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Universidade de So Paulo Instituto de Fsica de So Carlos Bacharelado em Cincias Fsicas e Biomoleculares

Biologia Celular e Molecular I 2014


Aula Prtica 02: REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
A. Reao em cadeia da polimerase (PCR)
A tcnica da reao em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction) foi desenvolvida por Kary
Mullis nos anos 80 e lhe propiciou o prmio Nobel de Qumica em 1994. A PCR permite amplificar um gene de cpia
nica em milhes de cpias, a partir de uma pequena quantidade do DNA original (DNA molde).
O pr-requisito essencial a determinao da regio do gene que ser amplificada. Em seguida, so
desenhados e sintetizados um par de oligonucleotdeos iniciadores (primers) complementares s regies
flanqueadoras da sequncia a ser amplificada em cada fita do DNA. Geralmente, primers especficos possuem
tamanho entre 17 a 30 nucleotdeos, teor de GC entre 40 a 60% e no so auto-complementares ou
complementares entre si.
O processo composto de trs etapas: desnaturao, hibridizao (anelamento) e extenso, que juntas
correspondem a um ciclo da reao. Normalmente so realizados de 25 a 35 ciclos para cada reao na qual a taxa
de amplificao exponencial, 2 n de ciclos.
1) Desnaturao: a 94 C, as fitas do DNA so separadas.
2) Hibridizao: geralmente entre 45 a 65 C, os primers hibridizam com suas sequncias complementares no DNA
molde desnaturado.
3) Extenso: a 72 C, a DNA Polimerase, na presena ons Mg2+ e dNTPs (desoxinucleotdeos), sintetiza uma nova fita
de DNA a partir da extremidade 3 OH do primer que se encontra hibridizado ao DNA molde. A descoberta da
enzima Taq DNA Polimerase, oriunda da bactria Thermus aquaticus, que vive em fontes hidrotermais, permitiu
automatizar o processo utilizando-se os termocicladores. A enzima Taq possui uma atividade tima a 72 C, mas
permanece estvel at 94 C.
Alm da amplificao para clonagem molecular, a tcnica de PCR possui outras aplicaes como: teste de
paternidade, diagnstico de doenas genticas e infecciosas, medicina forense, testes de organismos transgnicos,
anlise de polimorfismo de DNA, sequenciamento de DNA e vrias aplicaes no uso das metodologias do DNA
recombinante.
Procedimento
A partir do DNA genmico de Streptomyces clavuligerus, ser amplificado por PCR o gene cas2, que codifica
a protena clavaminato sintase (CAS). A clavaminato sintase uma protena Fe (II)/2-oxoglutarato oxigenase
importante na biossntese do cido clavulnico, um produto do metabolismo secundrio utilizado na indstria
farmacutica como antibitico.
1) Coloque os regentes para degelar no banho de gelo e realize todo o preparo das amostras no gelo para evitar que
as reaes se iniciem prematuramente.
2) Em um tubo de 0,2 mL, prepare a reao no volume final de 50 L conforme discriminado na tabela a seguir.
Pipete os reagentes na mesma sequncia em que eles aparecem na tabela.

Reagente
gua milli-Q estril
Tampo da Pfu DNA Polimerase (5X)
MgCl2 (50 mM)
dNTPs (10 mM)
Primer forward (10 M)
Primer reverse (10 M)
DMSO (100%)
DNA molde (DNA genmico)
Pfu DNA Polimerase (2 U/L)

Quantidade
30,5 L
10 L
2,5 L
1 L
1 L
1 L
2,5 L
1 L
0,5 L

Concentrao Final
1X
2,5 mM
0,2 mM
0,2 M
0,2 M
5%
0,1 1 g
1U

3) Coloque o tubo no termociclador sob as seguintes condies de reao:


Etapa
Desnaturao inicial
35 ciclos
(Desnaturao, hibridizao e extenso)
Extenso final
Armazenamento

Temperatura
95 C
94 C
69 C
72 C
72 C
4 C

Tempo
5 min
30 s
1 min
90 s
10 min

A figura a seguir esquematiza os dois primeiros ciclos de reao.

Questes
1) Compare as etapas da reao da PCR (desnaturao, hibridizao e extenso) com as etapas da replicao do
DNA na clula, destacando as diferenas e semelhanas.
2) Por que a PCR resulta em um fragmento de DNA de tamanho determinado?
3) Em uma PCR convencional, partindo de uma molcula de DNA, qual o nmero de molculas aps 30 ciclos?
4) Se fosse colocado apenas um dos primers, qual seria o nmero de molculas aps 2 ciclos? E aps 30 ciclos?
Informaes adicionais
No site NCBI (National Center for Biotechnology Information), esto disponveis sequncias de genes, RNA e
protenas de diversos organismos. No link http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6840451 encontram-se os registros
para o gene cas2 (Gene ID: 6840451).
Para mais informaes sobre as tcnicas, consultar: Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 3th Edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 2001.
B. Eletroforese do produto de PCR
Atravs de eletroforese em gel de agarose, verificaremos se o gene foi amplificado e se o tamanho do
produto de PCR est correto. Se positivo, procederemos, na prxima prtica, purificao do produto de PCR a
partir do gel de agarose para posterior ligao a um vetor de clonagem.
1)
2)

Retire 5 L do produto de PCR e adicione 1 L de tampo de amostra (soluo contendo: 20% (m/v) de Ficoll
400; 0,1 M de EDTA pH 8,0; 0,1% (m/v) de SDS e 0,25% (m/v) de azul de bromofenol).
Aplique a mistura em uma canaleta do gel de agarose 0,8%, contendo o corante Sybr Safe e, em seguida,
aplique a voltagem de 120 V por aproximadamente 40 min. Utilize o transluminador para analisar o gel no
comprimento de onda de 470 nm.