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ndice

1. Introduo .......................................................................................................................... 3
1.1.Objectivos ........................................................................................................................ 3
2. Mtodos ou tcnicas de estudo da clula............................................................................. 4
2.1. Tcnicas para observao ao microscpio ptico ............................................................. 4
2.1.1. Tcnicas de preparao citolgica ................................................................................ 6
3. Tcnica par observao ao Microscpio eletrnico ............................................................. 7
4. Outros mtodos de estudo da clula .................................................................................... 9
4.1. Fracionamento celular ..................................................................................................... 9
4.2. Uso de substncias radioativas ...................................................................................... 10
4.2.1. Radioautografia .......................................................................................................... 10
5. Concluso ........................................................................................................................ 11
6. Referncias Bibliogrficas................................................................................................ 12

1. Introduo
O presente trabalho surge no mbito da Cadeira de Biologia Celular e Molecular, tendo como
tema mtodos ou tcnicas de estudo da clula. A clula, o objeto de estudo da Citologia, pode
ser estudada sob diversos aspectos: podemos procurar conhecer sua forma e a de seus
constituintes, a natureza qumica desses constituintes e seu modo de funcionamento. Em
outras palavras, essas investigaes so denominadas morfolgicas, qumicas ou bioqumicas
e fisiolgicas e a cada uma delas correspondem mtodos de estudo particulares.
De uma maneira geral, podemos dizer que, devido s suas pequenas dimenses, um estudo
detalhado da clula e de seus constituintes com a vista desarmada virtualmente impossvel,
por isso, o citologista obrigado a se utilizar de instrumentos de aumento para a observao
conveniente da clula. Como em geral os constituintes celulares tm muito pouco contraste, o
citologista obrigado a lanar mo de certos artifcios para contornar esse problema, a
alternativa mais lgica criar, artificialmente, este contraste, no nvel de certas estruturas
celulares
1.1.Objectivos
Geral:

Conhecer os mtodos ou tcnicas de estudo da clula;

Especficos:

Identificar os mtodos ou tcnicas de estudo da clula;

Classificar os mtodos ou tcnicas de estudo da clula;

Descrever os diferentes mtodos ou tcnicas de estudo da clula.

1.2. Metodologia
Para a elaborao do presente trabalho recorreu-se a consultas bibliogrficas que esto citadas
na ltima pgina do trabalho.

2. Mtodos ou tcnicas de estudo da clula


Tcnicas citolgicas so conjuntos de operaes a que preciso submeter o material
biolgico para ficar em condies de ser observado ao microscpio.
Os conhecimentos sobre as clulas progridem paralelamente ao aperfeioamento dos mtodos
de investigao. Inicialmente, o microscpio ptico (por se utilizar da luz como fonte de
formao de imagens) possibilitou a descoberta das clulas e a elaborao de teorias de que
todos seres vivos so constitudos por clulas.
Posteriormente foram descobertos tcnicas citoqumicas que possibilitam a identificao e
localizao de diversas molculas constituintes das clulas. Com advento dos microscpios
eletrnicos (pode ser constitudo por dois sistemas de lentes sobrepostas: a objetiva e a ocular)
que tm grande poder de resoluo foram observados pormenores da estrutura celular que no
podiam sequer imaginados pelos estudos feitos com os microscpios pticos.

2.1. Tcnicas para observao ao microscpio ptico


De acordo com AMABIS & MARTHO (2004:96), para observar ao microscpio, o material
biolgico precisa ser submetida a uma seria de tcnicas citolgicas, processos de preparao
que variam de acordo com tipo do material e com oque se deseja observar.
a) Exame a fresco ou Observao vital
O exame a fresco um mtodo muito simples, consistindo na observao ao microscpio de
clulas, pequenos organismos vivos ou fragmentos de tecidos vivos, num meio lquido o mais
prximo possvel do meio natural desses organismos. A finalidade desse mtodo permitir a
observao de estruturas vivas, de modo a poder observar manifestaes funcionais, como a
ciclose, reaes a estmulos, etc., alm de ser importante na contraprova de outros mtodos de
estudos de estrutura celular que utilizem o estudo de clulas mortas, (AMABIS & MARTHO,
2004:96).
A grande vantagem desse mtodo no produzir modificaes nem na forma nem na funo
do objeto examinado, servindo portanto de contraprova para outros mtodos. Outra vantagem
a sua rapidez. O emprego do exame a fresco est restrito dentro de estreitos limites: s se
aplica a objetos finos e transparentes; no permite observaes prolongadas e mostra apenas
uma pequena parte dos detalhes das estruturas.

