIN
Lainduccinsimultneadelalipognesisylaoxidacindecidosgrasossonimportantesefectosdela
hormonatiroideaenelhgado.Elestudiodelaexpresindelasenzimaslimitantesdelavelocidadclave,as
comolaestimacindelastasasdeambosdeestosprocesosenmodelosanimalesycelularessepuedeutilizar
paramedirlaextensindelasealizacindelahormonatiroideaenelhgado.
Comentario ConlasegundadensidadmsaltadeTRenelcuerpo,elhgadoesmuysensiblealahormonatiroidea(
654).Dieciochoprotenassensiblesahormonastiroideasseidentificaronhacevariosaosenelanlisisdeunensayo
detraslacindemRNAhepticodeeutiroideoyhipotiroideo(655).Aligualqueconeltejidograso,lahormona
tiroideaestimulalalipognesisenelhgadomediantelaactivacindelaexpresindelasenzimasclaveimplicadasen
lasntesisdecidosgrasos(596),talescomolaenzimamlica(656),glucosa6Pdeshidrogenasa(ambasenzimas
generarNADPH),lasintasadecidosgrasos,ylaacetilCoAcarboxilasa(657659).Almismotiempo,lahormona
tiroideaacelerarpidamentelaoxidacindecidosgrasosenelhgado(660).Hayunareduccinde
aproximadamentecincovecesenlaoxidacindecidosgrasosenloshepatocitosaisladosderatashipotiroideos.En
contraste,laadministracindelahormonatiroideaarataseutiroideosaceleralatasadeoxidacindecidosgrasos(
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661).EstoexplicaenpartelareduccindeRQvistodurantelatransicinentreelhipotiroidismoyelhipertiroidismo
(599).Sinembargo,elresultadonetodelaaccindelahormonatiroideaentriglicridosdelhgadotiendeaser
neutrodadoslosefectoscombinadossobrelaliplisis,lipognesis,ylaoxidacindecidosgrasos(211).
59bRECOMENDACIN
Losnivelesdecolesterolensueroycontenidodecolesteroldelhgadopuedenusarsecomomarcadores
biolgicosdelosefectosmetablicosdelahormonatiroideaenelhgado.
Comentario Ratasconhipotiroidismosuelenteneraltoelcolesterolplasmticocontriglicridosnormales,reducidoo
ligeramenteelevadas(662a665).Lahipercolesterolemiaescausadaengranparteporunaumentoenla
concentracindecolesterolenlipoprotenasdebajadensidad(LDL)queresultadeladisminucindecatabolismo
mediadoporreceptordelalipoprotena,principalmenteenelhgado.Estoseintensificaporlaalimentacindelos
roedoresconunadietaaltaencolesterol.Unmodeloampliamenteutilizadoeslaalimentacindeunadietaaltaen
grasa,talescomo10%deaceitedemazquecontiene2%decolesterol(dietadecolesterol)o10%deaceitedemaz,
2%decolesterol,ycidoclico0,5%(dietacidoclico).Ratasconhipotiroidismomantienenentalesdietas
exhibicinmarcadahipercolesterolemia(665)ylasecrecinhepticadesteresdecolesterolyapoErica
lipoprotenasdemuybajadensidadyelcolesterolLDL(666,667).Encontraste,lasratastirotxicoshanreducido
losnivelesdecolesterolenasociacinconlareduccindevolumendenegociosLDL.Laadministracindela
hormonatiroideaafectaelmetabolismodelcolesteroltanprontocomo1semanadespusdeltratamiento(668).Esto
hafomentadounconsiderableintersenelpotencialdeanlogosdelahormonatiroideaeneltratamientode
trastornoshiperlipidmicos(310,315,669,670).
[J.4]Elmsculoesqueltico
Fondo Laspropiedadescontrctilesymetablicasdelosmsculosesquelticosestndeterminadasporlas
propiedadesdelosdiferentestiposdefibrasquecomponenelmsculo.Gruposdefibrasinervadasporunasola
neuronamotorformanunaunidaddemotor.Eltipodeinervacinylahormonatiroideasonlosprincipales
moduladoresdelfenotipodelasfibrasmusculares,tantoduranteeldesarrolloyeneladulto(671).Lainteraccin
dinmicaentreestosmoduladores,juntoconelorigendeldesarrollodelasfibras,losresultadosendiversosfenotipos
quevandesdelacontraccinlenta,fibrasoxidativas(TipoI)decontraccinrpida,fibrasglicolticas(tipoIIb)(671
).LasfibrasmuscularesesquelticasseidentificantpicamenteporelprincipaltipodeMHCqueseexpresaesdecir,
MHCI,IIa,IIx/d,yIIb(tengaencuentaqueMHCIesidnticaaMHCcardaco,peroquelasotrasisoformas
MHCnoseexpresanenelcorazn).Estasisoformashanaumentandolastasasderotacincatalticos,conMHCIIb
siendocincovecesmsrpidoqueelMHCI,ydeterminarengranmedidaelritmodecontraccin.Mltiples
isoformastambinexistenparaotrasprotenasclavequeconformanlafibramuscular,talescomolascadenasligeras
delamiosina(MLC)yelretculosarcoplsmico/endoplasmticoCa2+ATPasasSERCA2a(Atp2A2)y
SERCA1a(Atp2A1).EstasisoformasSERCAsonresponsablesdelarecaptacindecitoslicadeCa2+,la
determinacindeltipoderelajacin,yporlogeneralseasocianconlenta(SERCA2a)ofibrasrpidas(SERCA1a)(
672).Apartedelasobviasdiferenciasenladensidadmitocondrialentreprincipalmenteoxidativoyfibras
glucolticas,marcadasdiferenciascualitativastambinexistenenlacomposicinylafuncindelasmitocondriasen
estasfibras(673).
