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INTRODUO QUMICA

ALIMENTAR
Paulo Figueiredo

To my father...

ndice

Captulo 1 Nomenclatura em Qumica Orgnica

Captulo 2 Reactividade Qumica

10

Captulo 3 Ligaes Qumicas

14

Captulo 4 Cintica Qumica

17

Captulo 5 Qualidade dos Dados Analticos

20

Captulo 6 Amostragem

24

Captulo 7 Protenas

26

Captulo 8 Lpidos

41

Captulo 9 Hidratos de Carbono

58

Captulo 10 gua

70

Captulo 11 Vitaminas e Minerais

79

Captulo 12 Aditivos Alimentares

90

Captulo 13 Contaminantes Alimentares

94

Captulo 14 Aromas

102

Captulo 15 Tcnicas de Separao

105

Captulo 16 Mtodos Espectromtricos

126

Captulo 17 Ensaios Imunolgicos

146

Captulo 18 Mtodos de Anlise em Biotecnologia

152

Bibliografia

156

Introduo Qumica Alimentar

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Captulo 1
Nomenclatura em Qumica Orgnica

A qumica orgnica estuda os compostos que contm tomos de carbono


(Tabela 1.1). Apesar de existir um grande nmero de compostos orgnicos,
estes so constitudos por uma relativamente pequena quantidade de partes
semelhantes, combinadas de diversos modos, o que nos permite compar-los
entre si. Estas partes so denominadas grupos funcionais. A identificao
destes grupos funcionais e a capacidade de prever a reactividade de uma
molcula, tendo como base as propriedades dos seus grupos funcionais, so
uma das pedras basilares da qumica orgnica.
Tabela 1.1
Compostos orgnicos
Hidrocarbonetos
lcoois
teres, aldedos e cetonas
cidos carboxlicos e steres
Aminas e amidas
Compostos aromticos
Grupos funcionais so tomos, ies ou grupos de tomos especficos com
propriedades consistentes, caracterizados por possuirem uma composio
elementar e ligaes especficas, as quais conferem uma dada reactividade
molcula que os contm. Os principais grupos funcionais podem ser
encontrados na Tabela 1.2.
Um tomo de carbono saturado encontra-se ligado a 4 outros tomos e
designado como tetravalente. Hidrocarbonetos insaturados possuem uma ou
mais ligaes duplas (alcenos) ou triplas (alcinos) entre tomos de carbono.
As molculas orgnicas podem exibir diversos tipos de isomerismo.
Ismeros conformacionais so formados por rotao das ligaes simples C-C.
Estereoismeros so molculas com o mesmo padro de ligaes, mas cujos
tomos possuem diferentes arranjos espaciais. Existem 2 tipos de
estereoismeros: enantimeros e diasteremeros. Enantimeros so como
imagens no espelho um do outro. Diasteremeros so ismeros que no so
imagens espelhadas um do outro.

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Tabela 1.2

Famlia qumica

Grupo

Frmula

lcool

Hidroxilo

ROH

Frmula grfica

Exemplo

Metanol

Aldedo

Aldedo

RCHO
Acetaldedo

Alcano

Alquilo

RHn
Metano

Alceno

Alcenilo

R2C=CR2
Etileno

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Famlia qumica

Grupo

Frmula

Alcino

Alcinilo

RCCR

Amida

Carboxamida

RCONR2

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Frmula grfica

Exemplo

Acetileno

Acetamida

Aminas

Amina
primria

RNH2

Amina
secundria

R2NH

Amina
terciria

R3N

Metilamina

Dimetilamina

Trimetilamina

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Famlia qumica

Grupo

Frmula

Compostos azo

Azo

RN2R

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Frmula grfica

Exemplo

metilo

cido carboxlico

Carboxilo

Alaranjado de

RCOOH
cido actico

ter

ter

ROR

ter dietlico

ster

ster

RCOOR

Butirato de etilo

Haleto de alquilo

Haleto

RX

Cloroetano

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Famlia qumica

Grupo

Frmula

Cetona

Cetona

RCOR

Perxido

Peroxi

ROOR

Derivados do
benzeno

Fenilo

RC6H5

Fosfato

Fosfato

ROP(=O)(OH)2

Tiol

Sulfidrilo

RSH

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Frmula grfica

Exemplo

Metil etil cetona

Perxido de di-tert-butilo

Cumeno

Gliceraldedo 3-fosfato

Mercaptoetanol

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Diz-se que os enantimeros possuem quiralidade, ou seja no tm um


plano de simetria, no podendo ser sobrepostos sua imagem no espelho.
Num composto orgnico, qualquer tomo ligado a 4 tomos ou cadeias
diferentes pode ser considerado quiral.

Fig. 1.1 Enantimeros.


A configurao dos compostos orgnicos pode ser descrita segundo trs
nomenclaturas, a actividade ptica, a configurao relativa (mais antigas e em
desuso) e a configurao absoluta.
Os ismeros pticos recebem a designao (+) ou (-) consoante fazem
rodar o plano da luz polarizada no sentido dos ponteiros do relgio (+) ou no
sentido contrrio (-). Tambm so utilizadas as designaes dextrorotatrio
para o ismero (+) e levorotatrio para o (-).
A configurao relativa usa o gliceraldedo (o acar mais simples) como
modelo e designa as molculas que rodam o plano da luz no sentido dos
ponteiros do relgio como D e as que a rodam no sentido contrrio como L. De
notar que no existe relao entre as notaes (+)/(-) e D/L, pois esta ltima
apenas refere se a estereoqumica do composto est relacionada com o
enantimero dextrorotatrio ou levorotatrio do gliceraldedo.

Fig. 1.2 Configuraes relativas do gliceraldedo.


No caso dos aminocidos existe uma regra emprica que facilita a
atribuio da designao D ou L. Se os substituintes COOH, R, NH 2 e H
estiverem dispostos volta do carbono quiral no sentido contrrio ao dos
ponteiros do relgio, teremos um D-aminocido; no caso contrrio um Laminocido (Figura 1.3).

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Fig. 1.3 Configuraes relativas da alanina.


Na nomenclatura de configurao absoluta, os centros quirais so
designados R ou S, de acordo com um sistema em que atribuda uma ordem
de prioridades aos seus substituintes, baseada no seu n atmico. Deste modo,
no existe qualquer relao fixa com as duas outras nomenclaturas.

Fig. 1.4 Notao R/S.


A nomenclatura R/S s se aplica no caso de ligaes simples. Para o caso
de ligaes duplas carbono-carbono, utiliza-se a notao cis/trans ou,
preferencialmente, a mais recente E-/Z-.

Fig. 1.5 Alcenos com configuraes cis/trans.


No caso de os dois tomos de carbono terem substituintes idnticos
(Figura 1.5) a designao cis corresponde a Z e a trans a E. J no caso de os
substituintes serem diferentes, isso nem sempre corresponde verdade. A
nomenclatura cis/trans apenas dever ser utilizada se ambos os tomos de
carbono numa ligao dupla tiverem um tomo de H como substituinte.
Na Figura 1.6 est exemplificada a aplicao da nomenclatura E/Z.
Dividindo a ligao dupla em duas metades, atribuem-se prioridades (baseadas
no n atmico) a cada par de substituintes. No caso de os substituintes com

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igual ordem de prioridade serem simtricos relativamente ao corte imaginrio, a


ligao ser designada Z e se no forem simtricos E.

Fig. 1.6 Aplicao da notao E-/Z- a alcenos.


De uma forma simples, considera-se que dois estereoismeros so
diasteremeros se apenas um centro quiral diferir entre eles. Se uma molcula
tiver apenas um carbono assimtrico (estereocentro), ela exibir duas formas
que sero imagens espelhadas uma da outra. Se a molcula tiver dois carbonos
assimtricos, existiro quatro configuraes possveis, sendo impossvel que as
quatro sejam todas imagens no espelho umas das outras. Ou seja, quanto
maior o nmero de centros quirais numa molcula, mais provvel a existncia
de confrmeros diferentes, e portanto de diasteremeros. O nmero de
confrmeros possveis numa molcula quiral 2n, onde n indica o n de centros
quirais

Fig. 1.7 Diasteremeros.


Os compostos aromticos so um conjunto de molculas estveis, devido
ao total preenchimento e baixa energia dos seus orbitais ligantes, possuindo
4n+2 electres . As ligaes electrnicas esto dispostas numa forma cclica.
A aromaticidade pode ser definida como uma propriedade qumica em que
um anel conjugado de ligaes no saturadas, pares de electres ou orbitais
vazias exibem uma estabilidade superior resultante apenas do efeito de
conjugao. Tal devido capacidade que os electres tm de circular por
todos os tomos, os quais esto ligados por ligaes simples e duplas
alternadas. Estas ligaes podem ser consideradas como hbridos de ligaes
simples e duplas, sendo todas idnticas entre si.

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A aromaticidade regulada pela regra de Hckel, a qual diz que uma


molcula, para ser considerada aromtica, ter que possuir um n par de
electres deslocalizados, mas esse nmero no poder ser mltiplo de 4. A
regra indica que uma molcula aromtica ter 4n+2 electres , em que n =
0,1,2,3,

Fig. 1.8 Exemplos de molculas aromticas. Compostos cclicos,


com 4n+2 electres (n = 1, 2, 3, ...).

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Captulo 2
Reactividade Qumica

Existem

diversos mecanismos de reaces com compostos orgnicos,

nomeadamente adio, eliminao, substituio e rearranjos. Muitas delas


ocorrem em alimentos antes ou durante o seu processamento.
Numa reaco de adio, 2 molculas combinam-se para formar uma
nica molcula maior. Existem dois tipos de adio: electroflica e nucleoflica.
Uma adio nucleoflica uma reaco em que existe a remoo de uma
ligao pela criao de duas novas ligaes covalentes. Habitualmente, os
compostos aos quais feita a adio possuem ligaes carbono-carbono duplas
ou triplas.

Fig. 2.1 Reaco de adio electroflica.


Na adio nucleoflica, a ligao removida pela criao de duas novas
ligaes covalentes pela adio de um nuclefilo (substncia doadora de um
par de electres ligantes, numa ligao qumica). As reaces de adio
nuclefila esto limitadas a molculas com ligaes mltiplas carbono-carbono
ou carbono com outro tomo.

Fig. 2.2 Reaco de adio nucleoflica.


O oposto de uma reaco de adio uma reaco de eliminao. Nestas
reaces dois substituintes so removidos de uma molcula. A reaco pode
dar-se num nico passo (E2) ou em dois passos (E1).
A eliminao bimolecular (E2) resulta na formao de uma ligao e os
dois grupos de partida (habitualmente um hidrognio e um halognio) tero
que ser coplanares. Neste caso, a quebra das ligaes carbono-hidrognio e
carbono-halognio d-se num nico passo.

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Fig. 2.3 Exemplo de uma reaco de eliminao E2.


Na eliminao unimolecular E1 ocorre em primeiro lugar um passo de
ionizao em que a quebra da ligao carbono-halognio d lugar formao
de um carbocatio. No passo seguinte d-se a desprotonao do carbocatio.

Fig. 2.4 Exemplo de uma reaco de eliminao E1.


Numa reaco de substituio, um grupo funcional de uma molcula
substitudo por um outro grupo. Podem existir diversos tipos de substituio,
sendo as mais relevantes a substituio nucleoflica e a electroflica.
A substituio nucleoflica pode por sua vez ser aliftica ou aromtica,
conforme a natureza da molcula que sofre a substituio. Neste tipo de
reaco, um nuclefilo liga-se a um tomo com carga positiva ou parcialmente
positiva. Este tomo (electrfilo) faz parte de um grupo de sada. Existem dois
possveis mecanismos numa substituio nucleoflica, SN1 e SN2, em que 1 e 2
representam a ordem da cintica reaccional. Numa reaco SN2, a adio do
nuclefilo e a eliminao do grupo de sada ocorrem em simultneo. Uma
reaco SN1 ocorre em dois passos.
Numa reaco de substituio electroflica, um electrfilo desloca um
outro substituinte, frequentemente um hidrognio. Este tipo de substituio
caracterstico de compostos aromticos, embora tambm possa ocorrer em
compostos alifticos. Neste tipo de reaco, um composto electroflico que
desloca um grupo funcional, podendo a reao ocorrer em dois passos (S E1) ou
num nico passo (SE2). No mecanismo SE1, o substrato primeiro forma um
carbanio e um resduo orgnico com carga positiva. Segue-se uma rpida

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recombinao do carbanio com o electrfilo. No mecanismo S E2 existe um


nico estado de transio, no qual coexistem a nova ligao e a antiga.