b) Fixao
Para ROBERTIS & HIB (2006:358), a fixao do material essencial para preservar a
morfologia e a composio qumica dos tecidos e das clulas. Consiste na morte destas de
maneira tal que as estruturas que tinham em vida conservam-se com um mnimo de artifcios.
AMABIS & MARTHO (2004:96) afirmam que o efeito de fixao obtido mergulhando-se
as clulas em lquidos fixadores (formol, acido actico, lcool, etc.) que tm propriedade de
coagular as protenas do material preservando o espectro geral das clulas e das estruturas
celulares.
Estes agentes so utilizados em tcnicas citolgicas para inibir a actividade enzimtica da
clula, para impedir a actividade e a proliferao das bactrias, para endurecer as clulas de
modo a que resistam melhor s etapas seguintes da tcnica citolgica e para aumentar a
afinidade das estruturas celulares pelos corantes citolgicos, tornando-as assim mais
facilmente corveis, mantendo-lhes, tanto quanto possvel, a sua morfologia e estrutura.
A escolha do fixador adequado depende do estudo que se deseja realizar. Por exemplo, para
ncleo utilizam-se os fixadores cidos e para o exame da atividade enzimtica no citoplasma
emprega-se ou a acetona, o formaldedo ou o glutaraldedo, que produzem uma desnaturao
mnima e preservam muito os sistemas enzimticos, (ROBERTIS & HIB, 2006:358).

Um bom fixador deve: favorecer a observao das estruturas; impedir o aparecimento de


alteraes; impedir o aparecimento de estruturas artificiais; no impedir coloraes
posteriores; aumentar a afinidade do tecido pelos corantes; impedir o desaparecimento dos
elementos solveis e possuir alto poder de penetrao.
c) Colorao
Todos organelos e incluses so transparentes e incolores, oque dificulta o seu estudo
microscpio. Para vencer esta dificuldade, foram criados numerosos processos de colorao
que tornam visveis os diferente componentes celulares.
Na ptica de JUNQUERA & CARNEIRO (1997: 20), a maioria dos corantes comporta-se
como bsicos ou como cidos.
Nos corantes bsicos o grupamento qumico responsvel pela cor ou grupamento cromforo
(ou seja, o que distribui a cor) bsico (catinico). Os cromforos destes corantes combinam
se com os grupamentos cidos (aninicos) das molculas celulares. Por tanto as molculas
acidas, como as do DNA e RNA, so Basfilas, isto , tm afinidades pelos corantes bsicos.
O azul-de-teluidina e o azul-de-metileno so exemplos de corantes bsicos. A hematoxilina
comporta-se como corante bsico, ligando-se as estruturas basfilas dos tecidos.

Nos corantes cidos, o cromforo aninico e tende a se combinar com componentes


celulares bsicos, que so eletricamente positivos. Estruturas ricas em grupamentos bsicos
so acidfilas por terem afinidades por corantes cidos. Os corantes cidos como a eosina e
fuesina acida, coram principalmente os componentes bsicos das protenas citoplasmticas.
2.1.1. Tcnicas de preparao citolgica
A preparao de materiais biolgicos para observao microscpica consiste em coloca-los
sobre uma lmina retangular de vidro, recobrindo-as com uma lamnula de vidro muito fina.
H diversas tcnicas de preparao de lminas; a escolha de cada uma depende de material
que se quer estudar e do tipo de estudo que se quer fazer, (AMABIS & MARTHO, 2004:97).
a)

Corte manual

Esta tcnica usada perante material biolgico com clulas firmemente unidas entre si,
necessrio corta-los em fatias finas, processo denominado por cortes histolgicas.
possvel cortar manualmente certos matrias vegetais relativamente rgidos (caule, razes,
folhas, etc.), com uma lmina de barbear e observa-los fresco, com uma pequena gota de
gua entre a lamina e lamnula.
b)

Esfregao

Se o material biolgico constitudo por clulas isoladas ou fracamente unidas entre si pode
se simplesmente espalha los sobre a lmina de vidro. A tcnica de esfregao pode tambm ser
utilizada para observar clulas de revestimentos mucosos, as quais se soltam com certa
facilidade.
c)

Esmagamento

Est tcnica usada no caso das clulas frouxamente associadas, ou as partes de moles de
animais ou de vegetais. O material j fixado e corado colocado entre uma lmina em uma
lamnula de vidro e esmagado pela presso suave do dedo polegar. Em alguns casos as
matrias pode ser aquecido previamente para fazer com que as clulas se separem com mais
facilidade.

