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ZAMORANO
CARRERA DE INGENIERA AGRONMICA
Presentado por
Zamorano, Honduras
Noviembre, 2014
Aprobado:
________________________
Mara Alexandra Bravo, M.Sc.
Asesora principal
________________________
Renan Pineda, Ph.D.
Director
Departamento de Ciencia y
Produccin Agropecuaria
_________________________
Isidro Matamoros, Ph.D.
Asesor
_______________________
Ral H. Zelaya, Ph.D.
Decano Acadmico
_________________________
Mauricio Huete Ramirez, Ing.
Asesor
ii
iii
Abstract: In vitro culture is the massive multiply of heterogeneous genetic structures free
of diseases. The main objective of this work is to make the protocol of micropropagation
of coffe -Lempira variety- for the Laboratorio de Cultivo de Tejidos de Zamorano,
Honduras. (Tissue culture lab at Zamorano Honduras). For the establishment it was used
plagiotropic meristems with the medium of Murashige y Skoog modified with the salts at
a 50% and vitamins at a 100% and with 0.19 mg/L of ANA and 2.25 mg/L of BAP. In
multiplication it was used the salts of the medium of Murashige and Skoog with 100 mg/L
of inositol, 20 mg/l of cysteine and 1 mg/L of BAP in the subcultures and in the fourth
subculture also with 0.05 mg/L of gibberellic acid. For rooting it was used the half part of
the medium of Murashige and Skoog with 1 and 5 mg/L of ANA and 10 g/L of syrup
making an hormone shock for seven days. We also tried taking root ex-vitro, sowing
cuttings in Jiffys with 0.01% of AIB at the base. At the establishment we got a survival
of 13% and the meristems started to grow at the day 16. In the multiplication we got an
average of 6.3 new shoots for each cutting. The micro cuttings after 50 days didnt have
any roots. We had roots ex-vitro in the 21% of the cuttings, this where the ones that
presented callus at the base treat with AIB.
Key words: Auxins, establishment, hormone, hormone shock, micropropagation,
multiplication, rooting.
iv
CONTENIDO
Portadilla ...............................................................................................................
Pgina de firmas ....................................................................................................
Resumen ................................................................................................................
Contenido ..............................................................................................................
ndice de cuadros, figuras y anexos.......................................................................
iii
INTRODUCCIN...............................................................................................
MATERIALES Y MTODOS..........................................................................
RESULTADOS Y DISCUSIN........................................................................
14
CONCLUSIONES ..............................................................................................
18
RECOMENDACIONES ....................................................................................
19
20
ANEXOS .............................................................................................................
22
i
ii
v
vi
Pgina
8
10
11
15
Pgina
4
4
5
9
12
12
14
Anexos
15
16
17
Pgina
vii
22
23
23
1. INTRODUCCIN
El sector cafetalero est sufriendo actualmente una gran crisis debido a la infestacin por
el hongo Hemileia vastatrix conocido comnmente como roya del caf. La roya del caf
apareci por primera vez en Centroamrica en 1976, pero nunca haba afectado la
produccin tan gravemente como en el ciclo 2012-2013 (PROMECAF e IICA 2013).
El impacto econmico de la roya del caf en la regin centroamericana y Caribe es alto.
Al final del ciclo cafetero 2012/2013 se estima que el 16.4% de la produccin de caf de
la regin se perdi por la roya, el rea afectada estimada en 593,037 Hectreas (54.8% del
total), la mano de obra desplazada fue de en 373,584 personas (17.2% del total). La
prdida de cosecha fue de 3.5 millones de sacos de 60 kilos (19% del total), con $499
millones (16% del total) de divisas no percibidas (PROMECAFE).
Este hongo se presenta en la planta como tejido necrtico en las hojas y en los pednculos
causando la cada de los granos de caf. En los ltimos aos se han desarrollado
variedades resistentes a la roya pero estas son hbridos de los que an no se tiene gran
cantidad de semillas para su propagacin sexual. Al establecer mtodos de propagacin in
vitro de este cultivo, se puede hacer una propagacin masiva de estas variedades y se
puede seleccionar la planta que cuente con las mejores caractersticas ya que con este
mtodo se obtienen plantas genticamente iguales. Al utilizar esta tcnica de propagacin
se podr en un tiempo ms corto aumentar la cantidad de plntulas de variedades lite
(Ayala 2013).