Fig. 2.5 Exemplo de substituio nucleoflica.

Fig. 2.6 Sequncia de passos numa substituio electroflica.


Existe um terceiro tipo de reaces de substituio, importante na qumica
alimentar, a substituio radicalar, a qual envolve uma sequncia de 2 ou 3
passos. No 1 passo, a iniciao, criado um radical livre. No passo final, ou
terminao, o radical reage com outra espcie radical, parando a cadeia
reaccional. No caso de a reaco no terminar, o radical continua a reagir,
originando novos radicais, disponveis para novas reaces. Este passo
intermdio designado propagao.

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Fig. 2.7 Mecanismo de reaco numa substituio radicalar.


Quando uma molcula orgnica sofre uma alterao, de modo a originar
um seu ismero estrutural, essa reaco designada rearranjo.

Fig. 2.8 Exemplo de uma reaco de rearranjo.

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Captulo 3
Ligaes Qumicas

As

ligaes qumicas so responsveis pelas interaces de atraco

entre tomos e molculas. O conceito de ligao qumica est associado


partilha de electres entre os tomos participantes na ligao. Os electres
sofrem uma atraco electromagntica dos ncleos atmicos, devido
diferena de cargas elctricas. Na formao de ligaes qumicas, alguns
electres deslocam-se parcialmente de um tomo para outro(s). Esta
deslocao favorecida por uma reduo do estado de energia, causada por
um rearranjo das cargas, resultando numa reduo da distncia mdia entre os
electres de todos os tomos ligados e os seus ncleos. A transferncia de
carga provocada pelo movimento dos electres, origina uma atraco
electromagntica entre os tomos participantes na ligao. a esta fora
atractiva entre tomos que se chama ligao qumica.
As ligaes qumicas podem ser divididas em covalentes e inicas. Nas
primeiras, h uma partilha de electres entre os tomos; nas segundas, um
conjunto de tomos possui um excesso de electres, enquanto o outro tem
uma deficincia de electres, havendo uma transferncia de electres entre
ncleos atmicos. Numa ligao inica existe uma atraco electrosttica entre
tomos ionizados.

Fig. 3.1 Ligaes qumicas.

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A teoria da ligao de valncia diz que uma ligao qumica se forma


quando dois electres de valncia, nos seus respectivos orbitais atmicos,
colaboram para manter dois ncleos juntos, devido a um efeito de reduo da
energia do sistema. Esta teoria baseia-se em 6 princpios:
1. A ligao entre um par de electres forma-se devido interaco entre
um electro desemparelhado em cada um dos tomos.
2. Os spins dos electres tm que ser opostos.
3. Uma vez emparelhados, os electres no podero participar noutra
ligao.
4. A transferncia electrnica envolve apenas uma funo de onda por cada
tomo.
5. Os electres disponveis no mais baixo nvel energtico formam as
ligaes mais fortes.
6. Entre dois orbitais atmicos, aquele que consegue uma maior
sobreposio com um orbital de outro tomo formar a ligao mais
forte, a qual tender na direco do orbital concentrado.

Fig. 3.2 Ligao de valncia em BF3: 3 orbitais sp2 do tomo de


Boro sobrepostos a 3 orbitais p, um por cada tomo de
Flor.
Uma teoria alternativa, para explicar a natureza das ligaes qumicas, a
teoria dos orbitais moleculares, a qual utiliza uma combinao linear de orbitais
atmicos para formar orbitais moleculares, os quais cobrem a totalidade da
molcula. Nesta teoria, os orbitais moleculares so divididos em orbitais
ligantes, anti-ligantes e no ligantes. Se os electres de um orbital tiverem
maior probabilidade de se encontrar entre os ncleos atmicos que noutra
posio qualquer, o orbital ser ligante. No caso contrrio, o orbital molecular
ser anti-ligante. Os orbitais ligantes reforam a ligao e os anti-ligantes
enfraquecem-na. Num orbital no ligante, os electres encontram-se em
orbitais mais prximos do ncleo e no influenciam a fora da ligao qumica.

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Fig. 3.3 Orbitais moleculares na molcula de hidrognio (H2).


As duas teorias so hoje em dia consideradas complementares.
As ligaes covalentes e inicas so ligaes intramoleculares. As ligaes
formadas entre duas ou mais molculas so designadas ligaes
intermoleculares. Exemplos comuns em qumica dos alimentos so interaces
entre dipolos e ligaes de hidrognio.

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Captulo 4
Cintica Qumica

A cintica qumica descreve a dependncia da velocidade das alteraes


qumicas em funo de condies como a concentrao dos reagentes, a
temperatura, o pH e a fora inica. A velocidade da alterao habitualmente
representada como dependente das concentraes dos reagentes elevadas a
uma potncia.
velocidade = k[A]x[B]y

(4.1)

Em 4.1, k a constante de velocidade. A ordem da reaco (x+y) igual


ao n de molculas envolvidas no passo mais lento (o que determina a
velocidade) da reaco. Em qumica alimentar, a generalidade das reaces so
descritas por cinticas de ordem 0 ou 1. Numa sequncia de reaces, o
passo limitante que habitualmente determina a ordem da cintica. A velocidade
de uma reaco influenciada pelo estado fsico dos reagentes e suas
concentraes, pela temperatura qual ocorre e pela presena ou no de
catalisadores.
Reaces cidas, formao de sais e permutas inicas so reaces
rpidas. Pelo contrrio, quando so formadas ligaes covalentes ou grandes
molculas, as reaces tendem a ser lentas. Quando os reagentes esto no
mesmo estado, o movimento trmico coloca-os em contacto mas, quando esto
em diferentes fases, a reaco est limitada pela interface existente entre os
reagentes.
Segundo a teoria das colises, as molculas tm que colidir para reagirem.
Nessa perspectiva, quanto maior a concentrao dos reagentes, maior a
frequncia das colises entre si. A frequncia das colises tambm aumenta
com a temperatura. No entanto, existe uma mais importante dependncia
cintica da temperatura, dado que a energia trmica de uma molcula aumenta
com a temperatura. Desse modo, ao aumentar a temperatura, aumenta o teor
de molculas de reagente com energia suficiente para reagir, ou seja energia
mais elevada que a energia de activao (Ea).
A energia de activao, expressa pela equao de Arrhenius (4.2) indica
que a constante de velocidade (k) depende da temperatura T (em graus

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Kelvin). Nesta equao, A o factor de frequncia e R a constante universal


dos gases.

k
Ea RT ln
A

(4.2)

A velocidade de uma reaco qumicapode ser alterada atravs da


utilizao de substncias chamadas catalisadores. Um catalisador uma
substncia que modifica o estado de transio de uma reaco, de modo a
reduzir a energia de activao, aumentando a velocidade da reaco, mas no
sendo consumido por esta.

Fig. 4.1 Diferenas na energia de activao de uma reaco na


ausncia () e na presena (----) de um catalisador.
Enquanto a cintica qumica descreve a velocidade das reaces qumicas,
a termodinmica qumica determina a extenso dessas reaces. Numa reaco
reversvel, alcana-se o equilbrio qumico quando as velocidades das reaces
directa e inversa so iguais e as concentraes de reagentes e produtos deixam
de variar. De uma forma geral, a variao de energia livre (G) de uma reaco
determina a ocorrncia de uma transformao qumica e a cintica descreve a
velocidade dessa reaco. Uma reaco pode ser fortemente exotrmica e ter
uma variao de entropia positiva, mas na prtica no ocorre porque
demasiado lenta. Se um reagente tiver capacidade de originar dois produtos
diferentes, ser formado o que for termodinamicamente mais estvel, excepto
em circunstncias especiais, caso em que se diz que a reaco est sob
controlo cintico.
A energia livre de Gibbs a energia, associada a uma reaco qumica,
que pode ser utilizada para produzir trabalho. definida pela equao (4.3) em
que G a variao na energia livre de Gibbs, H a variao de entalpia, T a
temperatura absoluta e S a variao em entropia. Quando G < 0 a reaco

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espontnea, se G > 0 a reaco no espontnea e se G = 0 estamos em


condies de equilbrio (nem a reaco directa nem a inversa so favorecidas).
G = H TS

(4.3)

A expresso 4.4 relaciona a constante de equilbrio com a energia livre de


Gibbs. G0 representa a energia livre de Gibbs no equilbrio.
G 0
Keq e RT

(4.4)

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Captulo 5
Qualidade dos Dados Analticos

necessria uma atitude crtica relativamente aos resultados analticos,


de modo a compreender o seu significado e as suas limitaes. A preciso
depende do mtodo utilizado e s pode ser melhorada at um certo ponto. Para
obter um compromisso aceitvel entre a qualidade dos resultados e o tempo do
analista, necessrio conhecer a natureza e origem dos erros produzidos. Tal
possvel atravs do uso de mtodos estatsticos, tornados mais teis devido
utilizao conjunta de tcnicas informticas. Esta manipulao de dados
designada por quimiometria.
Definem-se de seguida alguns conceitos bsicos da quimiometria:

Exactido (accuracy) proximidade de uma medida ou resultado


ao seu verdadeiro valor. Expressa em termos de erro.
Erro a diferena entre o resultado verdadeiro e o resultado
medido. Deve ser expresso como erro absoluto, a diferena real
entre o verdadeiro valor e o valor medido, nas mesmas unidades.
Por vezes apresentado como erro relativo, ou seja uma
percentagem do valor medido relativamente ao verdadeiro.
Mdia mdia aritmtica de um conjunto de medidas (replicadas).
Preciso a variabilidade de uma medida. Pode ser expressa em
termos absolutos ou relativos. O desvio padro o melhor
indicador da preciso.
Desvio padro () calculado a partir da expresso 5.2 em que xi
um resultado medido, N o nmero de replicadas e x a mdia
dessas replicadas. Para um elevado nmero de amostras usa-se N
e para um pequeno nmero (30 ou menos) usa-se N-1.

1 N
2
xi

N i 1

1 N
xi x
N 1 i 1

(5.1)

(5.2)

Desvio padro relativo (coeficiente de variao) usado para


comparar precises.

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s 100
(5.3)
x
Varincia o quadrado do desvio padro. A sua utilidade prtica
advm do facto de os valores serem aditivos.

