Deteccin de

Infecciones
Fngicas del
Gnero
Fusarium en
Maz
Esteban Lpez Tavera
Rosa Desiree Ochoa Martnez

Proyecto Final

A01064766
A01063250

Introduccin
El rpido y correcto diagnstico de enfermedades vegetales es un componente
crucial en cualquier sistema de manejo de cultivos. Las enfermedades vegetales
pueden ser manejadas ms efectivamente si las medidas de control se introducen
en etapas tempranas del desarrollo de la enfermedad. Una bsqueda de sntomas
puede no ser un diagnstico muy confiable, pues la enfermedad puede estar
presente desde mucho antes de que los sntomas aparezcan y la expresin de
estos puede ser muy variable [1]. Dentro de los patgenos vegetales, uno de los
ms frecuentemente encontrados, aunque se le dio poca importancia hasta la
dcada de los sesenta, son los hongos, que son capaces de afectar a cualquier
cultivo y de diferentes formas. Uno de los gneros ms comunes de hongos es el
Fusarium, que como con otros hongos, los primeros pasos tomados para su
investigacin requieren de una correcta identificacin, desafortunadamente esto
presenta ciertas dificultades, principalmente debido a que las tcnicas para su
deteccin consumen mucho tiempo, son laboriosas y aquellas ms sencillas y
especficas no estn a disposicin de todos [2].
El gnero Fusarium fue primeramente elucidado en 1809 por el cientfico alemn
Link. Se trata de una especie ampliamente distribuida a lo largo del mundo tanto
en suelos como en sustratos orgnicos, se ha encontrado en suelos congelados
en el rtico y en las arenas del desierto del Sahara; abundan en suelos de cultivos
tanto en temperaturas templadas como en regiones tropicales. Uno de los factores
que contribuyen a su distribucin es el hecho de que tienen una gran capacidad
para cambiar rpidamente su morfologa y su fisiologa, adaptndose a ambientes
nuevos [2].
Los hongos de este gnero estn involucrados en el desarrollo de enfermedades
humanas y animales, pueden contaminar los alimentos destinados para animales
y para humanos al generar podredumbre en cultivos y producir micotoxinas. Las
micotoxinas son productos naturalmente producidos por los hongos que pueden
evocar una respuesta txica cuando se introducen en bajas concentraciones a
vertebrados complejos a travs de una ruta natural. Algunas micotoxinas pueden

tener muchos efectos y pueden causar sndromes fitotxicos y antimicrobianos

adems de la toxicidad animal [3].
En el presente trabajo, se enfocar en la identificacin de especies fngicas del
gnero Fusarium en un cultivo de gran relevancia para nuestro pas, el maz. Se
desarrollar una nueva tcnica basndose en los mtodos de diagnstico ya
establecidos. Se plantear un nuevo mtodo de deteccin utilizando un
inmunoensayo incorporado en un soporte de nanotubos de carbono que estn
formados por anticuerpos monoclonales especficos para las micotoxinas
producidas por especies del gnero Fusarium, que ser altamente especfico y
relativamente sencillo.

Justificacin
La mayor parte de las enfermedades que afectan al maz tienen que ver con el
deterioro de su raz, tallos, mazorca o granos, y estos son afectados
principalmente por hongos. Dentro de estas enfermedades, el pudrimiento de la
mazorca es la ms importante en pases en los que este cereal se cultiva, afecta
de manera adversa las cualidades fsicas, fisiolgicas y fitosanitarias de la
cosecha. Los agentes causales reportados como responsables de este
padecimiento son los hongos del gnero Fusarium, que son capaces de sobrevivir
en el suelo, en los restos de la planta infectada, dentro de semillas aparentemente
sanas y puede incluso afectar al embrin sin que se muestren sntomas aparentes.
Estos hongos son patgenos de diferentes plantas de cereales y pueden estar
presentes en todas las etapas de su desarrollo, desde las primeras horas de la
germinacin al tiempo de cosecha, incluyendo el periodo de post-cosecha de los
granos [4].
El maz es uno de los componentes bsicos de la alimentacin mundial, y al
mismo tiempo es el cultivo que toma el primer lugar en la produccin. En pases
desarrollados la mayor parte del maz producido se destina a la alimentacin de
ganado o usos industriales diferentes a la elaboracin de alimentos para humanos;
en pases en vas de desarrollo como Mxico, el maz es la principal fuente de