Lacomposicinenfibrasdediferentesmsculosenelcuerpovaraconsiderablemente,haciendocoincidirsustareas
especficas.Desarrollodelascaractersticaslentasdependedelainervacindelasneuronasmotoraslentas,mientras
queeldesarrollodecaractersticasrpidasesmuchomenosdependientedelaentradadelosnervios(674).La
expresindelfenotiporpidoes,sinembargo,coreguladaporlahormonatiroidea(671,674).Porejemplo,la
expresinpostnataldeSERCA1aescompletamentedependientedelahormonatiroidea(675,676)ylatransicin
defetoaadultosisoformasrpidasMHCseretrasaenelhipotiroidismo(677679).Enelanimaladultoesta
capacidadderespuestademsculosrpidosdisminuyeengranmedida,encontrasteconralentizarmsculos,queson
altamentesensiblesacambiosenelestadodelatiroides.Larazndeestoesque,engeneral,lahormonatiroidease
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oponeelefectodetipolentoinervacinesdecir,queestimulalaexpresindelascaractersticasrpidas,mientrasque
suprimecaractersticaslento,yaumentalacapacidadglobaldegeneracindeATPdelmsculo.Lasfibras
muscularesrpidassonenergticamentemenoseficienteyelaumentodelainducidaporlahormonatiroidea
velocidadseasociaconunamayorrotacindeenergayproduccindecalorconcomitante.Debidoalamasatotal
delmsculoesqueltico,estosefectosdelahormonatiroideatienenunimpactosobreelmetabolismodesustratode
todoelcuerpoylatermognesis(671).
Labasedelaplasticidadmusculareslaregulacinbastantecoordinadadelaexpresindelosgenesqueregulanlas
propiedadescontrctilesymetabolismodelaenergaenrespuestaaloscambiosenlassealesexternas,comoeluso
oestadodelatiroides.Aunquelosefectosglobalesdelahormonatiroideasobrelafisiologadelmsculoson
relativamentesencillos,losefectossobrelaexpresingnicaaniveldelasfibrasmuscularesindividualesson
complejasypuedenserdiametralmenteopuestas,dependiendodelcontexto(676,680).Porejemplo,laexpresin
deMHCIIaestfuertementeestimuladoporlahormonatiroideaenlosmsculospredominantementelentos,pero
igualmentefuertementereprimidaenlosmsculosrpidamente(674,680).Adems,laexpresindeambos
SERCA1aySERCA2aesttranscripcionalmenteestimuladaporT3.Sinembargo,entirotxicamsculolentola
expresindeSERCA2aseapagaenlamayoradelasfibrasysesustituyeporSERCA1a(676),peroalmismo
tiemposoncoexpresadoenaltosnivelesenotrasfibras.Estoreflejaprincipalmentelasdiferenciassutilesenlas
distintasunidadesmotorasquecomponenelmsculo.Enconsecuencia,elanlisisdemsculoenterodelaexpresin
gnicanopuedeproporcionarunaimagenprecisadelosefectosdelahormonatiroidea,sobretodocuandosetrabaja
conlosmsculosdeltipodefibramixtos.Portanto,estosestudiosdeberanincluiranlisisdeseccionesdetejidopara
determinarlosefectosenfibrasindividuales.
Enlosmamferosmsgrandes,todoslosmsculosesquelticoscontienenunamezclavariabledefibrasrpidasy
lentas.Sinembargo,enlosroedoresalgunosmsculosdelasextremidadestraserassecomponenprincipalmentede
tipoIydetipolentointermediosfibrasIIA,comoelsleodecontraccinlenta(SOL)muscular,oescribirrpidoIIB
fibras,talescomoeldecontraccinrpidaextensordigitorumlongus(EDL)muscular(681,682).Por
consiguiente,estosmsculosseutilizanamenudocomomodelosparaestudiarlosefectosdelahormonatiroideaen
laspropiedadesmusculareslentasyrpidas.
RECOMENDACIN60
Losefectosdelahormonatiroideaenelmetabolismoycontrctilespropiedadesenergticasdelmsculo
puedenserevaluadosporelanlisisdelospreparativosdelasextremidadestraserasperfundidos.
Comentario EnelmodelodemsculobombadeperfundidounasolaextremidadposteriordelarataseperfundiTras
elcateterismodelaarteriafemoralylavena(683).Lacontraccindeungrupodemsculosodeunsolomsculo
seactivayaseaporestimulacindelnervioqueinervaomedianteelusodeelectrodoscolocadosenelmsculo.
ParmetrosdecontraccinseregistranusandountransductordefuerzaconectadaaltendndeAquiles.Controldela
velocidadylacomposicindelmediodeperfusinpermitelamanipulacindesustratoyelsuministrodeoxgeno.
Anlisisdelaperfusinvenosaproduceinformacinsobrelarespuestametablicadurantediferentesprotocolosde
estmuloypermiteelclculodelaeficienciadecontraccin.Distribucindelflujosanguneoatravsdelosdiversos
msculosperfundidossepuededeterminarusandomicroesferasradiomarcadas,ylosanlisishistoqumicosy
bioqumicospuedencomplementarlosanlisisdelafuncindelmsculo(684).Aunquehayalgunaslimitaciones,
enparticularlaausenciadeunaregulacinvasomotoranormal(683),estemodeloquemejorseaproximaalainvivo
situacindelosmsculosesquelticosactivosysehautilizadoparaestudiarlasconsecuenciasfuncionalesy
metablicasdetirotoxicosis(685)yelhipotiroidismo(684,686).Estametodologahastaahoranohasidodescrita
pormodelosderatn.
RECOMENDACIN61
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Lainteraccinentrelahormonadelatiroidesylaactividadneuromuscularenlaregulacindelas
propiedadesdelmsculopuedeserestudiadainvivoporlaestimulacinelctricadirectadelosmsculos.
