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eg
en
eration de la pulpe dentaire par ing
enierie
tissulaire : mise au point dune pulpe
equivalente
Jean-Baptiste Souron
Rapporteur
Rapporteur
LETOURNEUR Didier, DR
Examinateur
POLIARD Anne, PR
Examinateur
Examinateur
Examinateur
LA PULPE DENTAIRE............................................................................................................11
A.
1.
2.
3.
4.
B.
C.
Vascularisation .........................................................................................................................................21
D.
Innervation ...............................................................................................................................................22
E.
1.
2.
II.
A.
B.
C.
D.
E.
III.
A.
1.
2.
3.
Matriel ....................................................................................................................................................37
Cultures cellulaires................................................................................................................................37
Prparation des matrices ......................................................................................................................38
Marquage loxyne-Indium 111 ...........................................................................................................38
1.
2.
In vivo .......................................................................................................................................................39
Implantation ectopique ........................................................................................................................39
Implantation dans la dent .....................................................................................................................39
1.
2.
3.
B.
C.
D.
1.
2.
3.
IV.
A.
RESULTATS .........................................................................................................................44
V. DISCUSSION ............................................................................................................................60
A.
Protocole ..................................................................................................................................................61
B.
C.
D.
VI.
CONCLUSION .......................................................................................................................67
VII.
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................69
VIII.
IX.
X. ANNEXE II ................................................................................................................................86
Contexte scientifique
travaillaient sur des approches plus fondamentales portant sur les proprits des cellules
souches de la pulpe afin de les caractriser et de rechercher leur capacit survivre en
conditions hypoxiques et induire une angiogense. Concernant mon projet, nous avons
dvelopp une culture tridimensionnelle de ces cellules pulpaires dans un lattis de
collagne, afin de constituer une pulpe quivalente . Linnocuit de ces matrices
ensemences de cellules pulpaires a t teste par des implantations ectopiques chez le rat.
Puis, dans une perspective prclinique, nous avons implant ces pulpes quivalentes dans un
modle de pulpotomie chez le rat.
Dans ce contexte dingnierie tissulaire partir de cellules souches, nous nous sommes
penchs sur la question cruciale du devenir des cellules implantes dans un organisme. Pour
ce faire, nous avons travaill en collaboration avec lquipe U698-IFR2 du Docteur
8
10
I.
La pulpe dentaire
11
Od
La pulpe contient diffrents types cellulaires, des cellules drives des crtes neurales, des
cellules migratrices provenant du msenchyme para-axial et des cellules msenchymateuses
dj prsentes dans le premier arc branchial. Par ailleurs, ce tissu contient galement des
vaisseaux sanguins et des lments nerveux (Piette 2001; Goldberg 2011). La prsence de
lensemble de ces populations cellulaires confre la pulpe, ses fonctions de nutrition,
sensitives et de rparation. Les diffrentes populations cellulaires pulpaires jouent un rle
primordial dans la rponse aux agressions.
12
A.
Les fibroblastes
2.
Les odontoblastes
La dentine primaire est synthtise avant la mise en place de la dent sur larcade et la
dentine secondaire aprs lruption de la dent. Quant la dentine tertiaire, elle est scrte
en rponse aux agressions, notamment lors des processus carieux (Smith, Cassidy et al.
1995; Farges, Keller et al. 2009).
3.
Plusieurs types de cellules immunitaires sont prsents dans la pulpe. La pulpe saine, non
enflamme, ne contient que des cellules dendritiques (iDc myloides), des macrophages et
des lymphocytes T (Jontell, Okiji et al. 1998). Les iDCs et les macrophages constituent
environ 8% de la population totale des cellules pulpaires avec un ratio iDCs/macrophages de
4 pour 1. Deux populations distinctes de cellules dendritiques ont t identifies dans la
pulpe saine : les cellules dendritiques CD11c+, prsentes principalement la jonction
dentine-pulpe, et les cellules dendritiques F4/80+, concentres autour des vaisseaux
sanguins du centre de la pulpe ainsi que dans la rgion sous-odontoblastique partir de
laquelle elles tendent de fins prolongements entre les odontoblastes, parfois jusqu la
dentine (Farges, Romeas et al. 2003). La fonction principale des iDCs est de prsenter les
antignes quelles ont capturs aux lymphocytes T nafs pour les activer. Cette prsentation
14
a lieu aprs maturation des iDCs dans les zones T des ganglions lymphocytes rgionaux
(Zhang, Kawashima et al. 2006).
Les
macrophages
pulpaires
apparaissent
comme
de
grandes
cellules
ovalaires
principalement localises dans les zones privasculaires. En labsence de pathologie, ils sont
impliqus principalement dans la phagocytose et llimination des cellules mortes.
Les lymphocytes T (LTs) sont rares dans la pulpe dentaire et les lymphocytes B (LBs) y sont
exceptionnellement rencontrs. (Farges, Romeas et al. 2003).
4.
a)
Origine
La prsence de cellules souches dans la pulpe a t mise en vidence ds 2000 par lquipe
de Gronthos, au sein de pulpe de dents permanentes ; elles ont t nommes DPSCs pour
Dental Pulp Stem Cells (Gronthos, Mankani et al. 2000). Lintrt principal de la dcouverte
de cette nouvelle niche de cellules multipotentes dans la dent rside la fois dans la facilit
daccs ces cellules et dans la possibilit de les conserver en vue dune utilisation future.
Quelques annes plus tard, la mme quipe a montr que des cellules souches pulpaires
taient aussi prsentes dans la pulpe des dents temporaires. Ces cellules sont alors
nommes SHED, pour Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous teeh, ouvrant ainsi la
voie une source de cellules souches unique et naturelle du fait de lexfoliation
physiologique des dents temporaires. (Batouli, Miura et al. 2003; Kerkis,Caplan 2012)
b)
Caractristiques phnotypiques
Les cellules souches pulpaires ont un phnotype proche des cellules souches issues de la
moelle osseuse, les BMSCs (Bone Marrow Stem Cells). En culture, ce sont de grandes
cellules, fusiformes, avec un grand noyau central, un cytoplasme volumineux (Figure 3).
15
10 m
Au niveau immuno-histologique, les cellules souches pulpaires sont trs proches des cellules
souches de moelle osseuse (Gronthos, Mankani et al. 2000). Les marqueurs de surface
16
communs sont retrouvs (Figures 4 et 5). In vitro, ces DPSCs sont capables de se diffrencier
dans de nombreux types cellulaires, comme les BMSCs.
17
Phnotypiquement les DPSCs prsentent des caractristiques similaires aux BMSCs (figure
6). Les marqueurs de surface et la rpartition des protines sont galement retrouvs de
faon comparable (Figure 6)(Gronthos, Mankani et al. 2000; Gronthos, Brahim et al. 2002;
Eleuterio, Trubiani et al. 2013).
Les DPSCs prsenteraient en outre un taux de prolifration plus important que les BMSCs,
sans perte de leur multipotence (Gronthos, Mankani et al. 2000; Seong, Kim et al. 2010).
18
c)
Isolation
Les techniques disolation qui ont t utilises pour les cellules souches pulpaires sont celles
qui ont t dveloppes pour les BMSCs (Tirino, Paino et al. 2012). En raison du taux
important de prolifration des DPSCs, lisolation partir de cette proprit a t propose
par (Gronthos, Mankani et al. 2000). Il sagit dindividualiser les cellules, de les ensemencer
et de slectionner les clones ayant le taux de prolifration le plus important. Ce taux de
renouvellement important est maintenu au-del de 25 passages (Rodriguez-Lozano, Insausti
et al. 2012).
Diffrents marqueurs sont proposs pour caractriser les cellules souches pulpaires
humaines (Kawashima 2012), pour la plupart communs aux BMSCs, savoir OCT3/4, CD90,
STRO1 Les marqueurs de surface caractristiques des cellules souches peuvent alors tre
utiliss pour slectionner les cellules par tri au FACS ou grce des anticorps fixs des billes
(Kawashima 2012). Cependant, il nexiste pas de marqueurs spcifiques aux DPSCs.
d)
Diffrenciation
In vitro, les DPSCs sont capables de se diffrencier dans tous les types de lignes
germinales (Kawashima 2012):
De nombreux protocoles permettent la diffrenciation des DPSCs vers les cellules neurales
(Kim, Bae et al. 2012; Fang, Yang et al. 2013). La diffrenciation en neurones a pu tre
obtenue (Arthur, Rychkov et al. 2008).
Les DPSCs peuvent se diffrencier en cellules issues de la ligne msodermique : myocites,
ostoblastes, chondrocytes, adipocytes et cardiomyocytes (Jo, Lee et al. 2007; Koyama,
Okubo et al. 2009; Gronthos, Arthur et al. 2011; I, Nargi et al. 2011)
La ligne endodermique (cellules hpatiques) est aussi obtenue par diffrenciation des
DPSCs (Iohara, Zheng et al. 2006; Rodriguez-Lozano, Insausti et al. 2012)
In vivo, ces capacits de diffrenciation ont t utilises lors de la mise en place de cellules
neurales diffrencies partir de DPSCs au niveau de lsions du cerveau chez le rat (Kiraly,
Kadar et al. 2011). Plus spcifiquement, les DPSCs ont montr leur capacit se diffrencier
dans de nombreux types de cellules pulpaires. Un point important est leur capacit se
diffrencier en cellules odontoblastiques synthtisant de la dentine (Yu, Deng et al. 2006;
Onyekwelu, Seppala et al. 2007)
19
B.
Chondrotines sulfates 4 et 6
Dermatane sulfate
Kratane sulfate
Hparane sulfate
Llastine est prsente au niveau des vaisseaux sanguins et assure llasticit des parois
(Piette 2001).
Les mtallo-protases matricielles jouent un rle de dgradation des protines
extracellulaires. Elles participent donc aux processus de remodelage de la pulpe normale et
aux phnomnes inflammatoires et cicatriciels (Bogovic, Nizetic et al. 2011)
Cette composition de la MEC permet le maintien de lhydratation par stockage des
molcules deau. Elle autorise le transit des mtabolites, des nutriments, des dbris
cellulaires, entre les vaisseaux et les cellules pulpaires (Goldberg, Six et al. 2009)
C.
