INTRODUCCIN:

La gentica es una parte de las ciencias biolgicas ms

modernas, con al menos un siglo de existencia pero con un desarrollo
vertiginoso colocndola como una de las ciencias ms destacadas del
ltimo siglo. Su objeto de estudio es la herencia y la variacin dentro
de ella tenemos a la gentica mdica que es una rama de la medicina
que se encarga de estudiar el papel que desempean los factores
hereditarios y genticos respecto de una enfermedad, un defecto
congnito o la susceptibilidad heredada para ciertos problemas de
salud.

El ADN hasta hace poco tiempo era una molcula que presentaba
amplias dificultades para su anlisis bioqumico. A partir de los aos
70 se desarrollaron las herramientas de la ingeniera gentica, o lo
que se ha denominado tcnicas del ADN recombinante. Hoy en da se
pueden separar regiones determinadas del ADN, obtenerlas en
grandes cantidades y determinar su secuencia de nucletidos.
Durante la ltima dcada las tcnicas moleculares han mostrado una
revolucionaria transformacin, que an no termina y que presenta un gran
potencial al futuro, siendo conocida como la Medicina del Siglo XXI.

La Gentica desempea un papel de gran importancia en la prctica

de la Medicina. Dado que todos los componentes del cuerpo humano
estn influidos por los genes, los conocimientos bsicos de gentica
conciernen a todas las especialidades mdicas. Sus aplicaciones tanto
en la medicina clnica como en la medicina forense son mltiples, y
en pocos aos podremos contar con sistemas ms rpidos, ms
sensibles y fiables, que mejoren la calidad de pruebas.

As la gentica mdica intenta brindarles una descripcin general de

los mecanismos genticos que pueden causar enfermedades. Se han
incluido algunas condiciones genticas comunes como ejemplo, sin
embargo no describimos todas las condiciones posibles. El objetivo es
entender cul es el impacto que tiene la gentica en la salud de
nuestros pacientes.

Por otro lado, existen algunos mtodos tradicionales que ya han

entrado en desuso, y otros ms nuevos, que se encuentran en fase de
experimentacin y transferencia tecnolgica, por lo que an no se los
pueden aplicar.

En este trabajo, nos centraremos en cuatro metodologas bsicas, que

por su utilidad y su aplicabilidad se estn generalizando en los
laboratorios clnicos y forenses e incorporndose en la rutina del
diagnstico. Estas metodologas son: tcnicas bsicas y herramientas
utilizadas por la gentica molecular humana, ADN recombinante,
anlisis de cidos nucleicos, PCR, secuenciacin del ADN, y los
microarrays, las mismas que sern tratadas brevemente en este
trabajo.

OBJETIVOS

Conocer el papel importante que juega la tecnologa para el

avance en el desarrollo de la gentica utilizando tcnicas de
microarrays de ADN.

Comprender de que manera al tcnica de PCR ( reaccin en

cadena de la polimerasa) permite aumentar una zona o regin
especfica de ADN y sobre todo en una pequea cantidad de
tiempo.

Entender las tcnicas ms importantes de la ingeniera gentica

y valorar sus aplicaciones.

TCNICAS DEL ADN RECOMBINANTE:

El ADN recombinante no se refiere a la recombinacin gnica meitica
o mittica, sino a procedimientos por los cuales una molcula de ADN
es cortada en un lugar determinado y luego pegada (con el mismo
fragmento o con otro), mediante el uso de ciertas enzimas de

existencia natural en microorganismos (enzimas de restriccin,

ligasas), tambin se refiere a los procedimientos que se utilizan para
multiplicar una molcula determinada de ADN (o un fragmento de
ella) mediante su incorporacin a elementos autorreproducibles en
microorganismos.
Estas tcnicas se basan en organismos vivos, por lo tanto es
conveniente explicar la funcin de biolgica de estos elementos de la
llamada Ingeniera Gentica. Las herramientas bsicas que se
utilizan son las enzimas de restriccin, cuyo conocimiento es
absolutamente necesario para comprender la biotecnologa.
1) ADN RECOMBINANTE:
A principios de 1970, este trmino nace como respuesta a la
necesidad de obtener grandes cantidades de un gen o de un genoma
completo para llevar a cabo estudios que permitiesen de un gen
concreto: obtener secuencias de nucletidos, estudiar mutaciones y
analizar funciones.
Desde el primer experimento que mostr la posibilidad de propagar
un fragmento de ADN de eucariotas en una bacteria, la tecnologa del
ADN recombinante se ha utilizado con xito en muchos campos desde
aplicaciones con fines industriales, dando lugar a la Biotecnologa,
hasta la deteccin de alteraciones genticas, incluyendo por lo tanto,
modificaciones genticas de los organismos y terapias gnicas.
La utilizacin del DNA recombinante es una herramienta poderosa
para el aislamiento de poblaciones puras de secuencias especficas
de DNA a partir de una poblacin de secuencias mezcladas. Los
procedimientos bsicos incluyen una serie de pasos:
1. Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas enzimas
denominadas endonucleasas de restriccin, que reconocen y cortan
las
molculas de DNA por secuencias nucleotdicas especficas.
2. Los fragmentos producidos mediante la digestin con enzimas de
restriccin se unen a otras molculas de DNA que sirven de vectores.
Los vectores pueden replicarse autnomamente en una clula
husped y facilitan la manipulacin de la molcula de DNA
recombinante
recin creada.

