Universidad de Santiago de Chile

Facultad de Qumica y Biologa

Principios de Sistemas Celulares

EXTRACCIN DE ADN

Autores:
-

Valentina Cantilln Carrasco.

Andrs Cerda Alvarado.
Profesor: Hans Khler.
Ayudante: Camila Seplveda.
Fecha Entrega: 4 de Noviembre de 2014.

Introduccin

El material hereditario de las clulas que componen a los seres vivos (los genes), se
encuentran codificados en el ADN. El ADN es un cido nucleico: una unin de monmeros
llamados nucletidos. Un nucletido, a su vez, corresponde a una molcula de fosfato y
un nuclesido, el que finalmente es la suma de un azcar (desoxirribosa) y una de las
cuatro bases nitrogenadas (Adenina, Citosina, Guanina y Timina)(1).
Este importante cido nucleico se puede extraer de las clulas de cualquier organismo
vivo. El presente informe centra su foco en la extraccin de ADN de un tejido de hgado de
Sus Scrofa L. (domestica)(2) (el tejido heptico es rico en ADN, conteniendo
aproximadamente 15

g/mg ). Para separar ADN o una mezcla de molculas de ADN,

se utiliza el procedimiento llamado Electroforesis(3). As como el microscopio sirvi para

observar estructuras microscpicas, la electroforesis hace posible observar una gran
cantidad de molculas, en este caso, el ADN.
Para preparar una muestra para la electroforesis, primero es necesario obtenerla del
tejido o fluido del que se quiera obtener, luego es necesario separar o dispersar la
muestra por maceracin, lisar las clulas por medio de una solucin tampn. Al romper un
tejido, comienzan a actuar inmediatamente las enzimas DNAasas (1), que se encargan de
degradar el ADN. Es por esto que es necesario agregar una enzima proteoltica (como la
proteinasa K, que funciona a 63 C)(1) que logre desnaturalizar las protenas (las enzimas
son protenas) y as permitir que el ADN se mantenga intacto. Para eliminar las protenas
desnaturalizadas y casi la mayora de los polisacridos, se agrega acetato de potasio (4).
Luego se centrifuga para que los tejidos, membranas, protenas y polisacridos se
separen de los cidos nucleicos, quedando estos en el sobrenadante (1). Para separar el
ADN de la fase acuosa, hay que precipitarlo por medio de un alcohol, como el etanol, por
ejemplo. El etanol secuestra las molculas de agua que rodean al ADN, aislndolo de la
solucin acuosa y liberndolo de impurezas(4).
En resumen, los principios de la electroforesis se basan en el movimiento de molculas a
travs de un medio poroso (generalmente un gel) debido a un campo elctrico aplicado.
Las molculas se separan en la matriz de electroforesis de acuerdo a su peso molecular,
tamao y carga elctrica. La velocidad de avance de las molculas en la placa

electrofortica es directamente proporcional a su carga e inversamente proporcional a su

tamao(5). Los fragmentos de ADN ubicados en la matriz poseen carga negativa, debido a
la presencia de un grupo fosfato en cada nucletido de la doble hebra (1). Como
consideracin adicional, se debe tener en cuenta que el tamao de los cromosomas
eucariontes es muy grande como para ser identificado con el presente proceso, por lo que
generalmente se debe fragmentar el ADN con nucleasas. Tambin, el tamao de las
molculas afecta la eleccin del medio poroso para la electroforesis. Para el caso de ADN,
al ser muy grandes las molculas (hasta 20 kb) (7), se recomienda el uso de gel de
agarosa.
Para detectar el ADN luego de ser separado, deben ser teidas o marcadas con algn
reactivo. El reactivo usado para marcar el ADN es el bromuro de etidio, un agente
intercalante, que se encarga de desenrollar la doble hlice en un punto, introducindose
en el ADN y siendo fluorescente a la luz ultravioleta (color naranja). De haber sido mal
eliminadas las DNAasas, el ADN se encontrar degradado y se observar una mancha
naranja muy difuminada(1). De encontrarse con impurezas, se vern varias manchas en
distintas posiciones de la matriz electrofortica, impidiendo distinguir con claridad el ADN.

Objetivos

2.1

Aislar y extraer cidos nucleicos a partir de una muestra de hgado de S. Scrofa.

2.2

Separar DNA de una mezcla de cidos nucleicos.

2.3

Someter DNA extrados al proceso de electroforesis en gel de agarosa.

2.4

Analizar cualitativamente el proceso de electroforesis a partir de la imagen obtenida.

Materiales y mtodos

Extraccin de ADN

Recibimos una muestra de hgado de S. Scrofa y luego la molimos en un mortero de

porcelana. Posteriomente el profesor agreg buffer TE en una cantidad proporcional a tres
veces el volumen de muestra de hgado molido que tenamos. Finalmente, se vaci la
muestra en un tubo eppendorf hasta completar 1
Se tomaron 20

Plus 20/200

(CH 3 COOK )

[L]

[ mL ] de ste

de proteinasa K mediante una micropipeta (Labnet BioPette

L
]), adems se tomaron 100

[ L ]

de acetato de potasio

mediante la misma pipeta. Ambas cantidades fueron agregadas al tubo

eppendorf que contena la muestra. Una vez hecho esto, se mezcl la muestra contenida
en el eppendorf mediante inversin. Se llev ste a centrifugar (Eppendorf 54151) a
10000

[rpm] durante 5 [ min ].