En comparacin con los procedimientos hortcolas de propagacin asexual convencional,
la tcnica de micropropagacin presenta las siguientes ventajas: tasas de multiplicacin
mucho ms elevadas, material (microesquejes) de tamao reducido que puede
transportarse a largas distancias a menor costo y produccin de material vegetal libre de
enfermedades (Dublin 1991).
Teniendo en cuenta los costos de produccin, relativamente altos de las plantas in vitro, es
recomendable utilizar esta tcnica para propagar plantas que realmente vayan a tener un
impacto econmico positivo en la produccin y calidad del caf (Dublin 1991). Este sera
el caso de la reproduccin de los cafetos de C. arbica y de los hbridos de individuos de
alto desempeo, con resistencia a la roya, produccin abundante y vigor hbrido, con
problemas de multiplicarse por va sexual por falta de material (Dublin 1991).
Desde hace varios aos se cuenta con varios procedimientos de reproduccin vegetativa in
vitro de los cafetos, tanto de C. arabica y C. canephora como de los hbridos
interespecficos de estas dos especies (Dublin 1991). Los microesquejes plagiotrtopos
pueden obtenerse de diferentes fuentes: yemas plagiotrtopas preexistentes (laterales o
1
2. MATERIALES Y MTODOS
La investigacin se llev a cabo en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales situado
en las instalaciones de la Carrera de Ingeniera Agronmica Zamorano. Las plantas
utilizadas fueron previamente establecidas a partir de semillas de caf -variedad Lempirateniendo al momento de la extraccin del material vegetal dos aos de edad. Estas plantas
estn situadas en el invernadero dos del laboratorio.
Establecimiento. El establecimiento de las plantas in vitro se realiz por medio de
meristemas plagiotrpicos. Para el establecimiento del material vegetal se desinfectaron
los esquejes, donde se encuentran los meristemas, haciendo un lavado con agua y jabn
(Figura 1) y sumergindolo por diez minutos en 1 g/L de benomilo y 0.3 g/L de
estroptomicna. Luego se le hizo uno inmersin en una solucin de NaOCl al 30% v/v
(Magia Blanca con 4.72% de hipoclorito de sodio) con Tween80 durante 30 minutos. En
la cmara de flujo laminar se realizaron tres lavados en agua destilada estril para eliminar
el NaOCl. Al momento de extraer los meristemas se sumergieron en una solucin de
antioxidante estril (100 mg/L de cido ascrbico y 150 mg/L de cido ctrico) durante
diez segundos.
La extraccin de los meristemas se realiz con ayuda de bistur y aguja. Con el bistur se
cort el pednculo al ras de la rama plagiotrpica primaria para tener un acceso ms fcil
y poder retirar el material vegetal que cubre el meristema (Figura 2). Al momento de
tenerlo descubierto se retira de la rama plagiotrpica con la aguja y se pone
inmediatamente en contacto con la solucin antioxidante estril previo a su siembra
(Figura 3).
Multiplicacin. La multiplicacin se llev a cabo con las plantas establecidas a partir de
meristemas. Se utiliz el mtodo de Nakamura y Sondahl el cual consta en realizar la
separacin de los brotes adventicios de las esquejes. Segn Nakamura y Sondahl se puede
obtener un promedio de 7.5 brotes nuevos por cada esqueje.
Frmula
Nombre Comn
Macroelementos
CaCl.2HO
KHPO
KNO
Nitrato de potasio
950.000
MgSO.7HO
185.000
NHNO
Nitrato de amonio
825.000
HBO
cido brico
3.100
CoCl.6HO
0.013
CuSO.5HO
0.013
KI
Yoduro de potasio
0.415
MnSO.4HO
NaMoO.2HO
0.125
ZnSO.7HO
4.300
FeNa EDTA
Microelementos
Hierro
mg/L
220.000
85.000
11.150
25.000
Etilendiaminotetraactico
Vitaminas
Auxinas
Inositol
100.000
cido Nicotnico
0.250
Piridoxina
0.250
Tiamina
0.200
cido Naftaleneactico
0.190
6-bencilaminopurina
2.250
Sacarosa
(Dublin 1991), adaptado por el autor.