3. La molcula de DNA recombinante, formada por un vector que

lleva un segmento de DNA insertado, se transfiere a una clula
husped.
Dentro de esta clula, la molcula de DNA recombinante se replica,
produciendo docenas de copias idnticas conocidas como clones.
4. Al replicarse las clulas husped, las clulas descendientes
heredan el DNA recombinante, crendose una poblacin de clulas
idnticas,
que llevan todas la secuencia clonada.
5. Los segmentos de DNA clonados pueden recuperarse de las clulas
husped, purificarse y analizarse.
6. Potencialmente, el DNA clonado puede transcribirse, su mRNA

puede traducirse, y el producto gnico puede aislarse y examinarse.

2) ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN:
En los aos 1950 se descubri que algunos bacterifagos podan
infectar algn tipo concreto de bacterias, debido a que algunas
bacterias eran capaces de digerir el ADN del fago y por tanto
impedan su crecimiento. Como el fago tiene un rango
restringido de huspedes que puede infectar, a dicho sistema se
le llam sistema de restriccin. Posteriormente se descubri que

dicha restriccin se lleva a cabo gracias a unas enzimas del tipo

endonucleasas. estas son enzimas que se encuentran en la
naturaleza, en numerosas especies de bacterias, en las cuales
desempean un papel defensivo.
Estas enzimas aisladas en bacterias, reciben este nombre debido
a que limitan o previenen las infecciones vricas degradando el
cido nucleico invasor. Las enzimas de restriccin reconocen una
secuencia especfica de nucletidos (denominada sitio de
restriccin) de una molcula de DNA de doble cadena, y cortan el
DNA por esa secuencia. El premio Nobel de 1978 se otorg a
Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans por su
investigacin sobre las enzimas de restriccin. Hasta la fecha, se
han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas de
restriccin diferentes.
Por ejemplo, en el caso del bacterifago su mecanismo se basa en
cortar las molculas de ADN del bacterifago, y de esa manera
eliminarlo. Dado que estas enzimas cortan el ADN solamente
cuando encuentran su secuencia de bases especfica a lo largo de
la doble hlice y no en sus extremos, es que se denominan
endonucleasas de restriccin (cortan por dentro).
Entonces podemos concluir que las endonucleasas de restriccin
son enzimas que reconocen secuencias de doble cadena
especficas en el DNA y las escinden a nivel de los elementos
fosfodister de la doble hlice del
DNA en el
lugar de
reconocimiento o cerca de este.
a)

Mecanismo de Accin

Muchas enzimas de restriccin reconocen una secuencia especfica de

bases del ADN que palindrmica, es decir que puede leerse, invertida,
en la hlice complementaria. Estas secuencias palindrmicas tienen
otras propiedades extraordinarias:

Poseen un eje de simetra en cada hlice, lo cual hace que cada

hlice tenga auto complementariedad en su secuencia; as, ese
segmento palindrmico puede escribirse en forma cruciforme.

En general pueden adoptar ms de una forma espacial cuando

se encuentran en un mol.
A su vez las enzimas que reconocen estos palndromos, como la EcoRI
est constituida por dos subunidades simtricas (estructura
cuaternaria), cada una de las cuales tiene un sitio (dominio) de

reconocimiento (de la secuencia de una hlice) y un sitio activo de

corte (catlisis)

b)

Clasificacin

Las enzimas de restriccin han posibilitado casi todos los dems

adelantos logrados en el conocimiento del genoma (humano y de
otros organismos) por dos espectaculares propiedades:

Son capaces de cortar de manera regular e infalible el ADN en

secuencias especficas. Al cortar el ADN, muchas de ellas dejan en
cada extremo un segmento pegajoso monocatenario, capaz de unirse
exactamente a su segmento complementario. Por lo tanto, estas
enzimas no solo cortan especficamente sino que adems dejan un
puente especfico y articulado para repegarse cuando se agrega una
ligasa.

Para que se produzca el repegado de las dos caras del corte

inferido por una enzima de restriccin, se requiere consumo de
energa (provista por el ATP) y una enzima ligasa de ADN (p. ej., la
ligasa T4) Por consiguiente, es posible cortar y repegar molculas de
ADN de diferente origen usando la misma enzima de restriccin.
No todas las enzimas de restriccin tienen las propiedades descritas
con anterioridad (es decir, cortar el ADN dentro de la secuencia
reconocida, dejar "extremos pegajosos", reconocer secuencias

palindrmicas). En realidad las enzimas de restriccin pueden

clasificarse en tres grupos:

Tipo 1: Son complejos multiproteicos que reconocen secuencias

especficas de ADN simtricas. Estas endonucleasas adems de cortar
el ADN, pueden metilarlo. Su corte se produce a alrededor de 1000
nucletidos de distancia; no existe una secuencia predecible de corte.
Requieren la presencia de ATP.

Tipo 2: Son las de mayor inters para la ingeniera gentica.

Suelen actuar en forma de dmeros. Su caracterstica principal es que
el corte endonucletico tiene lugar dentro de la misma secuencia de
reconocimiento por la que se une al ADN (cortan el ADN en secuencia
especifica). No requieren ATP y en su mayora dejan extremos de
corte pegajoso. Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II
son simtricas (palindrmicas), es decir, la secuencia de una de las
cadenas leda en direccin 5' 3' es la misma que la secuencia de la
cadena complementaria leda tambin en direccin 5' 3'. Otras
enzimas de restriccin de Tipo II, como SmaI, cortan el DNA formando
fragmentos romos. Los fragmentos de DNA con extremos romos
tambin pueden unirse y formar molculas recombinantes, pero
primero deben modificarse. La enzima desoxinucleotidil transferasa
terminal se utiliza para crear extremos de cadena sencilla mediante la
adicin de colas de nucletidos.


Tipo 3: Son complejos multiproteicos que reconocen secuencias
especficas de ADN simtricas. Cortan el ADN en las cercanas del
lugar reconocido por la enzima pero poseen accin metilante y
requieren ATP.