Comentario DecontraccinlentamsculoscomoelmsculoSOLsuelenseractivadoporlasneuronasmotoras
generandolargostrenesdeimpulsosdebajafrecuencia,mientrasquelosmsculosdecontraccinrpidaseactivan
deformaintermitenteporbrevesrfagasdeimpulsosdealtafrecuencia.Losefectoscontrapuestosdelahormona
tiroideaydetipolentoinervacinsobrelaexpresingnicadelmsculo(674)sepuedenestudiarmediantela
imposicindeunpatrndeestimulacindebajafrecuenciacrnicaencontraccinrpidamsculosdelas
extremidadestraseras.Enestemodelo,elnervioperoneodelaextremidadposteriorseestimulacontinuamenteinvivo
a10 Hzparaunmximode20dasatravsdeelectrodosimplantados.Laexpresindegenesyeltipodefibra
composicindecontraccinrpidatibialanteriorylosmsculosEDLdelaextremidadposteriorestimuladoy
contralateralpuedensercomparados.Estemtodohasidoutilizadoparaevaluarlosefectoscombinadosdela
hormonatiroideaydetipolentoinervacinenlaexpresindefactoresmiognicasreguladoras(687)ylasisoformas
deMHC(688).
RECOMENDACIN62
Losefectosdelahormonatiroideaenlaspropiedadescontrctilespuedenserevaluadosporexvivoanlisisde
losmsculosintactosyfibrasmuscularesaisladas.
Comentario Elanlisisdetalladodelaspropiedadescontrctilesderatayratnmsculosesquelticosrequiereexvivo
anlisis.ElmsculodecontraccinlentaSOLtpicamentesehautilizadoenestudiosqueimplicanlahormona
tiroidea(689692)debidoalamayorcapacidadderespuestaencomparacinconeldecontraccinrpidaEDL(
693).Aunquelaspropiedadescontrctilessepuedengrabarconelmsculoizquierdainsitu,elanlisisdemsculos
aisladosenunacmaradeestimulacinpermiteunamayorflexibilidadexperimental(690).LosmsculosEDLy
Solsonrelativamentedelgadasysuperfusionproporcionasuministrosuficientedeoxgenoysustratos,aunquelas
temperaturasreducidas(21C30C)puedesernecesariaparaprevenirlahipoxiadurantelaestimulacin
prolongada.Msculoscontralateralessemantienenenmediodesuperfusinoxigenadaparaservircomocontrolesen
losanlisisbioqumicossubsiguientes.Losparmetrostpicosanalizadosincluyencontraccinylarespuesta
contrctiltetnica,relacionesfuerzafrecuencia,lapotenciacinpostrestodeldesarrollodelafuerza,ylasrespuestas
derecuperacindelafatiga.Equiposysoftwarededicadoyaestdisponibleparaestetipodeanlisis(694).
Aunquetcnicamentedifcil,lasfibrasmuscularesindividualespuedenaislarsedelosmsculosesquelticostales
comoelSOLylosmsculosEDL(692,695)yeldiafragma(696).Enesteltimo,lahormonatiroideatambin
induceuncambioenelfenotipodetipofibradelentaarpida(697)yexvivoanlisisdelaspropiedadescontrctiles
deestemsculorequierefibrasindividualesohacesdefibras(698).Fibrasaisladassonqumicamentepiely
montadosentreuntransductordefuerzayunmotor,loquepermitelamedicindelascontraccionesisomtricase
isotnicas.Lacontraccinolarelajacinseconsigueporinmersindelasfibrasensolucionesquecontienen
concentracionesaltasobajasdecalcio,respectivamente.Anlisisdeunasolafibraposteriordelacomposicinde
protenascontrctilespermiteunaevaluacindetalladadelosefectosdelahormonatiroideaenelfenotipodelafibra
ylaspropiedadescontrctiles(692).
RECOMENDACIN63
Larespuestadeltejidodelmsculoesquelticoalahormonatiroideasepuedeevaluarmedianteelanlisisde
ensayosdeexpresindegenesyenzimas.
Comentario AnlisisdelaexpresingnicamuscularserealizaporRTqPCR(92,699,700)(verlaSeccinI.2,
Recomendacin35paraconsideracionestcnicas)ymedianteelanlisisdelosnivelesdeprotenautilizando
electroforesisengeldepoliacrilamida,seguidoporcuantificacindebandasteidasoWesternblotensucaso.Las
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isoformasdeMHC,ascomolasisoformasdeMLC,sepuedensepararporelectroforesisengeldealtaresolucin.
Latincinconplatayanlisisdensitomtricoposteriorpermiteladeterminacinprecisadelosnivelesdeexpresin
relativosdelosdiferentesisoformasenmuestrastanpequeascomofibrasindividuales(679,692,699,701,702).
LosanticuerposparaelanlisisdeWesternestndisponiblesparaungrannmerodeprotenasdelmsculo
esquelticocodificadasporgenesqueestndirectamenteoindirectamentereguladaporlahormonatiroidea,
incluyendoMyoD,miogenina,isoformasdeMHC,SERCA1a,SERCA2a,mioglobina,PGC1,RYR,yNa+K+
ATPasasubunidades(92,691,701,703,704).
Elretculosarcoplsmico(SR)esresponsabledehastaun50%delconsumodeenergaenelmsculoactivo.El
efectodelahormonatiroideaenestaactividadATPasapuedeserevaluadaespectrofotomtricamenteen
homogeneizadosdemsculosenterosofibrasindividuales(701,705).FragmentosdemembranadeRSen
homogeneizadosmuscularesvuelvenasellarenvesculasqueconservanlacapacidaddeabsorberyalmacenarCa2+
.Usodecondicionesdeensayoqueestimulanselectivamenteestacapacidad,esposibledeterminarelCaATPasa
junto2+tasaabsorcinymximoCa2+capacidadAlmacenamiento(675,704,705).Elltimoproporcionauna
estimacindelgradodeproliferacindelaredmembranaSR,queesenpartedependientedelestadodelatiroides.
LosCa2+ATPasayCa2+absorcinensayosdeterminanlasactividadestotalesdeSERCA,peronopermitenla
discriminacinentrelosSERCA1aySERCA2aisoformas.