alimento humano y se estima que su consumo per cpita es de 328 gramos al da

[4]. La ocurrencia y distribucin de especies de

Fusarium en Mxico es poco

estudiada; estudios realizados sobre los cultivos de maz en el estado de Nuevo

Len en Mxico, Costa Rica y Honduras arrojan resultados de una infeccin por
Fusarium en un 39-62% de los cultivos de maz. Algunos investigadores sostienen
la hiptesis de que el continente americano es el centro de origen de este
patgeno, sin embargo, la movilizacin mundial del maz debido a la intervencin
humana seguramente ha facilitado una dispersin de esta y mucha otras
enfermedades entre continentes [5].
Cuando un maz ha sido infectado con estos hongos, los primeros signos son la
formacin de micelios blancos, que van descendiendo desde la punta de la
mazorca y le otorgan un color rojizo a los granos infectados. El dao se manifiesta
principalmente en hongos individuales, y estos pueden desarrollar un moho
algodonoso o rayas blancas en el pericarpio. Estos hongos son capaces de
producir metabolitos que resultan txicos para varias especies animales [6].
Algunas respuestas a estos metabolitos que se tienen reconocidas en humanos y
animales despus de la ingesta de granos contaminados con hongos del gnero
Fusarium son: enfermedades hemorrgicas, fiebre, vmito, inflamacin aguda del
tracto alimentario, entre otras aberraciones [3].
Una vez que los granos han sido contaminados, existen algunas reducidas
opciones disponibles para limitar los efectos adversos de dicha contaminacin,
entre ellas se encuentran la destruccin total del cultivo, molienda de granos (se
han tenido reportes de que este tipo de tratamiento fsico puede reducir hasta en
un 75% la presencia de micotoxinas), separacin de plantas infectadas,
tratamientos qumicos involucrando hidrxido de calcio monometilamina, bidulfito
de sodio o amoniaco y tratamiento con funguicidas (aunque se puede provocar
una resistencia por parte de los hongos); todos estos tratamientos son efectivos a
diferentes magnitudes. Una opcin viable para el control del esparcimiento de este
patgeno es la seleccin de cultivos de cereales resistentes, cultivando solo
aquellas variedades que son menos susceptibles a ser contaminadas. [7].

La identificacin temprana y adecuada de hongos del gnero Fusarium en

cualquier cultivo de cereal, pero sobretodo en maz, es de vital importancia tanto
mdica como econmica, y actualmente existen tcnicas biolgicas disponibles
para la deteccin de estos patgenos que son altamente sensibles pero pueden
ser lentas y no ser reproducibles a gran escala. Avances recientes en Biologa
Molecular y Biotecnologa se han aplicado al desarrollo de tcnicas y herramientas
ms rpidas, especficas y sensibles para la deteccin de muchos tipos de
patgenos en plantas [1]. La cuantificacin de Fusarium en alimentos se puede
hacer mediante mtodos tradicionales, que grosso modo consisten en el cultivo de
granos infectados en medios de cultivo selectivos para estos hongos, sin embargo,
aunque simple y efectiva, esta tcnica requiere de habilidades especficas y
consume mucho tiempo; una alternativa a esta tcnica es por medio de una
identificacin basada en la Reaccin en Cadena de la Polimerasa o PCR, en
donde se usan sondas de primers especficas para identificar a diferentes
especies de hongos del gnero sin la necesidad de su cultivo, otra ventaja de esta
tcnica es que tambin provee un estimado de la biomasa del hongo, que permite
un mejor establecimiento de relacin entre el crecimiento del hongo y la
produccin de micotoxinas [8].