CV

sx2 y z sx2 s y2 sz2

(5.4)

Fig. 5.1 Ilustrao dos conceitos de excatido e preciso. a) boa


exactido e boa preciso; b) boa preciso e m
exactido; c) boa exactido e m preciso; d) m
exactido e m preciso.
Consoante a sua origem, os erros podem ser classificados como
determinados ou indeterminados. Os primeiros podem ser quantificados e
corrigidos; os segundos so aleatrios, no podendo ser quantificados. Os erros
tm como habitual origem: o operador, o equipamento ou o mtodo. Podem
ser detectados pela anlise de brancos ou de padres ou ainda anlises
independentes, utilizando mtodos diferentes ou alternativos.
Na avaliao da qualidade dos dados analticos importante conhecer a
sensibilidade e o limite de deteco do equipamento. A sensibilidade est
relacionada com a dimenso da variao do equipamento em resposta
variao na concentrao do composto. D indicao da variao que se pode
fazer na composio da amostra at ser notada uma alterao na resposta do
equipamento. O limite de deteco o menor incremento detectvel com um
determinado grau de confiana (geralmente 1%).
Para avaliar a qualidade dos mtodos utilizados e dos resultados obtidos
deve proceder-se a uma anlise estatstica desses resultados. Um nmero
mnimo de vinte e cinco replicadas deve ser usado, de modo a obter uma
amostra estatisticamente representativa. Como este nmero difcil de atingir,
quer do ponto de vista prtico, quer econmico, tero que ser utilizados
mtodos estatsticos eficazes com menor nmero de dados.
Os resultados so apresentados com um certo nmero de algarismos
significativos. Num nmero, todos os algarismos conhecidos com rigor mais o
primeiro algarismo incerto, constituem os algarismos significativos desse

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2009

nmero. Por exemplo, numa medida de 1.0421 g, com rigor de 0.0001 g, h


cinco algarismos significativos. Se a medida fosse de 0.0421 g, teramos trs
algarismos significativos, para o mesmo rigor, pois o 0 s considerado
significativo quando faz parte do nmero. Quando um resultado obtido por
adio ou subtraco de dois valores, os algarismos significativos so
determinados a partir das incertezas absolutas. Considere-se a adio de
155.50.1 e 0.0850.001, cujo resultado 155.585. A incerteza surge no
quarto algarismo, portanto o resultado deveria ser apresentado como 155.6. No
caso do resultado ser obtido a partir de uma multiplicao ou diviso, os
algarismos significativos so determinados a partir da incerteza relativa do valor
menos rigoroso. Nos dois valores anteriores, 0.085 tem a maior incerteza
relativa (12 ppm), logo o produto 155.5 x 0.085 = 13.3275 tem um desvio
absoluto de 13.3275 x 0.012 = 0.16. Aqui a incerteza aparece no terceiro
algarismo e o resultado deveria ser apresentado como 13.3.
Em anlise quantitativa exige-se que uma medida analtica exiba uma
proporcionalidade rigorosa e fivel relativamente composio da amostra.
Para estabelecer essa proporcionalidade, necessrio efectuar procedimentos
de calibrao. Numa calibrao simples, preparada uma gama de padres,
contendo diversas concentraes do analito em estudo. Estes padres so
analisados segundo um mtodo padro e obtida uma curva de calibrao
sinal vs. quantidade do analito. A partir deste grfico podem interpolar-se os
valores das amostras desconhecidas.

Fig. 5.2 Exemplo de uma curva de calibrao.


Uma boa curva de calibrao dever ser linear numa gama alargada de
concentraes. Idealmente dever passar pela origem, mas no obrigatrio
que tal acontea.

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2009

O coeficiente de correlao r define o ajuste dos dados a uma linha recta.


dado por

x x y y
i

(5.5)

2
2

xi x yi y

O valor de r dever ser o mais prximo possvel de +1.000 ou -1.000,


valores que correspondem a uma correlao perfeita.
O coeficiente de determinao r2 d uma melhor percepo do ajuste dos
dados.

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2009

Captulo 6
Amostragem

Dada a impossibilidade de analisar todos os componentes de um dado


lote para avaliar a sua qualidade ou outros parmetros, seleccionada uma
parte do todo e considera-se que esta poro representativa da totalidade do
produto. A obteno de uma poro, ou amostra, representativa do todo,
designada por amostragem e a quantidade total da qual foi retirada a amostra
chamada populao.
Os dois objectivos primrios da amostragem so o clculo do valor mdio
de uma caracterstica e determinar se esse valor mdio respeita as
especificaes definidas no plano de amostragem.
As regras para amostragem em alimentos especficos esto delineadas em
guias como Official Methods of Analysis da AOAC International, de modo a
poderem ser executadas pelos analistas em condies que validem os dados
obtidos.
Uma populao ideal seria uniforme e idntica em todas as circunstncias,
designando-se por homognea. A amostragem em tal populao simples,
podendo uma amostra ser tirada aleatoriamente, sendo os dados obtidos
sempre representativos do todo. No entanto, a maioria das populaes so
heterogneas, tendo a amostragem que ter tal facto em considerao.
A amostra deve ser retirada de diversos locais numa populao, para
garantir a sua representatividade. Para lquidos deve agitar-se antes de retirar a
amostra. Para slidos, devem retirar-se amostras de vrios pontos.
O tamanho ptimo de uma amostra, para obter representatividade, pode
ser determinado atravs de anlise estatstica, usando o teste de t. O tamaho
da amostra depende da exactido requerida.
Se o tamanho de partcula da amostra for demasiado grande para a
anlise pretendida, ele ter de ser reduzido. A amostra poder ser dividida em
quartos e serem utilizados os dois quartos opostos.
Muitas amostras requerem triturao para assegurar uma anlise mais
rigorosa. Existem diversos instrumentos para triturar alimentos, adaptados aos
diversos tipos de amostras. A triturao de amostras hmidas pode provocar

24

Introduo Qumica Alimentar

2009

perca de humidade e alteraes qumicas. A congelao ou a secagem das


amostras pode reduzir estas percas e devem ser efectuadas sempre que
possvel. Por outro lado, o processo de triturao no dever provocar
aquecimento da amostra e o contacto da amostra com superfcies metlicas
dever ser evitado, se a amostra se destinar anlise de minerais.
Um mau armazenamento das amostras pode tambm ser um factor de
erro para os dados analticos obtidos. As amostras devem estar protegidas dos
factores ambientais (humidade, ar, luz, calor) que as possam afectar. Em
alguns casos podero ser utilizados conservantes para proteger amostras de
alimentos.
Muitos alimentos contm enzimas, as quais podem causar degradao dos
componentes a analisar. Por esse motivo, a actividade enzimtica deve ser
eliminada ou controlada antes da anlise, atravs de mtodos seleccionados de
acordo com as caractersticas do alimento. Os mtodos mais comuns so
desnaturao e inactivao das enzimas a temperatura elevada ou limitao da
sua actividade por congelao, podendo tambm ser utilizada a alterao do pH
ou adio de agentes redutores no caso das enzimas com actividade oxidante.
Os alimentos com teor elevado de gordura apresentam maiores
dificuldades para preparao de amostras. A sua triturao difcil, requerendo
frequentemente prvia congelao e os lpidos insaturados so sensveis
oxidao, necessitando armazenamento em vcuo ou sob atmosfera de azoto.
Podero ser-lhes adicionados antioxidantes, desde que no interfiram com a
anlise.

25

Introduo Qumica Alimentar

2009

Captulo 7
Protenas

As

protenas

so

grandes

molculas

orgnicas,

compostas

por

aminocidos ligados entre si. Estas ligaes peptdicas (Fig. 7.1) so formadas
entre os grupos carboxilo e amino de dois aminocidos adjacentes. Dos cerca
de 500 aminocidos encontrados na natureza, apenas 20 aminocidos
diferentes so capazes de formar protenas. A composio em aminocidos de
uma protena determina o valor biolgico desta, de onde a importncia do
desenvolvimento de mtodos analticos que permitam a identificao dos
aminocidos resultantes da hidrlise de uma protena.
10 ou 11 destes 20 aminocidos no so sintetizados pelo organismo
humano, sendo apenas adquiridos atravs da dieta, da resultando a sua
classificao como aminocidos essenciais.

Fig. 7.1 Reaco de condensao entre 2 aminocidos,


originando uma ligao peptdica.
As diferentes caractersticas qumicas destes aminocidos (Fig. 7.2) esto
na base da estrutura tridimensional das protenas e da sua funo. A estrutura
das protenas pode ser classificada como:

primria uma sequncia de aminocidos


secundria estruturas regularmente repetidas estabilizadas por
ligaes de hidrognio. Adoptam a conformao de hlice alfa ou
folha beta
terciria formao de um ncleo hidrofbico, estabilizado por
pontes salinas, ligaes de hidrognio, pontes bissulfito e
modificaes ps-translacionais
quaternria interaces entre vrias protenas

Em funo da sua estrutura, as protenas podem ser classificadas como


fibrosas ou globulares (Fig. 7.3). As protenas fibrosas, apenas encontradas em
animais, so insolveis em gua devido sua estrutura secundria e possuem

26

Introduo Qumica Alimentar

2009

funes de armazenamento ou usadas em tendes, msculos e ossos. As


protenas globulares so hidrossolveis, devido a possuirem estrutura terciria e
desempenham diversas funes nos organismos, entre as quais hormonal e
enzimtica.

Fig. 7.2 Estruturas qumicas dos 20 aminocidos componentes


das protenas.
As protenas sofrem desnaturao quando expostas a temperaturas
elevadas, alteraes de pH, de fora inica ou de solvente e ainda a
manipulaes intensas, como por exemplo durante o processamento de alguns
alimentos. A desnaturao proteica consiste na perca da sua estrutura.

27

Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 7.3 Estruturas proteicas.


A anlise de protenas nos alimentos relevante para a correcta
rotulagem das embalagens, para a investigao das suas propriedades
funcionais e para a determinao da sua actividade biolgica. Existem mtodos
analticos que podem ser aplicados quando se pretende determinar o teor
proteico total, o teor de uma dada protena, o teor proteico durante o
isolamento e purificao de uma dada protena, o teor de azoto no proteico, a
composio em aminocidos e o valor nutritivo de uma protena.
O mtodo de Kjeldahl permite determinar o teor de azoto orgnico total
de um alimento. Todos os compostos orgnicos so digeridos com cido
sulfrico, na presena de catalisadores e o azoto orgnico total convertido em
sulfato de amnio. O material digerido neutralizado com uma base e destilado
numa soluo de cido brico. Os anies borato formados so titulados com
uma soluo padro de cido, obtendo-se o teor de azoto na amostra. Este

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Introduo Qumica Alimentar

2009

resultado pode ser relacionado com o teor proteico na amostra, atravs de um


factor de converso.
As amostras usadas tm que ser trituradas e homogeneizadas. A digesto
feita com auxlio de catalisadores e resulta na formao de sulfato de amnio.
O carbono e o hidrognio presentes so convertidos em CO2 e H2O.
Protena (NH4)2SO2

(7.1)

Depois de diluir o material digerido com gua, adiciona-se tiossulfato de


sdio em meio bsico, para neutralizar o cido sulfrico. A amnia formada
destilada numa soluo de cido brico, contendo indicadores.
(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O
NH3 + H3BO3 NH + H2BO

(7.2)

(7.3)

O io borato (quantidade proporcional de azoto) titulado com uma


soluo padro de HCl, permitindo calcular o nmero de moles de N na
amostra, o qual igual ao nmero de moles de NH3, que por sua vez igual ao
de HCl.
H2BO + H+ H3BO3

(7.4)

Deve ser feito um branco para subtrair o teor de azoto dos reagentes
daquele da amostra.

%N = N HCl x

Vol. cido corrigido 14 g N


x
x 100
peso da amostra (g)
mol

(7.5)

Nesta frmula N HCl a concentrao de HCl em mol.L-1, o volume de cido


corrigido corresponde ao volume de HCl gasto para titular a amostra menos o
gasto para titular o branco e 14 a massa atmica do azoto.
Utiliza-se um factor de correco para converter a percentagem de azoto
em percentagem de protena. Como a maioria das protenas contm 16% de
azoto, normalmente esse factor de 6.25 (100/16=6.25). Esto publicados
factores de converso especficos para diversos alimentos, encontrando-se
alguns dos quais expressos na Tabela 7.1.
Este um mtodo aplicvel a todo o tipo de alimentos, barato e exacto
mas algo lento e requer manipulao de reagentes corrosivos.
O mtodo de Kjeldahl tem sofrido modificaes que permitem um
aumento da sua eficcia e tambm uma automao ou semi-automao das
medidas e tambm a sua utilizao para medir teores na ordem dos g.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Tabela 7.1
Alimento
Ovos ou carne
Lacticnios
Trigo
Outros cereais e oleaginosas
Amndoas
Amendoins
Coco

Factor
6.25
6.38
5.70
6.25
5.18
5.46
5.30

Um mtodo alternativo, que tambm mede o azoto orgnico total, o de


Dumas. Neste processo, as amostras so pesadas e introduzidas num reactor
de combusto. O azoto libertado medido num cromatgrafo gasoso que lhe
est anexo. O mtodo de Dumas tambm se aplica a todos os alimentos, mas
mais rpido e permite automao, tendo ainda a vantagem de no utilizar
reagentes perigosos. Para calcular o teor proteico dos alimentos necessrio
recorrer aos mesmos factores de converso usados no mtodo de Kjeldahl.
O teor proteico pode tambm ser determinado atravs da espectroscopia
no infravermelho, tendo por base o princpio de que diferentes grupos
funcionais numa amostra absorvem radiao a diferentes frequncias. No caso
das protenas utilizam-se as bandas de absoro caractersticas das ligaes
peptdicas (6.47 m, 3300-3500 nm, 2080-2220 nm e 1560-1670 nm),
permitindo calcular a concentrao proteica. Este mtodo aplicvel a uma
vasta gama de alimentos e as anlises so rpidas, mas tem a desvantagem de
requerer uma calibrao prvia do equipamento, que poder ser demorada.
O mtodo do biureto um processo qumico que permite determinar a
concentrao de protenas num alimento, baseado no princpio de que
substncias contendo ligaes peptdicas reagem com ies Cu2+ em meio
bsico. A absorvncia da cor produzida pode ser medida a 540 nm e a sua
intensidade prporcional concentrao de protenas na amostra.
O reagente do biureto (inclui sulfato de cobre, NaOH e tartarato de sdio
e potssio, usado para estabilizar os ies Cu2+ em meio bsico) adicionado a
uma soluo da protena e aps estabilizao durante 15-30 minutos
temperatura ambiente mede-se a absorvncia relativamente a um branco do
reagente. No caso de a mistura reaccional no se apresentar lmpida
necessrio efectuar uma centrifugao ou filtrao da mesma, antes de ler a
absorvncia. Para obter a concentrao proteica necessrio obter
previamente uma curva padro, usando para o efeito albumina do soro bovino
(BSA).