Ensayosestndarseutilizanparadeterminarlasactividadesdelasenzimasimplicadasenelmetabolismodeenerga
aerbicayanaerbica,talescomoelcitocromocoxidasa,citratosintasa,succinatodeshidrogenasa,lactato
deshidrogenasa,ylacreatinaquinasa(675,703).Lasmitocondriassepuedenaislarporcentrifugacindiferencial
paralamedicindelafrecuenciarespiratoria,elpotencialdemembranayotrosensayosenzimticos(706,707).
RECOMENDACIN64
Evaluacindelosefectosdelahormonatiroideasobrelacomposicindeltipodefibrademsculoesqueltico
requiereunanlisishistoqumicodeseccionesdetejido.
Comentario TiposdefibrasmuscularesesquelticassedistinguenprincipalmentesobrelabasedelaisoformadeMHC
expresadoesdecir,ellentoMHCIyrpidoMHCIIa,IIx/d,oIIbisoformas.Losanticuerposdiscriminarentre
estasisoformassehandescrito(708)yaunquealgunosserecomiendaprecaucincuandoseutilizaanticuerpos
comercialesactualmentedisponibles(709),elanlisisdeinmunofluorescenciamulticolorsehadescritoparala
evaluacinsimultneadelaexpresindetodaslasisoformasdeMHCenlaratayelmsculoesquelticoderatn
usandoestosanticuerpos(710).Mstpicamente,unmtodohistoqumicoparalaexpresindelaATPasa
miofibrilaresampliamenteutilizadoquedistingueentreIfibrastipoI(MHCI),fibrastipoIIB(MHCIIb),yfibras
intermedias(MHCIIa,MHCIIx/d)(684,692,700,702,711).Losmsculossesujetanensuaproximadainsitu
longitudysecongelaronenNlquido2cooledfrenoisopentano.Seriedecryosectionssecortandespusdevarios
anlisishistoqumicos.Cabesealarquenotodaslasfibrasseextiendennecesariamentelalongituddelmsculo.Este
esporejemploelcasoenelmsculoSOL,quedebeserseccionadopreferentementeenelpuntomotorparaincluir
todaslasfibras(682,702).
AnlisisadicionalesdepreocupacinlaexpresingnicadefibraespecficalaexpresinyactividaddelaSRCa2+
ATPasaenzimas.CrioseccionesenseriesepuedenutilizarparacorrelacionarlatipificacinfibraabasedeMHCcon
inmunohistoqumicadeSERCA1aySERCA2a(676,682),ascomoconmRNAsisoformaespecficainsitude
hibridacin(676).DiferenciasdefibraespecficaenSRtotaldeCa2+ATPasaactividadtambinsepueden
determinarhistoqumicamente(676).Losefectosdeltratamientodelatiroidesdelahormonasobrecaractersticasde
lafibrasondinmicosy,enalgunoscasos,sontransitoriosduranteunperododevariosdas(676).Estodebe
tenerseencuentaalestudiarlosanimalestratadosdurantemenosde14das.
RECOMENDACIN65
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Loscultivosprimariosdeclulasdemsculoesqueltico,ascomodiversaslneascelularespuedenser
utilizadosparaestudiarlaexpresindegendelahormonadelatiroidesreguladoysuinteraccinconla
actividadcontrctil.
Comentario Loscultivosprimariosdemioblastosdemsculosepuedeobtenerderataoderatnmsculos
esquelticosneonatales(92,712715).Dependiendodelacomposicindelmediodecultivo,losmioblastosse
puedenmantenerenunestadoproliferativo,opuedenserinducidasafundirseyformarmiotuboscontratantes
espontneamente.Lainteraccindehormonastiroideasylaactividadcontrctilenlaspropiedadesdemiotubos
puedeserestudiadoporlascontraccionesqueinhiben(715)oporestimulacinelctricadirectadelosmiotubosen
cultivo(712).Aunqueloscultivosprimariosproporcionanunmodeloverstilparaestudiardiferentesaspectosdela
regulacindegenesmsculo,debetenerseencuentaquemiotubosnosedesarrollancompletamentecaractersticas
fenotpicasadultos.
ElC2C12deratn(704,716718)ylaL6derata(704,717,719721)laslneascelularesdemioblastosse
utilizancomoalternativasdecultivosprimariosenlosestudiosdelaaccindelahormonadelatiroides.Lastcnicas
estndarparalatransfeccindeclulaspuedenutilizarseparaanalizarlaregulacindelaexpresingnica(vasela
SeccinI.4).LossubclonesdelalneacelularL6conpropiedadesligeramentediferenteshansidoaisladospor
variosgrupos(704,721).Enparticular,elL6AMsubcln(721)muestraunamayorrespuestaalahormona
tiroideaencomparacinconlalneacelularoriginalL6.Similaracultivosprimarios,cultivosdemioblastos
confluentesdeambaslneascelularespuedenserinducidasaformarmiotubos,perosloC2C12miotubospuedenser
inducidasacontratarporlaestimulacinelctrica.SehandesarrolladomtodosparaestimularmiotubosC2C12
crnicaointermitenteduranteunmximode4dasutilizandoelectrodosdeestmulointegradosenplacasdecultivo
estndar(718,723).Estatcnicapermiteunanlisismsdetalladodelainteraccinentrelahormonadelatiroides
ylaactividadcontrctilenlaexpresingnicadelmsculo(718).
[J.5]Esqueleto
Fondo Laresistenciaseaenadultosestdeterminadaporlaadquisicindelamasaseaymineralduranteel
crecimientoylaposteriortasadeprdidaseadurantelaedadadulta.Estadoeutiroideonormalesesencialparael
desarrollodelesqueleto,elcrecimientoylamineralizacinyesunfactordeterminantedelamasaseamxima.T3
tambinregulalaremodelacinseaenlosadultos,ylacondicindelatiroidesesundeterminanteimportantedela
tasadeprdidasea(724).Elhipotiroidismoprovocaunestadodedisminucindelrecambioseo,quesise
prolongapuededarlugaralaacumulacindemasaseaymineral.Porelcontrario,tirotoxicosisaceleraelrecambio
seoylaprdidaresultanteenlaosteoporosis.