Estado del Arte

Existen mtodos tradicionales que identifican de manera general las especies del
gnero Fusarium, a travs de un medio de cultivo selectivo, generalmente se
utiliza Agar Papa Sacarosa (PSA), ajustado a un pH de 6.5-7 y dejndose crecer
a una temperatura de 22-25 C en un fotoperiodo de 12/12 horas luz/oscuridad.
Una vez cultivados los hongos, se pueden examinar y analizar bajo microscopio su
morfologa y caractersticas montndose con eritrosina e hidrxido de amonio al
10%. La morfologa de las esporas es la caracterstica de identificacin ms
importante en este gnero, estas pueden ser conidias, enteroblsticas o
clamidiosporas [2]. A pesar de que estas tcnicas son muy adaptables,
pudindose utilizar diferentes medios de cultivo y condiciones para crecer los
hongos, son relativamente sencillas y econmicas, tambin presentan problemas

como que no son muy especficas, la identificacin de una especie debe realizarse
por un experto en la materia y es muy susceptible a errores, adems de que este
tipo de tcnicas toman mucho tiempo en completarse, y esto puede ser perjudicial
si lo que se quiere es un diagnstico oportuno.
Avances recientes en sistemas moleculares de hongos proveen informacin de
secuencias de ADN que resulta muy til

para su deteccin y el diagnstico

molecular. La publicacin de diversos grupos de sondas de primers, algunos

universales, para la amplificacin de material gentico proveniente de hongos le
dieron un impulso a los anlisis moleculares que actualmente se utilizan
comnmente para la identificacin de hongos, especialmente para aquellos
gneros muy extensos que contienen a especies cuyas caractersticas
morfolgicas pueden parecerse mucho entre s o entre otros gneros, como es el
caso de Fusarium [9]. Una de las tcnicas ms utilizadas es la deteccin de
patgenos fngicos basadas en la hibridacin de cidos nucleicos. La hibridacin
de cidos nucleicos depende en un alto grado de la especifidad inherente de las
secuencias de nucletidos que se piensa emparejar, debido a que es altamente
especfica, esta tcnica es ampliamente aplicada para el diagnstico de patgenos
vegetales. El marcaje de una de las secuencias de nucletidos provee una seal
necesaria requerida para identificar la hibridacin, una de las maneras ms
comunes para marcar las sondas es la utilizacin de 32P, aunque en aos recientes
las sondas no-radioactivas han tomado un mayor inters en la comunidad
cientfica [1]. En el estudio Deoxynivalenol and other selected Fusarium toxins in
Swedish oats Occurrence and correlation to specic Fusarium species, los
investigadores lograron una identificacin y amplificacin exitosa de siete especies
diferentes de Fusarium a partir de muestras de avena provenientes del norte de
Europa a travs de un PCR tiempo real. En este estudio primero se tuvo que
establecer una curva estndar, utilizando cultivos de las siete diferentes especies
de Fusarium (F. poae, F. graminearum, F. langsethiae, F. culmorum, F. tricinctum,
F. sporotrichioides y F. avenaceum), que fueron crecidas en caldo de cultivo para
producir micelios, dentro de un bao de agua a 25 C por 5 das, despus los
micelios fueron lavados, centrifugados y congelados hasta la extraccin de su

