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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SO FRANCISCO

CURSO DE GRADUAO EM FARMCIA

RELATRIO DE AULAS PRTICAS

Relatrio apresentado disciplina


Microbiologia Bsica do curso de
Farmcia da Professora Dr
Andra Vieira Colombo por
JSSICA AMARAL.

PETROLINA-PE
2014

1. AULA PRTICA 01
NORMAS DE CONDUTA E BIOSSEGURANA NO LABORATRIO DE
MICROBIOLOGIA
Biossegurana a condio de segurana alcanada por um conjunto de
aes destinadas a prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes s
atividades que possam comprometer a sade humana, animal e vegetal e o
meio ambiente. (Comisso de Biossegurana em Sade, 2002).
Acidentes nos laboratrios de Microbiologia podem acarretar em contrao de
doenas infecciosas por microrganismos patolgicos, um risco no s para o
indivduo que est em contato direto com o patgeno, mas para todos que
tenham acesso ao local. Por isso devem ser tomadas algumas precaues
como: pessoas com cabelos longos devem prend-los; limpar a bancada com
lcool etlico a 70% (v/v) antes e depois de cada aula prtica; lavar as mos
com detergente e lcool etlico a 70% (v/v) ao entrar e sair do laboratrio;
sempre usar o jaleco; usar cala comprida e sapato fechado; trabalhar sempre
prximo ao bico de Bunsen; evitar o uso de materiais pessoais que possam ser
contaminados durante as aulas (cadernos, anis, colares, pulseiras, livros,
mochilas); utilizar luvas e culos de proteo sempre que necessrios (evitar o
contato direto do material contaminado com o indivduo); o tampo de algodo
de tubos e frascos deve ser manuseado com o dedo mnimo, nunca pode tocar
na bancada.

EQUIPAMENTOS E MATERIAIS

Meios de cultura so necessrios para o cultivo dos microrganismos, eles


atuam como alimentos para esses seres. Eles podem ser distribudos em
placas de Petri, Erlenmeyers, bales ou tubos, com tampas de alumnio,
algodo ou rosca.
Algumas vidrarias utilizadas so: bqueres, pipetas, provetas, bastes, swabs,
ala de Drigalsky, autoclave, bico de Bunsen, lminas e lamnulas, entre outros.

CONCEITOS BSICOS DA MICROBIOLOGIA

A microbiologia definida como a cincia que estuda os microrganismos


(protozorios, algas, fungos, vrus e bactrias). Suas formas, estruturas,
reproduo, identificao; suas relaes com a natureza, entre si e com outros
seres vivos; alm das alteraes qumicas e fsicas produzidas por eles em
seus habitats, que podem ser prejudiciais ou benficas aos seres humanos.
Algumas caractersticas dos microrganismos os tornam ideais para
investigao de fenmenos biolgicos, como: podem ser cultivados facilmente
em recipientes pequenos, como tubos (diferente de plantas e animais);
crescem e se reproduzem em um ritmo elevado (algumas chegam a se
reproduzir milhes de vezes em 24 horas).

Eles so encontrados em praticamente todos os ambientes, sendo mais


frequentes em locais em que encontram condies favorveis para o seu
desenvolvimento (midos, com temperatura ideal e presena de substncias
nutritivas).
Os microrganismos, atualmente, classificam-se de acordo com os reinos:
Monera (bactrias, cianobactrias e arqueobactrias) e Protistas (algas,
protozorios e fungos).
2. AULA PRTICA 02
TCNICAS
LABORATORIAIS
DE
TRANSPORTE E MEIOS DE CULTURA

MICROBIOLOGIA:

COLETA,

Os meios de cultura so uma mistura de substncias nutritivas que dependem


das exigncias nutricionais de cada espcie de microrganismos, decorrentes
do seu maior ou menor poder de sntese. Esses meios podem ser compostos
por solues de sais inorgnicos, extratos de tecidos ou rgos animais,
tecidos vivos...
Eles podem ser classificados a partir de diversos grupos: procedncia,
consistncia, composio e finalidade. Essas divises esto mostradas nas
tabelas abaixo:

O gar o solidificante utilizado para obter a variao na consistncia dos


meios de cultura, ele extrado de algas marinhas.

As amostras coletadas para anlise podem ser de dois tipos: clnica ou


ambiental. A primeira retirada do organismo do indivduo (secreo, urina,
fezes, sangue); j a segunda retirada do ambiente (gua, solo).

