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Universidade Nova de Lisboa

Faculdade de Cincias e Tecnologia


Mestrado em Tecnologia e Segurana Alimentar
1Ano -1Semestre

Indicadores Biolgicos na Qualidade Agro-Industrial


Docente Ana Lcia Monteiro Duro Leito

Mdulo 2

ANLISE MICROBIOLGICA A UMA FARINHA PARA USO


DOMSTICO

Elaborado por:

Ana Jlia Benites


Marlene Fernandes
Rubina Iquebal
Turma Ps-Laboral

Monte da Caparica, 03 de Dezembro de 2014

1. INTRODUO

A farinha um alimento rico em glcidos e fibras e a tecnologia do seu


fabrico simples, porm exige alguns cuidados fundamentais durante o seu
desenvolvimento para garantir um produto de qualidade, tais como a seleo
de matria-prima adequada, higiene e cuidados durante todo o processo de
fabrico at a obteno do produto final. A qualidade pode ser delimitada
atravs do controlo de qualidade analtico com a execuo de testes fsicoqumicos e microbiolgicos, este ltimo serve para avaliar o nvel de
contaminao microbiolgica do produto (Ferreira et al., 2004; Lima et al.,
2007).
As contaminaes microbiolgicas podem ocorrer em todas as etapas
pelas quais passam os produtos agrcolas, desde a colheita at o
processamento, embalagem, transporte e armazenamento, sendo inmeros os
fatores que podem interferir no crescimento microbiano, como o teor de
humidade, o contedo de oxignio, as caractersticas higinicas da matriaprima, a temperatura, o tempo de armazenamento, entre outros (Marcia e
Lazzari, 1998; Souza et al., 2004).
Segundo a Portaria n 254/2003 de 19 de Maro de 2003 consideramse no conformes as farinhas que tenham sido atacadas por quaisquer fungos
ou bactrias ou apresentem outros microrganismos em nveis que apresentem
um risco para a sade e que cuja presena seja evidenciada pela alterao do
aspeto fsico, exame microscpico e pela anlise qumica ou microbiolgica. J
a Resoluo brasileira n 12, de 02 de Janeiro de 2001 afirma que amidos,
farinhas, fculas e fub, em p ou flocados devem estar ausentes de
Salmonella em 25g de produto e apresentar no mximo 3x103 UFC de B.
cereus/g e 1x102 UFC de coliformes fecais/g.
Devido sua baixa atividade da gua a farinha considerada um
produto microbiologicamente estvel,
necessariamente

haja

inativao

embora isto no signifique que

e/ou

destruio

dos

microrganismos

possivelmente presentes neste substrato, como no caso de fungos, que


somente nestas condies podem ocorrer o crescimento de xerfilos ou
xerotolerantes como Eurotium, Aspergillus e Penicillium, que possuem elevada
capacidade de esporulao. No entanto, ambas as legislaes portuguesa e

brasileira no determinam um limite de contaminao por fungos, mas apesar


disso quase todas empresas fabricantes de farinha possuem esta exigncia,
sendo mais rigososos que a legislao em vigor, como no caso da empresa X e
Y (que so denominadas desta forma devido a confidencialidade) que
determinam contagem mxima de bolores e leveduras <103 UFC/g e
102UFC/g respetivamente (Lopes, 2002; Ukhun e Dibie, 1989).
Os fungos so organismos eucariotas com ncleo individualizado
contendo cromossomas e possuem organitos citoplasmticos delimitados por
membrana

(Duarte,

2014).

So

uns

dos

principais

microrganismos

responsveis pela deteriorao dos alimentos e a sua presena pode fornecer


vrias

informaes,

tais

como

condies

higinicas

deficientes

de

equipamentos, multiplicao no produto em decorrncia de falhas no


processamento e/ou armazenamento e matria-prima com contaminao
excessiva (Ferreira e Sousa, 2000; Siqueira, 1995).
Este grupo de microrganismos normalmente apenas causa alterao nas
caractersticas organolticas dos alimentos. O mais frequente, quando se
verifica que existiu contaminao fngica, a alterao do aspeto ou do sabor,
o que leva a que esse alimento no seja consumido (Oliveira, 2010).
A nvel alimentar os tipos de fungos mais frequentemente encontrados
so as leveduras e os fungos filamentosos, ambos importantes para produo
e deteriorao de alimentos (Ferreira e Sousa, 2000).
As leveduras so fungos unicelulares, podem ter uma forma oval,
esfrica ou alongada e, embora sejam responsveis pela deteriorao de
alimentos, no so causadoras de doenas alimentares. J os fungos
filamentosos so organismos pluricelulares, heterotrficos, organizados em
filamentos, capazes de produzir um elevado nmero de esporos que se
difundem facilmente mas que so pouco resistentes temperatura, no entanto,
as micotoxinas que produzem, alm de serem resistentes a altas temperaturas,
podem causar intoxicaes alimentares, ser cancergenas e causar toxicidade
dirigida a rgos especficos (Duarte, 2014).
Os coliformes fecais, citados na legislao, quando esto presentes em
produtos processados indicam que houve contaminao posterior ao
processamento e pode sugerir o uso inadequado de manipulao e de higiene
(Blood e Curtis, 1995; Souza et al, 2004).