ADN para generar curvas estndar para el PCR-RT. La extraccin del material
gentico de estos micelios se realiz siguiendo un protocolo descrito por Fredlund
et al. utilizando un kit comercial para su extraccin (DNeasy Plant Mini Kit),
despus se hizo una cuantificacin utilizando un equipo de Nanodrop incorporado
a un espectrofotmetro. La extraccin de material gentico proveniente de
muestras vegetales se realiz de la misma manera que la de los micelios, pero
primero las muestras se mezclaron con buffer, se sometieron a sonicacin y se
adicion adems soluciones de RNAasa y proteinasa. Los primers y sondas
especficas para la deteccin de cada especie de Fusarium utilizaron diferentes
marcajes, algunas de ellas eran detectadas por tecnologa SYBRGreen,
mientras que otras por medio de sondas tipo TaqMan , pero todas ellas estaban
marcadas en su extremo 5 con 6-carboxy-fluoresceina (FAM). La reaccin de PCR
se llev a cabo en un termociclador, despus de aadirse en el vial la muestra de
ADN (estndar o de material vegetal), mezcla de reaccin de PCR, mezcla master
universal TaqMan o SYBRGreen y los primers o sondas marcadas con FAM.
Las condiciones dentro del termociclador fueron las siguientes: 2 minutos a 50C,
10 minutos a 95 C, 40 ciclos a 95 C por 15 segundos y 1 minuto a 60 C. En este
estudio tambin se incluy un anlisis de micotoxinas sobre las muestras de
material vegetal utilizando un sistema de HPLC/Ionisacin ElectrosprayEspectrometra de Masas en Tandem [8]. Un estudio diferente, esta vez realizado
en Mxico, llev a cabo un anlisis filogentico de diferentes especies de
Fusarium que afectan drsticamente a los cultivos de maz dentro del pas, para
esto tambin se utiliz PCR pero para amplificar regiones ITS (Espaciador
Transcrito Interno o Internal Transcribed Spacer). Diversos granos de maz
infectados con Fusarium fueron colocados en medio selectivo para cultivar
micelios, se extrajo ADN de estos y se hizo la amplificacin con PCR, usando una
mezcla que contena buffer, MgCl 2, dNTPs, primers especficos para la regin, Taq
polimerasa y ADN en un termociclador con las siguientes condiciones: 2 minutos a
95 C, 30 ciclos a 95 C por 1 minuto, 30 segundos a 50 C, 2 minutos a 72 C y
10 minutos finales a 72 C. Los productos de PCR despus fueron purificados
utilizando un kit comercial (QIAquick kit) y fueron corridos por medio de

electroforesis en un gel de agarosa, despus este fue teido con bromuro de etidio
y pudo ser visualizado para el anlisis de los productos amplificados [4].
De acuerdo a los materiales que se utilizaron en ambos estudios, se dedujo que
para una deteccin por medio de PCR de especies del gnero Fusarium, se
debera contar con lo siguiente:
Producto
Medio de cultivo selectivo (500 g)
Oligonucletidos (10-79 bases)
Mezcla de PCR-RT (500 RX)
Mezcla
de
tincin
(universal

Precio (MXN)
$875.00
$20,716.00
$10,759.00
$4,298.00-17,220.00

SYBRGreen o TaqMan)
Agarosa (500 g)
$12,766.00
Bromuro de etidio (25 g)
$7,030.00
Kit de extraccin de ADN (250)
$8,804.00
Total
$708,170.00
Los precios de todos los productos fueron consultados en diferentes casas
comerciales y distribuidoras de reactivos analticos como Sigma-Aldrich, Phytotech
Laboratories, Custom Arrays y Life Technologies.
Aunado a esto, se debe considerar que para realizar un anlisis se deber contar
con equipo como un termociclador, Nanodrop, electrodos y soporte para
electroforesis, como mnimo, adems de que posiblemente se deber disponer de
algn homogeneizador para las muestras (molino por ejemplo), incubadora, baos
de agua, congeladores, entre otros.
Existe una estructura formada de tomos de carbono que consiste en hojas de
grafeno enrolladas y altamente ordenadas, que pueden ser de pared sencilla o
mltiple [10]. Estas estructuras son llamadas nanotubos de carbono (CNT) o
nanotubos de fulereno y tienen dimetros que van desde uno hasta decenas de
nanmetros y su longitud puede ser desde unos pocos micrmetros hasta cientos
de micrmetros o ms [10]. Dependiendo de la manera en que estn enrollados,
tienen propiedades similares tanto a metales como semiconductores [10].
Gracias a lo anterior, los CNTs han sido usados como componentes de elementos
de circuitos electrnicos [10]. Adems, ha habido muchos reportes que describen