Figura 1: Processo de preparao das razes da cebola para observao microscpica.


d)

Incluso e corte com micrtomo

O estudo microscpico detalhado das clulas requer que elas sejam cortadas em fatias
realmente finas, e para tal usa se um aparelho chamado micrtomo. Para isso, os materiais
biolgicos so submetidos a tratamentos que endurecem as clulas e facilitam o corte.
O mtodo mais comum para enrijecer materiais biolgicos chamado incluso e consiste em
mergulhar o material biolgico em uma substancia inicialmente liquida que depois endurece,
envolvendo o completamente.

Figura 2: Incluso e corte com micrtomo

3. Tcnica par observao ao Microscpio eletrnico


O microscpio eletrnico um instrumento que permite conhecer a estrutura das clulas e da
matriz extracelular, j que possui um poder de resoluo maior que o do microscpio ptico.
Utiliza as propriedades que os feixes de eletres tm de serem desviados por um campo
eletrosttico ou eletromagntico da mesma forma que um raio de luz refratado ao atravessar
uma lente (ROBERTIS & HIB, 2006:362).
No microscpio eletrnico no possvel observar materiais vivos, pois estes tm de ser
colocados no vcuo e atravessados ou varridos por um feixe de eletres.
a) Fixao e colorao
O primeiro procedimento na preparao do material a fixao, feita com uma substancia
chamada glutaraldeido. Em seguida, o material corado com sais de metais pesados,
principalmente os de osmonio (Os) e uranio (U), que aderem s estruturas celulares e
aumentam o seu contraste eletrnico. Os corantes eletrnicos no so realmente coloridos,
mas fazem com que as estruturas celulares se tornem diferencialmente electro densas, isto ,
mais ou menos permeveis ao feixe de eletres. Estruturas que incorporam bastante corante
aparecem em preto ou em tons escuros de cinza; as que incorporam pouco corante aparecem
em tons de cinza mais claros. As fotomicrografias eletrnicas podem ser coloridas
artificialmente, um recurso grfico que facilita a distino das estruturas celulares, (AMABIS
& MARTHO, 2004:101).
b) Incluso e corte com o ultramicrtomo
Depois de fixado e corado, o material biolgico desidratado, includo e cortado em fatias
muito finas. Esses procedimentos so necessrios porque o feixe de eletres tem pequeno por
penetrao e s consegue atravessar materiais de pouca espessura.
Para obter cortes histolgicos to finas necessrio endurecer previamente o material
biolgico, incluindo- o em resinas sintticas como o araldite. Em seguida, o bloco de resina
com o material incluso cortado com um tipo especial de micrtomo, o ultramicrtomo que
empregam lminas de vidro ou de diamante (AMABIS & MARTHO, 2004:101).

4. Outros mtodos de estudo da clula


4.1. Fracionamento celular
uma tcnica de anlise bioqumica das partes celulares. Enquanto a microscopia eletrnica
revela a estrutura fsica das partes da clula a anlise bioqumica mostra a sua composio
qumica e permite deduzir suas funes (AMABIS & MARTHO, 2004:102).
Para ROBERTIS & HIB (2006:370), fracionamento celular consiste na homogeneizao ou
destruio das unies celulares por meio de diferentes procedimentos mecnicos ou qumicos,
o que rompe as membranas plasmticas e separa as fraes subcelulares de acordo com sua
massa, superfcie e peso especfico. So utilizados diversos mtodos de fracionamento celular,
baseados, em sua maioria, na homogeneizao da clula em uma soluo aquosa.
A anlise bioqumica das estruturas celulares comea com a macerao das clulas. O
macerado obtido, chamado homogeneizado celular, submetido altas rotaes em aparelhos
chamados centrifugam.
Centrifugas so aparelhos dotados de um motor de alta rotao, cuja finalidade gerar forcas
centrfugas sobre objectos colocados no seu interior, (AMABIS & MARTHO, 2004:102).
O lquido sobrenadante pode ser submetido ento forcas centrfugas maiores. Neste cas
estruturas celulares mais leves, entre elas as mitocndrias, depositam se no fundo do tubo.
Continuando a aplicar forcas de centrifugao progressivamente maiores, pode se separar as
diversas estruturas celulares. Cada estrutura pode ser ento submetida a uma anlise qumica
isolada que permite a identificao dos seus componentes moleculares.