A E. coli um microrganismo do grupo dos coliformes fecais,


patognico, Gram-positivo, anaerbio facultativo, possui a capacidade de
fermentar acares e no produz esporos, no entanto, responsvel pela
produo de toxinas. Apesar de estar presente nas fezes e guas residuais
domsticas, constitui um dos indicadores de poluio no ambiente, podendo
ser encontrada no ar de forma acidental, nos locais pblicos e nos alimentos
(Alves, 2012; Mendes e Oliveira, 2004).
A ingesto deste microrganismo atravs de gua ou de alimentos
contaminados pode causar doenas gastrointestinais que variam a intensidade
dependendo da estirpe do microrganismo, podendo apresentar sintomas desde
diarreias at ao desenvolvimento de doenas que causam insuficincia renal
aguda e trombose (Alves, 2012).
Para a deteo de microrganismos nos alimentos, como no caso de
fungos e Escherichia coli, pode-se utilizar o mtodo de contagem padro em
placas, que permite conhecer o nmero exato de microrganismos presentes no
produto que se est a analisar. A sementeira deste mtodo pode ser por
incorporao, quando adicionado placa primeiramente o inculo com
posterior adio do meio de cultura ou por espalhamento, no qual a placa
contm o meio solidificado onde lhe adicionado um certo volume da diluio
que espalhado com uma ansa. No mtodo por incorporao as colnias
crescem entre o gar e no mtodo de espalhamento o crescimento d-se
superfcie do gar (Lightfoot e Maier, 2003).
O objetivo deste trabalho foi pesquisar a presena de fungos e
Escherichia coli numa farinha para uso domstico e comparar com os limites
aceitveis descritos na legislao e literatura para verificar se esta se encontra
em condies para consumo.

2. MATERIAIS E MTODOS

2.1 Amostra

A amostra analisada foi farinha de trigo para uso domstico.

2.2 Material

Cmara de fluxo laminar horizontal modelo Steril-Helios;

Estufa (Memmert);

Agitador Vortex;

Placas de Petri;

Tubos de ensaio;

Pipetas (2,0 mL e 20,0 mL).

Bico de Bunsen.

Espalhador

2.3 Reagentes

Diluente (Triptona 1,0 g/L; NaCl 8,5 g/L);

Meio de cultura para crescimento de fungos (Peptona de soja 5,0 g/L;


Glucose 10,0 g/L; KH2PO4 1,0 g/L; MgSO4. 7H2O 0,5 g/L; Rose Bengal
0,05 g/L; Cloranfenicol 0,1 g/L; Agar 13,0 g/L);

Meio de cultura para crescimento de E. coli (Triptona 20,0 g/L; Sais de


Bilis n31,5 g/L; acido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil--D-glucornico (BCIG)
75,0 mg/L; Agar 9,0g/L).

2.4 Mtodo de pesquisa de crescimento de fungos

Em primeiro lugar, realizou-se a preparao da suspenso me


pesando-se assepticamente 0,104 g de amostra e adicionando-a num frasco
com posterior adio de 9 mL do diluente, seguido de agitao. Realizou-se
este procedimento com a finalidade de se obter uma diluio 1/10.
A partir da suspenso me retirou-se 1 mL para o tubo de ensaio
contendo 9 mL do diluente com o objetivo de obter uma diluio 1/100 e desse
tubo foi retirado tambm 1 mL para outro tubo de ensaio contendo 9 mL de
diluente para obter uma diluio 1/1000, sendo ambos os tubos seguidamente
agitados no vortex para homogeneizar.

Para a pesquisa de fungos realizou-se um controlo negativo que neste


caso foi o prprio diluente.
Posteriormente,

realizou-se

sementeira

por

espalhamento

ou

superfcie das diluies 10-2 e 10-3 e do controlo negativo distribuindo 1 mL


pelas placas de petri identificadas contendo o meio de cultura (Peptona de soja
5,0 g/L; Glucose 10,0 g/L; KH2PO4 1,0 g/L; MgSO4.7H2O 0,5 g/L; Rose Bengal
0,05 g/L; Cloranfenicol 0,1 g/L; Agar 13,0 g/L) sendo espalhada logo em
seguida o inculo com um espalhador em forma de L.
As placas foram ento incubadas a 251C durante 1202 horas. Aps o
tempo de incubao as placas foram retiradas da estufa e acondicionadas sob
refrigerao at o momento da contagem das colnias.