Vascularisation
La pulpe dentaire est un tissu richement vascularis. Les vaisseaux sanguins pntrent dans
la pulpe par les foramens apicaux et secondaires. Ils progressent au centre du canal
radiculaire en direction de la chambre pulpaire o ils se ramifient progressivement pour
former en priphrie un fin rseau de capillaires sous-odontoblastiques de 5 10 m de
diamtre. Dautres vaisseaux, de taille infrieure, peuvent pntrer dans la pulpe par les
canaux accessoires (Trubiani, Tripodi et al. 2003). Au niveau de la couronne, les artrioles
principales se ramifient en artrioles secondaires qui se ramifient leur tour pour former
la priphrie de la chambre pulpaire un vaste rseau de capillaires vasculaires (5-10m). Ces
capillaires sont fenestrs proximit des odontoblastes ce qui permet une meilleure
diffusion des nutriments. Les vaisseaux sanguins pntrent dans la pulpe et en sortent par
les foramen apical et secondaire sous la forme dune ou parfois deux artrioles (35-45m)
passant au centre du canal de la racine.
Le retour veineux se fait galement par le foramen apical. Il est assur par des veinules postcapillaires qui se regroupent pour former des veinules collectrices dans la partie centrale du
canal radiculaire.
Lexistence danastomoses artrioveineuses, points de communication directe entre les
cts veineux et artriels de la circulation contribuent la rgulation du dbit sanguin et de
la pression intrapulpaire et permettent de driver le flux sanguin et disoler une anse en cas
de lsion.
La prsence dun rseau lymphatique pulpaire est aujourdhui dbattue. Selon certains
(Marchetti, Poggi et al. 1992; Sawa, Yoshida et al. 1998), ce rseau prendrait naissance dans
la rgion sous-odontoblastique. Les vaisseaux lymphatiques conflueraient vers la partie
21
D.
Innervation
Le rseau nerveux pulpaire est essentiellement constitu de fibres sensitives issues du nerf
trijumeau dont les corps cellulaires se trouvent dans le ganglion de Gasser. Les fibres
pntrent dans la pulpe par le foramen apical et les canaux accessoires et se regroupent au
centre du canal radiculaire pour former de volumineux faisceaux qui se ramifient dans la
chambre pulpaire o ils se terminent sous la forme dun rseau dense de fibres nerveuses
appel plexus pulpaire sous-odontoblastique (ou plexus de Rashkow) (Bletsa, Fristad et al.
2009; Magloire, Couble et al. 2009). Si la plupart des fibres nerveuses sensitives se terminent
dans ce plexus, certaines se prolongent jusquau ple apical de lodontoblaste et pntrent
dans la prdentine, puis dans la dentine sur une distance denviron 200 microns (Maeda,
Iwanaga et al. 1987). Les fibres nerveuses pulpaires sont pour la plupart des fibres
amyliniques de type C qui reprsentent 70 90 % des fibres nerveuses des dents dfinitives
et temporaires. Ce sont des fibres chimio et thermosensibles, actives essentiellement au
cours de linflammation pulpaire, transmettant la douleur. Elles librent galement un
certain nombre de neuromdiateurs, en particulier la substance P. La pulpe contient
galement des fibres A- impliques elles aussi dans la transmission douloureuse. Elles
seraient stimules par le dplacement du fluide intratubulaire. Des fibres myliniques A-
ont t mises en vidence dans la pulpe. Elles pourraient tre impliques dans la
transmission de sensations non douloureuses engendres par des stimulations dentaires de
trs faible intensit, de type vibratoire (Piette 2001). Ces fibres sont donc responsables de la
sensibilit pulpo-dentinaire observe en rponse des stimuli mcaniques, thermiques
chimiques ou lectriques.
Des fibres sympathiques originaires du ganglion cervical suprieur sont galement prsentes
dans la pulpe mais en quantit moins importante. Ce sont principalement des fibres
noradrnergiques qui rgulent la circulation pulpaire grce leurs effets vasoconstricteurs.
22
E.
Les pathologies endodontiques trouvent leur origine dans trois types d'agression :
-
bactriennes
physiques
chimiques
Les bactries constituent la cause majeure de pulpite. Les toxines bactriennes et les
bactries peuvent entrer en contact avec le parenchyme pulpaire via les tubuli dentinaires
lors dune lsion carieuse ou dune exposition pulpaire. Lchauffement par les instruments,
lors du curetage dune lsion carieuse ou la prparation dune dent vivante, peut galement
tre lorigine dune inflammation pulpaire. La section des prolongements odontoblastiques
par linstrumentation rotative peut provoquer le relargage de cytokines pro-inflammatoires
par les odontoblastes.
Un nombre important de classifications concernant les pathologies pulpaires et priapicales
existe : histologiques, radiographiques, cliniques.
La classification clinique apparat comme la plus adapte car elle est directement oriente
vers l'indication ou la contre-indication du traitement. Le diagnostic de l'tat pathologique
pulpaire ou priapical, sil constitue une tape essentielle, reste difficile poser. En effet, il
est bas sur l'analyse des informations obtenues par lentretien avec le patient et les
rsultats des tests cliniques effectus. Il ny a donc pas toujours de correspondance entre ce
diagnostic et ltat inflammatoire du parenchyme pulpaire (Fadavi,Anderson 1996).
a)
Pulpite rversible
Cliniquement, la dent est le plus souvent asymptomatique. Dans les cas les plus avancs, des
douleurs sont observes au contact d'un agent irritant (froid, sucre, acide). Elles sont
caractrises par leur brivet et leur faible amplitude. Le plus souvent ces sensations
douloureuses sont associes au froid. Le processus inflammatoire est rversible, si lagent
causal est limin et une tanchit par restauration est obtenue.
23
Figure 7: Coupe histologique dune dent diagnostique en pulpite rversible (Seltzer and Bender)
b)
Pulpite irrversible
Figure 8 : Coupe histologique dune dent diagnostique en pulpite irrversible (Seltzer and Bender)
c)
Ncrose pulpaire
2.
Inflammation
25
Les rcepteurs TLRs (Toll like receptors) prsents sur les membranes cellulaires et des
endosomes, dtectent les composants bactriens et dclenchent la raction inflammatoire
par lactivation de facteur nuclaire kappaB (Pevsner-Fischer, Morad et al. 2007).
La scrtion de cytokines pro-inflammatoires par les cellules actives et le relargage par la
dminralisation dentinaire cre un gradient chmotactique, recrutant et activant les
cellules du systme immunitaire (Reing, Zhang et al. 2009; Kokkas, Goulas et al. 2011)
Les cellules de dfense infiltrant la pulpe, les lymphocytes B et T, les plaquettes, les
neutrophiles et les macrophages augmentent en nombre au fur et mesure que la lsion
progresse. Paradoxalement, larrive de ces cellules provoque des dommages au tissu car les
cellules relarguent des enzymes protolytiques digrant la MEC pour atteindre la zone
lse. De plus, ces cellules librent des radicaux libres, des enzymes notamment des MMPs
aux effets dltres sur les protines, lADN et les lipides. Lexposition des cellules ces
molcules peut induire ncrose ou apoptose par activation de la voie des MAP-kinase ou la
voie du NFkappa B (Fiers, Beyaert et al. 1999; Simon, Berdal et al. 2011). Les activateurs de
ces voies de signalisation, le stress cellulaire, lexposition du LPS bactrien et les chocs
thermiques, participent linflammation pulpaire (Guha,Mackman 2001).
Les rles des rseaux capillaires et nerveux sont prendre en compte lors de linflammation
pulpaire. La vasodilatation lors de la rponse inflammatoire permet lapport de cellules
immunitaires et de progniteurs privasculaires (Sloan,Smith 2007; Toda, Ayajiki et al. 2012)
Linnervation dentaire participe aussi la rponse inflammatoire. Lors dune inflammation
neurognique, les nerfs affrents ragissent aux antignes bactriens par le relargage de
neuropeptides qui recrutent et activent le systme immunitaire (Caviedes-Bucheli, Munoz et
al. 2008; Cooper, Takahashi et al. 2010; Manuja, Nagpal et al. 2010). Plusieurs neuropeptides
ont une action reconnue dans ces mcanismes inflammatoires : les Calcitonin Gene Related
Peptide (GRP),Calcitonine (CT),Substance P (SP) sont retrouves dans les pulpes
inflammatoires.
II.
Enjeux de la rgnration
27
Linfection de la pulpe dentaire cause par la carie ou par un traumatisme, ncessite souvent
un traitement endodontique. Ce traitement a pour but dliminer lensemble du
parenchyme pulpaire vascularis et innerv, les bactries et leurs toxines. Le nettoyage par
des agents chimiques est associ une mise en forme mcanique du rseau canalaire afin
dobtenir la dsinfection du rseau canalaire. Le maintien dans le temps de cette
dsinfection est recherch par une obturation tanche et complte du rseau canalaire par
un matriau inerte.(Huang 2008; Huang 2009).
Malgr un succs clinique rapport, les tudes valuant les traitements endodontiques
montrent des taux dchec trs importants, avec environ 70% de traitements insatisfaisants
par manque dtanchit, contamination bactrienne ou persistance des pathologies
infectieuses ou inflammatoires de la pulpe. En effet, la complexit de lanatomie radiculaire
cre des zones non instrumentables, peu accessibles aux solutions de dsinfection
(Robinson, Lumley et al. 2012) et aux produits dobturation canalaire. Une dent traite
endodontiquement a 5 10 fois plus de risques de prsenter une lsion apicale
(Buckley,Spangberg 1995; Friedman, Abitbol et al. 2003) induisant un essaimage bactrien
pouvant conduire une greffe bactrienne sur un organe vital (cur, rein, articulation...). De
plus, du fait de labsence dapport sanguin et de la disparition de la proprioception, les
proprits de rsistance de la dentine aux pressions axiales diminuent, conduisant
lapparition de fissures, puis de fractures qui peuvent condamner la dent lextraction. En
outre, la perte de vitalit pulpaire des dents permanentes immatures implique larrt de la
formation de la dentine et la maturation de la dent.