Figura 3: Processo de fracionamento celular

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4.2. Uso de substncias radioativas


O uso das substncias radioativas uma das principais ferramentas de pesquisa biolgica
moderna. Com essas substncias possvel descobrir o momento exato em que certos
compostos so produzidos na clula e identificar o local onde est ocorrendo essa produo.
4.2.1. Radioautografia
A radioautografia baseia-se na marcao de componentes celulares com radioistopos, desta
forma, o radioistopo incorporado a um componente da clula e em seguida localizado
mediante uma emulso fotogrfica. Para tanto, o tecido com componente celular marcado
posto em contato com a emulso fotogrfica durante um tempo e a radioautografia revelada
como uma fotografia comum. Em seguida, a imagem fotogrfica se superpe com outra do
tecido (que foi processada para ser examinada ao microscpio) e obtida uma ideia bastante
precisa sobre a localizao do componente celular que leva a marca do radioistopo
(ROBERTIS & HIB, 2006:369).
Se desejarmos determinar em que local da clula o DNA est a ser produzido podemos usar
uma tcnica conhecida por radioautografia. Nesse caso, o rgo do animal injetado com
compostos radioativos retirado e preparado para observao microscpica. As lminas so
lavadas para um quarto totalmente escuro, prova da luz e so recobertas com uma fina
pelicula fotogrfica (AMABIS & MARTHO, 2004:104).

Figura 4: Processo radio-autogrfico do DNA

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5. Concluso
Findo o trabalho conclui-se que a observao nas estruturas biolgicas foi dificultada pelo
fato de as clulas serem muito pequenas e transparentes. Mais difcil ainda foi descobrir sua
organizao molecular e estabelecer de que maneiras as molculas atuam para determinar as
estruturas e as funes celulares. Desta forma foram descritos os princpios gerais das
microscopias ptica e eletrnica, alguns mtodos especiais que tomam possvel o estudo da
clula viva, diversos mtodos Microscpicos, radio autogrficos e fracionamento celular, e as
tcnicas empregadas na anlise molecular das clulas.
Porm, estudos morfolgicos ou morfo-fisiolgicos da clula comea normalmente com o
emprego do microscpio ptico, mais corretamente denominado de microscpio fotnico (por
se utilizar da luz como fonte de formao de imagens) ou microscpio composto (pode ser
constitudo por dois sistemas de lentes sobrepostas: a objetiva e a ocular). Este instrumento
pode ser considerado como a ferramenta bsica e indispensvel de todo o citologista.
Verificou-se tambm que o poder de resoluo (a capacidade de o instrumento fornecer
imagens diferentes de pontos muito prximos) do microscpio eletrnico to alto que a
imagem da objetiva pode ser aumentada pela ocular em uma proporo muito maior que a
obtida com o microscpio ptica. Outra diferena com o microscpio ptico que o
eletrnico oferece uma maior profundidade de foco. Por isso, o citologista obrigado a
utilizar instrumentos de aumento para a observao conveniente da clula.

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6. Referncias Bibliogrficas
1) AMABIS, Jos Mariano & MARTHO, Gilberto Rodrigues. Origem da Vida Citologia
e Histologia, Reproduo e Desenvolvimento. 2aed. So Paulo, Editora Moderna,
2004.
2) JUNQUEIRA, L. C. & CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 6ed. Rio de
Janeiro RJ: Guanabara Koogan, 1997.
3) ROBERTIS, Eduardo M. F. & HIB, Jos. Bases da Biologia Celular e Molecular.
4aed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.