RECOMENDACIN66
Efectoshormonastiroideassobreelcrecimientolinealpostnatalylamaduracinseasedeterminanmejorex
vivomedianteelusodemuestrasdelosanimalesrecolectadosenedadesdefinidas.
Comentario Losratonesdebensergenotipoeidentificadosaedadespostnatalesjvenesmientrasquepreservasucola
demaneraquelavelocidaddecrecimientolinealpuededeterminarsepormedicinsemanaldelongituddelacola
entrepostnataldaP7aP70.LavelocidadmximadecrecimientoseproduceentreP14yP42enratones,yla
comparacindelascurvasdecrecimientoproporcionaunaindicacinprecisaderetrasoeneldesarrollo.RatonesP1
neonatalesylasextremidadesdelosanimalesdeedadescomprendidasentreP21yP42debenteirsederojode
alizarina(hueso)yazulalcin(cartlago)parainvestigareldesarrollodelesqueletointrauterinoyelprogresodela
formacinseaposnatal.reasdemedicindelasdimensionesdelcrneo,lasfontanelasysuturasproporcionanuna
evaluacindelaosificacinmembranosamedidasdelongitudyelcrecimientoseoplacahistomorfometrason
indicadoresprecisosysensiblesdelaprogresindelaosificacinendocondral(725731).
RECOMENDACIN67
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Larespuestaestructuralylamineralizacindelhuesoadultoaalteracionesenelestadodelatiroidesola
interrupcindelaaccindelahormonatiroideasepuedeevaluarusandolastcnicasdeimagen
complementariosadiferentesnivelesderesolucin.
Comentario Anlisisdelesqueletoenratonesrequierelarecoleccindemuestrasdehuesoexvivo.Noesposible
determinarconprecisinlosparmetrosestructuralesinvivodebidoalasmodalidadesdeimagennotienensuficiente
resolucinparadiscriminarcaractersticasdehuesotrabecularconprecisinymuchomsinformacinsepuede
obtenerdeexvivomuestrasutilizandoenfoquesymtodoscomplementarios(Fig.19).Contenidomineraldelhueso,
lalongituddelhueso,yhuesocorticalmedicionessedeterminanenloshuesoslargosyvrtebrasdelosadultosde
edadescomprendidas12semanasenadelanteporFaxitronpuntodeproyeccindigitalmicrorradiografaderayosX(
725).Lamicroarquitecturaseaylosparmetrosvolumtricosdeformacindeimgenesrequierensofisticadosy
puedenserobtenidosporaltaresolucinmicroCT(hastaunaresolucinmximanominalde0,52 micras).Los
volmenesdehuesocorticalytrabecularcomoproporcionesdevolumendetejido,elespesortrabecular,separacin
trabecular,yelnmerotrabecularsepuedendeterminar.Talesparmetrosenelratnestnenloslmitesde
resolucinespacialpormicroCT.Elanlisisdetalladodelamicroarquitecturaseayladensidaddemicro
mineralizacinpuedeseranalizadousandoespecialistavolverelectrnmicroscopaelectrnicadebarridodispersa
(BSESEM)tcnicas(725727,729731).Losefectosdelestadotiroideoalteradolosparmetrosdecrecimiento
linealyhuesoestructuralsonsignificativosydeterminarfcilmenteelusodeestosmtodos,aunqueserequieren
equiposespecializadosydeanlisisdedatosmtodos.
FIG.19.
Esquemaparalarecogidademuestrasdehueso,lafijacindeltejido,y
mtodosdeanlisis.Elusodeestegrficosepuedemaximizarlainformacin
obtenidafenotipodelosratonesjuvenilesyadultos.qBSESEM,
retrodispersadadeelectronesmicroscopadebarridodeelectrones
cuantitativa....
RECOMENDACIN68
Latiroidescambiosinducidosporlashormonasenlaestructuraseaylamineralizacinsereflejanpor
anormalidadesfuncionales,quepuedenserinvestigadospordeterminacindelaspropiedadesbiomecnicas
bajocarga.
Comentario Lafuerzadehuesosedeterminautilizandoelequipodecargamecnicaadecuada(Fig.20).Ensayosde
flexindetrespuntosdestructivasserealizanenloshuesoslargosdelosratonesadultosparadeterminarlasvariables
biomecnicasdelhuesocorticaldelascurvasdedesplazamientodecarga,incluyendolarigidez,lacargamxima,la
cargadelafractura,ylasenergasdisipadasamximacargayfractura.Resistenciaalacompresindelhueso
trabecularsepuededeterminardemanerasimilarenlasvrtebras.Medicionesdereadeseccintransversalse
obtienenapartirFaxitronymicroCTyutilizandatosconlosdatosbiomecnicosparacalculartensinderotura,la
tensindefluencia,ylosparmetrosdemdulo(725).Estudiosmsdetalladosyespecializadosdelaspropiedades
delmaterialdehuesoenvariasescalasderesolucinsepuedenobtenerutilizandotcnicasyequiposaltamente
sofisticadosencolaboracinconlaingenierayotroslaboratoriosespecializados(732734).Talesmediciones
proporcionanunadeterminacinprecisadelaresistenciaseajuntoconlaevaluacindesuspropiedadesdelmaterial
(fragilidadodeductilidad)quesevenafectadossignificativamente,porejemplo,porlaprdidademasaseayel
contenidomineralenlatirotoxicosis.
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FIG.20.
AparatodebastidordecargaInstron5534paratrespuntosdepruebadecurvaturadestructivode
laresistenciasea.Montajespersonalizadosincorporansoportesredondeadosypasadoresde
cargaqueminimizanlasfuerzasdecorteydecorte,permitiendoasalosparmetros
biomecnicosdelaresistenciaseaa...
69aRECOMENDACIN
Respuestasmetablicasyloscambiosenlaresorcinseaylaformacinenrespuestaalacondicindela
tiroidesalteradopuedenevaluarseindirectamentepormedicindelosparmetrosdesuero.
