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El microscopio confocal es un microscopio que emplea una tcnica ptica de imagen para incrementar el
contraste y/o reconstruir imgenes tridimensionales utilizando un "pinhole" espacial (colimador de orificio
delimitante) para eliminar la luz desenfocada o destellos de la lente en especmenes que son ms
gruesos que el plano focal.
CONCEPTO BSICO
El concepto de imagen confocal fue patentado por Marvin Minsky en 1957.[2] En un microscopio de
fluorescencia convencional (p.ej., de campo amplio), el espcimen entero est sobresaturado de luz a
partir de la fuente de iluminacin. Debido a la conservacin de la intensidad de la luz en su recorrido,
todas las partes del espcimen a lo largo de su ruta ptica sern excitadas y la fluorescencia detectada
por un fotodetector o una cmara.
Tipos
Existen tres tipos de microscopios confocales disponibles comercialmente: El Microscopio confocal lser
de barrido, el microscopio confocal de disco giratorio (disco de Nipkow) y microscopios de matriz
programable,(Programmable Array Microscope, PAM). La microscopa confocal de barrido por lser
produce un mayor rendimiento en la calidad de la imagen que los de disco o PAM, pero la tasa de frames
era muy lenta (menos de tres frames/segundo) hasta hace poco. Los microscopios de disco pueden
lograr velocidades compatibles con la creacin de videos.
El Microscopio de fuerza atmica (AFM, de sus siglas en ingls Atomic Force Microscope) es un
instrumento mecano-ptico capaz de detectar fuerzas del orden de los nanonewtons. Al rastrear una
muestra, es capaz de registrar continuamente su topografa mediante una sonda o punta afilada de forma
piramidal o cnica.
Historia
Gerd Binnig y Heinrich Rohrer fueron galardonados con el Premio Nobel de Fsica en 1986 por su trabajo
en microscopa de barrido de tnel. Binnig y Rohrer fueron reconocidos por el desarrollo de la tcnica de
microscopa poderosa, que puede formar una imagen de cada uno de los tomos sobre una superficie de
metal o de semiconductores mediante el escaneo de la punta de una aguja sobre la superficie a una
altitud de slo unos pocos dimetros atmicos.
El microscopio de efecto tnel (STM) es un instrumento que permite visualizar regiones de alta o baja
densidad electrnica superficial, y de ah inferir la posicin de tomos individuales o molculas en la
superficie de una red. La "observacin" atmica se ha vuelto una tarea comn en muchos laboratorios
debido al bajo costo de este tipo de microscopa en comparacin con la microscopa electrnica.
MICROSCOPA VIRTUAL
MICROSCOPIO ELECTRNICO
Un microscopio electrnico es aqul que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar
imgenes de objetos diminutos. Los microscopios electrnicos permiten alcanzar ampliaciones hasta
5100 veces ms potentes que los mejores microscopios pticos, debido a que la longitud de onda de los
electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles".
El primer microscopio electrnico fue diseado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, quienes
se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los
electrones.
Un microscopio electrnico, como el de la imagen, funciona con un haz de electrones generados por un
can electrnico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnticas (todo ello
al alto vaco ya que los electrones son absorbidos por el aire).
Existen tambin distintas aberraciones producidas por las lentes: astigmtica, esfrica y cromtica
El microscopio de campo oscuro (en ingls: Dark field microscope or dark ground microscope) es un
microscopio que utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado
sobre el espcimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace as visible contra el fondo oscuro que
tiene detrs, como las partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin
cerrada.
El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espcimen. Para lograrlo, el
microscopio de campo oscuro est equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz
fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa detrs de la muestra como un fondo oscuro
sobre el cual aparecen pequeas partculas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el
objetivo. Los condensadores que se emplean en microscopa de campo oscuro son de dos tipos: del tipo
paraboloide (tiene una superficie espejada), y los del tipo cardioide, con dos superficies espejadas. El
empleo de uno u otro es indistinto, mediante cualquiera de ambos, la luz no incide directamente en el
objetivo (este es el objetivo de estos condensadores), sino que incide con una apertura numrica mayor
al del objetivo.
Algunos compuestos inorgnicos responden al efecto de la luz, stos tienen un alto grado de orientacin
molecular (sustancias anistropas), que hace que la luz que los atraviesa pueda hacerlo en determinados
planos vibratorios atmicos.
El prisma de Nicol permite el paso de luz en un solo plano, as la calcita gira la posicin de polarizacin,
facilitando la identificacin de sustancias que extinguen la luz. Al fenmeno de extincin de luz causado
por estos planos atmicos y orientaciones moleculares se llama birrefringencia.
Este tipo de microscopio se usa para poder identificar sustancias cristalinas (minerales) o fibrosas (como
el citoesqueleto), sustancia amiloide, asbesto, colgeno, cristales de uratos, queratina, slice, polen, etc.
Algunos tejidos vivos pueden ser observados bajo microscopa ptica de luz polarizada debido a la
birrefrigencia provocada por la orientacin de sus fibroinas,[1] tales como la actina o miosina. Algunos
animales tales como los Anisakis pueden observarse mediante esta tcnica.
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
MICROSCOPIO COMPUESTO
El sistema mecnico est constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y detener los
instrumentos a observar.
El sistema ptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de los objetos
que se pretenden observar mediante filtros llamados "de antigel subsecuente".
Parte mecnica del microscopio
El pie y soporte: contiene la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general
forma de Y o bien es rectangular.
La columna o brazo: Sostiene el tubo en su porcin superior y por el extremo inferior se adapta al
pie.
El tubo: tiene forma cilndrica. El tubo se encuentra en la parte superior de la columna mediante
un sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos.