Ainsi, les recherches actuelles en endodontie travaillent la mise au point de mthodes
alternatives, efficaces, fiables et sres (Nakashima,Akamine 2005; Murray, Garcia-Godoy et
al. 2007). Il existe notamment une volont de crer des alternatives biologiques au
traitement endodontique, avec le dveloppement de lendodontie rgnratrice , visant
llimination des tissus pulpaires infects ou ncross et leur remplacement par un tissu
pulpaire rgnr pour revitaliser les dents.
De nombreux scientifiques et dentistes travaillent ensemble la ralisation de ce projet
ambitieux (Tziafas 2004; Nakashima,Akamine 2005; Huang 2009; Sun, Jin et al. 2011; Rai,
Kaur et al. 2012; Iohara, Murakami et al. 2013; Masthan, Sankari et al. 2013), dont le but
ultime de ce traitement rgnrateur vise reconstituer le continuum de tissu la frontire
28
A.
Comme voqu plus haut, il est dsormais dmontr qu'une population de cellules
prognitrices se trouve au sein de la pulpe dentaire, quelles peuvent se diffrencier en cas
dagression pulpaire. Ainsi, les odontoblastes dtruits peuvent tre remplacs par de
nouvelles cellules pseudo-odontoblastiques (odontoblast-like), issues de la diffrenciation
des cellules mesenchymateuses indiffrencies (Nakashima,Akamine 2005; Huang 2008;
Huang 2009; Huang, Gronthos et al. 2009; Scheller, Krebsbach et al. 2009; Sun, Jin et al.
2011).
Les thrapeutiques de maintien de la vitalit pulpaire par formation dun pont de dentine
rparatrice, aprs une lsion pulpaire rversible, reposent sur ce principe. Cependant, le
pronostic dun coiffage pulpaire dans les cas de caries dentinaires profondes ou de
traumatismes reste assez imprvisible et doit donc tre limite quelques cas bien
slectionns (Bashutski,Wang 2009). En effet, les rsultats de cette thrapie sont trs
dpendants du type deffraction pulpaire, de ltat inflammatoire de la pulpe, de l'ge de la
dent, des modalits de traitement (choix du matriau de coiffage) et de l'tanchit de la
restauration (Mjor 2002; Murray, Windsor et al. 2002; Ward 2002; Murray, About et al.
2003; Tziafas 2004). De plus, le diagnostic clinique du degr dinflammation pulpaire est
dlicat poser, il nexiste pas actuellement de lignes directrices fondes sur la preuve,
permettant aux cliniciens de dterminer quels cas mritent d'tre traits par coiffage
pulpaire (Huang 2008; Sun, Jin et al. 2011). De fait, il nest pas rare que les dents ainsi
traites ncessitent ensuite un traitement endodontique.
Les
progrs
dans
la
comprhension
de
la
composition
molculaire
et
des
recherche
rgnrative,
dans
lesquelles
la
pulpe
endommage
est
limine
B.
pralable. In vitro, la ralisation dun tissu reproduisant le parenchyme pulpaire est ralis.
Deux modles de rgnration pulpaire partielle ont t proposs et expriments chez
lanimal. Le premier modle consiste implanter un culot de DPSCs autologue au niveau
dune pulpotomie partielle, le second mettre en place une matrice de collagne
ensemence de cellules souches tries (CD31-, CD146-) dans la chambre pulpaire aprs
pulpotomie chez lanimal.
Notre approche de la rgnration pulpaire sest donc concentre sur la rgnration
partielle, dont la mise en uvre semble plus simple. Une fois la rgnration partielle
matrise, la meilleure comprhension des mcanismes molculaires de cicatrisation
permettra daborder la synthse de novo de la pulpe dentaire.
Les concepts d'ingnierie tissulaire appliqus la pulpe dentaire ont t tudis in vitro et in
vivo (Mooney, Powell et al. 1996). Le collagne constitue llment principal de la matrice
extracellulaire de la pulpe dentaire et limplantation in vivo de matrices collagniques
ensemences de cellules ont montr la possibilit de vascularisation de ces matrices. Afin de
ne pas crer une inflammation lie la dgradation de produits de la matrice, le collagne
de type I semble parfaitement adapt.
Les traitements de revascularisation sont proposs lors datteintes pulpaires sur des dents
permanentes immatures. Cette technique semble intressante mais limite aux dents trs
immatures. La nature du tissu prsent dans le canal et la possibilit dallongement
radiculaire font lobjet de dbats (Neha, Kansal et al. 2011; Nosrat, Seifi et al. 2011;
Andreasen,Bakland 2012)
C.
Lorsque le tissu pulpaire est entirement dtruit, la synthse de novo de la pulpe doit avoir
lieu dans le but de rgnrer le tissu. Le volume de la pulpe mature est trs faible (environ
10-100 l), par consquent, la rgnration de la pulpe devrait tre relativement plus simple
que celle pour les grands organes ou de tissus. Cependant, ce tissu est considr comme un
tissu difficile concevoir et rgnrer en raison des caractristiques suivantes: 1) une
situation unique anatomique des tissus de la pulpe contenus dans une cavit ayant un
foramen apical troit, compliquant l'angiogense lors de l'ingnierie tissulaire; 2) la structure
31
du tissu pulpaire, les diffrents types de cellules (par exemple, les odontoblastes) en
diffrents couches et zones d'innervation.
Rcemment, plusieurs quipes ont montr la faisabilit de limplantation et de la survie de
cellules dans la dent in vivo. Lquipe dHuang (Huang 2009) a montr la ralisation de tissu
minralis par limplantation de cellules parodontales dans chambre pulpaire de la canine de
chien. Iohara et al (Iohara, Murakami et al. 2013) montrent une rgnration pulpaire
partir de diffrentes cellules souches, leur permettant dobtenir un tissu pulpaire vascularis
et innerv.
D.
Ingnierie tissulaire
Pour le moment, ces socits prives ninterviennent pas en France et dans la plupart des
pays europens. Ces banques de cellules permettraient un accs rapide aux cellules et la
ralisation en un dlai court de matrices implantables chez les patients.
La thrapie cellulaire est efficace pour la rparation de dfauts de taille importante.
Lapproche des cellules souches fournit de meilleurs rsultats en raison de leurs capacits de
division et de diffrenciation en rponse des signaux micro-environnementaux. En raison
de ces caractristiques, lemploi de cellules souches pulpaires en vue de la rgnration
pulpaire parat tre la meilleure voie.
E.
Cette technique repose sur le fait que l'inflammation pulpaire reste compartimente un
certain temps, avant que l'ensemble du tissu ne soit atteint (Huang 2009). Les donnes
actuelles suggrent que la partie saine de la pulpe pourrait tre conserve et aurait, de plus,
le potentiel pour rgnrer la partie perdue (Huang 2009). Afin de permettre
cette
33
III. Objectifs
34
Ce travail sinscrit dans un projet global du laboratoire dingnierie orofaciale partir des
cellules souches msenchymateuses. Il a pour buts de poser les jalons de la rgnration
pulpaire, travers la mise au point dune pulpe quivalente implante dans un modle
murin. Nous nous sommes placs dans un contexte de rgnration pulpaire partielle, en
utilisant une population de cellules pulpaires htrognes. Pour lensemble des
manipulations in vivo, nous avons travaill en allogreffe.
35
36
A.
1.
Matriel
Cultures cellulaires
37
2.
3.
38
avec du DMEM sans srum, et les concentrations de radioactivit des surnageants et culots
cellulaires sont mesures dans un compteur (Cobra II, Packard, USA).
Le rendement de marquage loxyne-Indium 111 peut ainsi tre dtermin, il est exprim
par le rapport du comptage des cellules en suspension aprs le lavage (comptages des
cellules) sur le surnageant du culot (activit totale obtenue juste aprs le marquage).
Dans nos exprimentations chez le rat, le contrle choisi est constitu de matrices
ensemences de cellules marques radioactivement, puis lyses, avant mlange avec le
collagne. La lyse cellulaire est obtenue par la suspension du culot cellulaire dans une
solution hypotonique (eau distille) pendant 5 min.
B.
1.
In vivo
Implantation ectopique
Les 6 rats utiliss lors de cette manipulation sont des rats LEWIS (Janvier) de 6 semaines Les
rats sont anesthsis par une injection intrapritonale dune solution de 0.1 ml/10g de
ktamine 20% (Imalgne 500, Bayer Pharma) et xylazine 5% (Rompun 2%, Merial Inc.). Le rat
est plac en dcubitus ventral. Le dos est ras puis dsinfect (Betadine). Une incision est
pratique laide dun bistouri ct doit du rat puis une poche sous cutane ralise laide
de ciseaux. Un lattis avec ou sans cellules est dispos dans la poche sous-cutane. Les berges
de la plaie sont sutures (fil non rsorbables, 4-0, Ethicon). La mme opration est rpte
ct gauche avec une matrice sans cellules si le ct droit a reu une matrice cellularise et
vice-versa Le sacrifice de 3 animaux a eu lieu 15 jours aprs limplantation et les 3 autres
animaux 30 jours aprs limplantation.
2.
20% (Imalgne 500, Bayer Pharma) et Xylazine 5% (Rompun 2%, Merial Inc.). Au niveau de la
premire molaire maxillaire, une cavit occlusale est ralise par fraisage (fraise boule
surtaille, ISO 005, Maillefer, turbine Kavo GentleSilence) sous microscope (Zeiss, Pico)
permettant laccs la chambre pulpaire. Le plafond de la chambre pulpaire est ensuite
effondr et lexrse du parenchyme pulpaire camrale complte. Lhmostase est
obtenue par compression laide de cnes de papier striles. Les matrices cellularises sont
mises en place dans lespace quoccupait la pulpe camrale. La cavit daccs est ensuite
isole de faon tanche par la mise en place dun ciment biocompatible (Biodentine,
Septodont) puis dune couche de composite photopolymrisable (FloRestore, Denmat). Les
rats sont ensuite sacrifis 1 mois.