Comentario Elanlisisbioqumicodelmetabolismomineralyelrecambioseodebeincluirlamedicindesuerode
Ca2+,Mg2+,PO43 ,yfosfatasaalcalina,quesepuededeterminarutilizandoautoanalizadoresestndar.Adems
dedeterminacindelacondicindelatiroides,otrashormonasqueafectanelhuesosepuedeensayarusando
ensayoscomerciales,incluyendolacorticosterona,lavitaminaD,hormonaparatiroidea,yelfactor1decrecimiento
similaralainsulina.Adems,lahormonagonadotropinasexoyestadopuedendeterminarsesiesnecesario(735).
Anlisisindirectoderecambioseopuedeobtenersemediantelamedicindelaresorcinseaylosmarcadoresde
formacinutilizandokitsdisponiblescomercialmente(725).CterminalreticuladatelopptidodecolgenotipoIyla
fosfatasacidaresistentealtartrato(TRACP)5BsonmedidosporELISAyensayodelaactividaddelaenzima
inmunofijoenfaseslidacomoindicadoresderesorcinsea.Nterminaldelpropptidodeprocolgenodetipo1y
laosteocalcinatambinsemidiporELISAyIRMAcomomarcadoresdeformacinsea.Evaluacinde
marcadoresderecambioseoidealmentedeberealizarseidealmenteenlamaanaenanimalesenayunasparamitigar
losefectosdiurnosydietticasdeconfusinsobreelrecambioseo.Roedoresmayorestienenbajosnivelesde
recambioseoenelestadobasalyladeterminacinnosepuedenrealizardeformafiabledespusdecercade12a
16semanasdeedadcomolosnivelesdemarcadoresestarncercadeloslmitesdedeteccin.Esimportanteteneren
cuentaquehaydiferenciasporsexoylacepaespecficadelamasaseayelvolumendenegociosyelcuidadoenel
diseoexperimentaldebeseradoptadasparagarantizarcamadasecomparanenloposible.Sinembargo,lamedicin
derecambioseoutilizandomarcadoresseossustitutosesunmtodoestablecidoenelcampoqueproporciona
informacinadicionalpararespaldarlosdatosdeimagenylahistologa.
69bRECOMENDACIN
Losefectosdelahormonatiroideaenelrecambioseopodranimplicarefectossobrelaresorcin
osteoclsticadelhueso,laformacinseaosteoblstica,ounacombinacindeambos.Elanlisisbioqumico
delosmarcadoresderecambioseoenrespuestaalahormonatiroideaproporcionaunaevaluacincrudo
indirectadeestosparmetros,peroestotambindebeserinvestigadodirectamenteeneltejidoseo.
Comentario Elhipotiroidismoprovocalareduccindelrecambioseoqueafectantantoalaformacinyresorcin
sea.Tirotoxicosisaceleraambosparmetrosconunmayorefectoenlaresorcinseaqueresultaenlaprdidade
hueso.Parainvestigarycuantificarlabasecelularparaelrecambioseoalterado,serequierenmedicionesdinmicas
delahistologa.Losratonesrecibendosinyeccionesintraperitonealesdelacalcenafluorocromo(15 mg/kgen
solucinsalinacon2%debicarbonatodesodio)aproximadamente7y4dasantesdelsacrificio,aunqueelintervalo
deprecisinpuedeservariadaydebeserdeterminadaempricamentedependiendodelanlisisdisponiblelocalmente
tcnicas.Parmetroshistomorfometraseadinmicodebendeterminarsedeacuerdoconelsistemaestndarde
nomenclatura(736).LaresorcinseaseinvestigenlasseccionesdehuesoteidasparaTRACP,ynmerode
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osteoclastosylasuperficiedeterminadapormicroscopadeluzynormalizadoalasuperficieseatotal.Superficiesde
resorcinseacorticalytrabecularenvivotambinsepuedendeterminarusandotcnicasespecializadasBSESEM(
725,727,729),aunquetalesmtodosnosonrutinariamenteoampliamentedisponibles.Laformacindehuesose
cuantifiquenendoblehuesocalcenamarcadoporhistomorfometraylosndicesdeformacindehuesonorma
determinautilizandoImageJ(http://rsbweb.nih.gov/ij)deacuerdoconlaAmericanSocietyforBoneandMineral
Investigacinsistemaestndardenomenclatura(736).Mtodosalternativosdealtaresolucinusandomicroscopa
confocalsepuedenrealizarenlaboratoriosespecializados(725,737).Estudiosdeexpresingnicasepuede
realizarenlasseccionesdescalcificadasparafinadehuesoycartlago(insituhibridacinyIHC),utilizandoARN
extradodemuestrasdetejido(deexpresindeARNmydeperfiles)yenlosextractosdetejidoesqueltico
(expresindeprotenasyensayosdeactividadenzimtica)(726,727,729731,738740).
70aRECOMENDACIN
Losmecanismosdeaccindelahormonatiroideaenelcartlagosepuedenestudiarencultivosdecondrocitos
preparadosapartirdelasextremidadesocajastorcicasderatonesneonatales.
Comentario Elhuesoesunrganocomplejoylasrespuestascelularesalahormonatiroideapuedeserdeterminadapor
invivoenlosestudiosytejidos.UnacomprensinmsprofundadelosmecanismosmolecularesdelaT3acciny
lasvasdesealizacinimplicadasenlamediacindeT3respuestasenlinajesdeclulasseassepuedeobtener
medianteelestudiodelosefectosdelahormonatiroideaencultivoscelularesprimariosdeclulasesquelticas.