2.5 Mtodo de pesquisa e contagem de Escherichia coli

A soluo me para pesquisa de E. coli foi a mesma utilizada para a


pesquisa de fungos (Item 2.4).
Para a pesquisa de E.coli utilizou-se diluies 10-1 e 10-2, sendo a
soluo me considerada a diluio 10-1. Para a preparao da diluio 10-2
retirou-se 1 mL da soluo me e adicionou-se no tubo de ensaio contendo 9
mL de diluente com posterior agitao no vortex.
Diferente da pesquisa de fungos, neste caso utilizou-se um controlo
positivo que consistia numa suspenso de E. coli -glucuronidase positiva.
A sementeira foi realizada por incorporao. Com uma pipeta
esterilizada retirou-se 1 mL de cada uma das diluies e do controlo positivo,
ambos recm-agitados para homogeneizao adequada, adicionando-os em
placas de Petri identificadas. Aps isto foi adicionado 15mL de meio de cultura
(Triptona 20,0 g/L; Sais de Bilis n31,5 g/L; acido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil--Dglucornico (BCIG) 75,0 mg/L; Agar 9,0g/L) arrefecido a cerca de 47C em
cada placa, sendo ento levemente agitado para haver mistura entre o inculo
e o meio de cultura.
Aps a solidificao do meio as placas foram invertidas e incubadas em
estufa a uma temperatura de 441C durante 18 a 24 horas. Transcorrido o
tempo de incubao as placas foram retiradas da estufa e acondicionadas sob
refrigerao at o momento de verificao e contagem das colnias.

3. RESULTADOS

3.1 Fungos

Aps o perodo de incubao a 251C por 120 horas verificou-se que


no houve crescimento de colnias nas diluies 10 -2, 10-3 e no controlo
negativo, como pode se pode ver na Figura 1.
Neste caso o controlo negativo foi o prprio diluente, o que significa que
a experincia foi vlida. Como no houve crescimento de colnias no foi
necessrio realizar os clculos necessrios para determinar o teor total de
fungos por grama de produto, visto que este resultado zero.

Figura 1: Da esquerda para direita placa de Petri contendo diluio 10-3, 10-2 e
controlo negativo.

3.2 Escherichia coli

Aps as 24 horas de incubao a 441C verificou-se que no houve


crescimento

de

colnias

azuis

caractersticas

de

Escherichia

coli--

glucuronidase nas placas com diluies 10-1 e 10-2, ao contrrio do controlo


positivo, que apresentou 33 UFC/mL como se pode ver na Figura 2.
Se a amostra estivesse contaminada com Escherichia coli deveria haver
nas placas de petris colnias brancas ou azuis. O aparecimento da colorao
azul deve-se presena da enzima -glucuronidase produzida por este
microrganismo, que reage com alguns constituintes do meio. No entanto,
segundo Ramos e Simes (2006) cerca de 6% a 3% das estirpes de E. coli no
possuem esta enzima, ento neste caso as colnias deveriam apresentar uma
colorao branca.

Figura 2: Da esquerda para direita placa de petri contendo diluio 10-2, 10-1 e
controlo positivo.

4. DISCUSSO/CONCLUSO

Os controlos so utilizados para indicar se uma anlise vlida, neste


caso atravs dos resultados dos controlos obtidos pode afirmar-se que a
anlise efetuada farinha foi vlida, isto porque como esperado no controlo
negativo no houve crescimento de colnias ao contrrio do positivo. Sendo
assim, a partir dos resultados obtidos conclui-se que a amostra de farinha est
apta para consumo, visto no se ter verificado o crescimento dos
microrganismos analisados.
De acordo com a Resoluo brasileira n12 de 2001 caso a farinha
obtivesse valores maiores que 1x102 para Escherichia coli a mesma estaria
inapta para consumo e, em relao aos fungos, no h limites determinados
pela legislao, porm algumas empresas fabricantes de farinha utilizam como
parmetro permitindo que haja contagem mximo de bolores e leveduras <103
UFC/g e 102 UFC/g.
O no crescimento de E. coli e fungos no produto indica que no
ocorreram falhas no processamento e armazenamento do produto, que a
matria-prima

no

possui

contaminao

excessiva,

que

no

houve

contaminao posterior ao processamento e que as condies higinicosanitrias para obteno desta farinha estavam em timas condies. No
entanto, para uma avaliao completa deste produto deveriam ter sido
realizadas tambm anlises de Salmonella e Bacillus cereus, conforme a
Resoluo brasileira n12 de 2001.

Neste presente trabalho o resultado adquirido do controlo positivo de E.


coli -glucuronidase foi 33 UFC/mL, nmero inferior em relao aos outros
grupos que, em alguns casos, chegaram a verificar o crescimento de 51
UFC/mL. Este valor inferior pode ter sido causado por uma agitao
insuficiente do tubo de ensaio contendo o controlo positivo antes de adicionar o
volume necessrio placa de Petri, causando assim uma m homogeneizao
da soluo e/ou tambm devido a possibilidade do meio de cultura estar mais
quente do que deveria quando adicionado placa, destruindo assim alguns
microrganismos presentes no controlo.

5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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