la unin de biomolculas sobre y dentro de los nanotubos de Carbono [10]. En

2012, Jack Andraka, un estudiante de 15 aos, desarroll un mtodo de
diagnstico para cncer de pncreas inmovilizando nanotubos de carbono a un
soporte de papel y unindoles anticuerpos especficos para la protena Mesotelina,
cuyos niveles en sangre aumentan enormemente en pacientes con cncer de
pncreas [11]. Cuando los anticuerpos reaccionan con la Mesotelina, ocurre un
cambio medible en las propiedades elctricas del sensor, como resistencia,
impedancia, capacitancia, potencial elctrico o una combinacin de las anteriores
[12].
En el presente mtodo de diagnstico, se utilizan sensores que consisten en una
mezcla de nanotubos de carbono y anticuerpos especficos para las micotoxinas
producidas en hongos del gnero Fusarium, inmovilizada en un soporte slido que
en este caso consiste en papel. Cuando esta mezcla es aplicada en la superficie
del soporte slido, se crea una compleja red de CNTs y anticuerpos con una
resistencia especfica al flujo de corriente. Cuando se aplica al sensor una muestra
que contiene las micotoxinas en cuestin, estas forman un inmunocomplejo con
los anticuerpos, incrementando la resistencia por contacto nanotubo-nanotubo
mediante la formacin de una red ms ordenada y densa. Esto aumenta el
potencial a travs del sensor, o alternativamente, incrementa la resistencia del
sensor. Ambos valores pueden ser medidos y correlacionados con la cantidad de
micotoxina en la muestra [12].

Diseo y Protocolo
El mtodo que se presenta requiere de la produccin de los sensores que se
utilizarn para detectar y cuantificar las micotoxinas de Fusarium en la muestra. El
proceso puede dividirse en dos grandes etapas: la produccin de los anticuerpos y
la inmovilizacin de una mezcla de estos con CNTs en un soporte slido.
Los materiales requeridos en la primera etapa son: Agua desionizada nanopura,
ovalbmina (OVA), albmina de suero bovino (BSA), polivinil alcohol (PVA), 1-1carbonildiimidazol (CDI) y 1[3-(dimetilamino)propil]-3-etil-carbodiimida hidrocloruro