Luego de la centrifugacin, se obtuvieron 100 [L]

micropipeta (Labnet BioPette Plus 20/200

del sobrenadante mediante una

L
]) y fueron traspasados a otro

eppendorf. Luego, se tomaron 100 [ L ] de PCI (Fenol-Cloroformo- Alcohol Isoamlico)

mediante misma micropipeta recientemente mencionada, fueron agregados al nuevo
eppendorf (el que contena el sobrenadante) y finalmente mezclado por inversin. El tubo
fue llevado a centrfuga (Eppendorf 54151) a 5000

[rpm]

Una vez hecha esta centrifugacin, se extrajeron 20

[L]

una micropipeta (Labnet BioPette Plus 2/20

durante 5

[min] .

de la fase superior mediante

L
]) y fueron traspasdos a un nuevo

tubo eppendorf. A ste ltimo se gregaron 20

[L]

de cloroformo que fueron tomados

mediante la misma micropipeta recientemente mencionada y fue mezclado por inversin

del tubo. ste fue llevado a centrfuga (Eppendorf 54151) a 5000

[rpm]

durante 5 [

min ].
Luego de traer de la centrfuga el eppendorf que contena la muestra, se extrajo la mayor
20 [ L ]) usando una micropipeta

cantidad posible de la fase superior (

(Labnet BioPette Plus 2/20

L
L ] de etanol fro (otorgado
]), se agregaron 200 [

por la ayudante) , que fueron tomado mediante la micropipeta recientemente mencionada,

y fue mezclado mediante inversin del tubo.
Finalmente, se bot con cuidado el etanol y para secar el restante, se dej el tubo
eppendorf abierto.
4

Resultados

Resultado de la electroforesis de ADN de S. scrofa en gel de agarosa.

Figura 4.1: Fotografa de los resultados correspondientes a las muestras de ADN

extrado.

La figura 4.1 muestra el resultado del proceso de la tcnica de electroforesis. Esta imagen
fue entregada por el profesor das posteriores a la experiencia.

Se pueden observar bandas difuminadas producto de la contaminacin de la muestra y la

ausencia de marcadores de peso molecular.

Discusin

El resultado obtenido luego de la extraccin de ADN, nos muestra que el mtodo de

electroforesis en gel de agarosa es til a la hora de verificar que el aislamiento de ADN
fue correctamente ejecutado.
La muestra utilizada en esta experiencia provino de hgado de S. scrofa y, en particular, el
resultado de la electroforesis (Figura 4.1) muestra bandas difuminadas producto de la
contaminacin resultado de la prolijidad con que se llev a cabo la extraccin misma.
Una de las razones por las cuales se observa una difuminacain por contaminacin de la
muestras puede ser el manejo incorrecto de la enzima proteinasa K. Es probable que la
enzima no haya actuado todo el tiempo que se necesita para, efectivamente, degradar
todas las protenas presentes en la muestra, por sobre todo las DNAasas, que al
encargarse de degradar el ADN reducen el material gentico disponible para observar,
dejndolo en proporciones muy pequeas en comparacin al resto de componentes de la
muestra(1). Adems, otro motivo de contaminacin pudo haber sido el tratado de muestras
demasiado pequeas. Al hacer la ltima separacin de la fase superior se pudo haber

traspasado con la micropipeta la zona de separacin y haber llevado consigo

contaminantes provenientes de la zona no requerida.
Al observar una zona con mayor densidad en las columnas difuminadas, se deduce que
es ah donde el ADN se encuentra, por lo tanto, la electroforesis fue exitosa a pesar de
que la preparacin de la muestra fue deficiente (1). Entonces, es posible decir que se
comprob que las molculas de ADN migran hacia el nodo de la matriz electrofortica
debido a las cargas negativas que posee, producto de las cargas negativas de los grupos
fosfato(1).
Como la difuminacin se extiende ms all de la zona densa del ADN y compone, al
menos, la mitad de la fotografa, se deduce que gran parte de la contaminacin producida
se debe a molculas con una menor relacin carga/peso en comparacin con el cido
nuclico en cuestin(3), debido a que las molculas que con esta caracterstica migran con
mayor facilidad, pues al tener ms carga, se ven ms atradas por el polo positivo (nodo)
e inclusive, al tener menor peso, la matriz de agarosa ofrece menor resistencia mecnica
al movimiento.

Conclusiones

Se logr aislar y posteriormente extraer cidos nucleicos proveniente de clulas de hgado

de S. Scrofa. Luego, se consigui separar ADN de la mezcla de cidos nucleicos para su
posterior anlisis.
Adems, se entreg la muestra aislada de ADN para que el profesor la sometiera al
proceso de electroforesis en gel de agarosa. Luego de la entrega, en sta se detect que
hubo una manipulacin deficiente de las muestra porque el resultado arroj bandas
difuminadas, esto quiere decir que haba presencia de contaminantes en el extracto de
muestra.
No fue posible caracterizar cualitativamente el tamao de los fragmentos de ADN ya que
la fotografa recibida no captura las bandas marcadoras de peso molecular.

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