C.
1.
Techniques dimagerie
scanner
Le systme (Microscanner Skyscan 1172#060 Camra CCD 5x10 cm) est compos
dun tube radio fixe et dun capteur CCD. Les images ont t obtenues 80 V et 100 A, un
filtre Aluminium d1 mm dpaisseur tant mis en place. Les chantillons taient placs dans
un cryotube contenant de lalcool 70, le bouchon de ce cryotube rendu solidaire de laxe de
rotation du micro-scanner. Pour chaque chantillon, une srie de 400 acquisitions a t faite
avec une rotation de 0,45 entre chaque image. Les sries dacquisition ont ensuite t
reconstruites pour chaque chantillon, enregistres sous le format DICOM puis analyses.
2.
SPECT
Les acquisitions SPECT ont t ralises pendant 15 min minutes (acquisition de la tte
uniquement), 35 min (corps entier).
3.
Autoradiographie
Aprs cryofixation lazote liquide, les matrices cellularises ont t passes au cryotome
aprs inclusion en OCT afin dobtenir des coupes de 20m dpaisseur dposes sur une
lame de verre. Les lames ont t rendues conductives par lapplication dadhsif mtallis
du ct libre de la lame puis place dans la chambre du beta-imageur (BIOSPACE LAB), sous
atmosphre partielle dargon. Les donnes ont t acquises durant toute la nuit.
D.
Analyse histologique
Lors du sacrifice, aprs anesthsie, la fixation des tissus est ralise par une perfusion
intracardiaque de para-formaldhyde 4%. Les maxillaires sont prlevs, puis immergs
dans une solution de para-formaldhyde 4% pendant 5 jours. La dminralisation est
ralise par immersion dans une solution dacide nitrique 7% pendant 36 heures.
Les pices histologiques sont ensuite dshydrates par passage successifs dans des bains
dalcools croissants puis de tolune, avant inclusion dans la paraffine (Paraplast). Des
coupes longitudinales de 7 m dpaisseur sont ralises au microtome.
Les coupes en paraffine sont dparaffines dans des bains de tolune et rhydrates dans
des bains dalcool dcroissants avant coloration ou immunohistochimie.
1.
Coloration lHmalun-osine
41
2.
Cette coloration a t employe pour ltude histologique des matrices places dans le dos
des animaux.
Les coupes dparaffines et rhydrates sont plonges dans un bain dhmalun pendant 4
minutes. Aprs rinage, elles sont immerges durant 4 minutes dans de la Fuchsine Ponceau
puis rinces leau actifie, 5 %. Elles sont ensuite plonges dans lOrang G-Molybdique, 4
min, nouveau rinces leau actifie puis contre-colores au Vert-Lumire pendant 5
min.
Un dernier rinage leau puis la dshydratation en alcools croissants et enfin en bain de
tolune prcdent le montage des lames au DPX. Lobservation peut ensuite se faire en
microscopie photonique.
3.
Immunohistochimie
42
Les lames sont immerges dans une solution de3-3 Diaminobenzidine (DAB) 0,04% de
peroxyde dhydrogne 30% (40 mg de DAB, Sigma, 150 mL de PBS1X et 60 L dH2O2)
pendant 20 min temprature ambiante. Entre chaque tape, les lames sont soigneusement
rinces au PBS 1X/BSA 1%.
Les lames sont ensuite montes en milieu aqueux (DEPEX) afin dtre observes en
microscopie photonique.
43
V.
Rsultats
44
A.
Afin de pouvoir implanter les cellules pulpaires chez dautres rats, des rats LEWIS sont
utiliss. Les germes de molaires sont extraits chez des rats gs de 5 jours, les pulpes sont
ensuite dissques et mises en culture selon le protocole.
Figure 10 : Cellules pulpaires de rat (P0) en culture (A) et cellules pulpaires humaines (B)
phnotype des cellules pulpaires de rat est lgrement diffrent par rapport aux cellules
pulpaires humaines: les cellules pulpaires de rat apparaissent moins fusiformes que les
cellules humaines (Fig.10)
2.
45
Prolifration cellulaire
TO
J2
Nombre de
cellules par
ml
(en million)
J4
J6
J8
Temps
Figure 11 : Analyse de la prolifration cellulaire dans les matrices de collagne
Les cellules pulpaires sont capables de prolifrer au sein dune matrice de collagne I.
Figure 12: Imagerie de SPECT / CT dun essai de marquage de cellules pulpaires dans une matrice collagnique
46
3.
Implantation ectopique
D
m
200 m
47
Nous proposons ici une pulpe quivalente, compose dune matrice de collagne
ensemence de cellules souches pulpaires. Ce modle vise reconstruire une matrice
extracellulaire mimant lenvironnement naturel des cellules. Linnocuit de nos matrices a
t teste et montre une parfaite tolrance de lorganisme.
4.
Mise au point du modle dimplantation dans la molaire
de rat
Le modle traditionnel deffraction pulpaire au laboratoire tant ralis en routine, nous
avons utilis lexprience acquise pour mettre au point le modle de pulpotomie puis
dimplantation de matrice dans la chambre pulpaire (Fig.16).
48
500 m
Les essais prliminaires ont pu mettre en vidence des fractures dentaires msio-distales et
de la crte marginale distale causes par une limination trop importante des tissus
minraliss. En labsence de fracture, aucune perte dobturation na t note (Figure 18). La
matrice tant dispose sur une compresse strile avant la mise en place dans la chambre
pulpaire, son volume tait diminu cause de laspiration de liquide par le tissu, do un
volume et une paisseur trop faibles de cette matrice avant limplantation. Il a suffi de
dposer la matrice sur une plaque de culture cellulaire pour viter ce problme.
49
m
d
Lun des points importants de cette technique dimplantation est la mise en place dun
ciment biocompatible au contact direct de la matrice cellularise. Un silicate de calcium,
Biodentine (Septodont) a t utilis lors de nos exprimentations (Figure 19). Il na pas t
not de raction inflammatoire au niveau de cette interface
50
Figure 20 : Technique d'implantation des matrices dans la premire molaire maxillaire de rat aprs pulpotomie
51
B.
Cytotoxicit du marqueur
Figure 22 : Prolifration et survie des cellules pulpaires de rat avec et sans marquage radioactif
Le marquage lOxyne Indium 111 ne modifie pas la prolifration cellulaire et la survie cellulaire de faon
statistiquement significative.
52
Le marquage lOxyne-Indium a ainsi t valid pour les cellules pulpaires. Dautres types de
cellules pulpaires prsentent aussi de bons rsultats au marquage radioactif et pourraient
tre utiliss dans des protocoles proches.
2.
Le suivi in vivo par SPECT / CT aprs implantation a t ralis sur des matrices ensemences
de cellules pulpaires marques vivantes ou lyses. Le signal est dtectable dans les dents
implantes avec une matrice de cellules marques pendant 3 semaines aprs implantation
sans dcroissance significative (aprs correction de la dcroissance due la demi-vie
radioactive) au fil du temps pour les cellules entires ; au contraire le signal est trs faible
ds limplantation pour les cellules lyses.
Figure 23 : Suivi par SPECT/CT d'une matrice cellularise implante dans une premire molaire de rat
53
Limagerie par SPECT/CT permet de valiser la bonne implantation de la matrice dans la dent
juste aprs limplantation puis de suivre le devenir des cellules aprs limplantation grce
leur marquage radioactif (figures 23 et 24).
Figure 24. Reconstructions SPECT/CT chez un animal implant avec des cellules entires (flche rouge) et des cellules
lyses (flche bleue)
Le marquage est suivi pendant 21 jours. Le marquage de la matrice avec les cellules vivantes (flche rouge) est plus fort
que la matrice ensemence de cellules lyses (flche bleue).
Le signal des matrices ensemences de cellules vivantes est 5 fois plus fort que celui des
matrices contenant des cellules lyses (figure 25) alors que le marquage des cellules
loxyne Indium est strictement le mme. Ce rsultat montre une corrlation entre lintgrit
cellulaire et lintensit du signal.
54
Figure 25. Quantification du signal des matrices implantes avec des cellules lyses et des cellules entires.
Le signal des cellules pulpaires vivantes est statistiquement plus important que le signal des cellules lyses J0, J7 et J14.
Pour savoir si les cellules implantes restent localises dans la chambre pulpaire ou se
dissminent dans lorganisme, les zones crnio-faciales et lensemble du corps ont t
scannes laide du SPECT/CT. Aucun signal na t dtect en dehors de la chambre
pulpaire pendant toute la dure du suivi, suggrant que les cellules implantes restent
localises dans la dent (Figures 26 et 27). Les organes dlimination des dbris cellulaires
(foie, reins, rate ou poumon en ces de diffusion veineuse) ont t particulirement scruts et
ne montrent aucun signal radioactif.
Figure 26 : Imagerie par SPECT/CT d'une tte de rat aprs implantation dans les premires molaires maxillaires. Aucun
signal radioactif nest retrouv en dehors de la zone dimplantation.
55
L'intensit du signal SPECT in vivo est lie l'intgrit des cellules implantes, et a permis un
suivi longitudinal non-invasif pendant au moins 3 semaines des cellules pulpaires
implantes.
Aucun signal radioactif, lexception des premires molaires implantes, nest mis en
vidence au niveau crnio-facial, ni au niveau des organes dlimination.
56
C.
Fonctionnalit du tissu
1.
Analyse histologique
57
Des structures vasculaires sont observes auprs des matrices ensemences de cellules
vivantes. Ces structures sont marques par lanticorps anti FvW. Autour des cellules
ensemences de cellules pulpaires lyses, ces structures vasculaires ne sont pas retrouves
(Figure 29).
2.
Analyse en CT
58
59
VI. Discussion
60
A.
Protocole
Mme si notre protocole a volu au cours des diffrentes manipulations, nous avons fait le
choix dun protocole proche de la clinique humaine, dans la perspective dun transfert de
cette thrapeutique chez lhomme.