Condrocitosprimariosseprepararonapartirderatonesrecinnacidos(741,742)ylaproliferacin,la
diferenciacin(colgenoXmRNAexpresin,actividaddelafosfatasaalcalina,latincindeazulalcin),apoptosis,
ylasrespuestasdelaexpresingnica(Ihh,PTHrP,Sox9porRTqPCR)aT3tratamientodeterminadespusde7,
14y28das.CabesealarqueloscondrocitossondifcilesdeestudiarinvitrodebidoaquetiendenaDEdiferenciar
yadquirirunfenotiposimilarafibroblastosencultivoenmonocapadespusdeunospocosdas.Estonosuponeun
problemaparalosestudiosdeexpresingnicasilainvestigacinderespuestasagudasaT3eltratamientoselimita
alanlisisdelasclulascultivadasrecientementeenlasprimeras48horas.Sinembargo,enestudiosparainvestigar
losefectosdelahormonatiroideaenlacondrognesisylaproliferacincelularduranteperodosdetiempo,comoya
sehaindicado,loscultivos3Ddebenrealizarseensuspensindeagarosamslargosparaevitarlatendenciaala
desdiferenciacindeloscondrocitoscuandosecultivanduranteperodosprolongadosenmonocapas(653).
70bRECOMENDACIN
Cultivosdeosteoblastospuedenemplearseparainvestigarlosmecanismosdeaccindelahormonatiroidea
sobreladiferenciacincelular,ascomoenlosensayosdemineralizacinseafuncionalesinvitro.Tales
cultivossepreparannormalmentepordigestinconcolagenasadecalotasobtenidosderatonesneonatales
utilizandotcnicasestndar.
Comentario LososteoblastosexpresanTRy,aligualqueloscondrocitos,responderdirectamentealasaccionesdeT3
.OsteoblastosdecalotaprimariosseprepararonapartirdecachorrosP4ylaproliferacin,ladiferenciacin
(osteocalcinaymRNAosterixexpresin,actividaddelafosfatasaalcalina,ensayosdemineralizacindecolorrojoy
devonKossadealizarina),ylaexpresingnica(Runx2,OPG,receptoractivadordelfactornuclearkappaB
ligando[RANKL]porRTqPCR)lasrespuestasestndeterminadasporlogeneraldespusde7,14y28das(738
740,743).
70cRECOMENDACIN
Losefectosdelahormonatiroideaenlaosteoclastognesisylafuncinsepuedendeterminarencultivosde
osteoclastospreparadosapartirde6semanasdeedad,loshuesoslargosderatn.Losprotocolosutilizados
incluyeneltratamientodeclulasdemdulaseaextradasconelfactorestimulantedecoloniasdemonocitos
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yRANKLparainducirlaformacindeosteoclastosinvitro.
Comentario LamdulaseaesaisladodeloshuesoslargosdelosratonesP42ycultivosprimariostratadosconel
factorestimulantedecoloniasdemonocitosyRANKLparainducirlaformacindeosteoclastosinvitro(725,729,
740).Nmerodeosteoclastos(despusdetincinTRAP)yladiferenciacincelular(actividadTRAP,receptorde
calcitonina,lacatepsinaKexpresindeARNm)sedeterminandespusdelosdas0,3,6y9das.Actividaddelos
osteoclastostambinsepuededeterminarmedianteelensayoderesorcindeladentinausandotcnicasestndar
empleadaspreviamenteenlosestudiosdeT3accin(725,729).Elmecanismodeaccindelahormonatiroideaen
funcindelososteoclastosActualmentenoestclaro,ynosesabesilaprincipalrespuestaparaaumentarlaresorcin
seaosteoclsticarepresentaunefectodirectodelaT3enosteoclastososilarespuestaesunefectosecundario
mediadoatravsdelasaccionesdeT3enlososteoblastos,clulasestromalesdemdulasea,uotrosfactores.
Abreviaturasutilizadas
Ira:
2D bidimensional
3D tridimensional
5'd 5'desyodacin
5D 5desyodacin
ATA AsociacinAmericanadelaTiroides
MURCILAGO tejidoadiposomarrn
BSA albminadesuerobovino
BSESEM microscopaelectrnicadebarridodeelectronesretrodispersados
bTSH TSHbovina
BW pesocorporal
CAR androstanereceptorconstitutiva
Chip inmunoprecipitacindelacromatina
SNC sistemanerviosocentral
Connecticut Latomografacomputarizada
Connecticut umbralcrtico
D1 tipoIdesyodasa
D2 tipoIIdeiodinasa
D3 TipoIIIdeiodinasa
DITPA cido3,5diiodothyropropionic
TDT ditiotreitol
DUOX2 dualoxidasa2
ECG electrocardiograma
EDL extensorlargodelosdedos
EDTA cidoetilendiaminotetraactico
ELISA ensayoinmunoenzimtico
EMSA ensayosdedesplazamientodeelectromovilidad
EYFP protenaamarillafluorescentemejorada
FBS suerobovinofetal
FT3I Tlibre3ndice
FT4I Tgratis4ndice
GFP protenaverdefluorescente
GPD glicerofosfatodeshidrogenasa
H&E hematoxilinayeosina
HFUs ultrasonidodealtafrecuencia
HPLC cromatografalquidadealtaresolucin
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HPT ejehipotlamohipfisistiroides
Ibat BATinterescapular
ICV intracerebroventricular
IHC inmunohistoqumica
IRMA ensayoradiomtricoinmune
KClO4 percloratodepotasio
KO knockear
LDL lipoprotenadebajadensidad
TAPA dietabajaenyodo
LPS lipopolisacrido
LT4 levotiroxina
LV ventrculoizquierdo(ventricular)
MCT monocarboxilatotransportador
MHC cadenapesadadelamiosina
MLC cadenaligeradelamiosina
MMI metimazol
MRI imgenesporresonanciamagntica
NaClO4 percloratodesodio
NIS yodosymportersodio
NTI enfermedadnotiroidea
OATP polipptidotransportadordeanionesorgnicos
SAFP 3'fosfoadenosina5'fosfosulfato
PBS bufferfosfatosalino
PCR reaccinencadenadelapolimerasa
PET Latomografaporemisindepositrones
PTU 6npropil2tiouracilo
PXR receptordepregnanoX
RAIU lacaptacindeyodoradiactivo
RANKL receptoractivadordelfactornuclearkappaBligando
rhTSH TSHhumanarecombinante
RIA radioinmunoensayo
RNAseq LassecuenciasdeARN
RQ cocienterespiratorio
rT3 3,3',5'triyodotironina
RTqPCR latranscriptasainversaPCRcuantitativa
RV ventrculoderecho(ventrculo)
SR retculosarcoplsmico
SERCA1y2 sarcoplsmico/endoplasmticoCaretculo++ATPasa1y2
SIMS espectrometrademasasdeionessecundarios
SLC26A4/PDS pendrin
SNS sistemanerviososimptico
SOL sleo
SPECT latomografacomputarizadaporemisindefotones
SR retculosarcoplsmico
SULT sulfotranferase
T2 3,3'diyodotironina
T3 3,3',5triyodotironina
T3RE T3elementosensible
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T3S T3sulfato
T4 tiroxina
TBG globulinafijadoradetiroxina
TCA cidotricloroactico
T/ebp protenadeuninapotenciadorespecficasdelatiroides
Tetrac cidotetraiodotiroactico
Tm puntodetiempodeequilibrio
TR receptordelahormonatiroidea
TRACP tartratoresistentealafosfatasacida
TRH hormonaliberadoradetirotropina
TRIAC tiratricol(cido3,5,3triyodotiroactico)
TrisHCl 2amino2hidroximetil1,3propanodiolclorhidratode
TSH tirotropina
TSHR ReceptordeTSH
UDPGA cidoUDPglucurnico
UGT UDPglucoroniltransferasa
UPLC cromatografalquidadeultraalta
VO2 elconsumodeoxgeno
CMLV clulasdemsculolisovascular
Notasalpie
*
Presidentetodoslosdemsautoressemuestranenordenalfabtico.