El tornillo macromtrico o macroscopico: girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del
microscopio, deslizndose en sentido vertical gracias a un mecanismo de cremallera.
La platina: es una pieza metlica plana en la que se coloca la preparacin u objeto que se va a
observar. Presenta un orificio, en el eje ptico del tubo, que permite el paso de los rayos luminosos
a la preparacin.
Las pinzas: son dos piezas metlicas que sirven para sujetar la preparacin. Se encuentran en la
platina.
El revlver: es una pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos.
Sistema ptico
Es el encargado de reproducir y aumentar las imgenes mediante el conjunto de lentes que lo componen.
El ocular: se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la cercana de
la pieza con el ojo del observador. Tiene como funcin aumentar la imagen formada por el objetivo.
.
Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria denominada revlver y producen el aumento de
las imgenes de los objetos y organismos.
Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la
preparacin. El nmero de objetivos vara con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los
aumentos de los objetivos secos ms frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X.
Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparacin
u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. Comprende los siguientes
elementos:
Condensador: est formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos
luminosos sobre el plano de la preparacin, formando un cono de luz con el mismo ngulo que el
del campo del objetivo.
MICROSCOPIO SIMPLE
MICROSCOPIO PTICO
2 * Objetivo: lente situado en el revlver. Ampla la imagen, es un elemento vital que permite ver a travs
de los oculares.
3 * Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.
4 * Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador.
5 * Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
6 * Tubo: es la cmara oscura que porta el ocular y los objetivos. Puede estar unida al brazo mediante
una cremallera para permitir el enfoque.
7 * Revlver: Es el sistema que porta los objetivos de diferentes aumentos, y que rota para poder utilizar
uno u otro, alinendolos con el ocular.
8 * Tornillos macro y micromtrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina o el tubo hacia arriba y
hacia abajo.
9 *Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparacin, que
permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo.
10 *Brazo: Es la estructura que sujeta el tubo, la platina y los tornillos de enfoque asociados al tubo o a la
platina. La unin con la base puede ser articulada o fija.
11 * Base o pie: Es la parte inferior del microscopio que permite que ste se mantenga de pie.
Sistema de iluminacin
La fuente de luz, con la ayuda de una lente (o sistema), llamada colector, se representa en el plano del
diafragma iris de abertura del condensador. Este diafragma se instala en el plano focal anterior del
condensador y puede variar su abertura numrica.
Microscopio de luz fluorescencia - Las lentes del objetivo, que habitualmente se componen de vidrio se
sustituyen por lentes de cuarzo, y la iluminacin se produce por lmparas de mercurio. No usa filtros y se
observa en placas fotogrficas. La variedad de fluorescencia, si usa filtros, y la observacin es directa.
Microscopio de luz ultravioleta depende de la absorcin de esa luz por las molculas de la muestra. La
fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una
resolucin de 100 nm. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un
espectrofotmetro pero sus resultados son registrados en fotografas. La muestra no se puede observar
directamente a travs del ocular porque la luz ultravioleta puede daar la retina. El mtodo sirve para
detectar cidos nucleicos, protenas que contienen determinados aminocidos. Mediante longitudes de
ondas especficas para la iluminacin se puede obtener mediciones espectrofotomtricas para cuantificar
el ADN y el ARN de cada clula.
Historia
El primer microscopio electrnico de transmisin fue desarrollado entre 1931 y 1933 por Ernst Ruska y
sus colaboradores. La ptica bsica de ese primer microscopio electrnico se mantiene hasta nuestros
das; los cambios en los microscopios modernos consisten en adicionar ms lentes para incrementar el
mbito de aumentos y darle mayor versatilidad. El primer microscopio electrnico de transmisin
comercial lo construy Siemens en 1939.
Estructura
Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible, pueden
mostrar estructuras mucho ms pequeas.
Las partes principales de un microscopio electrnico de transmisin son:
Can de electrones, que emite los electrones que chocan o atraviesan el espcimen
(dependiendo que tipo de microscopio electrnico es), creando una imagen aumentada.
Lentes magnticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las
lentes convencionales utilizadas en los microscopios pticos no funcionan con los electrones.
Sistema de vaco es una parte muy importante del microscopio electrnico. Debido a que los
electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, se debe hacer un vaco casi total en el
interior de un microscopio de estas caractersticas.
Placa fotogrfica o pantalla fluorescente que se coloca detrs del objeto a visualizar para
registrar la imagen aumentada.
Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser un
ordenador.
El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se
desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan
formando una imagen aumentada de la muestra.
primera tcnica con la que se consigui resolver espacialmente tomos individuales. La tcnica fue
desarrollada por Erwin Mller. En 1951 se publicaron por primera vez imgenes de estructuras atmicas
de tungsteno en la revista Zeitschrift fr Physik.
varios otros lquidos o gases del ambiente, y a temperaturas que abarcan un rango desde casi cero
Kelvin hasta unos pocos cientos de grados Celsius.
El STM est basado en el concepto de efecto tnel. Cuando una punta conductora es colocada muy
cerca de la superficie a ser examinada, una corriente de polarizacin (diferencia de voltaje) aplicada entre
las dos puede permitir a los electrones pasar al otro lado mediante efecto tnel a travs del vaco entre
ellas. La resultante corriente de tunelizacin es una funcin de la posicin de la punta, el voltaje aplicado
y la densidad local de estados (LDOS por sus siglas en ingls) de la muestra. La informacin es adquirida
monitoreando la corriente conforme la posicin de la punta escanea a travs de la superficie, y es
usualmente desplegada en forma de imagen. La microscopa de efecto tnel puede ser una tcnica
desafiante, ya que requiere superficies extremadamente limpias y estables, puntas afiladas, excelente
control de vibraciones, y electrnica sofisticada.