(EDC) de Sigma-Aldrich; peroxidasa conjugada cabra anti-ratn IgG de Jackson

ImmunoResearch Laboratories [13]. Para el cultivo de los hongos productores de
Fumonicina, se necesitan: Medio de cultivo GAM, GYP (2% glucosa, 1% peptona,
y 0.3% extracto de levadura), jugo agar V-8, granos de maz molidos; el siguiente
medio utilizado se prepara combinando 10 g de granos de maz molidos y 2.5 mL
de agua destilada en un matraz Erlenmeyer, autoclaveando por 20 minutos y
despus aadiendo 2 mL de agua estril. El medio GYAM contiene glucosa 0.24
mM, 0.05% de extracto de levadura, L-asparagina 8.0 mM, cido mlico 5.0 mM,
NaCl 1.7 mM, K2HPO4 4.4 mM, MgSO4 2.0 mM y CaCl2 8.8 mM [14]. Para
preparar este medio, las sales y el extracto de levadura se combinan con agua a
concentracin 2x, se ajusta a pH 3 con cido fosfrico y se autoclavea. Esta
solucin se combina con 0.4 vol de una solucin de glucosa 1.2 M (autoclaveada
separadamente), 0.2 vol de una solucin de cido mlico 50 mM (esterilizada por
filtracin), y 0.4 vol de agua estril [14]
Para producir las Fusarinas C y A, se cultiva Fusarium verticillioides M-3125 en
lquido por 14 das [13] en medio de cultivo GYAM, inoculado con un solo manojo
miceliar proveniente de un cultivo en jugo agar V-8 [14]. Durante este tiempo, se
mantienen en agitacin constante a 200 rpm en oscuridad a 28C [14].
Las Fusarinas se extraen con un volumen igual de acetonitrilo, se filtran, y la
mezcla se particiona dos veces contra cloruro de metilo [13]. La fraccin orgnica
se concentra al vaco hasta ser un aceite. El aceite se solubiliza en 50 mL de nhexano y se extrae dos veces con un total de 100 mL de acetonitrilo. El extracto se
concentra al vaco y se diluye en agua para dar a la solucin aproximadamente
10% v/v de acetonitrilo [13]. Este extracto concentrado se inyecta en un sistema
de HPLC fase reversa preparativo, con una columna 8 21.4x250 mm Microsorb
C18 Dynamax HPLC. Las Fusarinas se recolectan como 50 mL de fracciones
acetonitrilo/agua. La fase mvil (20 mL/min) es inicialmente 100% agua por 2.5
min, despus de los cuales el acetonitrilo se aumenta a 50% por 60 min. Entre 60
y 90 min, la concentracin de acetonitrilo se aumenta a 70%. Las fracciones se

extraen con cloruro de metileno, se concentran hasta aceites y se almacenan a

-20 C [13].
Se preparan soluciones stock de las fusarinas A y C diluyendo los aceites
correspondientes en acetonitrilo. Las concentraciones de las soluciones pueden
ser calculadas por absorbancia UV a 360 nm con coeficiente de extincin de
33000 en 95% de etanol para la fusarina C y a 352 nm con coeficiente de extincin
de 21300 en metanol para la fusarina A [13].
Para la produccin de los anticuerpos, el inmungeno utilizado es un conjugado de
la fusarina C con OVA (FU-OVA). Para esto, se concentran 10 mg de fusarina C en
cloruro de metileno, se concentran hasta la consistencia de vidrio a presin
reducida [13]. Se aaden 0.16 mL de acetona para solubilizar la fusarina y se
aaden 10 mg de 1,1-carbonildiimidazol. La reaccin se sella y se mantiene a
temperatura ambiente por 1 hora, despus de la cual se aaden 0.04 mL de agua,
seguidos por 0.8 mL de solucin de OVA (18.8 mg/mL en buffer de bicarbonato de
sodio 0.1M, pH 8.6). La mezcla se incuba por 24 horas a 4C, luego se dializa
contra tres cambios secuenciales de 0.1 M PBS para remover la fusarina no ligada
[13].
Para la inmunizacin, tomando como base el protocolo reportado por Maragos et
al. [15], diez ratones Balb/C hembra se inmunizan por inyeccin de 95 g FU-OVA
por animal. Las inmunizaciones consisten en volmenes de 0.2 mL de una mezcla
1 + 1.1 de Fu-OVA emulsificado en adyuvante completo de Freund e inyectado de
manera subcutnea en cuatro sitios. Despus de 28 das, los ratones reciben una
segunda inyeccin de 50 g/ratn de manera subcutnea en adyuvante
incompleto de Freund. Cuatro semanas despus, se administran 50 g de
inmungeno a los ratones [15]. Despus de 27 das de la segunda aplicacin, se
aplica una tercera dosis de 50 g Fu-OVA a los cinco ratones con la mayor
respuesta en el suero. 83 das ms tarde, se aplica una cuarta dosis (pre-fusin)
va intraperitoneal,con con 50 g de FU-OVA inyectada en 0.5 mL de PBS, en
lugar de adyuvante incompleto de Freund como en las inyecciones anteriores. Una

segunda dosis pre-fusin se administra dos das despus con fusin esplenoctica
tres das despus de la inyeccin final.
Los ratones con anticuerpos reactivos a FU presentes en el suero se sacrifican y
se

esplenectomizan

aspticamente

[15].