Ira:
AGRADECIMIENTOS
Ira:
ElgrupodetrabajodeseaagradeceralaSraBobbiSmith,DirectorEjecutivo,ATA,ylaSraAdoniaCoatesylaSra
SharleeneCano,miembrosdelpersonalATA,porsuasistenciaalgrupodetrabajo,suayudadeexpertos,ysu
apoyoSr.CezarBianchiparalaasistenciavaliosaconilustracionesylaSraYanettePericichyCristinaAndrade
(DivisindeEndocrinologadelaUniversidaddelaEscuelaMillerdeMedicinadeMiami)porsuayudala
preparacindeltexto.Elgrupodetrabajotambindeseaagradeceralossiguientescolegasqueaportaroncomentarios
interesantesy/omaterialdeapoyo:
SherineAbdalla,MD(DivisindeEndocrinologadelaUniversidaddeMiamiEscueladeMedicinaMiller)
AnitaBoelen,PhD(DepartamentodeEndocrinologa,CentroMdicoAcadmicodeAmsterdam,Pases
Bajos)
DeniseP.Carvalho,MD,PhD(CarlosChagasFilhoInstitutodeBiofsicadelaUniversidadFederaldeRo
deJaneiro,RodeJaneiro,Brasil)
OrsolyaDohan,MD,PhD(DepartamentodeEstudiosClnicosdelaFacultaddeCienciasdelaSalud
PrimerDepartamentodeMedicinaInternadelaFacultaddeMedicicnelaEscueladeMedicina
Semmelweis,Budapest,Hungra)
JamesFagin,MD(DivisindeEndocrinologa,CentrodeCncerMemorialSloanKettering,NuevaYork,
NY)
TatianaFonseca,PhD(DivisindeEndocrinologadelaUniversidaddeMiamiEscueladeMedicinaMiller)
RonaldKoenig,MD,PhD(DivisindeMetabolismo,EndocrinologayDiabetesdelaUniversidadde
Michigan,AnnArbor,MI)
VaniaNariz,MD,PhD(DepartamentodeAnatomaPatolgica,HospitalGeneraldeMassachusetts,
Boston,MA)
MiriamO.Ribeiro,PhD(DepartamentodeCienciasBiolgicasyCentrodeCienciasdelaSalud,
UniversidadPresbiterianaMackenzie,SoPaulo,Brasil)
ThomasScanlan,PhD(DepartamentodeFisiologayFarmacologadelaFacultaddeMedicinadela
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OregonHealthandScienceUniversity,Portland,OR)
StevenJ.Soldin,PhD(DepartamentodeMedicinadeLaboratorio,InstitutoNacionaldeMedicina,
Washington,DC)
CintiaUeta,PhD(DepartamentodeAnatomadelaUniversidaddeSoPaulo,SoPaulo,Brasil)
EstaobrafuefinanciadaenparteporelprogramadeinvestigacinintramuraldelNIDDKenlosInstitutosNacionales
deSalud(DF),NIDDKotorga2R01DK5853808,1R01DK06505502,R01DK77148(ACB),R37DK015070(a
XHLySR)yR21HD07252602(aVAG),subvencinNICHDR03HD061901(aPAK),SAF201232491del
MINECOyS2010/BMD2423deCAM(aOMJ),FundacinEstadosUnidosIsraelBinacionalScience(aGA),la
FundacinNacionaldeCienciasdeHungra(OTKAK81226)yelSptimoProgramaMarcodelaComunidad
Europea(FP7/20072013)envirtuddeacuerdodesubvencinno.259772(BG),yelZonMwClnicadeBecas
Grant(90700412)yunZonMWTOPGrant(91.212.044)(RPP).
DECLARACINDEDIVULGACIN
Ira:
Divulgacindeinformacindurante2aosantesdediciembrede2012yelfuturoconocidoapartirdenoviembrede
2013:todoslosautoresdeclarannotenerconflictosfinancierosdeinteresessignificativosarevelar.
Referencias
Ira:
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20/1/2015

secrecintiroideaesde5:1(1000 pmol/ddeT4a190 pmol/ddeT3),loqueindicaunapequeacontribucin

concentraciones,sloalcanzandovaloresdeaproximadamente20 horas(283),otanaltocomo35 horas,enelcaso

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