30000.000
Frmula
Macroelementos CaCl.2HO
mg/L
440.000
KHPO
170.000
KNO
Nitrato de potasio
MgSO.7HO
NHNO
Nitrato de amonio
Microelementos HBO
Hierro
Nombre Comn
1900.000
370.000
1650.000
cido brico
6.200
CoCl.6HO
0.025
CuSO.5HO
0.025
KI
Yoduro de potasio
0.830
MnSO.4HO
NaMoO.2HO
0.250
ZnSO.7HO
8.600
FeNa EDTA
22.300
50.000
Etilendiaminotetraactico
Vitaminas
Inositol
100.000
Auxinas
Cistena
30.000
6-bencilaminopurina
Sacarosa
(Dublin 1991), adaptado por el autor.
1.000
30000.000
Frmula
Nombre Comn
Macroelementos
CaCl.2HO
440.000
KHPO
170.000
KNO
Nitrato de potasio
MgSO.7HO
NHNO
Nitrato de amonio
HBO
cido brico
6.200
CoCl.6HO
0.025
CuSO.5HO
0.025
KI
Yoduro de potasio
0.830
MnSO.4HO
Microelementos
Hierro
mg/L
1900.000
370.000
1650.000
22.300
0.250
ZnSO.7HO
8.600
FeNa EDTA
50.000
Etilendiaminotetraactico
Vitaminas
Inositol
100.000
Auxinas
Cistena
30.000
6-bencilaminopurina
1.000
cido giberlico
0.050
Sacarosa
(Dublin 1991), adaptado por el autor.
30000.000
Enraizamiento in vitro. Los esquejes utilizados fueron clasificados por tamao (Figura
4). Para la etapa de enraizamiento se us el medio basal y vitaminas de Murashige y
Skoog (1962) (Cuadro 4) suplementado con ANA y sacarosa, y reduciendo la dosis de
minerales al 50% segn los tratamientos a probar. En el testigo se utiliz el medio basal y
las vitaminas al 100% junto con 1 mg/L de ANA durante todo el tiempo hasta obtener
races. En los tratamientos se prob realizar un golpe hormonal con 1 mg/L de ANA en el
primer tratamiento y 5 mg/L en el segundo. Los explantes se dejaron solo por siete das en
este medio, al da ocho se cambiaron al mismo medio pero con la ausencia de la auxina
(Cuadro 5). Tambin se disminuy la dosis de sacarosa segn lo recomendado por
Alvarenga Venutolo (2004).
Todos los medios de cultivo se prepararon con agua destilada, se ajust el pH a 5.6 con
KOH y/o HCL con ayuda del medidor de pH Meter S20 Seven Easy. Los medios se
solidificaron con 1.8 gr/L de Phytagel. Luego se dispens 20ml de medio de cultivo por
cada frasco de vidrio de 100 mL y se esteriliz en el autoclave Market Forge Sterilmatic
STM- E a 15 PSI de presin, 121C y durante 20 minutos.
Frmula
Macroelementos CaCl.2HO
Microelementos
Hierro
Nombre Comn
mg/L
440.000
KHPO
170.000
KNO
Nitrato de potasio
MgSO.7HO
NHNO
Nitrato de amonio
HBO
cido brico
6.200
CoCl.6HO
0.025
CuSO.5HO
0.025
KI
Yoduro de potasio
0.830
MnSO.4HO
1900.000
370.000
1650.000
22.300
0.250
ZnSO.7HO
8.600
FeNa EDTA
50.000
Etilendiaminotetraactico
Vitaminas
Inositol
100.000
cido Nicotnico
0.500
Piridoxina
0.500
Tiamina
0.400
(Dublin 1991)
10
Medio MS (%)*
ANA (mg/L)
Sacarosa (g/L)
Testigo
28
100
30
ANA 1
50
10
21
50
10
50
10
21
50
10
Tratamiento
ANA 5
Enraizamiento ex-vitro. Se realiz una prueba para enraizar los esquejes ex-vitro. Para
esta prueba se utilizaron catorce esquejes los cuales se sembraron en Jiffys (sustrato
comprimido para enraizamiento) previamente humedecidos y esterilizados en el
autoclave. A la base de los esquejes se les aplic cido indol-3 butrico al 0.1% previo a
su siembra (Figura 5). La bandeja con las plntulas se cubri con tela Agribn para
protegerlas durante su enraizamiento. Se tuvieron en el cuarto de crecimiento del
laboratorio a 23C, 16 horas luz a 2000 lux, una humedad relativa del 50% durante 21
das (Figura 6). Luego se trasladaron al invernadero, siempre tapados con el Agribn
retirndolo hasta el da 52. Los esquejes sembrados en los Jiffys se mantuvieron con
constante humedad en el medio.