A transferncia de um microrganismo para um meio de cultura chamada de


repique, semeadura ou inoculao. Para que esse transporte seja realizado em
condies de assepsia (no contaminao da amostra), recomenda-se
trabalhar prximo ao bico de Bunsen, em cmaras asspticas (esterilizadas por
raios UV) ou em cmaras de fluxo laminar, que alm de esterilizao UV,
possuem filtros de ar, que evitam a presena de partculas de ar no seu interior,
mantendo o meio estril.
Aps a semeadura, incuba-se o microrganismo para que haja a formao de
colnias (massa visvel que cresce no meio de cultura). Essa incubao pode
ser realizada em banhos de gua, incubadoras, quartos-estufa, jarras de
anaerobiose.
A preservao de microrganismos por perodos curtos feita geralmente em
refrigeradores temperatura de ~4C. Para perodos mais longos utilizam-se
freezers com temperaturas entre -20C e -70C ou em cmaras de nitrognio
lquido, alm de liofilizao (mtodo caro).

UBIQUIDADE BACTERIANA: COLETA DO MATERIAL CLNICO E

AMBIENTAL E SEMEADURA EM MEIO SLIDO


Objetivos:
Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos
de uso mais frequente no laboratrio de microbiologia;
Desenvolver habilidade de manipulao dos meios de cultura, em
condies de assepsia;
Executar semeadura em meios slidos e lquidos.
Prtica
A turma foi subdividida em grupos e cada um ficou responsvel pela coleta de
um material ambiental ou clnico (este j presente no laboratrio).
O meu grupo ficou responsvel pela coleta ambiental e optamos por analisar os
microrganismos presentes na pia do banheiro da Universidade Federal do Vale
do So Francisco Univasf, localizado no primeiro andar do bloco de
Laboratrios.
A coleta do material foi feita pelo contato do dedo polegar, previamente lavado
com gua e detergente, com a pia. Aps a coleta, o dedo foi pressionado em
placa de Petri (meio slido) contendo gar.
Os materiais coletados foram corretamente identificados com pincel e
submetidos incubao e preservao para anlise na aula posterior.

3. AULA PRTICA 03
LEITURA E INTERPRETAO DO CRESCIMENTO MICROBIANO
Houve a formao de uma massa densa, com pouca diferenciao, de cor
esbranquiada. Notou-se tambm a presena de odor caracterstico.
ISOLAMENTO MICROBIANO SEMEADURA POR ESGOTAMENTO
Introduo
Nos ambientes naturais, os microrganismos se encontram, quase sempre, sob
a forma de populaes mistas e, para estudar as espcies que compem essas
misturas, preciso isol-las em culturas puras. O isolamento mais comum
feito em placas de Petri.
A semeadura por esgotamento caracterizada pela formao de estrias
superficiais lado a lado com a placa. preciso ocupar toda a superfcie da
placa, no pode passar duas vezes no mesmo lugar e as estrias devem manter
uma distncia razovel entre si.

Pode-se tambm fazer as estrias por quadrantes, flambando o swab antes de


cada quadrante.

As colnias isoladas e de tamanho caracterstico sero observadas mais ao


final da semeadura, pois tanto no meio, quanto no ponto de esgotamento e nas
primeiras estrias, ainda no possvel esse isolamento.

Inicialmente o crescimento exponencial em relao ao tempo. Logo aps,


entretanto, a ordem de crescimento se torna muito complexa, devido
proximidade das clulas acumuladas. Esta proximidade cria uma situao que
pode ser chamada aglomerao fisiolgica na qual as clulas competem
entre si pelos nutrientes disponveis e afetam-se mutuamente pelo acmulo de
produtos residuais.
Objetivos
Treinar a tcnica de esgotamento;
Semear o material em estudo para obter o isolamento da bactria em
cultura pura, cujas propriedades serviro para caracterizao e posterior
identificao.
Prtica
Utilizando a placa da aula prtica anterior, foi coletada uma amostra de
caracterstica aparentemente uniforme e semeada a partir da tcnica de
esgotamento. Essa placa foi novamente levada para incubao e
armazenamento adequado, para anlise na aula posterior.
4. AULA PRTICA 04
ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DE COLNIAS
Utilizando as placas da aula anterior, pde-se observar a formao de
Unidades Formadoras de Colnias - UFC (provvel presena de apenas uma
bactria). A partir da observao macroscpica, foi possvel visualizar as
colnias isoladas.

