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CURSO:
Bioqumica I
DOCENTE:
Q.F.
Mg.
Yadira
ALUMNOS:
MESA:
N 03
AO:
Tercero
SEMESTRE: 2013-I
Fernndez
Jer
INTRODUCCIN
Por definicin, y a diferencia de las clulas procariontes, las clulas
eucariontes poseen un ncleo que contiene la mayora del DNA envuelto
en una membrana. Esto deja al material gentico en un compartimento
separado del resto de los contenidos de la clula o citoplasma, donde
ocurren las reacciones metablicas. En el citoplasma se pueden distinguir
varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retculo endoplsmico,
aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los
cuales cumplen funciones especficas dentro de la clula.
As como un tejido puede ser separado en las clulas que lo constituyen,
con las tcnicas adecuadas la clula puede separarse en los diferentes
organelos y macromolculas que la componen. Una de las tcnicas ms
utilizadas para tal propsito es el Fraccionamiento Subcelular, que permite
obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto
grado de pureza. Esta tcnica fue desarrollada entre otros por Alberte
Claude y Christian Duve entre1940 y 1950, y consiste en la separacin de
los componentes de la clula en base a su tamao y densidad.
Finalmente, cabe resaltar que una separacin pura de una protena es
esencial para poder determinar sus propiedades y su actividad. Puesto que
las clulas las contienen miles de tipos de diferentes protenas.
I.
OBJETIVOS
Adquirir destrezas en el manejo y en la obtencin de rganos y fracciones celulares a partir de
un ratn de laboratorio.
Obtener homogenizados de hgado de rata.
Separar fracciones subcelulares del homogenizado de hgado de rata mediante el proceso de
centrifugacin diferencial.
Determinar el contenido de protenas en las diferentes fracciones obtenidas.
Aplicar el mtodo de Biuret en la cuantificacin de protenas totales.
II.
MARCO TERICO
El fraccionamiento celular permite separar los componentes de las clulas. Las membranas y
organelos celulares suelen separarse mediante centrifugadoras, aparatos que hacen girar tubos de
ensayo. Esto ejerce una fuerza centrfuga en el contenido de los tubos, que sedimenta las partculas
suspendidas en la solucin (como los organelos y membranas de clulas).
Algunas de estas partculas, como las mitocondrias, son organelos completos. Otras son pequeas
vesculas cerradas, llamadas microsomas, constituidas por membranas de Retculo
Endoplasmtico, complejo de Golgi y membrana plasmtica. Despus de la centrifugacin
algunas de las partculas forman un condensado en el fondo del tubo. Las diferentes partes celulares
tienen densidad distinta, lo que permite separarla en fracciones celulares al centrifugar la suspensin
a velocidad creciente (centrifugacin diferencial).
Las membranas y los organelos de los condensados resuspendidos pueden purificarse despus
mediante centrifugacin por gradiente de densidad, que se ilustra como el ltimo paso en la figura. El
condensado resuspendido se dispone en una capa en la parte superior de un gradiente de densidad,
por lo general compuesto de una solucin de sacarosa y agua. Dado que las densidades de los
organelos y las membranas difieren, cada uno emigrar durante la centrifugacin y formar una
banda a una altura distinta en el gradiente. (1)
FIGURA 1 ESQUEMA DE
FRACCIONAMIENTO CELULAR
El pellet es una mezcla de todos los componentes sedimentados y est contaminado con cualquier
partcula no sedimentada que estuviera en el fondo del tubo. Las dos fracciones son recuperadas por
decantacin de la solucin sobrenadante del pellet.
El sobrenadante puede ser recentrifugado a altas velocidades para obtener una mayor purificacin
con la formacin de nuevo pellet y sobrenadante. El pellet puede ser resuspendido en un pequeo
volumen y recentrifugado dependiendo de lo que se desee separar.
FIGURA 2: CENTRIFUGACION
Otro
mtodo
de
separacin es por gradiente de
DIFERENCIAL
densidad, un mtodo
que es ms complicado que la
centrifugacin diferencial pero tiene algunas ventajas: el mtodo de gradiente de densidad permite la
FIGURA 3: CENTRIFUGACIN
ZONAL
La separacin zonal es ideal
para separar partculas de
tamao definido (ejemplo: protenas, RNA y ribosomas), sin embargo, las partculas del mismo tipo
son heterogneas; en este caso, la separacin por centrifugacin zonal no es eficiente y es ms
FIGURA 4: ISOPYCNIC
Criterios para el xito de la separacin isopcnica:
La densidad de las partculas utilizadas debe estar dentro de los lmites de las densidades de
los gradientes.