-
Nous avons pris le parti de prendre une population totale de cellules pulpaires, sans tri
cellulaire pralable. Dans notre dmarche de mise au point du modle, nous avons estim
quil tait prfrable dinitier les exprimentations avec une population pulpaire htrogne.
Lenrichissement en cellules prognitrices pourra se faire par la suite. Cependant, ce jour,
en dpit de recherches actives, aucun marqueur spcifique permettant une purification
totale des progniteurs de la pulpe na t trouv. Des cellules souches de la pulpe ont t
tries sur leur expression de marqueurs de surface comme STRO-1 ou CD34 ou sur leur
capacit d'exclusion d'un colorant de liaison l'ADN ou en fonction de leur taille (Gronthos,
Brahim et al. 2002; Iohara, Zheng et al. 2008). Les diffrents types de sous-populations de
cellules obtenues pourraient conduire diffrents potentiels de diffrenciation. Dans
lobjectif de reconstruire une pulpe fonctionnelle, lenrichissement sur une potentialit de
diffrenciation odonto/ostoblastique ne semble pas pertinent, car il pourrait conduire
une minralisation de lensemble de la chambre pulpaire, ce qui nest pas souhaitable. Par
contre, nous pourrions envisager dutiliser lavenir des DPSCs enrichies en cellules
prognitrices prsentant des proprits angiogniques ou de rsistance lhypoxie accrues.
Il a notamment t montr que les DPSCs CD31 / CD146 prsentent un potentiel
angiognique trs important dans l'ischmie crbrale (Sugiyama, Iohara et al. 2011)).
61
Il est vident que les interactions entre les cellules souches et de leur milieu sont
essentielles, non seulement en terme de trafic cellulaire, de survie, de prolifration et de
diffrenciation, mais galement pour dterminer le potentiel de l'environnement sur la
rgnration des tissus. Ce biomatriau doit bien sr tre biocompatible et non toxique et
avoir des caractristiques physiques et mcaniques optimales (Landrigan, Flatley et al.
2010).
Dans le contexte de rgnration de la pulpe dentaire, parmi les diffrents types de
biomatriaux disponibles, notre choix sest port sur un matriau naturel, le collagne de
type 1, car il permet de reproduire le microenvironnement de la pulpe (Nakashima,Reddi
2003; Iohara, Nakashima et al. 2004; Nakashima,Akamine 2005; Murray, Garcia-Godoy et al.
2007; Prescott, Alsanea et al. 2008; Ishimatsu, Kitamura et al. 2009; Kim, Xin et al. 2010). De
plus il prsente une excellente biocompatibilit (Hubbell 1995; Helary, Bataille et al. 2010).
Par ailleurs, un hydrogel de collagne est biodgradable avec des produits de dgradation
physiologiquement acceptables (Middelkoop, de Vries et al. 1995), ne ncessitant pas ainsi
une nouvelle intervention en vue dune ablation chirurgicale. De plus, il offre une porosit
adquate pour faciliter la pntration des cellules et leur prolifration, pour permettre le
transport des nutriments, de l'oxygne et de dchets mtaboliques efficacement (Geiger, Li
et al. 2003). Des travaux ont montr que les cellules dans ces matrices de collagne
prsentaient des divisions cellulaires rgules et que le processus de diffrenciation des
progniteurs / cellules souches tait activ (Ortinau, Schmich et al. 2010; Estes,Guilak 2011).
Dans notre tude, nous n'avons pas mis en vidence de minralisation de la chambre
pulpaire, laquelle on aurait pu sattendre en implantant des cellules pouvant facilement
subir un processus de diffrenciation odonto / ostognique. Cela confirme que l'utilisation
dune matrice lche de collagne de type 1 est adapte pour reconstruire la pulpe dentaire.
Une alternative ce matriau naturel, serait lutilisation de polymres synthtiques, comme
le PGA (acide polyglycolique), dont la biocompatibilit est moins bonne mais dont le taux de
dgradation et les proprits mcaniques sont plus contrlables (Mooney, Powell et al.
1996; Bohl, Shon et al. 1998; Buurma, Gu et al. 1999; Vasita,Katti 2006; Vasita,Katti 2006). Il
pourrait tre judicieux dutiliser de telles matrices, si nous ajoutions des peptides ou des
molcules proangiogniques aux pulpes quivalentes. Le taux de libration pourrait tre
ainsi plus contrlable dans lespace et dans le temps (Ferracane, Cooper et al. 2010).
62
B.
Une des problmatiques lies l'ingnierie tissulaire concerne le devenir des cellules
implantes en pralable une utilisation clinique potentielle. En effet, il est capital de
dterminer si les cellules implantes restent dans la pulpe artificielle pour participer aux
processus de rgnration dun tissu pulpaire vascularis et innerv, ou bien si elles migrent
via la circulation sanguine vers un autre tissu, ou encore si elles dgnrent et sont
limines par phagocytose.
Si les marquages cellulaires la Green Fluorescent Protein (GFP) ou par la beta-galactosidase
sont des techniques couramment dcrites, elles sont inutilisables dans notre modle
dentaire en raison de la prsence de tissus minraliss. Pour limplantation spcifique de la
pulpe quivalente dans la chambre pulpaire, limagerie nuclaire et lIRM sont les deux
seules mthodes envisageables d'imagerie non invasives.
Nous avons choisi de faire le suivi in vivo des cellules par marquage par imagerie nuclaire.
Le marquage des cellules pulpaires a t fait lIndium-oxine suivi d'une dtection par
scintigraphie monophotonique (SPECT). Cet isotope a t valid dans les marquages
cellulaires dans des tudes prcliniques (Aicher, Brenner et al. 2003). Il est couramment
utilis chez l'homme pour le radiomarquage des leucocytes dans le cadre de limagerie de
linfection (Thakur, Lavender et al. 1977; Thakur, Segal et al. 1977; Roca, de Vries et al.
2010). Il et est bien tabli pour surveiller des cellules implantes dans plusieurs modles, y
compris le traumatisme crnien aigu, lischmie crbrale et l'infarctus. Un tel marquage
radioactif permet de suivre la migration des cellules avec une grande sensibilit en utilisant
la scintigraphie monophotonique (SPECT). En outre, le processus de marquage radioactif n'a
pas modifi la viabilit ni la capacit de prolifration des cellules de la pulpe in vitro.
Limagerie nuclaire offre une sensibilit leve avec la possibilit de quantification du signal
des concentrations trs faibles (de l'ordre de 10-12 10-15 mole /l), idale pour le suivi
cellulaire. De plus, cette technique permet dobtenir des informations sur la biodistribution
de cellules marques dans tout le corps. Cela permet de vrifier qu'il n'y a pas
d'accumulation de dbris cellulaires dans les organes impliqus dans la clairance du sang
(reins, foie et rate) ni dans les poumons en cas de diffusion veineuse. En outre, l'imagerie du
corps entier permet la dtection d'une diffusion possible des cellules implantes, ce qui,
63
dans le cas des DPSCs, pourrait conduire des minralisations ectopiques, un problme
critique en ingnierie tissulaire.
Par contre, la radioactivit diminuant avec le temps, le suivi ne peut se faire que sur une
priode de temps limite, et la manipulation des isotopes reste contraignante.
Dans l'avenir, l'utilisation de l'IRM, pourrait permettre un suivi plus long terme des cellules
implantes, avec toutefois une sensibilit infrieure limagerie nuclaire. Pour lIRM, le
marquage des cellules est magntique. Les agents de marquage de rfrence sont les
nanoparticules supermagntiques de fer (AMNP pour anionic superparamagnetic
nanoparticles), utiliss pour de nombreux types cellulaires sans effet dltre
(Bulte,Kraitchman 2004; Poirier-Quinot, Frasca et al. 2010; Robert, Fayol et al. 2010; Brule,
Levy et al. 2011). Pour nos exprimentations, le domaine de frquence radio spcifique reste
dvelopper.
Toutefois, quelle que soit la mthode dimagerie utilise, elle ne permet de rpondre avec
certitude la question de lorigine des cellules prolifratives, retrouves dans le lattis. Mme
si la quantit de signal SPECT est importante uniquement dans le cas des pulpes
quivalentes avec des cellules intgres, ce qui suggre que les cellules implantes restaient
viables, nous ne pouvons exclure la possibilit que les cellules en prolifration mises en
vidence en histologie, soient des cellules de l'hte recrutes. La preuve scientifique pourrait
tre apporte soit en implantant des cellules humaines chez des rats immunodprims ou
grce l'analyse FISH avec des sondes spcifiques donneurs/receveurs, qui toutes deux
permettraient
C.
-
de
distinguer
les
cellules
implantes
des
cellules
htes.
Limites du modle
Inflammation
Dans nos travaux, les cellules ont t implantes dans des dents saines, alors quen clinique,
les cellules seraient implantes dans les dents prsentant une inflammation gnre par une
infection bactrienne ou un traumatisme. Il serait pertinent dans lavenir dutiliser un
modle mimant linflammation pulpaire. La notion de rversibilit/irrversibilit, ralit de
cliniciens mais non prouve histologiquement et du diagnostic de cette inflammation se
retrouverait alors au centre de ces recherches (Eba, Murasawa et al. 2012) proposent un
64
Mme en faisant voluer le modle chez le rat en tenant compte de paramtres cliniques,
ce modle animal prsente des limites, notamment en termes dchelle et danatomie. Il
en rsulte une restriction dans lapplication des procdures cliniques et dans la prennit
des obturations, ce qui bien entendu limite le suivi dans le temps.
Nous envisageons donc de faire voluer notre travail vers un autre modle animal, savoir
le mini-porc. Le transfert vers un modle animal non-rongeur permettrait en effet une
relle tape prclinique. En effet, cet omnivore prsente une physiopathologie assez
similaire lhomme, notamment en terme de rponse pharmacologique, mtabolique et
anatomique. Ceci semble galement vrai pour le systme buccodentaire. Les porcs
prsentent par exemple un systme de dentition comparable lhomme, avec deux
dentures. Il nous sera donc possible de cultiver des cellules pulpaires de dents temporaires,
dont la faisabilit a dj t prouve. Afin de faire la preuve du concept, bien quil soit
rapport des greffes de cellules, de mini-cochons consanguins, nous envisageons de rester,
comme chez lhomme, dans un systme de greffe autologue. Les pulpes quivalentes
seraient donc prpares de manire similaire avant implantation dans les prmolaires et
molaires aprs pulpotomie.