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 7.4 Mtodo do biureto. direita gua com reagente do


biureto; esquerda alterao de cor produzida quando
se adiciona o reagente a uma protena.
Este mtodo pode ser usado para determinar concentraes de protenas
em cereais, carnes e soja e como mtodo qualitativo em raes para animais.
Este um dos mtodos mais simples para anlise de protenas, sendo
mais barato e mais rpido que o de Kjeldahl e tem poucos interferentes. As
principais desvantagens so uma menor sensibilidade que outros mtodos e
necessidade de pelo menos 2-4 mg de protena. Para utilizar como mtodo
quantitativo necessrio comparar os valores obtidos com uma curva padro.
O mtodo de Lowry um procedimento que combina a reaco do biureto
com a reduo do reagente de Folin-Ciocalteau por resduos de tirosina e
triptofano das protenas. Forma-se uma cor azulada que pode ser medida a
750 nm (elevada sensibilidade para baixas concentraes de protena) ou a
500 nm (baixa sensibilidade para elevadas concentraes de protena).
As protenas a determinar so inicialmente diludas para garantir uma
gama de absorvncias apropriada, de seguida -lhes adicionada uma soluo
de tartarato de sdio e potssio e carbonato de sdio. Aps incubar 10 minutos
temperatura ambiente, adiciona-se uma soluo de sulfato de cobre-tartarato
de sdio e potssio-hidrxido de sdio, deixando-se de novo temperatura
ambiente durante 10 minutos. Adiciona-se o reagente de Folin-Ciocalteau,
sendo a mistura incubada a 50 C durante 10 minutos. L-se a absorvncia a
650 nm (modificao do mtodo original) e comparam-se os valores obtidos
com os de uma curva padro obtida com BSA.
um mtodo muito sensvel e mais especfico que a maioria dos outros e
bastante rpido, no entanto apenas funciona com protenas previamente
extradas do alimento e pode ser afectado pela presena de interferentes como
sejam alguns acares, lpidos e tampes.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

O mtodo de Bradford outro mtodo colorimtrico para determinao do


teor proteico, baseado na mudana de cor de um reagente (azul brilhante de
Coomassie) de vermelho para azul, quando se liga a protenas. O seu mximo
de absorvncia muda de 465 nm para 595 nm e a intensidade a este ltimo
comprimento de onda proporcional concentrao de protena na amostra.
Este mtodo, tal como outros semelhantes, tira partido da natureza
anfotrica das protenas. Quando a soluo que contm a protena acidificada
a um pH inferior ao valor do seu ponto isoelctrico (pI) o pigmento forma uma
ligao electrosttica.
Para efectuar a determinao de protenas por este mtodo, o pigmento
dissolvido em 95% de etanol e acidificado com 85% de cido fosfrico, sendo
de seguida adicionado a solues contendo a protena e um padro (BSA). L-se a absorvncia a 595 nm contra um branco do reagente e a concentrao da
protena calculada a partir da curva padro para a BSA.
O mtodo de Bradford muito usado em purificao de protenas, devido
sua rapidez, sensibilidade e existncia de poucos interferentes. Alteraes ao
procedimento original permitem a determinao de g de protenas.
A capacidade que as protenas possuem de reduzir ies Cu2+ a ies Cu+
utilizada no mtodo do cido bicinchoninico (BCA) para a sua determinao
quantitativa. O reagente BCA (sal de sdio do BCA, carbonato de sdio, NaOH e
sulfato de cobre) adicionado soluo de protena, deixa-se incubar a 37 C
durante 30 minutos (ou temperatura ambiente durante 2 h ou ainda a 60 C
durante 30 minutos) e l-se a absorvncia a 562 nm contra um branco do
reagente. A quantificao feita a partir de uma curva padro obtida com BSA.
O mtodo pode ser adaptado para medir g. A sua principal desvantagem
reside no facto de outros compostos com capacidade de reduzir o cobre
(acares redutores, ) poderem interferir.
As protenas exibem uma forte absorvncia a 280 nm, devido presena
dos aminocidos triptofano e tirosina. Como o teor destes aminocidos nas
protenas dos alimentos razoavelmente constante, a absorvncia a 280 nm
pode ser usada para calcular a concentrao de protenas, atravs da lei de
Beer. Como a composio das diversas protenas diferente, necessrio
conhecer o seu coeficiente de extino molar, de modo a determinar a sua
concentrao.
Para proceder anlise, as protenas tm que ser dissolvidas num tampo
ou numa base, sendo aplicvel com maior eficcia a protenas previamente
extradas dos alimentos. Pode sofrer interferncias da presena de cidos

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Introduo Qumica Alimentar

2009

nucleicos, os quais tambm absorvem a 280 nm. um mtodo rpido e


relativamente sensvel. No destruindo a amostra, pode utilizar-se a protena
para posteriores anlises.
A maioria das tcnicas utilizadas para separao de protenas explora as
diferenas em tamanho, solubilidade e carga, as caractersticas de adsoro e a
afinidade biolgica para outras molculas.
A separao por precipitao explora as diferenas de solubilidade das
protenas. Estas so determinadas pelo tipo e carga dos aminocidos
componentes. As protenas podem ser selectivamente precipitadas alterando o
pH, fora inica, constante dielctrica, ou temperatura. Este um processo
habitualmente utilizado nas fases iniciais de uma sequncia de purificao e
apresentam maiores vantagens quando se trabalha com grandes quantidades
de material.
Sais neutros podem ser usados para aumentar a fora inica do meio e
precipitar protenas. O mais usado o sulfato de amnio, sendo alternativas
NaCl, KCl ou outros. Este processo designado salting out e desenrola-se em
dois passos. Primeiro adiciona-se (NH4)2SO4 numa concentrao ligeiramente
inferior necessria para precipitar a protena (quando a soluo
centrifugada, as protenas menos solveis so precipitadas, enquanto a
protena de interesse permanece em soluo) e depois adiciona-se (NH4)2SO4
at perfazer uma concentrao imediatamente superior necessria para
precipitar a protena de interesse (quando a soluo centrifugada, a protena
precipita e as outras mais solveis permanecem no sobrenadante).
O ponto isoelctrico (pI) de uma protena corresponde ao pH ao qual uma
protena em soluo no possui carga. As protenas formam agregados e
precipitam a esse valor devido no existncia de repulso electrosttica entre
elas. Como as protenas possuem diferentes valores de pI, podem ser
separadas ajustando o pH da soluo.
A solubilidade de uma protena a um dado pH e fora inica depende da
constante dielctrica da soluo. Esta propriedade serve de base separao
de protenas por fraccionamento em misturas de gua e solventes orgnicos. A
adio de solventes miscveis com gua (etanol, acetona) reduz a constante
dielctrica da gua e reduz a solubilidade da maioria das protenas.
Muitas protenas desnaturam e precipitam quando aquecidas ou
submetidas a valores de pH muito altos ou muito baixos. As protenas que so
estveis a temperaturas elevadas ou a valores extremos de pH podem ser
separadas das restantes.

33

Introduo Qumica Alimentar

2009

A cromatografia de adsoro usada na separao de protenas, tendo


por base a diferente afinidade das protenas para a fasee estacionria ou para o
eluente. As cromatografias de afinidade e de permuta inica usam esta
propriedade para separar protenas.
A cromatografia de permuta inica a tcnica de separao de protenas
mais utilizada, sendo usadas sobretudo resinas aninicas (com carga positiva).
A protena de interesse adsorvida resina sob condies tampo (fora inica
e pH) que maximizem a afinidade da protena para a resina. As restantes
protenas, tendo cargas diferentes, no so adsorvidas. As protenas que ficam
ligadas resina so depois eludas por alterao gradual do pH ou da fora
inica do eluente.
Na cromatografia de afinidade, a protena separada numa fase
estacionria contendo um ligando covalentemente ligado ao suporte slido. Os
ligandos usados incluem inibidores enzimticos, substratos enzimticos,
coenzimas, anticorpos e alguns pigmentos. A protena eluda sob condies
tampo (pH, fora inica, temperatura e concentrao proteica) que
maximizem a ligao da protena ao ligando. As restantes protenas e outras
molculas que no se ligam ao ligando so eludas. No final, a protena ligada
ser eluda da coluna alterando as condies de pH, temperatura ou
concentrao do sal ou do ligando no tampo usado como eluente.

Fig. 7.5 Separao de protenas utilizando a cromatografia de


afinidade.
Esta tcnica muito eficaz na separao de protenas, mas apresenta a
desvantagem da necessidade de utilizao de fases estacionrias caras.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Diversos mtodos cromatogrficos para separao de protenas foram


adaptados para utilizao em sistemas de HPLC.
As protenas podem ser separadas com base no seu raio de Stokes, o raio
mdio da protena em soluo, o qual depende da conformao da protena.
Uma das tcnicas que tem em conta essa propriedade para separar
protenas a dilise. So utilizadas membranas semi-permeveis, as quais
apenas permitem a passagem de pequenas molculas. Coloca-se uma soluo
contendo a protena num tubo de dilise, o qual colocado num grande volume
de gua ou de tampo, sob agitao suave. Os solutos de baixo peso molecular
saem para fora do tubo, enquanto o tampo entra. Este mtodo simples mas
demorado (12 h ou mais).

Fig. 7.6 Separao de protenas utilizando o processo de dilise.


Um processo alternativo e mais rpido passa pela utilizao de
membranas de ultrafiltrao, estando a sua utilizao quase restrita a
laboratrios de investigao.
A cromatografia de excluso molecular outra tcnica utilizada para
separao de protenas, esta baseada no seu tamanho. Uma soluo contendo
a protena elui atravs de um suporte slido poroso. As molculas maiores que
os poros so excludas, atravessando rapidamente a coluna. As molculas de
menores dimenses so retidas nos poros, eluindo muito lentamente. Molculas
de tamanhos intermdios interagem parcialmente com o suporte e eluem a
tempos intermdios. Deste modo, a ordem de eluio segue a diminuio do
tamanho da molcula.
Existem suportes com diversas dimenses de poro, podendo ser utilizados
para fraccionar eficazmente protenas.

35

Introduo Qumica Alimentar

2009

Esta tcnica tambm pode ser utilizada para calcular pesos moleculares de
protenas, fazendo eluir em conjunto protenas de peso desconhecido e padres
de peso molecular conhecido. Um grfico do volume de eluio para cada
protena em funo do logaritmo do seu PM d uma recta.
A electroforese permite separar protenas a partir de uma mistura
complexa, por migrao diferencial destas atravs de uma matriz slida, qual
aplicado um campo elctrico. A tcnica mais utilizada para separar protenas
a electroforese de zona e os gis de poliacrilamida, as matrizes mais utilizadas.
A separao depende da frico da protena na matriz e da sua carga, de
acordo com:

Mobilidade =

tenso aplicada x carga da molcula


frico da molcula

(7.6)

Uma protena apresenta carga negativa se o pH da soluo for superior ao


seu pI e carga positiva se o pH for inferior ao seu pI. A dimenso da carga e a
tenso aplicada determinaro a extenso da migrao da protena num campo
elctrico. Quanto mais alta a tenso aplicada e mais forte a carga da protena,
maior a migrao. A migrao tambm depende do tamanho e forma da
molcula, ou seja do raio de Stokes da protena. Um aumento do raio de Stokes
origina um aumento da frico e uma reduo da mobilidade. Deste modo, as
protenas mais pequenas tendem a migrar mais rapidamente. Finalmente, uma
reduo no tamanho do poro do gel provoca uma reduo na mobilidade.