Se admite cualquier longitud de gradientes.
El tiempo de ejecucin debe ser suficiente para que las partculas se agrupen en el punto
isopcnica. No se producen efectos adversos ante el exceso de tiempo. (3)
III.
RESULTADOS
BLANCO
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
Agua (Ml)
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
Concentracin
(mg/mL)
20
40
60
80
Biuret(mL)
0.074
0.077
0.128
0.172
0.226
0.283
ABSORBANCIA
10
Solucin
Absorbancia
Blanco
0.074
Cst1
0.077
0.003
Cst2
0.128
0.054
Cst3
0.172
0.098
0.283
0.209
MUESTRA PROBLEMA
Blanco
Homogenizad
o
Pellet A
Pellet B
Sobren. A
Sobren. B
Vol. M.P
0.2
0.5
Sucrosa 0.25
0.8
0.5
Sol. De NaCl
0.9%
Reactivo de
Biuret
0.107
0.263
0.373
0.137
0.215
0.332
ABSROBANCI
A
Solucin
Absorbancia
Blanco
0.107
Homogenizado
0.263
0.156
Pellet A
0.373
0.266
Pellet B
0.137
0.030
Sobrenadante A
0.215
0.108
Sobrenadante B
0.332
0.225
Blanco
REFERENCIA:
Curva de
calibracin
IV.
Homogeni
zado
300 mg/mL
Pellet A
90mg/mL
Pellet B
12mg/mL
Sobren. A
Sobren.
B
84 mg/mL
82
mg/mL
DISC
USIO
NES
Dos
de las
A pesar de tener indicada la aceleracin centrifuga aplicada respecto a cada velocidad en RPM
y observando las diferentes lecturas obtenidas, surge la pregunta si en verdad tenemos en
cada sedimento o sobrenadante lo que decimos tener, es por ello que averiguamos si existen
tcnicas para identificar en cada fraccin celular el respectivo contenido, encontramos que se
puede hacer un anlisis con el microscopio electrnico pero esta tcnica en la mayora de los
casos resulta cara y se necesita una preparacin especial de la muestra.
Otra
tcnica
consiste
en
el
uso
de
marcadores
enzimticos
de
organelas:
V.
Otra duda que surgi fue sobre la importancia del tiempo, si tendramos los mismos resultados
duplicando el tiempo de centrifugacin o si detuviramos el proceso a la mitad; pues la
respuesta se halla en la Ley de Stokes. Ya que no hemos modificado ni el dimetro ni la
densidad de las partculas, ni la densidad ni viscosidad del medio; la nica variable a la que le
podemos hacer cambios es a la gravedad y esto se logra con las diferentes fuerzas de
centrifugacin aplicadas a cada tubo en cada parte del experimento. Si cambisemos el tiempo
de centrifugacin nos distanciaramos del objetivo que realmente queremos retener en cada
pellet o mantener en cada sobrenadante.
CONCLUSIONES
El mtodo de centrifugacin diferencial es el adecuado para separar fracciones subcelulares
previas a una homogenizacin.
Se determin fracciones celulares como ncleos, mitocondrias, lisosoma por centrifugacin
diferencial.
El contenido proteico fue determinada por el mtodo de Biuret y se obtuvo lo siguiente:
Homogenizado >Pellet A>Sobrenadante A>Pellet B>Sobrenadante B.
VI. CUESTIONARIO
1. Con qu fin obtenemos fracciones celulares?
Las fracciones celulares son ampliamente usados para la investigacin en la bioqumica y fisiologa
de organelos fuera del ambiente complejo de la clula intacta. El objetivo principal de este
experimento es aislar los cloroplastos, ncleo y mitocondria del tejido de plantas por el mtodo de
fraccionamiento celular. Los otros objetivos son examinar esas fracciones microscpicamente y
estimar el coeficiente de sedimentacin de los organelos.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS