Programa de Iniciao Cientfica

Relatrio Parcial
Ttulo do Projeto do Orientador

Alternativas biotecnolgicas para a produo de plsticos

biodegradveis

Ttulo do Plano de Atividades do

Bolsista

Produo de Poli(3-hidroxibutirato) a partir de Ralstonia

eutropha utilizando vinhaa como substrato

Nome do Bolsista

Thas Rocha Guimares

Nome do Orientador

Glucia Maria Falco de Arago

Grupo de Pesquisa
Palavras-chave

Plstico biodegradvel, poli-hidroxialcanoatos,

Cupriavidus necator

Perodo de Vigncia da Bolsa

Incio: 1 de AGOSTO de 2014. Trmino: 31 de JULHO

de 2015

IAA anterior/IAA posterior

7.09/6.95

Resumo
Poli-hidroxialcanoatos (PHAs) so uma famlia de biopolmeros sintetizados por diversos
microrganismos. Estes compostos so uma possvel alternativa aos polmeros derivados do
petrleo. Para diminuio dos custos de produo destes polmeros pode-se utilizar fonte de
carbono de baixo custo, como a vinhaa. O objetivo nesta fase do projeto foi obter uma anlise
qualitativa do crescimento de R. eutropha, estudo cintico do crescimento e produo de P(3HB)
a partir de R. eutropha em vinhaa. O microrganismo utilizado foi a bactria Ralstonia eutropha
DSM 545, e a vinhaa foi obtida de resduo de produo de etanol. Cultivos realizados em
incubador com agitao foram feitos variando a concentrao de vinhaa pura, e vinhaa com
glicose. Observou-se que R. eutropha DSM545 capaz de crescer e produzir P(3HB) a partir de
vinhaa, sendo que em vinhaa cresce com velocidades especficas mximas de crescimento
maiores que s obtidas quando apenas glicose utilizada como substrato sendo o maior valor de
mx para o ensaio com 50 % de vinhaa. Para os cultivos em biorreator, o maior Xrmx foi de
0,29 h-1 para vinhaa pura e para vinhaa com adio de nitrognio, porm a maior biomassa total
foi no cultivo de vinhaa com glicose (5 g/L).

Introduo
Os materiais plsticos de origem petroqumica vm ganhando cada vez mais espao em
diversas aplicaes. Contudo, a durabilidade do plstico de origem petroqumica, ao mesmo
tempo em que o faz um produto atraente para o mercado, torna-o tambm indesejvel, devido ao
crescente acmulo de materiais plsticos no meio ambiente. Diante deste panorama, necessrio
o desenvolvimento de novos produtos que possam aliar a eficincia dos polmeros de petrleo
com a degradabilidade necessria para preservar o meio-ambiente dos biopolmeros
biodegradveis (REDDY; GHAI; KALIA, 2003). Entre os biopolmeros, destacam-se os Poli-

hidroxialcanoatos (PHAs), sendo o Poli(3-hidroxibutirato) o mais estudado, particularmente em

funo de suas propriedades similares s do polipropileno.
Estes polmeros so polisteres microbianos, produzidos por um grande nmero de
microrganismos, principalmente como compostos de reserva de carbono e energia. Dentre os mais
de 300 diferentes microrganismos capazes de sintetizar PHAs (HAZER; STEINBUCHEL, 2007;
STEINBUCHEL; VALENTIN, 1995), destaca-se a bactria Ralstonia eutropha (tambm
conhecida como Cupriavidus necator ou Alcaligenes eutrophus) pela capacidade de produzir
elevadas porcentagens de PHAs (LEE, 1996).
Um dos principais obstculos da produo de PHAs seu elevado custo, este
inconveniente tem estimulado a procura por substratos de baixo custo, uma vez que em torno de
40 % desses custos de produo esto relacionados fonte de carbono utilizada (RAMADAS
et al., 2009; KIM, 2000). Um dos estudos visando a diminuio dos custos a utilizao de
vinhaa, resduo da produo de etanol, como substrato, j que uma fonte de carbono de baixo
custo e com potencial para ser utilizada na produo de PHAs. Informaes presentes na literatura
indicam que os principais componentes orgnicos presentes na vinhaa de cana-de-acar so o
glicerol, cido ltico, etanol e cido actico (PARNAUDEAU, et al., 2008).

Estratgia Metodolgica Utilizada

A vinhaa utilizada nos experimentos foi obtida junto Usina Iracema (produtora de
etanol e acar), no municpio de Iracempolis/SP, coletada diretamente das colunas de
destilao. As amostras foram acondicionadas em recipientes plsticos de 5 L e congeladas
permanecendo desta forma at o momento da sua utilizao. Antes de cada experimento, a
vinhaa passou por tratamentos que incluram o ajuste do pH para 7,0 (atravs da adio de
NaOH 2,5 N) e esterilizao por filtrao em sistema com membrana tubular, capilar, de
polipropileno, autoclavvel, modelo MD020 CP 2N (Mycrodin Nadir, FRINGS DO BRASIL
Engenharia e Comrcio Ltda, Piracicaba SP), com dimetro de poro igual a 0,2 m e rea de
filtrao de 0,1 m2.
O microrganismo utilizado a bactria Ralstonia eutropha DSM 545, mantida em
glicerol a -80 C. Em todos os ensaios o meio de cultura utilizado para a reativao da cepa foi o
Nutrient Broth (NB - Difoico), conduzida em frasco erlenmeyer aletado de 500 mL, com 150 mL
de volume til, incubada por 18 horas (150 rpm/35 C). Esta reativao serviu como inculo
(10 % v/v) para os testes posteriores.
Para verificar se haveria inibio do crescimento de R. eutropha DSM 545 na presena de
vinhaa, diferentes concentraes do substrato foram testadas (0,5, 5, 10 e 100 % v/v) em meio
mineral (MM) (composio descrita por Arago et al. (1996) com modificaes). Os testes foram
realizados em frascos erlenmeyers aletados de 250 mL, mantidos a 35 C e 150 rpm, com 100 mL
de meio. Os ensaios seguintes foram realizados partindo-se de duas pr-culturas, a primeira j
descrita e a segunda, inoculado da pr-cultura, em frasco aletado de 1 L contendo 200 mL de
vinhaa adicionada dos sais do meio mineral totalizando 400 mL meio de cultivo, realizado
incubador rotativo (150 rpm/35 C).
Dez cultivos em shaker foram feitos, oito com objetivo de investigar o crescimento de R.
eutropha em diferentes concentraes de vinhaa, e dois ensaios para avaliar o crescimento e
acmulo de polmero por R. eutropha em meio contendo vinhaa. Trs cultivos em biorreator
foram realizados contendo vinhaa e/ou demais nutrientes, biorreator (BIOFLO III, New
BrunswickScientific) de 5 L, com volume til de 4 L. A temperatura foi mantida em 35 C e o pH
em 7,0 com adio de solues de NaOH 2,5 N ou HCl 2,7 N, com condies iniciais de agitao
e aerao de 450 rpm e 0,1 vvm, respectivamente. As condies de agitao e aerao foram
monitoradas e controladas para que a concentrao de oxignio dissolvido no meio no fosse
inferior a 40 %, em relao saturao com ar atmosfrico.
Em ambos os cultivos a determinao do crescimento celular foi feita atravs da leitura
da absorbncia (600 nm) em espectrofotmetro (modelo 1105, marca Bel). Nos ensaios em

biorreator, 2 mL de meio de cultivo foram coletados em microtubos de plstico e centrifugados a

14000 rpm por 3 min, em seguida lavados os precipitados com 1 mL de gua destilada,
centrifugados mais uma vez, sendo congelados os sobrenadantes e precipitados. O sobrenadante
foi posteriormente utilizado para a anlise do consumo de substrato e o precipitado para anlise
de determinao de P(3HB).
A biomassa foi determinada por gravimetria aps filtrao, seguida de secagem em estufa
(100 C), durante 24 horas. A determinao de acares redutores totais (ART) foi realizada pelo
mtodo do cido 3-5 dinitrosaliclico (DNS) (MILLER, 1959). As determinaes de glicerol,
frutose, sacarose, manitol foram realizadas por cromatografia lquida de alta presso (HPLC) em
um equipamento Jasco (LC-2000Plus Series). O nitrognio foi determinado utilizando-se o kit
Ureia ES (Gold Analisa). As clulas contendo P(3HB) foram analisadas por HPLC, segundo Karr
et al. (1983), com modificaes. Esta anlise foi realizada em equipamento Jasco (LC-2000Plus
Series). A concentrao foi detectada a A210 nm (Jasco UV-2077). A determinao de demanda
qumica de oxignio foi realizada segundo o procedimento do Standart Methods for the
Examination of Water and Wastewater (APHA; AWWA; WEF, 1995).

Atividades Realizadas
Perodo
Agosto/Outubro

Novembro

Dezembro/Janeiro

Fevereiro/Abril

Atividades realizadas
Definio da metodologia. Levantamento dos materiais e
equipamentos necessrios e disponveis para a realizao dos
experimentos propostos. Tratamento da vinhaa.
Anlise qualitativa do crescimento de R. eutropha em
vinhaa.

Estudo cintico do crescimento de R. eutropha em vinhaa.

Estudo cintico do crescimento e produo de P(3HB) a

partir de R. eutropha em vinhaa. Elaborao de relatrio
parcial de atividades.

Resultados Obtidos
Os experimentos em carter qualitativo realizados, para verificar uma possvel inibio no
crescimento de R. eutropha DMS 545, causada pelos componentes da vinhaa, permitiram
verificar que, sob as condies testadas, foi verificado crescimento da biomassa em todas as
concentraes de vinhaa (0,5; 5; 10 e 100 %) (v/v) em meio mineral.
Nas Figuras 1 e 2 est apresentada a representao logartmica da absorbncia em funo
do tempo de cultivo, para os ensaios sem a adio de glicose (1) e com adio de glicose (2).
Figura 1. Representao logartmica da absorbncia com o tempo de cultivo, para a obteno da
velocidade especfica mxima de crescimento, para vinhaa pura (a), vinhaa 25 % (b), vinhaa
50 % (c) e vinhaa 100 % (d).

Figura 2. Representao logartmica da absorbncia com o tempo de cultivo,

para os cultivos com glicose (a), glicose e vinhaa 25 % (b), glicose e vinhaa
50 % (c) e glicose e vinhaa 100 % (d).

Os resultados observados durante o estudo cintico do crescimento de R. eutropha em

vinhaa sugerem que esta bactria cresce com velocidades especficas mximas de crescimento
maiores que s obtidas quando apenas glicose utilizada como substrato. Na Figura 1, o maior

valor de mx foi para o ensaio com 50 % de vinhaa, levando em considerao apenas os valores
de densidade ptica para a obteno desses valores. Na figura 2, observa-se que o crescimento foi
mais acentuado com o aumento da concentrao de vinhaa no meio.
A partir da anlise cintica dos cultivos representados determinou-se que o tempo de
incubao da segunda pr-cultura, ou seja, a que posteriormente foi utilizada como inculo para
os demais cultivos em incubador rotativo e biorreator, foi 7 horas (35 C/150 rpm), sem limitao
de nitrognio e sem a adio de glicose, pois neste momento a biomassa celular se encontrava
com velocidade especfica mxima de crescimento e maior concentrao celular desta fase.
No cultivo em shaker para a produo de P(3HB), o acmulo mximo de P(3HB) (m/v)
foi de 33 %, o qual foi acumulado a partir dos compostos orgnicos presentes na vinhaa. A
produo de biopolmero foi interrompida com 16 horas de ensaio. No segundo ensaio para
crescimento de R. eutropha em vinhaa (com adio de sais) e acmulo de biopolmero, optou-se
pela adio de uma soluo concentrada de glicose (500 g/L). Neste cultivo, apesar da
concentrao final (em g/L) ter sido maior que o ensaio sem adio de glicose, a porcentagem
final de biopolmero acumulado foi aproximadamente 30 % (m/v).
Figura 3. Evoluo de biomassa total (Xt ()), biomassa residual (Xr (-)) e P(3HB) () para R.
eutropha em biorreator, para o ensaio em vinhaa pura (A), vinhaa com adio da fonte de
nitrognio (B), vinhaa com adio da fonte de nitrognio e dos sais do meio mineral (C), ao
longo do tempo.
B

No conjunto contendo trs cultivos realizados em biorreator, o Xrmx foi de 0,29 h-1 (com
durao da fase exponencial de crescimento de 6 horas) para vinhaa pura, 0,29 h-1 (com durao

da fase exponencial de crescimento de 8 horas) para vinhaa com adio de nitrognio e mx de