11
12
13
3. RESULTADOS Y DISCUSIN
Establecimiento. De los 255 meristemas establecidos se obtuvo un 13.02% de
sobrevivencia. Hubo un 6.25% de contaminacin por hongos en los primeros seis das y
un 80.73% por bacteria en los primeros nueve das. Se observ que el inicio del
crecimiento de los meristemas fue, en promedio, al da 16 desde su establecimiento
(Figura 7).
14
15
Figura 9. Callo presentado en la base de un esqueje de caf -variedad Lempira- a los siete
das de haber sido trasplantado a medio de enraizamiento in vitro.
16
Figura 10. Races en un esqueje de caf -variedad Lempira- enraizado ex-vitro. (a) A los
59 das despus del trasplante. (b) A los 85 despus del trasplante.
17
4. CONCLUSIONES
18
5. RECOMENDACIONES
Realizar los cambios de medio cada 21 das para evitar la muerte de los esquejes.
19
6. LITERATURA CITADA
Abdelnour-Esquivel, A. y J. Vincent Escalant. 1994. Conceptos bsicos del cultivo de
tejidos vegetal. CATIE. 16 p.
Alvarenga Venutolo, S. 2004. Laboratorio Cultivo de Tejidos I. Instituto Tecnolgico de
Costa Rica, Centro de Investigacin en Biotecnologa, Escuela de Biologa. 47 p.
Ayala, P. 2013. Cultivo in vitro (micropropagacin) de yemas de caf (Coffea arabica)
(en lnea). Tesis Ing. en Biotecnologa, Cultivo de Tejidos Vegetales. Departamento de
Ciencias de la Vida, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE, Sangolqui, Ecuador. 2 p.
Disponible en: http://es.slideshare.net/pahola_estefy/yemas-de-caf
Dublin, P. 1991. Multiplicacin Vegetativa de caf, hevea y cacao, captulo 26. In: Roca,
W. M. y L. A. Mroginski. 1991. Cultivo de tejidos en la Agricultura, Fundamentos y
Aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). Colombia. 577-596 p.
Espinal de Rueda, D. 2009. Gua para la produccin in vitro de cultivos: fundamentos y
prcticas de laboratorio. Mdulo de Biotecnologa, Cultivo de Tejidos Vegetal y
Reproduccin In vitro. Zamorano, Carrera de Ciencia y Produccin Agropecuaria. 85 p.
Murashige, T. y F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue culture. In: J. Janick (ed). 2000. Classic Papers in Horticultural Science.
Blackburn Press. p. 59.
PROMECAFE e IICA. Junio 2013. La crisis del caf en Mesoamrica, causas y respuesta
apropiada
(en
lnea).
Disponible
en:
http://www.iica.int/Esp/prensa/BoletinRoya/2013/N01/Roya-MA.pdf
PROMECAFE. Visto el 15 de mayo del 2014. La Caficultura y la Roya del Caf (en
lnea).
Consultado
21
de
mayo
de
2014.
Disponible
en:
http://www.promecafe.org/web/index.php?option=com_content&view=article&id=55:roy
a-del-cafe&catid=34:promecafe&Itemid=118
Read P. y G. Yang. 1989. Response in vitro of explants chemically treated via forcing
solutions.
Consultado
6
de
octubre
del
2014.
Disponible
en:
http://link.springer.com/article/10.1007/BF01997594#page-1
Rojas Garcidueas, M. y M. Rovalo Merino. 1984. Fisiologa vegetal aplicada. Tercera
edicin. 204-226 p.
20
21
7. ANEXOS
22
23