COLORAO

DIFERENCIAL

DE

GRAM

MICROSCOPIA

DE

BACTRIAS
Introduo
A colorao de Gram um mtodo de colorao de bactrias que consiste no
tratamento sucessivo de um esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os
reagentes: cristal violeta (corante principal), responsvel pela cor; lugol
(mordente), refora a ao do corante principal; lcool-acetona (diferenciador),
descora seletivamente as bactrias; e fucsina (corante secundrio), cora o que
foi descorado pelo diferenciador e tem que contrastar com o principal.

Cristal Violeta

Lugol

lcool-Acetona

Fucsina Fenicada

Essa tcnica permite a separao de amostras bacterianas em Gram-positivas


(violetas) e Gram-negativas (rosas), e a determinao da morfologia e do
tamanho das amostras analisadas. Essa tcnica tem grande importncia
clnica, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterizao de
amostras de bactrias. Muitas das bactrias associadas a infeces so
prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gramnegativas em esfregaos de pus ou de fluidos orgnicos, da a frequente
utilizao desse mtodo.
As bactrias podem ser classificadas de acordo com a sua forma e disposio
como: cocos (arredondadas), bacilos (cilndricas/bastonetes) e vibries
(espiraladas). E elas podem se agrupar, formando os seguintes grupamentos:

Objetivos
Preparar lminas;
Aprender o mtodo de colorao de gram;
Visualizao das lminas preparadas;
Verificao da morfologia celular.
Prtica
Utilizando a placa analisada na primeira parte da aula, extraiu-se uma das
UFCs para preparo da lmina e posterior colorao. Esse mtodo realizado
nas etapas apresentadas a seguir:
I.

Realizao do esfregao com amostra coletada;

II.

Fixao a quente no bico de Bunsen;

III.

Colorao

IV.

Secagem a temperatura ambiente

Aps a secagem, houve a observao da lmina no microscpio, obtendo o


seguinte resultado:

Bacilo GramCoco Grampositivo


Bacilos Gramnegativos

Fungos
(contamina
o da amostra)

5. AULA PRTICA 05: TESTE DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE


DESINFETANTES E ANTISSPTICOS
Introduo
A escolha de um agente qumico depende da finalidade do uso. No existe uma
substncia ideal capaz de agir em todos os casos. Alguns so muito ativos,
mas txicos para os tecidos vivos, portanto usados apenas em objetos
inanimados. Outros apresentam instabilidade quando em soluo. Alguns so
rapidamente inativados em contato com matria orgnica.
Desinfetantes so compostos qumicos que podem matar ou inibir o
crescimento dos microrganismos, usados em superfcies e objetos. Os
antisspticos so utilizados em tecidos vivos, para uso tpico.
Os desinfetantes e antisspticos (e suas aes) utilizados na aula esto
descritos a seguir:

Alm destes tambm foi usado um desinfetante comercial.

Clorexidina
0,12%

Formaldedo
10%

lcool
Etlico 70%

Hipoclorito
de Sdio

Desinfetante
Comercial

Objetivo
Verificar a eficcia de desinfetantes e antisspticos contra os microrganismos.
Prtica
Foram utilizadas placas de Petri com culturas de bactrias utilizadas no
controle de qualidade.
Utilizando a pina, foram mergulhados nas solues desinfetantes e
antisspticas, pequenos discos de papel estreis. Depois, esses discos foram
depositados na placa com espaamentos semelhantes e razoveis entre si e
entre a borda da placa.
Por ltimo, essas placas foram incubadas e armazenadas para anlise na aula
posterior.
6. AULA PRTICA 06
LEITURA E
INTERPRETAO
DO
TESTE
DE ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA DE DESINFETANTES E ANTISSPTICOS
O resultado obtido na aula prtica anterior est mostrado a seguir:
Legenda:
Fo Formaldedo
A lcool Etlico
D Desinfetante
Clo Clorexidina
Hip Hipoclorito de Sdio
C - Controle

O anel formado ao redor do disco chamado de Halo de Inibio. Halos com


dimetro superior a 15 mm apresentam poder inibitrio contra os
microrganismos presentes no meio, valores menores significam que no h
inibio satisfatria.

Das substncias testadas, apenas o formaldedo apresentou halo com dimetro


superior a 15 mm (30 mm), todos os demais apresentaram valores inferiores.
Isso significa que o nico capaz de inibir o crescimento da cultura de bactrias
eficazmente presente no meio de cultura , foi o Formaldedo.