D.
Il est dsormais tabli que la dent est une source de cellules souches msenchymateuses
exploiter pour la dentisterie rgnrative. Une pulpe saine peut tre facilement recueillie
aprs la chute de dents temporaire ou leur extraction, ainsi que lextraction de prmolaires
ou troisimes molaires ralise dans le cadre dun traitement orthodontique. La question de
la prservation de ces cellules en vue dune potentielle utilisation quelques dizaines
dannes aprs, nest pas rsolue. En France, il est probable que l'utilisation thrapeutique
des cellules souches pulpaires de l'homme sera dveloppe travers la mise en place de
biobanques de cellules gres par les hpitaux universitaires ou d'autres organismes
nationaux. Comme toutes les cellules souches, celles de la pulpe ont des proprits
immunomodulatrices, il pourrait donc tre envisageable de les utiliser en allogreffe. Dans ce
65
66
VII. Conclusion
67
Ce travail constituait une premire tape en vue dune thrapie permettant de rgnrer la
pulpe la place du traitement endodontique.
Nos rsultats ont dabord montr la faisabilit de la pulpe quivalente in vitro. La
biocompatibilit a ensuite t value en implantation ectopique, la bonne intgration de
ces matrices les rendant difficiles localiser.
Ltape suivante, savoir limplantation dans la dent a ncessit la mise au point et la
validation du modle de pulpotomie chez le rat. Lutilisation de la technique de marquage
loxyne-Indium sur les cellules pulpaires a ensuite permis limplantation de cette pulpe
quivalente et le suivi par SPECT/CT, CT des cellules implantes in vivo. En parallle,
lemploi des techniques classiques dhistologie ont permis de dmontrer la survie cellulaire,
la prolifration, langiogense et une no-innervation. Labsence de migration des cellules
implantes hors de la zone dimplantation est lun des points importants de cette technique
de rgnration pulpaire.
Les rsultats obtenus lors de ces travaux permettent dimaginer terme la transposition
dune technique de rgnration pulpaire chez lhomme. Cependant, de nombreuses
questions se prsentent quant la nature et la fonctionnalit du tissu ainsi que son
comportement long terme. Lamlioration de la pulpe quivalente par la slection de
cellules, lutilisation de facteurs de croissance ou dautres agents et la comprhension des
ractions inflammatoires aprs la mise en place de la pulpe quivalente sont les enjeux
de la russite de ce type de traitement. La poursuite du projet au sein du laboratoire chez un
animal plus proche de lhomme, le mini-porc ; sera extrmement intressante et mettre en
parallle avec les volutions des techniques de revascularisation.
68
VIII. Bibliographie
69
Aicher, A., W. Brenner, et al. (2003). "Assessment of the tissue distribution of transplanted human
endothelial progenitor cells by radioactive labeling." Circulation 107(16): 2134-2139.
Andreasen, J. O. and L. K. Bakland (2012). "Pulp regeneration after non-infected and infected
necrosis, what type of tissue do we want? A review." Dent Traumatol 28(1): 13-18.
Arthur, A., G. Rychkov, et al. (2008). "Adult human dental pulp stem cells differentiate toward
functionally active neurons under appropriate environmental cues." Stem Cells 26(7): 17871795.
Bashutski, J. D. and H. L. Wang (2009). "Periodontal and endodontic regeneration." J Endod 35(3):
321-328.
Batouli, S., M. Miura, et al. (2003). "Comparison of stem-cell-mediated osteogenesis and
dentinogenesis." J Dent Res 82(12): 976-981.
Bell, E., B. Ivarsson, et al. (1979). "Production of a tissue-like structure by contraction of collagen
lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro." Proc Natl Acad Sci U
S A 76(3): 1274-1278.
Bender, I. B., S. Seltzer, et al. (2003). "The incidence of bacteremia in endodontic manipulation:
preliminary report. 1960." J Endod 29(11): 697-700; discussion 696.
Bletsa, A., I. Fristad, et al. (2009). "Sensory pulpal nerve fibres and trigeminal ganglion neurons
express IL-1RI: a potential mechanism for development of inflammatory hyperalgesia." Int
Endod J 42(11): 978-986.
Bogovic, A., J. Nizetic, et al. (2011). "The effects of hyaluronic acid, calcium hydroxide, and dentin
adhesive on rat odontoblasts and fibroblasts." Arh Hig Rada Toksikol 62(2): 155-161.
Bohl, K. S., J. Shon, et al. (1998). "Role of synthetic extracellular matrix in development of engineered
dental pulp." J Biomater Sci Polym Ed 9(7): 749-764.
Brule, S., M. Levy, et al. (2011). "Doxorubicin release triggered by alginate embedded magnetic
nanoheaters: a combined therapy." Adv Mater 23(6): 787-790.
Buckley, M. and L. S. Spangberg (1995). "The prevalence and technical quality of endodontic
treatment in an American subpopulation." Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod
79(1): 92-100.
Bulte, J. W. and D. L. Kraitchman (2004). "Iron oxide MR contrast agents for molecular and cellular
imaging." NMR Biomed 17(7): 484-499.
Buurma, B., K. Gu, et al. (1999). "Transplantation of human pulpal and gingival fibroblasts attached to
synthetic scaffolds." Eur J Oral Sci 107(4): 282-289.
Caviedes-Bucheli, J., H. R. Munoz, et al. (2008). "Neuropeptides in dental pulp: the silent
protagonists." J Endod 34(7): 773-788.
Chaussain Miller, C., D. Septier, et al. (2002). "Human dermal and gingival fibroblasts in a threedimensional culture: a comparative study on matrix remodeling." Clin Oral Investig 6(1): 3950.
Cooper, P. R., Y. Takahashi, et al. (2010). "Inflammation-regeneration interplay in the dentine-pulp
complex." J Dent 38(9): 687-697.
Coulomb, B., L. Friteau, et al. (1998). "Advantage of the presence of living dermal fibroblasts within in
vitro reconstructed skin for grafting in humans." Plast Reconstr Surg 101(7): 1891-1903.
d'Aquino, R., A. Graziano, et al. (2007). "Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into
osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation."
Cell Death Differ 14(6): 1162-1171.
de Almeida, F. M., S. A. Marques, et al. (2011). "Human dental pulp cells: a new source of cell therapy
in a mouse model of compressive spinal cord injury." J Neurotrauma 28(9): 1939-1949.
Decup, F., N. Six, et al. (2000). "Bone sialoprotein-induced reparative dentinogenesis in the pulp of
rat's molar." Clin Oral Investig 4(2): 110-119.
Eba, H., Y. Murasawa, et al. (2012). "The anti-inflammatory effects of matrix metalloproteinase-3 on
irreversible pulpitis of mature erupted teeth." PLoS One 7(12): e52523.
70
Eleuterio, E., O. Trubiani, et al. (2013). "Proteome of human stem cells from periodontal ligament
and dental pulp." PLoS One 8(8): e71101.
Estes, B. T. and F. Guilak (2011). "Three-dimensional culture systems to induce chondrogenesis of
adipose-derived stem cells." Methods Mol Biol 702: 201-217.
Fadavi, S. and A. W. Anderson (1996). "A comparison of the pulpal response to freeze-dried bone,
calcium hydroxide, and zinc oxide-eugenol in primary teeth in two cynomolgus monkeys."
Pediatr Dent 18(1): 52-56.
Fang, C. Z., Y. J. Yang, et al. (2013). "Intraventricular injection of human dental pulp stem cells
improves hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats." PLoS One 8(6): e66748.
Farges, J. C., J. F. Keller, et al. (2009). "Odontoblasts in the dental pulp immune response." J Exp Zool
B Mol Dev Evol 312B(5): 425-436.
Farges, J. C., A. Romeas, et al. (2003). "TGF-beta1 induces accumulation of dendritic cells in the
odontoblast layer." J Dent Res 82(8): 652-656.
Ferracane, J. L., P. R. Cooper, et al. (2010). "Can interaction of materials with the dentin-pulp
complex contribute to dentin regeneration?" Odontology 98(1): 2-14.
Fiers, W., R. Beyaert, et al. (1999). "More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive
oxygen damage." Oncogene 18(54): 7719-7730.
Friedman, S., S. Abitbol, et al. (2003). "Treatment outcome in endodontics: the Toronto Study. Phase
1: initial treatment." J Endod 29(12): 787-793.
Gandia, C., A. Arminan, et al. (2008). "Human dental pulp stem cells improve left ventricular function,
induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction." Stem
Cells 26(3): 638-645.
Geiger, M., R. H. Li, et al. (2003). "Collagen sponges for bone regeneration with rhBMP-2." Adv Drug
Deliv Rev 55(12): 1613-1629.
Gerli, R., I. Secciani, et al. (2010). "Absence of lymphatic vessels in human dental pulp: a
morphological study." Eur J Oral Sci 118(2): 110-117.
Goldberg, M. (2008). "Histologie du complexe dentino-pulpaire." Encyclopdie Mdico Chirurgicale.
Goldberg, M. (2011). "Pulp healing and regeneration: more questions than answers." Adv Dent Res
23(3): 270-274.
Goldberg, M., J. C. Farges, et al. (2008). "Inflammatory and immunological aspects of dental pulp
repair." Pharmacol Res 58(2): 137-147.
Goldberg, M., N. Six, et al. (2009). "Dentin extracellular matrix molecules implanted into exposed
pulps generate reparative dentin: a novel strategy in regenerative dentistry." J Dent Res
88(5): 396-399.
Goldberg, M. and A. J. Smith (2004). "Cells and Extracellular Matrices of Dentin and Pulp: A Biological
Basis for Repair and Tissue Engineering." Crit Rev Oral Biol Med 15(1): 13-27.
