LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

PERCOBAAN KE 2
PEMISAHAN PROTEIN PUTIH TELUR DENGAN FRAKSINASI (NH4)2SO4

Disusun oleh :
Ulan Darulan - 10511046
Kelompok 1

Asisten Praktikum

: R. Roro Rika Damayanti (10510065)

Tanggal percobaan

: Rabu, 1 Oktober 2014

Tanggal pengumpulan

: Rabu, 8 Oktober 2014

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2014

PERCOBAAN 1
REAKSI UJI TERHADAP ASAM AMINO DAN PROTEIN
I.

Tujuan Percobaan
1. Melakukan pemisahan protein putih telur dengan penambahan (NH4)2SO4 jenuh.
2. Menentukan berat molekul protein putih telur pada berbagai fraksi (NH4)2SO4 dengan
menggunakan metode SDS-PAGE

II.

Prinsip Percobaan
Penambahan garam pada konsentrasi rendah dapat meningkatkan kelarutan protein
(salting in) tetapi protein akan mengalami prepitasi pada konsentrasi garam yang tinggi
(salting out). Garam yang biasa digunakan adalah amonium sulfat, sodium sulfat, dan sodium
klorida. Endapan yang terbentuk dapat dilarutkan kembali, protein tidak mengalami
denaturasi. Mekanisme salting out terjadi melalui dehidrasi protein akibat penambahan
garam. Ion garam dapat menarik molekul air yang melarutkan protein, sehingga protein
menjadi tidak larut. Pemisahan protein putih telur dapat dilakukan dengan fraksinasi.
SDS-PAGE atau Elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium Dodesil Sulfat adalah teknik
elektroforesis gel yang menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan protein yang
bermuatan berdasarkan berat molekulnya saja. Sodium Dodesil Sulfat (SDS) merupakan
deterjen ionik yang dapat melarutkan molekul hidrofobik yang memberikan muatan negatif
pada keseluruhan struktur protein. Cara kerja SDS-PAGE adalah dengan menghambat
interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen. Metode SDS-PAGE digunakan untuk
memisahkan protein demi keperluan biokimia, genetika forensik, dan biologi molekuler.

III.

Data Pengamatan
Data migrasi
Marker
Jarak migrasi (cm)
0.5
1.4
2.5
3.4
4.6

Mr (kDa)
116
66,2
45
35
25

Log Mr
2.06446
1.82086
1.65321
1.54407
1.39794

Sampel
Fraksi
0-20 %
20-50 %
50-70 %

IV. Pengolahan data

1. Kurva jarak migrasi protein terhadao log kDa untuk marker

Jarak migrasi
r1 = 2.1
r2 = 3,7
r1 = 2.0
r2 = 3,6
r1 = 2.1
r2 = 3,5

2. Perhitungan ukuran protein berdasarkan jarak migrasi

Dari kurva tersebut maka didapatkan nilai regresi y = -0.157x + 2.0854
Maka akan didapatkan nilai kDA :
y = mx + c
Log kDA = m(jarak tempuh) + c
Untuk fraksi 0-20% (NH4)2SO4
Log kDA = -0,157 (2,1) + 2.0854
Log kDA = 1.7557
kDA = 56.97706
Dengan cara yang sama, diperoleh Mr protein pada berbagai fraksi:
Fraksi
0-20 %
20-50 %
50-70 %
V.