TESTE DE SENSIBILIDADE MICROBIANA AOS ANTIBITICOS

Introduo
Antibiograma ou Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (TSA) utilizado
para alguns grupos de bactrias, principalmente as que adquirem resistncia
facilmente.
Os testes para a deteco de resistncia so realizados em bactrias isoladas
de amostras representativas de um processo infeccioso, no qual a
sensibilidade aos antimicrobianos no previsvel ou quando existem
problemas de resistncia a antibiticos. No indicada a realizao do TSA em
microrganismos da microbiota normal, devido possibilidade de mutao,
podendo se desenvolver para um microrganismo patognico e resistente ao
antibitico.
O meio que deve ser utilizado o gar Mueller-Hinton por possuir propriedades
que permitem o crescimento da maioria dos microrganismos.
Para a realizao do TSA, necessariamente a bactria em questo,
primeiramente deve ter sido isolada e realizado os testes de gram, catalase,
DNAse e coagulase, a fim de fazer uma previa identificao da bactria para a
escolha dos discos de antibiticos adequados.
O Mtodo de Kirby-Bauer considerado o mtodo-padro para a realizao de
antibiogramas. Utiliza pequenos discos de papel com a Concentrao Inibitria
Mnima (CIM) do antibitico, ou seja, a menor concentrao de antibitico
capaz de inibir o crescimento da bactria.
Objetivo
Verificar a ao de substncias antimicrobianas no crescimento de bactrias,
utilizando o mtodo de Kirby-Bauer.
Prtica
Com o auxlio de uma pina, os discos so colocados na placa de petris
contendo a cultura previamente identificada, com distncias semelhantes entre
si. Os antibiticos utilizados foram: Penicilina G - PEN (10 g/mL),
Piperacilina+tazobactam PPT (110 g/mL), Eritromicina - ERI (15 g/mL) e
Imipenem - IPM (10 g/mL).

Logo aps, as placas foram incubadas e armazenadas para a anlise na aula


posterior.
7. LEITURA E INTERPRETAO DO ANTIBIOGRAMA
Com o auxlio de uma rgua foi medido o dimetro dos halos inibitrios de cada
disco, com posterior consulta a uma tabela apropriada com valores padro,
para determinar se a bactria em anlise sensvel ou no aos antibiticos
testados.
Os resultados podem ser observados na tabela a seguir:

Valores de Referncia (mm)


Substnci
a

Dimetro
do Halo
(mm)

Resistente
()

Intermediri
a

IPM

21

13

14-15

16

Sensvel

PEN

09

28

29

Resistente

PPT

19

17

18

Sensvel

ERI

Resistente

Sensvel
Resultado
()

Segundo este mtodo, as bactrias podem ser classificadas como Sensveis,


Resistentes ou Intermedirias (I).
A categoria sensvel implica que a infeco causada pela bactria isolada pode
ser adequadamente tratada com a dosagem do antimicrobiano recomendada
para o tipo de infeco e o agente infeccioso.
A categoria intermediria permite a aplicabilidade do antimicrobiano em
infeces em stios onde as drogas so fisiologicamente concentradas ou
quando doses maiores podem ser utilizadas.
A categoria resistente inclui isolados que no so inibidos pelas concentraes
usuais do antimicrobiano na dosagem padro e/ou falha quando um especfico
mecanismo de resistncia expresso.
REFERNCIAS

Microbiologia
Industrial.
Disponvel
<http://www.fat.uerj.br/intranet/disciplinas/Microbiologia
%20Industrial/APOSTILA%20PR%C1TICA%20DE%20MICROBIOLOGIA
%20INDUSTRIAL.pdf>. Acesso em: 08/12/14.

em:

Monteiro, C. L. B.; Cogo L. L.; Galarda, I.; Filho, F. C. B. Manual TericoPrtico De Procedimentos Bsicos Em Microbiologia Mdica. 3 ed.
Curitiba, 2010.
Teste De Sensibilidade Aos Antimicrobianos (TSA). Disponvel em
<http://users.med.up.pt/cc04-10/micropratica/micro_p_5.doc>
Acesso
em:
08/12/14.
TRABULSI, L. R., Alterthum, F.; Microbiologia. 5 ed.. So Paulo: Atheneu,
2008.
Vermelho, A. B.; Pereira, A. F.; Coelho, R. R. R.; Souto-Padrn, T. C. B. S. S.
Prticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.