Fig. 7.7 Separao de protenas por electroforese em gel.


Na electroforese no desnaturante, as protenas so separadas na sua
forma nativa com base na carga, tamanho e forma da molcula. Na
electroforese com desnaturao (ou SDS-PAGE), utiliza-se um gel de
poliacrilamida e um detergente aninico (dodecil sulfato de sdio - SDS) para
separar protenas com base no seu tamanho. As protenas, depois de reagir
com um agente redutor (adicionado en conjunto com o detergente), ligam-se

36

Introduo Qumica Alimentar

2009

ao SDS e adquirem carga negativa, sendo depois separadas em funo do seu


tamanho. Adiciona-se habitualmente um corante (azul de bromofenol)
soluo contendo a protena. Sendo uma molcula pequena, o corante migra
frente das protenas e permite seguir o andamento da migrao. Aps concluda
esta, o gel corado de maneira a permitir a visualizao das bandas das
protenas. A mobilidade relativa de cada protena calculada por comparao
com a do corante.

Rm =

distncia percorrida pela protena


distncia percorrida pelo corante

(7.7)

O peso molecular pode ser determinado por esta via, relacionando o Rm


de uma protena com os Rm de protenas padro, de PM conhecido. Traa-se
um grfico dos logaritmos dos PM dos padres em funo dos seus Rm e usa-se
esse grfico para extrapolar os PM das protenas desconhecidas.
A focagem isoelctrica uma modificao da electroforese em que as
protenas so separadas, de acordo com a sua carga, num campo elctrico
aplicado a um gel, no qual se produziu um gradiente de pH. As protenas
migram para o local em que o pH do gel iguala o seu pI. Esta uma das
tcnicas de separao de protenas com melhor resoluo.

Fig. 7.8 Princpio de separao de protenas por focagem


isoelctrica.
A focagem isoelctrica e o SDS-PAGE podem ser combinados na
electroforese em duas dimenses, muito til para separar misturas muito
complexas de protenas. As protenas so primeiro separadas por focagem

37

Introduo Qumica Alimentar

2009

isoelctrica, com base na sua carga, sendo depois separadas por SDS-PAGE,
segundo os seus tamanho e forma.

Fig. 7.9 Electroforese em duas dimenses de protenas.


A electroforese capilar partilha dos mesmos princpios que a electroforese
convencional, quando aplicada separao de protenas. A principal diferena
a utilizao de um tubo capilar no lugar de um gel. O principal factor de
separao o fluxo electroosmtico gerado no interior do tubo.
O sistema (Fig. 7.10)
com tampes, uma fonte
separadas so analisadas
comuns), fluorescncia ou
em HPLC.

composto por um tubo capilar, dois reservatrios


elctrica e um detector. As protenas, depois de
por detectores de absoro electrnica (os mais
condutividade elctrica, semelhantes aos utilizados

Fig. 7.10 Esquema de um equipamento de electroforese capilar.

38

Introduo Qumica Alimentar

2009

Existem trs variantes de electroforese capilar, aplicadas separao de


protenas: electroforese capilar de zona, electroforese capilar com SDS e
focagem isoelctrica capilar.
A electroforese capilar de zona semelhante electroforese em gel
clssica, exceptuando que as protenas so separadas no interior de tubos
capilares cheios com um tampo do pH desejado. a parede interna do capilar
possui carga negativa e atrai caties do tampo para formar uma dupla camada
inica na interface entre o capilar e o tampo. Quando se aplica um campo
elctrico, esses caties so atrados para o ctodo e puxam as outras
molculas na mesma direco. Isto permite que caties, anies e molculas
neutras sejam separadas numa nica corrida. O fluxo elctroosmtico pode ser
controlado por alterao do pH ou da fora inica do tampo.
Na electroforese capilar com SDS as protenas so desnaturadas e
dissociadas na presena de SDS e de um agente redutor, sendo depois
separadas no capilar.
A focagem isoelctrica capilar usa um gradiente de pH no interior do
capilar para separar as protenas.

A anlise de aminocidos usada para determinar quantitativamente a


composio em aminocidos de uma protena. A protena primeiro hidrolisada
para libertar os aminocidos, os quais so depois separados por mtodos
cromatogrficos e quantificados. As tcnicas cromatogrficas usadas so a
permuta inica, RP-HPLC e GC.
A hidrlise habitualmente feita na presena de HCl 6N durante 24 h,
mas como os aminocidos no tm um comportamento homogneo nestas
condies, necessrio proceder a alguns procedimentos especiais para
prevenir a ocorrncia de erros na determinao.
O triptofano completamente destrudo durante a hidrlise, sendo
necessrio proceder a uma hidrlise alcalina seguida de cromatografia para o
quantificar.
Os aminocidos metionina, cistena, treonina e serina so
progressivamente destrudos durante a hidrlise, portanto a durao desta
influenciar os resultados obtidos. As percas de treonina e serina podem ser
calculadas por hidrlise das amostras durante trs perodos diferentes (24, 48 e
72 h, por exemplo). Pode ser feita uma compensao para a destruio de
aminocidos por extrapolao para o tempo zero, considerando que a
degradao segue uma cintica de 1 ordem. A cistena e a cistina podem ser

39

Introduo Qumica Alimentar

2009

convertidas em cido cstico, mais estvel, o qual depois hidrolisado e


cromatografado.
Asparagina e glutamina so convertidos quantitativamente em cido
asprtico e cido glutmico, respectivamente, no podendo ser quantificados.
Isovalina e leucina so hidrolisados mais lentamente, sendo por isso os
seus valores calculados a partir de um hidrolisado com 72 h e, finalmente, a
tirosina pode sofrer oxidao.
A separao por cromatografia de permuta inica utiliza um gradiente de
pH e fora inica e ps-derivatizao com nihidrina, para produzir formas
coradas, as quais podem ser medidas espectrofotometricamente. Em RP-HPLC,
a derivatizao feita antes da entrada na coluna, com feniltiocarbamil (ou
outros compostos) e a quantificao feita por um detector de absoro
electrnica.
A quantificao de cada aminocido feita com a ajuda de um padro
interno. Este padro interno , habitualmente, um aminocido no encontrado
nos alimentos, como a norleucina.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Captulo 8
Lpidos

Os lpidos podem ser descritos como substncias solveis em solventes


orgnicos e incluem gorduras, leos, ceras, colesterol, esteris e as quatro
vitaminas lipossolveis (A, D, E e K). Os termos gorduras e leos so usados
para descrever triacilgliceris, respectivamente no estado slido e no estado
lquido. Devido ao seu elevado grau de saturao, os triacilgliceris de origem
animal tendem a ser slidos, equanto que os provenientes de peixes e plantas
tendem a ser leos.

Fig. 8.1 Exemplos de diversos lpidos.


Os triacilgliceris so formados por uma molcula de glicerol esterificada
com trs cidos gordos. Estes trs cidos gordos podem ser todos diferentes,
todos iguais ou dois iguais e um diferente. O comprimento das cadeias dos
cidos gordos existentes nos triacilgliceris naturais varivel, embora as
estruturas com 16, 18 e 20 carbonos sejam as mais frequentes. Nos animais e
nas plantas, os cidos gordos possuem nmero par de tomos de carbono, mas
alguns microrganismos so capazes de sintetizar cidos gordos com nmero
mpar. Esta a razo pela qual nos ruminantes se encontram cidos gordos
com nmero mpar de tomos de carbono, pois as bactrias existentes no
rmen so capazes de os produzir.

41

Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 8.2 Estruturas de cidos gordos saturados (lineares) e


insaturados.
Os cidos gordos so cidos carboxlicos com cadeias alifticas mais ou
menos longas, as quais podem ser saturadas ou insaturadas. Nos cidos gordos
insaturados, as ligaes duplas (insaturaes) podem ocorrer em configurao
cis ou trans. Nos cidos gordos cis, as cadeias exibem uma curvatura,
restringindo a liberdade conformacional da molcula. Quanto maior o nmero
de ligaes cis, menor a flexibilidade. J nos cidos gordos trans, no se
verifica esse efeito conformacional e as molculas adoptam configuraes
semelhantes s dos cidos gordos saturados.

Fig. 8.3 cido oleico nas configuraes cis e trans.


Na natureza, a maioria dos cidos gordos ocorre na configurao cis. Nos
alimentos, uma fraco pode ocorrer em configurao trans devido ao
processamento dos alimentos, como por exemplo na operao de hidrogenao
que est na origem da produo de gorduras slidas a partir de leos
alimentares.

42

Introduo Qumica Alimentar

2009

Existem diversos sistemas de nomenclatura para os cidos gordos


insaturados:

nome comum nomes habitualmente utilizados, no obedecendo a


qualquer sistematizao. Ex: cido oleico
nome IUPAC a contagem comea na ponta cido carboxlico e as
ligaes duplas so designadas cis/trans ou E/Z. Nomenclatura
sistemtica. Ex: cido (9Z)-octadec-9-enoico
nomemclatura x cada ligao dupla indicada por x, o que
indica que a ligao dupla se encontra na x ligao carbonocarbono, contando a partir da ponta do cido carboxlico. Cada
ligao dupla precedida pela designao cis ou trans. Ex: cido
cis-9-octadecenoico
nomenclatura n-x (-x) indica que a ligao dupla est situada na
x ligao carbono-carbono, contando a partir da cauda aliftica. A
notao muito comum na literatura, mas a IUPAC d
preferncia notao n. Ex: -9, n-9
nmeros de lpidos na nomenclatura C:D, C designa o :nmero de
tomos de carbono e D o nmero de ligaes duplas. Ex: 18:1

O corpo humano capaz de sintetizar todos menos dois dos cidos gordos
de que necessita. Estes dois, o cido linoleico e o cido -linolnico,
considerados cidos gordos essenciais, encontram-se amplamente distribudos
em leos vegetais.
Os fosfolpidos so semelhantes aos triacilgliceris, com a excepo de
que um dos grupos hidroxilo do glicerol est ligado a um grupo fosfato, o qual
por sua vez se encontra ligado a um outro grupo orgnico (Fig. 8.1).
Os cidos gordos insaturados podem sofrer ataques por parte de agentes
oxidantes levando formao de flavours desagradveis. Frequentemente, a
oxidao ocorre atravs de reaces radicalares, nas quais se formam
compostos intermdios, denominados hidroperxidos, os quais se degradam a
aldedos e cetonas volteis, que so os responsveis pelo forte flavour final.
O teor lipdico total de um alimento habitualmente determinado a partir
de mtodos de extraco com solventes orgnicos. A polaridade dos solventes
influencia a solubilidade dos lpidos e a quantificao dos mesmos. Para alm
destes mtodos, outros baseados nas propriedades qumicas e fsicas, so
utilizados para a determinao do teor em gordura dos alimentos.
A preparao da amostra para anlise de lpidos depende do alimento e
dos lpidos presentes. Por tal razo, no existe um mtodo nico para a
extraco de todos os tipos de lpidos em todos os alimentos. Um factor em