Jarak migrasi
2,1
3,7
2,0
3,6
2,1
3,5

log kDa
1.7557
1.5045
1.7714
1.5202
1.7557
1.5359

Mr (kDa)
56.97706
31.95214
59.07449
33.12836
56.97706
34.34788

Pembahasan
Pada percobaan kali ini, dilakukan pemurnian senyawa protein dari putih telur dengan
metode fraksinasi. Fraksinasi adalah proses pemisahaan senyawa tertentu dari
campurannya. Dimana untuk percobaan ini metode fraksinasi yang digunakan adalah
dengan memanfaatkan prinsip salting out. Salting out adalah proses berkurangnya
kelarutan protein atau proses pengendapan protein yang disebabkan adanya konsentrasi
garam dalam larutan yang terlalu tinggi. Proses ini terjadi karena garam akan lebih mudah
terhidrasi oleh air dibandingkan protein dikarenakan entropi dari hidrasi garam lebih
tinggi (luas permukaan ion garam total akan lebih besar). Sesuai hukum termodinamika,
suatu proses akan mengarah kepada penambahan entropi sistem sehingga protein kurang
terhidrasi dan akhirnya menggumpal satu sama lain dan mengendap. Pada percobaan ini
digunakan garam amonium sulfat, karena garam ini memiliki kelarutan yang sangat tinggi
dalam air, juga tidak berbahaya dan dijual dengan harga yang relatif murah dipasaran.
Dari hasil pengamatan, terdapat perbedaan pengendapan dalam segi kuantitas pada
setiap fraksi, hal ini dikarenakan dalam sampel putih telur terdapat beberapa jenis
senyawa protein yang memiliki titik isoelektrik yang berbeda sehingga terdapat senyawa
protein yang mengendap hanya saat konsentrasi garam amonium sulfat yang ditambahkan
mencapai 50% dan 70%. Perbedaan kelarutan protein bergantung kepada kehidrofobikan
dari muatan dan kehidrofilikan permukaan protein. Karena protein merupakan polimer
dari asam amino, maka kehidrofobikan protein ditentukan oleh gugus samping (gugus R)
residu asam amino; jika protein sebagian besar terdiri dari asam amino dengan gugus R-

nya hidrofobik maka protein yang terbentuk memiliki sifat hidrofobik yang besar. Protein
dengan kelarutan yang kecil mengindikasikan permukaan protein dengan hidrofobilitas
yang besar, sedangkan protein dengan hidrofobilitas yang kecil akan larut dalam pelarut
polar (contoh : air).
Endapan yang dihasilkan pada proses fraksinasi tersebut kemudian dianalisis dengan
menggunakan teknik SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis), SDS-PAGE adalah metode pemisahan elektroforesis berdasarkan berat
dari senyawa-senyawa yang akan dipisahkan dengan bantuan medan listrik yang mengalir
melalui perantaraan fasa diam gel. Untuk pemisahan senyawa protein, gel yang
digunakan adalah gel yang dibuat dari poliacrylamida. Protein akan bergerak dengan
kecepatan migrasi yang berbeda sesuai dengan berat dan ukurannya. Protein yang lebih
besar, akan memiliki kecepatan migrasi yang lebih lambat dan akhirnya akan memilki
jarak migrasi yang paling kecil begitu juga sebaliknya. Data jarak migrasi ini kemudian
dibandingkan dengan marker SDS-PAGE melalui kurva kalibrasi sehingga akan diperoleh
data massa molekul protein dalam masing-masing fraksi.
Gel yang digunakan adalah poliacrylamida dengan Bahan yang digunakan dalam
pembuatan stacking gel ini yaitu 40 % akrilamid yang digunakan sebagai pembentuk
pori-pori untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran yang dimilikinya, akrilamid
dipilih juga karena larutan ini bersifat inert sehingga tidak bereaksi dengan sampel
protein. Pada gel ini juga ditambahkan buffer tris pH 6.8 ini guna membuat protein
bermuatan negatif dan untuk mempertahan pH protein agar tidak berubah. 10 % H2O
berperana sebagai pelarut polar dan media polar untuk aliran listrik dalam gel. Reagen 10
% SDS juga digunakan sebagai surfaktan yang mendenaturasi protein dengan
memutuskan ikatan disulfide protein agar menjadi unfolding dan dapat menyelubungi
protein dengan muatan negatif. 10 % APS dimasukkan sebanyak

50 L sebagai

katalisator dalam polimerasi gel poliakrilamid. TEMED digunakan sebagai katalisator

pembentukan radikal bebas dari ammonium persulfat dan sebagai pemadat sehingga
pencampurannya dilakukan terakhir agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu
sebelum seluruh bahan tercampur. Bagian gel yang kedua, separating gel, berfungsi untuk
memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat molekulnya, komposisi gel
separating ini tidak jauh berbeda dengan stacking gel, hanya saja berbeda pada volume
dari setiap zat yang digunakan. Pada pembuatan gel ini buffer tris yang digunakan bukan
pada pH 6.8 tapi pada pH 8.8 ini berfungsi untuk menjaga agar muatan protein tetap
negatif. Dalam gel tersebut terdapat TEMED yang berfungsi sebagai katalis pembentukan