Graziano, A., R. d'Aquino, et al. (2007). "Concave pit-containing scaffold surfaces improve stem cellderived osteoblast performance and lead to significant bone tissue formation." PLoS One
2(6): e496.
Gronthos, S., A. Arthur, et al. (2011). "A method to isolate and culture expand human dental pulp
stem cells." Methods Mol Biol 698: 107-121.
Gronthos, S., J. Brahim, et al. (2002). "Stem cell properties of human dental pulp stem cells." J Dent
Res 81(8): 531-535.
Gronthos, S., M. Mankani, et al. (2000). "Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and
in vivo." Proc Natl Acad Sci U S A 97(25): 13625-13630.
Guha, M. and N. Mackman (2001). "LPS induction of gene expression in human monocytes." Cell
Signal 13(2): 85-94.
Helary, C., I. Bataille, et al. (2010). "Concentrated collagen hydrogels as dermal substitutes."
Biomaterials 31(3): 481-490.
Huang, G. T. (2008). "A paradigm shift in endodontic management of immature teeth: conservation
of stem cells for regeneration." J Dent 36(6): 379-386.
71
Huang, G. T. (2009). "Pulp and dentin tissue engineering and regeneration: current progress." Regen
Med 4(5): 697-707.
Huang, G. T., S. Gronthos, et al. (2009). "Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs.
those from other sources: their biology and role in regenerative medicine." J Dent Res 88(9):
792-806.
Huang, G. T., T. Yamaza, et al. (2010). "Stem/progenitor cell-mediated de novo regeneration of
dental pulp with newly deposited continuous layer of dentin in an in vivo model." Tissue Eng
Part A 16(2): 605-615.
Hubbell, J. A. (1995). "Biomaterials in tissue engineering." Biotechnology (N Y) 13(6): 565-576.
I, D. A., E. Nargi, et al. (2011). "Vascular endothelial growth factor enhances in vitro proliferation and
osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells." J Biol Regul Homeost Agents
25(1): 57-69.
Iohara, K., M. Murakami, et al. (2013). "A novel combinatorial therapy with pulp stem cells and
granulocyte colony-stimulating factor for total pulp regeneration." Stem Cells Transl Med
2(7): 521-533.
Iohara, K., M. Nakashima, et al. (2004). "Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with
recombinant human bone morphogenetic protein 2." J Dent Res 83(8): 590-595.
Iohara, K., L. Zheng, et al. (2006). "Side population cells isolated from porcine dental pulp tissue with
self-renewal and multipotency for dentinogenesis, chondrogenesis, adipogenesis, and
neurogenesis." Stem Cells 24(11): 2493-2503.
Iohara, K., L. Zheng, et al. (2008). "A novel stem cell source for vasculogenesis in ischemia:
subfraction of side population cells from dental pulp." Stem Cells 26(9): 2408-2418.
Ishimatsu, H., C. Kitamura, et al. (2009). "Formation of dentinal bridge on surface of regenerated
dental pulp in dentin defects by controlled release of fibroblast growth factor-2 from gelatin
hydrogels." J Endod 35(6): 858-865.
Jegat, N., D. Septier, et al. (2007). "Short-term effects of amelogenin gene splice products A+4 and A4 implanted in the exposed rat molar pulp." Head Face Med 3: 40.
Jo, Y. Y., H. J. Lee, et al. (2007). "Isolation and characterization of postnatal stem cells from human
dental tissues." Tissue Eng 13(4): 767-773.
Jontell, M., T. Okiji, et al. (1998). "Immune defense mechanisms of the dental pulp." Crit Rev Oral Biol
Med 9(2): 179-200.
Kawashima, N. (2012). "Characterisation of dental pulp stem cells: A new horizon for tissue
regeneration?" Arch Oral Biol 57(11): 1439-1458.
Kerkis, I., C. E. Ambrosio, et al. (2008). "Early transplantation of human immature dental pulp stem
cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or
systemic?" J Transl Med 6: 35.
Kerkis, I. and A. I. Caplan (2012). "Stem cells in dental pulp of deciduous teeth." Tissue Eng Part B Rev
18(2): 129-138.
Kim, B. C., H. Bae, et al. (2012). "Osteoblastic/cementoblastic and neural differentiation of dental
stem cells and their applications to tissue engineering and regenerative medicine." Tissue
Eng Part B Rev 18(3): 235-244.
Kim, J. Y., X. Xin, et al. (2010). "Regeneration of dental-pulp-like tissue by chemotaxis-induced cell
homing." Tissue Eng Part A 16(10): 3023-3031.
Kiraly, M., K. Kadar, et al. (2011). "Integration of neuronally predifferentiated human dental pulp
stem cells into rat brain in vivo." Neurochem Int 59(3): 371-381.
Kokkas, A., A. Goulas, et al. (2011). "The role of cytokines in pulp inflammation." J Biol Regul Homeost
Agents 25(3): 303-311.
Koyama, N., Y. Okubo, et al. (2009). "Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells." J Oral
Maxillofac Surg 67(3): 501-506.
Lacerda-Pinheiro, S., N. Jegat, et al. (2006). "Early in vivo and in vitro effects of amelogenin gene
splice products on pulp cells." Eur J Oral Sci 114 Suppl 1: 232-238; discussion 254-236, 381232.
72
Landrigan, M. D., J. C. Flatley, et al. (2010). "Detection of dentinal cracks using contrast-enhanced
micro-computed tomography." J Mech Behav Biomed Mater 3(2): 223-227.
Maeda, T., T. Iwanaga, et al. (1987). "Distribution of nerve fibers immunoreactive to neurofilament
protein in rat molars and periodontium." Cell Tissue Res 249(1): 13-23.
Magloire, H., M. L. Couble, et al. (2004). "Odontoblast primary cilia: facts and hypotheses." Cell Biol
Int 28(2): 93-99.
Magloire, H., M. L. Couble, et al. (2009). "Odontoblast: a mechano-sensory cell." J Exp Zool B Mol Dev
Evol 312B(5): 416-424.
Magloire, H., J. C. Maurin, et al. (2010). "Topical review. Dental pain and odontoblasts: facts and
hypotheses." J Orofac Pain 24(4): 335-349.
Manuja, N., R. Nagpal, et al. (2010). "Dental pulp neuropathophysiology." J Clin Pediatr Dent 35(2):
121-127.
Marchetti, C., P. Poggi, et al. (1992). "Lymphatic vessels of the human dental pulp in different
conditions." Anat Rec 234(1): 27-33.
Martin, A., H. Gasse, et al. (2010). "Absence of lymphatic vessels in the dog dental pulp: an
immunohistochemical study." J Anat 217(5): 609-615.
Masthan, K. M., S. L. Sankari, et al. (2013). "Mystery inside the tooth: the dental pulp stem cells." J
Clin Diagn Res 7(5): 945-947.
Mathieu, S., A. El-Battari, et al. (2005). "Role of injured endothelial cells in the recruitment of human
pulp cells." Arch Oral Biol 50(2): 109-113.
Maurin, J. C., M. L. Couble, et al. (2013). "[Odontoblast: a key cell involved in the perception of
dentinal pain]." Med Sci (Paris) 29(3): 293-299.
Middelkoop, E., H. J. de Vries, et al. (1995). "Adherence, proliferation and collagen turnover by
human fibroblasts seeded into different types of collagen sponges." Cell Tissue Res 280(2):
447-453.
Mjor, I. A. (2002). "Pulp-dentin biology in restorative dentistry. Part 7: The exposed pulp."
Quintessence Int 33(2): 113-135.
Mjor, I. A., O. B. Sveen, et al. (2001). "Pulp-dentin biology in restorative dentistry. Part 1: normal
structure and physiology." Quintessence Int 32(6): 427-446.
Mohamadreza, B. E., A. Khorsand, et al. (2012). "Autologous Dental Pulp Stem Cells in Regeneration
of Defect Created in Canine Periodontal Tissue." J Oral Implantol.
Mooney, D. J., C. Powell, et al. (1996). "Engineering dental pulp-like tissue in vitro." Biotechnol Prog
12(6): 865-868.
Murray, P. E., I. About, et al. (2003). "Odontoblast morphology and dental repair." J Dent 31(1): 7582.
Murray, P. E., F. Garcia-Godoy, et al. (2007). "Regenerative endodontics: a review of current status
and a call for action." J Endod 33(4): 377-390.
Murray, P. E., L. J. Windsor, et al. (2002). "Analysis of pulpal reactions to restorative procedures,
materials, pulp capping, and future therapies." Crit Rev Oral Biol Med 13(6): 509-520.
Nakashima, M. and A. Akamine (2005). "The application of tissue engineering to regeneration of pulp
and dentin in endodontics." J Endod 31(10): 711-718.
Nakashima, M. and A. H. Reddi (2003). "The application of bone morphogenetic proteins to dental
tissue engineering." Nat Biotechnol 21(9): 1025-1032.
Neha, K., R. Kansal, et al. (2011). "Management of immature teeth by dentin-pulp regeneration: a
recent approach." Med Oral Patol Oral Cir Bucal 16(7): e997-1004.
Nosrat, A., A. Seifi, et al. (2011). "Regenerative endodontic treatment (revascularization) for necrotic
immature permanent molars: a review and report of two cases with a new biomaterial." J
Endod 37(4): 562-567.
Onyekwelu, O., M. Seppala, et al. (2007). "Tooth development: 2. Regenerating teeth in the
laboratory." Dent Update 34(1): 20-22, 25-26, 29.
Ortinau, S., J. Schmich, et al. (2010). "Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in
human neural progenitor cells." Biomed Eng Online 9: 70.
73
Pevsner-Fischer, M., V. Morad, et al. (2007). "Toll-like receptors and their ligands control
mesenchymal stem cell functions." Blood 109(4): 1422-1432.
Piette , G. (2001). La dent normale et pathologique, De Boeck Universit.
Poirier-Quinot, M., G. Frasca, et al. (2010). "High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging
for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold
architecture and cell seeding." Tissue Eng Part C Methods 16(2): 185-200.