43

Introduo Qumica Alimentar

2009

comum a necessidade de preparar a amostra sob uma atmosfera inerte de


azoto e a baixa temperatura, para minimizar reaces qumicas, tais como a
oxidao. Outros passos comuns, que contribuem para a eficcia do mtodo
analtico, so a remoo da gua, a reduo do tamanho de partcula e a
separao dos lpidos ligados a protenas e/ou hidratos de carbono.
Uma parte significativa dos lpidos em certos alimentos (lacticnios, po,
farinha e produtos crneos) est ligada a protenas e hidratos de carbono,
impedindo a sua eficaz extraco com solventes no polares. Antes da
extraco, tais alimentos devem ser sujeitos a uma hidrlise cida, de modo a
quebrar ligaes covalentes e inicas. A amostra pode ser pr-digerida com HCl
3 N, a refluxo durante 1 h e pode adicionar-se etanol e hexametafosfato para
facilitar a separao dos lpidos dos restantes componentes, antes da extraco
daqueles por solvente.
Os requisitos de um solvente para extraco de gorduras so uma elevada
capacidade de dissolver lpidos e baixa ou nula para protenas, aminocidos e
hidratos de carbono. O solvente a usar deve evaporar rapidamente e no deixar
resduos, possuir um ponto de ebulio relativamente baixo e no ser
inflamvel nem txico, tanto no estado lquido como no gasoso. Deve ainda ser
no higroscpico e barato. Sendo difcil encontrar um solvente ideal, que
preencha todos estes requisitos, opta-se pelo uso habitual de ter etlico e ter
de petrleo, existindo ainda as alternativas de hexano e pentano.
O ter etlico um melhor solvente para gorduras que o ter de petrleo,
mas relativamente caro, apresenta maior risco de exploso e de incndio,
higroscpico e forma perxidos. O ter de petrleo uma mistura de
compostos (principalmente pentano e hexano) e mais hidrofbico que o ter
etlico. selectivo para lpidos mais hidrofbicos, mais barato, menos
higroscpico e menos inflamvel que o ter etlico.
Utiliza-se frequentemente uma combinao de dois ou trs solventes, para
optimizar a extraco. necessrio utilizar uma razo solvente/soluto adequada
para maximizar a extraco de lpidos dos alimentos.
O mtodo de Goldfish um processo de extraco contnua por solvente,
em que um solvente quente flui continuamente sobre a amostra contida num
recipiente de cermica. O teor de gordura obtido a partir da perca de peso da
amostra ou por pesagem da gordura removida. Um mtodo contnuo mais
rpido e eficaz que um semi-contnuo, mas pode resultar numa extraco
incompleta.
O clculo da gordura obtido a partir da equao 8.1

44

Introduo Qumica Alimentar

2009

(8.1)

Peso de gordura = (proveta + gordura) - proveta

e a percentagem de gordura com base no peso seco por

% Gordura =

gordura na amostra/g
x 100
amostra seca/g

(8.2)

Fig. 8.4 Um extractor de Goldfish.


O mtodo de Soxhlet um exemplo de processo de extraco semi-contnua, em que o solvente se acumula no recipiente de extraco durante 5-10 minutos, envolvendo completamente a amostra, e depois recirculado para
o balo de aquecimento. O teor de gordura medido a partir do peso da
amostra inicial subtraindo a gordura perdida ou por pesagem da gordura
removida.

Fig. 8.5 Um extractor de Soxhlet.

45

Introduo Qumica Alimentar

2009

Este um mtodo mais lento que o de Goldfish, mas permite uma


extraco mais completa da gordura. No caso de amostras com mais de 10%
de gua, estas tero que ser previamente secas at atingirem um peso
constante (~5 h). O clculo do teor de gordura tambm efectuado a partir da
equao 8.2.
O mtodo de Mojonnier para extraco de gordura por solventes um
processo descontnuo em que a extraco realizada com uma mistura de ter
etlico e ter de petrleo num balo chamado de Mojonnier. A gordura extrada
seca at peso constante e exprime-se em percentagem por peso.

Fig. 8.6 Extraco em balo de Mojonnier.


Este mtodo tem a vantagem de no exigir remoo prvia de humidade
da amostra e aplica-se quer a alimentos lquidos quer a slidos, mas requer a
preparao diria de um branco de gua destilada em duplicado, para efectuar
os clculos. O teor de gordura dado por
peso prato + gordura - peso prato - peso mdio do resduo do branco
% Gordura = 100 x
peso amostra

(8.3)

Existem dois mtodos que utilizam interaces entre o solvente e a


amostra a presses e temperaturas elevadas, a extraco por fluidos
supercrticos (SFE) e a extraco acelerada por solvente (ASE). Estes mtodos
apresentam a caracterstica de reduzir o consumo de solventes orgnicos, com
o consequente benefcio ambiental. No caso de SFE, completamente
eliminado o uso de solventes orgnicos perigosos, sendo substitudos por um
solvente inerte e no txico, como o CO2. Quando submetido a condies de
temperatura e presso elevadas e ultrapassa o seu ponto crtico, passa a exibir
propriedades de fluido supercrtico. Neste estado, a sua densidade facilita a
extraco de gorduras, e as suas propriedades semelhantes s de um gs
facilitam a sua remoo do extracto, no finnal da extraco. A sua densidade

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Introduo Qumica Alimentar

2009

pode ser alterada por variao da presso e/ou temperatura, aumentando a


selectividadde para componentes especficos.

Fig. 8.7 Diagrama de fases de uma substncia, ilustrando o


estado supercrtico.
Na extraco por fluidos supercrticos, a gordura extrada precipitada,
aps separao do solvente, seca e quantificada como percentagem de gordura
por peso da amostra. O teor em gordura obtido atravs de
% Gordura =

peso gordura + recipiente - peso recipiente


peso amostra seca

x 100

(8.4)

Um extractor supercrtico pode ser acoplado a um cromatgrafo gasoso,


permitindo uma rpida e eficaz separao e quantificao dos componentes da
gordura extrada.

Fig. 8.8 Diagrama de um extractor supercrtico.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

O mtodo ASE no elimina completamente a necessidade de solventes


orgnicos, mas reduz significativamente o seu consumo. A extraco de
gordura ocorre a temperaturas muito superiores do ponto de ebulio do
solvente usado, aumentando a solubilidade e a difuso dos lpidos da amostra
para o solvente, encurtando o tempo de extraco e a quantidade de solvente.

Fig. 8.9 Funcionamento de um extractor ASE.


A extraco pode funcionar em modos esttico ou dinmico, usando um
solvente no polar. No modo esttico, a extraco d-se sem fluxo de solvente
para o exterior, enquanto que em modo dinmico, solvente fresco flui
continuamente atravs da amostra. O solvente separado, por evaporao, da
gordura e esta seca e pesada para quantificao. Esta feita a partir da eq.
8.4. Os resultados so comparveis aos obtidos por extraco em Soxhlet, com
menor dispndio de tempo e solvente.
A extraco em modo dinmico mais rpida, mas usa mais solvente; o
modo esttico usa menos solvente mas mais lento. A combinao dos dois
mtodos produz melhores resultados globais e frequentemente utilizada.
A extraco de lpidos pode tambm ser feita por mtodos que no
utilizam solventes, quer qumicos quer instrumentais.
No mtodo de Babcock, adiciona-se H2SO4 amostra, num recipiente
apropriado (garrafa de Babcock). O cido digere as protenas, produz calor e
liberta a gordura. A gordura isolada por centrifugao e adio de gua
quente e medida volumetricamente na parte graduada da garrafa de
Babcock, mas o resultado expresso como percentagem de gordura por peso
da amostra.
O mtodo no capaz de determinar fosfolpidos nem aplicvel a
alimentos contendo acar ou chocolate.

48

Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 8.10 Exemplos de garrafas de Babcock.


O mtodo de Gerber semelhante ao de Babcock, mas utiliza cido
sulfrico e lcool amlico. O cido digere as protenas e hidratos de carbono,
liberta a gordura e liquef-la devido ao calor gerado. Este mtodo mais
simples e rpido que o de Babcock. O lcool amlico impede a queima dos
hidratos de carbono, permitindo um uso mais amplo.
Um outro mtodo qumico o mtodo do detergente, em que este reage
com as protenas formando um complexo, levando quebra de emulses e
libertao da gordura. A amostra pipetada para uma garrafa de Babcock e
adiciona-se um detergente aninico, o qual dispersa a camada proteica que
estabiliza a gordura, para a libertar. De seguida adiciona-se um detergente no
inico para separar a gordura dos restantes componentes. A gordura medida
volumetricamente e expressa como percentagem.
O ndice de refraco caracterstico para cada tipo de gordura, variando
os valores com o grau e tipo de insaturao e teor de gordura. A gordura
extrada com um solvente (bromonaftaleno), e o ndice de refraco do
solvente comparado com os ndices de refraco da soluo com a gordura
extrada e da gordura, segundo a equao 8.5, em que V o volume de
bromonaftaleno, d a densidade da gordura, n o ndice de refraco da gordura,
n1 o ndice de refraco do bromonaftaleno, n2 o ndice de refraco da soluo
extrada e W o peso da amostra.
% Gordura = 100 x

Vd (n1 n2 )
W (n2 n)

(8.5)

Comparativamente com os mtodos anteriores, os mtodos instrumentais


so, em geral, rpidos, no destrutivos, exigem pouca preparao da amostra e

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Introduo Qumica Alimentar

2009

consomem poucos reagentes. No entanto, alguns equipamentos so caros e


frequente a necessidade de curvas de calibrao.
A ressonncia magntica nuclear (NMR) pode ser usada para medir lpidos
de forma no destrutiva. um mtodo rpido e exacto, que permite um
elevado grau de automao. Na quantificao e caracterizao de lpidos em
alimentos usa-se o NMR de baixa resoluo, em que se obtm informao
sobre a intensidade do sinal e tempo de relaxao da amostra sujeita ao campo
magntico aplicado. Estes dados podem ser usados para determinar a
quantidade de lpidos, o teor de lpidos slidos e lquidos teores de gua e leo
presentes.
O NMR aplicado no modo pulsado, em que o campo magntico
aplicado durante perodos muito curtos. Nesta modalidade, os sinais dos
ncleos 1H dos diversos componentes dos alimentos podem ser distinguidos
atravs das suas relaxaes nucleares. Os ncleos em fases slidas relaxam
muito rapidamente, enquanto que os protes em fases lquidas relaxam muito
devagar. A intensidade dos sinais proporcional ao nmero de ncleos de
hidrognio, ou seja ao teor de hidrognio. Esta intensidade pode ser convertida
em teor de leo, usando mtodos de calibrao. Esta tcnica permite medir
teores de gua e de leo, teor de gorduras slidas e razo slido/lquido.
A utilizao de espectrometria de NMR exige que as amostras estejam a
temperatura constante, j que uma tcnica cujo sinal varia com a
temperatura.
A absoro de raios X um mtodo rpido, que tem sido usado para
anlise de lpidos em carnes. Baseia-se no facto de que a absoro de raios X
maior em carne magra do que em carne gorda. A quantificao feita por
comparao com curva padro obtida a partir de uma extraco com solvente.
A medio da constante dielctrica pode ser usada para determinar o teor
lpidico de um alimento, tendo por base o princpio de que a constante dieltrica
varia com o teor de leo. Os valores medidos so comparados com os obtidos a
partir de uma curva de calibrao, preparada a partir de uma extraco com
solventes.
As gorduras originam uma absoro a 5.73 m, cuja intensidade
proporcional concentrao de gorduras na amostra. A espectroscopia de
infra-vermelho usada para determinar o teor de gorduras em alimentos,
tendo por base essa propriedade, podendo o mtodo ser utilizado durante o
processamento dos alimentos, j que se trata de uma tcnica no destrutiva.