gel dan penstabil buffer tris. Selain itu terdapat APS yang berfungsi untuk mengaktifkan
TEMED. Setelah setiap fraksi dimasukkan ke dalam gel, maka gel tersebut
dielektroforesis. Setelah itu dilakukan staining dengan menggunakan Coomasie Brilliant
Blue dalam waterbath agar band yang timbul tampak jelas. Setelah itu dilakukan
destaining agar band dapat diamati.
Untuk analisis jenis protein yang dipisahkan, digunakan UNSTAINED PROTEIN
MOLECULAR WEIGHT MARKER sebagai perbandingan, yang nantinya hasil band
dari marker tersebut diterjemahkan dalam bentuk kurva jarak migrasi terhadap Log Mr.
Sehingga didapatkan fungsi regresinya untuk menghitung Mr dari tiap senyawa protein
yang dianalisis dalam sampel.

Pada hasil percobaan yang dilakukan, didapatkan hasil metode SDS-PAGE yang
kurang baik. Hal ini diindikasikan karena saat pembuatan gel, campuran komposisi gel
tidak tersebar merata. Hal ini ditunjukan dari hasil noda yang ditimbulkan tidak berbentuk
pita melainkan menyebar keluar jalur. Komposisi gel yang tidak merata dapat
menimbulkan pori-pori yang dihasilkan tidak merata pula, sehingga mengakibatkan
senyawa protein tidak dapat mengalir melalui gel dengan baik. Karenanya untuk
menanggulanginya , proses pengadukan komponen penyusun gel harus dilakukan dengan
cukup lama agar tercapai pemerataan komponen.
Selain dengan menggunakan fraksinasi, pemurnian protein dapat dilakukan dengan
berbagai metode lain, salah satunya adalah metode Dialisis. Metode dialisis adalah proses
perpindahan molekul terlarut dari suatu campuran larutan yang terjadi akibat difusi pada
membran semi-permeabel. Molekul terlarut yang berukuran lebih kecil dari pori-pori

membran tersebut dapat keluar, sedangkan molekul lainnya yang lebih besar akan
tertahan di dalam kantung membran. Selulosa adalah salah satu jenis materi penyusun
membran dialisis yang cukup umum dipakai karena bersifat inert untuk berbagai jenis
senyawa atau molekul yang akan dipisahkan. Laju difusi ditentukan oleh beberapa
kondisi:

Konsentrasi molekul pelarut yang akan keluar dari kantung dialisis. Jika
konsentrasi molekul terlarut di lingkungan lebih kecil dibandingkan dengan yang

ada di dalam kantung dialisis maka laju difusi akan semakin cepat.
Luas permukaan kantung dialisis. Semakin luas permukaan membran yang

digunakan maka laju difusi akan semakin cepat.

Volume pelarut. Jika rasio luas permukaan membran dengan volume pelarut besar
maka laju difusi akan berlangsung dengan cepat karena molekul terlarut dapat
berdifusi dalam jarak yang dekat.

VI.

Kesimpulan
Dari hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa dari tiap fraksi telah terdeteksi beberapa
protein dengan Mr sebagai berikut :
Fraksi 0 - 20 %

= 56.97706 kDa
31.95214 kDa

Fraksi 20 - 50%

= 59.07449 kDa
33.12836 kDa

Fraksi 50 - 70%

= 56.97706 kDa
34.34788 kDa

VII.

Daftar pustaka
Boyer, Rodney F. 1993. Model Experimental Biochemistry, 2nd ed. Michigan: The

Benjamine/ Cummings Publishing Company, Inc. Page: 248-249

Muchtadi, D., Nurheni Sri Palupi, dan Made Astawan. 1992. Metode kimia biokimia

dan biologi dalam evaluasi nilai gizi pangan olahan. Hal.: 5-28, 82-92, dan 119-121.
http://abo.com.pl/pl/p/Unstained-Protein-Molecular-Weight-Marker/14370 (diakses
pada tanggal 7 Oktober 2014 pada pukul 20.37)