Los

esplenocitos

se

fusionan

qumicamente con clulas de mieloma no secretoras de inmunoglobulina (NS-1)

Balb/C utilizando polietilenglicol [15]. Las clulas fusionadas se siembran en medio
de seleccin HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). Despus de 11 das, los
cultivos resistentes a HAT se aslan y se analiza su actividad anti-FU. Los cultivos
positivos se clonan, se expanden y se congelan. Las clonas que resultaron
positivas se expanden para la produccin de fluido de ascitis [15].
El fluido de ascitis producido se trata con 5% de dextrano sulfato de sodio y 11.1%
de cloruro de calcio para remover lipoprotenas [15]. Despus de centrifugar a
5000 rpm por 10 min, se extrae la solucin sobrenadante y se precipitan de ella las
inmunoglobulinas aadiendo un volumen equivalente de sulfato de amonio
saturado [15]. La mezcla se centrifuga de nuevo y el pellet se suspende en PBS
0.1 M y las inmunoglobulinas se precipitan una segunda vez con sulfato de
amonio. La mezcla se centrifuga una vez ms y el pellet se suspende en PBS 0.1
M y se dializa contra PBS 0.1 M [15].
Los materiales de la de inmovilizacin en el soporte slido requieren los siguientes
materiales: Poli 4-estirensulfonato de sodio (PSS), nanotubos de carbono de 1 a
15000 nm de dimetro indistintamente y cualquier longitud, papel Whatman, los
anticuerpos producidos en la etapa anterior [12]
Primeramente, se debe preparar una suspensin uniforme de nanotubos de
carbono de pared sencilla (SWCNTs) y anticuerpos para recubrir el papel filtro de
manera que la distribucin final del complejo anticuerpo/nanotubo en el sensor sea
uniforme [12]. El polmero PSS se seleccion debido a su habilidad para
estabilizar protenas [12]. Se mezclan los CNTs (50 mg/mL) en una solucin
acuosa de PSS 1% p/v y se somete la mezcla a sonicacin para uniformizar la
suspensin de los CNTs en el polmero por 60 min en total, divididos en cuatro

sesiones de 25, 5, 25 y 5 minutos cada una. Estos parmetros ptimos se

determinaron monitoreando la uniformidad midiendo la absorbancia a 660 nm [12].
A continuacin, se aaden los anticuerpos especficos para FU directamente a la
suspensin para una concentracin final de 10 g/mL y se mezcla en vrtex para
asegurar la distribucin uniforme del anticuerpo en la suspensin de nanotubos.
La tasa final SWCNT:anticuerpo es de 5000:1 [12].
El soporte slido utilizado ser papel filtro Whatman analtico con un grosor de
0.18 mm. Este se corta en tiras rectangulares de 0.5 cm x 5 cm [12]. Las tiras se
sumergen en la suspensin de SWCNT/anticuerpo/PSS y se seca por congelacin
al vaco (-80C por 48 h) para minimizar la desnaturalizacin de los anticuerpos.
Este ciclo de sumergir/secar por congelacin se repite 6 veces para obtener
suficiente deposicin de SWCNT y anticuerpo en la tira de papel [12].
Una vez que se ha producido el sensor, el proceso para llevar a cabo el
diagnstico en las plantas comienza con la preparacin de la muestra. Esta
consiste en una simple extraccin con acetato de etilo, homogeneizando la
muestra en una solucin de este y dejando extraer por 60 min [8].
Todas las mediciones de potencial elctrico pueden realizarse con un multmetro
como el MAS830B de Commercial Electric ajustado en el rango de 20 Ohm [12].
Se aplica 1 L del extracto en el sensor y se colocan los electrodos en la periferia
del rea ocupada por la muestra. Se toma una medicin despus de 5 min de
haber aplicado la muestra y se registra la mxima respuesta, as como el tiempo
de la mxima respuesta. Estos pueden compararse con una curva estndar que
se elabora realizando mediciones de la misma manera con diluciones seriadas de
estndares de Fusarina comercial.
Los costos de produccin se muestran en la tabla siguiente:
Material
Fusarina
SWCNT
PSS
Acetato de etilo