0,12 h-1 (com durao da fase exponencial de crescimento de 9 horas).
Apenas com a adio de nitrognio, a biomassa total final aumentou para 2,3 g/L, e com a
adio de sais do meio mineral, a biomassa total aumentou para 5 g/L, comprovando que a
quantidade de nitrognio e os sais presentes na vinhaa no so suficientes para o crescimento de
R. eutropha, em biorreator, sendo estas comparaes em relao ao experimento com vinhaa
pura. De forma geral, ficou evidente que, para que maiores concentraes de biomassa e de
P(3HB) venham a ser alcanadas, a utilizao de fonte de carbono adicional nos cultivos de R.
eutropha em vinhaa, deve ser levada em considerao.
Com a anlise conjunta dos resultados obtidos neste trabalho at o presente, conclui-se
que R. eutropha DSM545 capaz de crescer e produzir P(3HB) a partir de um resduo abundante
e poluente, a vinhaa, porm o desempenho desse microrganismo a partir deste substrato ainda
pode ser explorado.

Avaliao do Aluno em Relao ao PIBIC

O Programa de Iniciao Cientfica proporciona uma oportunidade para o aluno obter
conhecimento tanto prtico quanto terico em diversas reas de seu curso. Atravs dele
possvel, com a orientao de pesquisador qualificado, aprender tcnicas e mtodos de pesquisa,
estimular o aluno a pensar de modo cientfico e prtico tanto para resolver problemas gerados
durante os trabalhos, como problemas de convivncia, aprendendo a pensar e agir em grupo, alm
de ampliar o acesso e a integrao do estudante cultura cientfica. A maior dificuldade no
Programa de Iniciao Cientfica est na pouca disponibilidade de tempo, o que dificulta conciliar
as atividades realizadas em laboratrio com a grade curricular.

Bibliografia
APHA, AWWA, WEF. Standard methods for the examination of water and wastewater 19 th.
American public health association. Washington, DC. 1995.
ARAGO, G.M.F.; SCHMIDELL, W.; IENCZAK, J.L., SCHMIDT, F.C.; DALCANTON, F.;
FIORESE, M.L.; RODRIGUES, R.; DEUCHER, R.; MARANGONI, C. Preparation of
polyhydroxyalkanoates from a citric residue. International Application Published Under the
Patent Cooperation Treaty (PCT), WO2009/149529 A1, 2009.
ARAGO, G.M.F.; LINDLEY, N.D.; URIBELARREA, J.L.; PAREILLEUX, A. Maintaining a
controlled residual growth capacity increases the production of polyhydroxyalkanoate
copolymers by Alcaligenes eutrophus. Biotechnology Letters, v. 18, p. 937-942. 1996.
HAZER, B.; STEINBUCHEL, A. Increased diversification of polyhydroxyalkanoates by
modification reactions for industrial and medical applications. Applied Microbiology and
Biotechnology, v. 74, p. 112. 2007.
KARR, D.B.;WATERS,J.K; EMERICH, D.W. Analysis of Poly-3-Hydroxybutyrate in Rhizobium
japonicum bacteroids by ion-exclusion high-pressure liquid chromatography and UV detectiont
Applied and Environmental Microbiology, v. 46 (6), p. 1339-1344. 1983.

LEE, S.Y. Plastic bacteria progress and prospects for polyhydroxyalcanoate production in
bacteria. Trends Biotechnology, v. 14, p. 437 - 438. 1996.
MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars.
Analytical Chemistry, v. 31, p. 426 428. 1959.
PARNAUDEAU, V.; CONDON, N.; OLIVER, R.; CAZEVIEILLE, P.; RECOUS, S. Vinasse
organic matter quality and mineralization potential, as influenced by raw material, fermentation
and concentration processes. Bioresource Technology, v. 99, p. 15531562. 2008.
REDDY, C. S. K.; GHAI, R.; KALIA, V. C. Polyhydroxyalkanoates: an overview. Bioresource
Technology, v. 87, pp. 137-146. 2003.
STEINBUCHEL, A.; VALENTIN, H,E. Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids. FEMS
Microbiology Letters, v. 128, p. 21928. 1995.
SILVA, L. F.; GOMES, J. G. C.; ROCHA, R. C. S.; TACIRO, M. K.; PRADELLA, J. G. C.
Produo biotecnolgica de poli-hidrxialcanoatos para a gerao de polmeros
biodegradveis no Brasil. Quim. Nova, Vol. 30, No. 7, p. 1732-1743, 2007.