50

Introduo Qumica Alimentar

2009

As medidas de ultra-sons tambm so no destrutivas e podem ser


usadas para determinar a composio de diversos alimentos, baseadas no facto
de que os vrios componentes possuem diferentes propriedades acsticas. As
medidas so efectuadas a partir de modelos empricos ou tericos.
O teor de leo nas oleaginosas pode ser determinado a partir da medida
da densidade das sementes e estabelecendo uma correlao entre esse valor e
o medido para o teor de gordura atravs de um mtodo de extraco por
solventes.
Por motivos de rotulagem, nutricionais ou outros frequente haver
necessidade de medir no apenas o teor em gordura total de um alimento mas
tambm de caracterizar a sua composio lipdica. Parmetros como o teor de
colesterol, de cidos gordos saturados e insaturados e mesmo o tipo de cidos
gordos presente so importantes para determinar a conservabilidade de um
produto e influem no seu processamento.
As amostras utilizadas para caracterizao de leos e gorduras devem ser
preparadas sob condies que evitem a sua oxidao (exposio a calor, luz ou
ar) e a presena de gua e devem apresentar-se lmpidas, sem sedimentos.
A refractometria uma das tcnicas utilizadas para caracterizar gorduras,
trabalhando a 20 C com leos e s temperaturas a que as restantes gorduras
se apresentam fluidas. O ndice de refraco, para alm de permitir uma anlise
qualitativa, devido a possuir um valor especfico para cada substncia,
proporcional saturao do cido gordo, podendo ser usado para medir o grau
de saturao. Este mtodo apresenta as desvantagens de ser influenciado pela
presena de cidos gordos livres, pela oxidao dos cidos gordos e ser
dependente da temperatura.
Existem diversos mtodos que permitem medir o ponto de fuso de uma
gordura, com o objectivo de determinar a sua composio, sendo todos eles
algo subjectivos quanto ao valor medido e, portanto, relativamente pouco
rigorosos.
O ndice de iodo uma medida do grau de insaturao. Define-se como a
quantidade (em peso) de iodo absorvida por 100 g de amostra. Quanto maior a
insaturao, mais iodo absorvido, ou seja quanto maior o ndice de iodo,
maior o grau de insaturao.
Uma amostra de leo ou gordura dissolvida num solvente apropriado e
-lhe adicionada uma quantidade conhecida de iodo (ou outro halogneo). Dse uma adio s ligaes duplas (8.6). Adiciona-se uma soluo de iodeto de
potssio para reduzir o excesso de ICl e produzir iodo livre (8.7). Este iodo livre

51

Introduo Qumica Alimentar

2009

depois titulado com uma soluo padro de tiossulfato de sdio, usando


amido como indicador, o qual muda de azul para incolor (8.8).
ICl(excesso) + R-CH=CH-R R-CHI-CHCl-R + ICl
ICl + 2KI KCl + KI + I2

(8.6)

(8.7)

I2 + amido + 2Na2S2O3 2NaI + amido + Na2S4O6

(8.8)

O ndice de iodo calculado a partir da equao 8.9, em que B o


volume de titulante usado para titular um branco, S o volume de titulante para
a amostra, N a concentrao de Na2S2O3 (mol/1000 mL), W o peso da amostra
e 126.9 a massa de iodo (g/mol).

ndice de iodo

B S xNx126.9 x100
W

(8.9)

O ndice de saponificao mede a quantidade de base necessria para


saponificar uma determinada quantidade de leo ou gordura. A gordura
tratada com uma base degradando-a em glicerol e cidos gordos. O ndice de
saponificao expresso como a quantidade de KOH necessria para
saponificar 1 g de amostra. Este ndice uma medida do peso molecular mdio
dos triacilgliceris presentes na amostra. Se este valor mdio for dividido por 3,
d um peso molecular mdio aproximado para os cidos gordos presentes. Na
prtica, quanto menor o ndice de saponificao, maior a cadeia dos cidos
gordos.
Uma soluo alcolica com KOH em excesso adicionada amostra,
aquecendo-se para saponificar a gordura. O KOH que no reage titulado com
HCl, usando fenolftalena como indicador e o ndice calculado atravs da
equao 8.10, onde B o volume de titulante para o branco, S o volume de
titulante para a amostra, N a concentrao de HCl (mmol/mL), W o peso da
amostra e 56.1 a massa de KOH (mg/mmol).

ndice de saponificao

B S xNx56.1 x100
W

(8.10)

As medidas de acidez das gorduras geralmente reflectem a quantidade de


cidos gordos hidrolisados dos triacilgliceris. A percentagem em peso de um
dado cido gordo designa-se cido gordo livre (FFA free fatty acid) e o ndice
de acidez define-se como a quantidade de KOH necessria para neutralizar os
cidos livres presentes em 1 g de leo ou gordura. A percentagem de FFA
frequentemente referida a cido oleico e calcula-se a partir de uma amostra de

52

Introduo Qumica Alimentar

2009

gordura fluida qual so adicionados etanol a 95% e o indicador fenolftalena.


Aps titulao com NaOH, o valor calculado usando

% FFA(como oleico) =

V x N x 282
x 100
W

(8.11)

em que V o volume de NaOH usado para titular, N a concentrao de NaOH,


W o peso da amostra e 282 o peso molecular do cido oleico.
Numa gordura bruta, este valor uma estimativa da quantidade de leo
que ser perdida durante a refinao. Numa gordura refinada, um ndice de
acidez elevado indica uma incorrecta refinao ou degradao da gordura aps
armazenamento ou utilizao. No caso de os cidos libertados serem volteis, o
valor de FFA pode ser uma medida da rancidez hidroltica.
A percentagem de gorduras slidas numa amostra pode ser determinada
por NMR. A proporo de gorduras slidas em alimentos (margarinas, cremes
para barrar, ...) tem importncia no que se relaciona com as suas propriedades
funcionais, tais como a textura.
As gorduras podem sofrer processos de degradao, originando a
produo de sabores e aromas indesejados, globalmente designados por rano.
A rancidez das gorduras pode provir da liplise (rancidez hidroltica) ou da
oxidao lipdica (rancidez oxidativa).
A liplise designa a hidrlise dos triacilgliceris. Quando os cidos gordos
que os compem possuem cadeias curtas, a liplise resulta na formao de
compostos volteis, frequentemente caracterizados por aromas desagradveis.
A oxidao lipdica (ou autoxidao) ocorre atravs de um mecanismo com
radicais livres, o qual origina a produo de hidroperxidos, que por sua vez
sofrem degradao com produo de diversos produtos, incluindo aldedos,
cetonas, cidos orgnicos e hidrocarbonetos.
Existem diversos mtodos que permitem a quantificao da oxidao
lipdica em alimentos, a maioria dos quais requer a extraco de lpidos antes
de efectuar a anlise.
O ndice de perxidos um mtodo titrimtrico, que parte do pressuposto
que todos os compostos reactivos so perxidos ou produtos anlogos
resultantes da oxidao lipdica. A amostra dissolvida numa mistura de cido
actico e isooctano, qual adicionado um excesso de KI. O iodeto reage com
os perxidos, libertando iodo. Esta soluo titulada com tiossulfato de sdio,
usando amido como indicador.

53

Introduo Qumica Alimentar

ROOH + KI ROH + KOH + I2

2009

(8.12)

I2 + amido(azul) + 2Na2S2O3 2NaI + amido(incolor) + Na2S4O6

(8.13)

O ndice de perxidos ento calculado a partir da equao 8.14, em que


S o volume de titulante usado para a amostra, B o volume de titulante para o
branco, N a concentrao de tiossulfato de sdio, W o peso da amostra e 1000
o factor de converso de g para kg.
ndice de perxidos =

( S B) x N
x 1000
W

(8.14)

Como este ndice mede um produto transiente de oxidao (os perxidos


formados sofrem, tambm eles, degradao para formar outros produtos)
quando se obtm um valor baixo, tal pode significar quer um incio quer um
estado adiantado de oxidao. Para distinguir entre os dois, deve medir-se o
ndice de perxido em funo do tempo, durante um certo perodo.
Um valor de 0 indica uma gordura de elevada qualidade e um valor
superior a 20 corresponde a uma gordura de m qualidade.
Uma desvantagem na aplicao deste mtodo a alimentos a necessidade
de uma amostra de 5 g de gordura ou leo.
O ndice de p-anisidina calcula a quantidade de aldedos e insaturados,
formados como produtos secundrios de oxidao de leos e gorduras. Estes
aldedos reagem com a p-anisidina formando um composto corado, podendo
ser medido espectrofotometricamente. O ndice obtido multiplicando por 100
o valor da absorvncia a 350 nm, de uma soluo contendo 1 g de leo diludo
para 100 mL de isooctano e p-anisidina.
O ndice totox indica a oxidao total de uma amostra atravs dos ndices
de perxidos e de p-anisidina:
ndice totox = ndice de p-anisidina + 2 x ndice de perxidos

(8.15)

Este ndice totox aumenta continuamente ao longo da oxidao.


Os compostos orgnicos volteis (VOCs) presentes nas gorduras e leos
esto associados ao seu flavour, qualidade e susceptibilidade oxidao.
Incluem-se neste grupo os produtos secundrios da oxidao lipdica,
responsveis pelos sabores e aromas desagradveis das gorduras e leos
oxidados. Entre os compostos habitualmente medidos incluem-se pentano,
pentanal, hexanal e 2,4-decadienal. A medio, por GC, do hexanal no espao
de cabea uma indicao da extenso da oxidao. Os detectores
habitualmente utilizados so o de ionizao de chama (FID) ou de massa (MS)

54

Introduo Qumica Alimentar

2009

e a quantidade de hexanal formada calculada a partir da rea do respectivo


pico.
Este mtodo apresenta a vantagem de no exigir prvia extraco de
lpidos.
O ensaio do cido tiobarbitrico (TBA) mede um outro produto secundrio
da oxidao dos lpidos, o malonaldedo. Baseia-se na reaco de malonaldedo
com o TBA para produzir um composto colorido, o qual medido
espectrofotometricamente. Como a reaco no especfica para o
malonaldedo, os resultados so por vezes apresentados como medida de
substncias reactivas com TBA (TBARS). O ensaio pode ser feito directamente
com o alimento, mas este sofre habitualmente uma destilao prvia, para
eliminar interferentes e s depois se faz reagir o destilado com o TBA.
A absorvncia da soluo medida a 530 nm e os valores so
convertidos, usando uma curva padro, a mg de malonaldedo por kg de
amostra. Alternativamente, o teor de malonaldedo pode ser medido atravs de
uma anlise do destilado por HPLC.
O malonaldedo tambm um produto transiente da oxidao, mas o
ensaio do TBA apresenta melhores correlaes com a avaliao sensorial da
rancidez que o ndice de perxido.
As ligaes duplas dos lpidos passam de no conjugadas a conjugadas
quando sofrem oxidao. Os compostos com ligaes duplas conjugadas
apresentam absores caractersticas, podendo essa propriedade ser utilizada
para identificar a existncia de oxidao numa amostra.
As amostras lquidas so pesadas e diludas para um volume que permita
obter um valor de absorvncia entre 0.1 e 0.8. A absorvncia ento medida a
232 nm (dienos conjugados) e 270 nm (trienos conjugados) contra um branco
do solvente.
O mtodo dos dienos e trienos conjugados permite seguir as primeiras
fases de uma oxidao, no existindo uma boa correlao em etapas mais
adiantadas.
A estabilidade de um alimento relativamente oxidao pode ser
determinada atravs de ensaios acelerados, os quais provocam artificialmente a
rpida oxidao por exposio das amostras ao calor, oxignio, catalisadores
metlicos, luz ou enzimas. Estes ensaios partem da condio de que as
reaces que ocorrem nestas condies artificiais so as mesmas que ocorrem
em condies normais.

55

Introduo Qumica Alimentar

2009

Um destes ensaios usa um forno a cerca de 60 C, no qual colocado o


leo ou a gordura. O ensaio permite simular condies de armazenamento, mas
num perodo muito mais curto. Actualmente designa-se por ensaio em forno de
armazenamento e uma actualizao do ensaio em forno de Schaal.
Um outro mtodo mede o tempo necessrio para que o oxignio comece a
desaparecer de um sistema fechado. Designado por bomba de oxignio, este
mtodo usa um contentor hermeticamente fechado, ligado a um medidor de
presso. A amostra colocada no seu interior e adiciona-se O2 at alcanar
uma presso de ~690 kPa (100 psi). De seguida, coloca-se o contentor num
banho de gua a ferver. Mede-se o tempo que demora a atingir uma queda
brusca de presso, correspondente rpida absoro de O2 pela amostra.
A fraco lipdica, presente num alimento, pode ser caracterizada pela sua
composio em cidos gordos, mono, di e triacilgliceris, fosfolpidos, esteris,
pigmentos e vitaminas lipossolveis. A cromatografia gasosa ideal para a
anlise de lpidos, podendo ser utilizada para determinar a composio em
cidos gordos totais, distribuio e posio dos cidos gordos, estabilidade e
oxidao, deteco de adulteraes e antioxidantes. Quando combinada com a
espectrometria de massa, a cromatografia gasosa permite a identificao dos
compostos separados. A cromatografia lquida (HPLC) tambm tem aplicaes
na anlise de lpidos e a cromatografia em camada fina (TLC) usa-se em
ensaios de rotina devido sua simplicidade e baixo custo.
O perfil em cidos gordos de um alimento determinado aps extraco
dos lpidos e anlise do extracto em GC capilar. Para aumentar a volatilidade, os
triacilgliceris e os fosfolpidos so saponificados e os cidos gordos livres
resultantes so esterificados, formando steres metlicos (FAMEs).