Cantidad
10 mg
1g
500 g
1L

Costo (pesos)
8, 524
11, 214
1, 953
918

Papel Whatman
OVA
Medio GYAM
Anyuvante
completo
Freund
Adyuvante

1 paquete
2 mL
250 g
10 mL

incompleto 10 mL

439
2, 522
1, 200
350
310

Freund
Los precios de todos los productos fueron consultados en diferentes casas
comerciales y distribuidoras de reactivos analticos como Sigma-Aldrich, Phytotech
Laboratories, Custom Arrays y Life Technologies.

Resultados Esperados
El sensor detectar cambios en alguna propiedad elctrica como resistencia o
potencial elctrico del sensor una vez que los anticuerpos presentes en este
hayan reaccionado con la micotoxina presente en la muestra. Estos cambios sern
correlacionados con la concentracin de la micotoxina presente en la muestra.
Se espera que el mtodo permita obtener resultados en solo 5 minutos despus
de aplicar la muestra al sensor y tenga un lmite de deteccin de alrededor de
0.005 ng/mL [12]. Los resultados reportados hasta ahora en sensores similares por
Jack Andraka han reflejado un lmite de deteccin de 0.156 ng/mL para Mesotelina
en sangre [12].

Comentarios Generales
Los mtodos de diagnstico disponibles para la identificacin de especies de
hongos del gnero Fusarium son utilizados ampliamente alrededor del mundo
debido a que afectan a muchos cultivos importantes, y aunque cumplen con el
propsito de deteccin, siempre hay lugar para mejoras en todas las tcnicas. El
mtodo propuesto en este proyecto, incorpora tcnicas y conocimientos ya
planteados para la deteccin y diagnstico de esta y otras patologas. Es gracias a
una combinacin de tcnicas de diferentes reas (como Medicina, Microbiologa,
Agricultura, Diagnstico Molecular, entre otras) que se pudo plantear la creacin

de un diagnstico ms especfico, sencillo y relativamente accesible si es que se

produce y utiliza bajo las condiciones adecuadas.
El Diagnstico Molecular es un medio para combinar diferentes tcnicas y
mtodos, que perfeccionan la relacin que se tiene con patologas existentes
desde mucho antes de que esta ciencia existiera, pero que siguen afectando a la
poblacin en general hasta la fecha. Solo con el estudio de los mtodos y tcnicas
ya planteados es que se puede innovar y mejorarlos, as como adecuar algunos
de ellos para darles un nuevo propsito.
Con el presente trabajo nos pudimos dar cuenta de que uno de los padecimientos
que afecta fuertemente un aspecto econmico, agrcola y social de nuestro pas,
podra resolverse de manera relativamente sencilla si se utilizan y conocen los
principios de tcnicas de Diagnstico Molecular. Por lo anterior consideramos
importante que su estudio se siga impulsando y ms importantemente se apliquen
los conocimientos adquiridos.

Referencias
[1] Miller, S. A. y Martin, R. R. (1988). Molecular Diagnosis of Plant Disease.
Annual Reviews of Phytopathology, 26: 409-432
[2] Booth, C. Fusarifum, pp. 11-14. En Booth, C. (Ed.). The Genus FUSARIUM,
Commonwealth Agricultural Bureaux, Inglaterra (1985)
[3] Chelkowski, J. Mycotoxins Associated With Corn Cob Fusariosis, pp. 53-63. En
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