Prescott, R. S., R. Alsanea, et al. (2008). "In vivo generation of dental pulp-like tissue by using dental
pulp stem cells, a collagen scaffold, and dentin matrix protein 1 after subcutaneous
transplantation in mice." J Endod 34(4): 421-426.
Rai, S., M. Kaur, et al. (2012). "Redefining the potential applications of dental stem cells: An asset for
future." Indian J Hum Genet 18(3): 276-284.
Reing, J. E., L. Zhang, et al. (2009). "Degradation products of extracellular matrix affect cell migration
and proliferation." Tissue Eng Part A 15(3): 605-614.
Robert, D., D. Fayol, et al. (2010). "Magnetic micro-manipulations to probe the local physical
properties of porous scaffolds and to confine stem cells." Biomaterials 31(7): 1586-1595.
Robinson, J. P., P. J. Lumley, et al. (2012). "An analytical Micro CT methodology for quantifying
inorganic dentine debris following internal tooth preparation." J Dent 40(11): 999-1005.
Roca, M., E. F. de Vries, et al. (2010). "Guidelines for the labelling of leucocytes with (111)In-oxine.
Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine." Eur J
Nucl Med Mol Imaging 37(4): 835-841.
Rodriguez-Lozano, F. J., C. L. Insausti, et al. (2012). "Mesenchymal dental stem cells in regenerative
dentistry." Med Oral Patol Oral Cir Bucal 17(6): e1062-1067.
Ruch, J. V., H. Lesot, et al. (1995). "Odontoblast differentiation." Int J Dev Biol 39(1): 51-68.
Sawa, Y., S. Yoshida, et al. (1998). "Immunohistochemical demonstration of lymphatic vessels in
human dental pulp." Tissue Cell 30(5): 510-516.
Scheller, E. L., P. H. Krebsbach, et al. (2009). "Tissue engineering: state of the art in oral
rehabilitation." J Oral Rehabil 36(5): 368-389.
Seong, J. M., B. C. Kim, et al. (2010). "Stem cells in bone tissue engineering." Biomed Mater 5(6):
062001.
Simon, S. R., A. Berdal, et al. (2011). "Dentin-pulp complex regeneration: from lab to clinic." Adv Dent
Res 23(3): 340-345.
Six, N., D. Septier, et al. (2007). "Dentonin, a MEPE fragment, initiates pulp-healing response to
injury." J Dent Res 86(8): 780-785.
Sloan, A. J. and A. J. Smith (2007). "Stem cells and the dental pulp: potential roles in dentine
regeneration and repair." Oral Dis 13(2): 151-157.
Smith, A. J., N. Cassidy, et al. (1995). "Reactionary dentinogenesis." Int J Dev Biol 39(1): 273-280.
Sugiyama, M., K. Iohara, et al. (2011). "Dental pulp-derived CD31(-)/CD146(-) side population
stem/progenitor cells enhance recovery of focal cerebral ischemia in rats." Tissue Eng Part A
17(9-10): 1303-1311.
Sun, H. H., T. Jin, et al. (2011). "Biological approaches toward dental pulp regeneration by tissue
engineering." J Tissue Eng Regen Med 5(4): e1-16.
Thakur, M. L., J. P. Lavender, et al. (1977). "Indium-111-labeled autologous leukocytes in man." J Nucl
Med 18(10): 1014-1021.
Thakur, M. L., A. W. Segal, et al. (1977). "Indium-111-labeled cellular blood components: mechanism
of labeling and intracellular location in human neutrophils." J Nucl Med 18(10): 1022-1026.
Tirino, V., F. Paino, et al. (2012). "Identification, isolation, characterization, and banking of human
dental pulp stem cells." Methods Mol Biol 879: 443-463.
Toda, N., K. Ayajiki, et al. (2012). "Neurogenic and endothelial nitric oxide regulates blood circulation
in lingual and other oral tissues." J Cardiovasc Pharmacol 60(1): 100-108.
Tran, X. V., C. Gorin, et al. (2012). "Effect of a calcium-silicate-based restorative cement on pulp
repair." J Dent Res 91(12): 1166-1171.
74
Trubiani, O., D. Tripodi, et al. (2003). "Human dental pulp vasculogenesis evaluated by CD34 antigen
expression and morphological arrangement." J Dent Res 82(9): 742-747.
Tziafas, D. (2004). "The future role of a molecular approach to pulp-dentinal regeneration." Caries
Res 38(3): 314-320.
Vasita, R. and D. S. Katti (2006). "Growth factor-delivery systems for tissue engineering: a materials
perspective." Expert Rev Med Devices 3(1): 29-47.
Vasita, R. and D. S. Katti (2006). "Nanofibers and their applications in tissue engineering." Int J
Nanomedicine 1(1): 15-30.
Veerayutthwilai, O., M. R. Byers, et al. (2007). "Differential regulation of immune responses by
odontoblasts." Oral Microbiol Immunol 22(1): 5-13.
Ward, J. (2002). "Vital pulp therapy in cariously exposed permanent teeth and its limitations." Aust
Endod J 28(1): 29-37.
Yu, J., Z. Deng, et al. (2006). "Differentiation of dental pulp stem cells into regular-shaped dentin-pulp
complex induced by tooth germ cell conditioned medium." Tissue Eng 12(11): 3097-3105.
Zhang, J., N. Kawashima, et al. (2006). "The existence of CD11c+ sentinel and F4/80+ interstitial
dendritic cells in dental pulp and their dynamics and functional properties." Int Immunol
18(9): 1375-1384.
75
IX.
Publications
Pulp Cell Tracking by Radionuclide Imaging for Dental Tissue Engineering.
Souron JB, Petiet A, Decup F, Tran XV, Lesieur J, Poliard A, Le Guludec D, Letourneur D,
Chaussain C, Rouzet F, Opsahl Vital S.
Tissue Eng Part C Methods. 2013
Multiple effects of the cellular prion protein on tooth development.
Zhang Y, Kim SO, Opsahl-Vital S, Ho SP, Souron JB, Kim C, Giles K, Den Besten PK.
Int J Dev Biol. 2011
Communications
Conseuro, Paris, mai 2012, poster, 1er prix Recherche
Titre Pulp Cell tracking by Nuclear Imaging for tissue engineering
IADR, Helsinki, Finlande, septembre 2012, oral session
Titre Pulp bioengineering: tracking of implanted stem cells by nuclear imaging
CNEOC, Strasbourg, octobre 2012, oral session
Titre Rgnration de la pulpe dentaire : suivi de cellules pulpaires implantes par
imagerie nuclaire
EAPD, Strasbourg 2012, oral session
Titre Bioengineering for the injured pulp: tracking of implanted stem cells by
nuclear imaging
ICCBMT, Scottsdale Arizona, USA, septembre 2010, poster
Titre The role of Prion protein in dentinogenesis
Congrs de lADF, Paris, novembre 2010, confrence
Titre Le traitement chimique de la carie : mythe de lindustrie ou ralit pour nos
patients ?
CNEPO, Reims, septembre 2010, poster, 3me prix de recherche
Titre Rle de la protein Prion dans lodontogense
IADR, Munich, septembre 2009, poster, slectionn pour le prix Robert Franck
Titre The role of Prion protein in dentinogenesis
76
X.
Annexe I
77
78
79
80
81
82
83
84
85
XI.
Annexe II
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
Rsum :
La pulpe dentaire est sujette des lsions svres faisant suite une carie dentaire ou un traumatisme. La
thrapeutique conventionnelle prconise alors est le traitement endodontique, qui consiste en lexrse de la totalit
de la pulpe dentaire et le comblement de lespace pulpaire par un matriau inerte. Ce traitement induit une fragilisation
de la dent et une plus grande susceptibilit aux infections.
Au cours de ce travail, nous avons mis au point une solution alternative, en proposant le remplacement de la pulpe
dentaire lse par une pulpe quivalente constitue de cellules souches msenchymateuses de la pulpe
ensemences dans une matrice de collagne. Nous avons test ce substitut pulpaire au travers dun modle de
pulpotomie de la molaire chez le rat, savoir lexrse de la totalit du parenchyme de la chambre pulpaire et
conservation du rseau vasculaire radiculaire, o nous avons implant des pulpes quivalentes . Notre objectif tant
notamment de dterminer le devenir des cellules souches pulpaires implantes dans la dent grce limagerie nuclaire,
dans ce contexte de dveloppement dune thrapie cellulaire. Les cellules ont t marques l111Indium-oxine
pralablement leur implantation. Nous avons montr que le marquage n'avait pas d'incidence sur la viabilit et la
prolifration des cellules pulpaires. Le suivi du signal sest fait par tomographie d'mission monophotonique, couple
un scanner spcifique du petit animal (NanoSPECT/CT, Bioscan), hebdomadairement pendant 3 semaines. Nous avons
mis en vidence que l'intensit du signal SPECT tait directement lie l'intgrit des cellules, puisque que les matrices
implantes avec des cellules marques puis lyses par choc isotonique prsentaient une diminution rapide de lintensit
du marquage. Grce la sensibilit de la mthode dimagerie choisie, nous avons montr labsence de diffusion majeure
des cellules dans la circulation sanguine partir du site d'implantation, ce qui pourrait constituer un risque de
minralisation ectopique li limplantation de cellules souches msenchymateuses.
Par ailleurs, ltude par histologie des processus de rparation et rgnration de la pulpe dans les dents de rat a mis en
vidence une prolifration abondante de cellules de type fibroblastique au sein des matrices, ainsi que la prsence de
nombreux vaisseaux et de nerfs dans la matrice cellularise et proximit. Ces rsultats, non observs dans les matrices
implantes avec des cellules lyses, suggraient donc une fonctionnalit du tissu reconstruit et suggraient que les
cellules pulpaires implantes favorisaient une novascularisation rapide de la pulpe quivalente, vraisemblablement en
induisant un recrutement de cellules endothliales partir du rseau vasculaire radiculaire rsiduel.
Keywords :
Dental pulp, tissue engineering, mesenchymal stem cells, nuclear imaging, cell tracking
97