Fig. 8.11 Reaco de formao de steres metlicos de um cido


gordo, em meio bsico.
A maioria das gorduras e leos naturais extrados das plantas contm
apenas ligaes duplas cis (no conjugadas), mas os extrados de fontes
animais podem conter pequenas quantidades de ligaes duplas trans. Estas
ligaes trans tambm podem resultar de processos como a oxidao,

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Introduo Qumica Alimentar

2009

extraco, aquecimento e hidrogenao. A determinao de ismeros trans


pode ser efectuda por GC, mas tambm por espectrometria de infra-vermelho.
A concentrao de cidos gordos trans pode ser medida a partir da
absoro a 966 cm-1. Para obter um espectro de IV, a amostra ter que estar
no estado lquido e os cidos gordos tero que ser convertidos nos respectivos
steres metlicos. Usa-se elaidato de metilo como padro externo, para calcular
o teor em compostos trans.
Os mtodos cromatogrficos, HPLC e GC, so as tcnicas mais recentes
utilizadas para determinar mono, di e triacilgliceris.
Para quantificar colesterol num alimento, necessrio saponificar os
lpidos extrados da amostra. O colesterol, que fica na fraco no saponificada,
extrado e derivatizado para formar teres trimetilsililados, que sero
analisados por GC.
No caso de alimentos crneos e congelados, no necessria a prvia
extraco da gordura, podendo saponificar-se directamente a amostra.
Os produtos de oxidao do colesterol podem se quantificados por GC,
HPLC ou TLC.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Captulo 9
Hidratos de carbono

Designa-se

por hidrato de carbono qualquer composto orgnico de

frmula (CH2O)n com n 3. Quimicamente, os hidratos de carbono so


aldedos ou cetonas, com diversos grupos hidroxilo ligados. Os hidratos de
carbono simples, que no podem ser hidrolisados a acares mais simples so
chamados monossacridos.

Fig. 9.1 -D-glucopiranose, um monossacrido.


Os monossacridos so classificados de acordo com trs caractersticas: a
posio do grupo carbonilo, o nmero de tomos de carbono e a quiralidade.
Se o grupo carbonilo um aldedo, o monossacrido designa-se por aldose; se
o grupo carbonilo for uma cetona, o monossacrido ser uma cetose. Os
acares simples com valores n de 3, 4, 5 e 6 so designados por trioses,
tetroses, pentoses e hexoses. Cada tomo de carbono com um OH substituinte,
exceptuando o primeiro e o ltimo carbonos, so assimtrcos podendo exibir
configuraes R ou S.
A nomenclatura D ou L tem em conta a orientao do carbono assimtrico
mais afastado do grupo carbonilo. Numa projeco de Fischer, se o grupo
hidroxilo est direita da molcula, o acar ser D e no caso oposto ser L.
Os grupos aldedo ou cetona de um monossacrido reagem
reversivelmente com um grupo hidroxilo de outro tomo de carbono, formando
um anel heterocclico. Se o anel tiver cinco membros uma furanose e se tiver
seis uma piranose. Na forma cclica, o tomo de carbono do grupo carbonilo
(carbono anomrico) torna-se um centro quiral com duas conformaes
possveis: o tomo de oxignio pode ficar acima ou abaixo do plano do anel,

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Introduo Qumica Alimentar

2009

originando dois possveis anmeros. Num anmero , o grupo OH do carbono


anomrico fica situado no lado oposto do anel relativamente ao grupo CH 2OH;
num anmero , o CH2OH fica no mesmo lado do plano do anel relativamente
ao hidroxilo do carbono anomrico.

Fig. 9.2 A azul est representado o tomo de carbono mais


afastado do grupo carbonilo (vermelho). Como o OH
est direita, este um acar D.

Fig. 9.3 Anmeros e da glucose.


Nos acares simples, o grupo aldedo do carbono 1 pode sofrer uma
hidrogenao, resultando na formao de um lcool polihidroxilado ou poliol.
Alguns destes compostos ocorrem na natureza, podendo tambm ser
produzidos industrialmente. Estes compostos possuem menor teor calrico, so
melhor tolerados por diabticos e no provocam formao de cries,
comparativamente com os acares normais.
Os monossacridos podem ligar-se uns aos outros, formando
oligossacridos ou polissacridos. A ligao covalente entre dois
monossacridos designa-se ligao peptdica. Os oligossacridos mais simples
so os dissacridos, como a lactose ou a sacarose.
A sacarose no possui um carbono anomrico, sendo considerado um
acar no redutor. Pelo contrrio, a maioria dos monossacridos e dissacridos
como a lactose tm capacidade de reduzir Cu2+ a Cu+ (teste de Fehling) sendo
designados acares redutores.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 9.4 Sacarose, o dissacrido mais abundante na natureza.


A partir de dez unidades monomricas, os hidratos de carbono so
habitualmente designados polissacridos. Alguns dos polissacridos mais
importantes na natureza so o amido, a celulose e o glicognio. O amido uma
mistura dos polissacridos amilose e amilopectina em diferentes propores. A
celulose um polmero linear de unidades de D-glucose ligadas por ligaes
(14).

Fig. 9.5 Cadeia de celulose, evidenciando as ligaes de


hidrognio formadas entre as unidades D-glucose.
O equivalente do amido nos animais o glicognio, tambm um
polissacrido de glucose com funes de armazenamento.
A pectina um heteropolissacrido estrutural, encontrado nas plantas
terrestres. A sua estrutura difere de planta para planta, nas diferentes partes
das plantas e mesmo durante o desenvolvimento das plantas.
Como os hidratos de carbono possuem uma elevada gama de
solubilidades, os mtodos de preparao de amostra para a sua anlise so
tambm variados.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 9.6 Esquema mostrando a estrutura fortemente ramificada


do glicognio.
Para analisar os hidratos de carbono na maioria dos alimentos, efectua-se
um primeiro passo de secagem (pode servir para determinar o teor de
humidade). Aps secagem, a amostra finamente triturada e faz-se a
extraco dos lpidos por Soxhlet, usando uma mistura 95:5 v/v
clorofrmio/metanol. A extraco da fraco lipdica facilita a mais completa
extraco de hidratos de carbono.
Os produtos alimentares contm frequentemente substncias que
interferem com as medidas de mono e oligossacridos presentes. Por essa
razo, a amostra, depois de seca e sujeita extraco da fraco lipdica,
extrada a quente com 80% de etanol, na presena de carbonato de clcio para
neutralizar alguma acidez. Os hidratos de carbono so solveis em solventes
polares, mas outros componentes dos alimentos (polissacridos, protenas, ...)
so insolveis em etanol quente a 80%. O passo de extraco repetido, de
modo a ssegurar uma completa extraco dos mono e oligossacridos.
O extracto ainda conter outras substncias, para alm dos hidratos de
carbono. Como estes so neutros e aquelas possuem carga, os contaminantes
podem ser removidos por tcnicas de permuta inica.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

A soluo etanlica contendo o extracto sujeita a secagem, num


evaporador rotativo a 45 50 C e o resduo resultante dissolvido num
volume conhecido de gua, para posterior anlise.
A determinao do teor total em hidratos de carbono pode ser feita
tirando partido da reaco caracterstica dos hidratos de carbono com cidos
fortes. Nestas condies (o efeito pode ser reforado a temperatura elevada)
produzem-se diversos furanos, os quais podem condensar entre si ou com
outros produtos, originando substncias de cor castanha e preta. Entre estes
outros produtos que reagem com os furanos, contam-se os compostos
fenlicos. O mtodo mais utilizado para determinar hidratos de carbono totais
a condensao com o fenol em meio de cido sulfrico (mtodo do fenol/cido
sulfrico). Este mtodo simples, rpido, sensvel, rigoroso e especfico para
hidratos de carbono. Prepara-se uma soluo com os hidratos de carbono a
determinar e um branco com gua. Adiciona-se uma soluo aquosa de fenol,
mistura-se e adiciona-se cido sulfrico. A soluo fica com uma cor amarelo-alaranjada e a sua absorvncia medida a 490 nm.
O mtodo do fenol e outros usados para medir o teor de acares
redutores no envolvem reaces estequiomtricas, dependendo a extenso da
reaco da estrutura do acar. Por este motivo, necessria a utilizao de
curvas de calibrao, frequentemente com D-glucose.
O mtodo mais utilizado para determinar teores de acares redutores o
mtodo de Somogyi-Nelson. Este e outros mtodos semelhantes podem ser
usados em conjunto com mtodos enzimticos para determinar oligo e
polissacridos. Os mtodos enzimticos usam hidrolases especficas para
converter oligo e polissacridos em monossacridos ou unidades repetitivas de
oligossacridos, os quais podem ser medidos pelos mtodos usados para
determinar acares redutores.
O mtodo de Somogyi-Nelson baseia-se na reduo de Cu2+ a Cu+ pelos
acares redutores. Os ies Cu+, por sua vez, reduzem um complexo de
arsenomolibdato em cido sulfrico. A reduo deste complexo origina uma cor
azul intensa e estvel, a qual pode ser medida espectrofotometricamente a
520 nm, contra um branco de gua. Como a reaco no estequiomtrica,
tem que usar-se uma curva de calibrao para quantificar os acares
redutores.
Existem outros mtodos baseados na reduo, em meio alcalino, de Cu 2+
a Cu+. Nestas condies, o Cu+ precipita na forma de Cu2O, de cor vermelho-tijolo. O mtodo de Munson-Walker um deles, podendo o precipitado ser
medido por gravimetria, por titulao com tiossulfato de sdio, por titulao
com permanganato de potssio, por titulao na presena de azul de metileno

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Introduo Qumica Alimentar

2009

(mtodo de Lane-Eynon) e por electrlise. Todas estas variantes requerem a


utilizao de curvas de calibrao, devido especificidade de reaco de cada
acar.
Em geral, conveniente identificar cada hidrato de carbono presente e
determinar as suas concentraes, para o que ser necessrio optar por outros
mtodos.
HPLC o mtodo mais eficaz para a anlise de oligo e monossacridos,
podendo tambm ser usado para anlise de polissacridos, aps hidrlise
destes.
Como os hidratos de carbono possuem pKa elevados (12-14) em solues
com pH alcalino alguns grupos hidroxilo dos hidratos de carbono so ionizados,
permitindo a separao em colunas de permuta aninica. A sequncia de
eluio geralmente alditis, monossacridos, dissacridos e oligossacridos de
maior cadeia. A cromatografia de permuta aninica habitualmente utilizada
em conjunto com detectores electroqumicos.
As resinas de permuta catinica podem ser usadas em alternativa,
invertendo-se aqui a ordem de separao. A maior eficcia destas colunas est
na separao de monossacridos.
HPLC tambm pode ser usada em fase normal para anlise de hidratos de
carbono. Usando fases estacionrias com grupos amino e fases mveis
acetonitrilo/gua conseguem separar-se os hidratos de carbono na ordem
monossacridos, alditis, dissacridos e outros oligossacridos. Alguns acares
reagem com os grupos amino e a fase estacionria vai perdendo eficcia,
embora modificaes recentes na fase estacionria permitam a regenerao da
mesma.
As colunas de fase reversa mostram alguma eficcia na separao de
mono, di e trissacridos, mas os monossacridos tendem a coeluir com baixos
tempos de reteno.
A deteco em HPLC de hidratos de carbono pode ser feita por ndice de
refraco, detectores electroqumicos ou por derivatizao pr e ps-coluna.
Os detectores de ndice de refraco podem ser aplicados a todos os
hidratos de carbono e apresentam uma resposta linear numa ampla gama de
concentraes, mas no so compatveis com a utilizao de gradientes.
Os detectores de amperometria pulsada so utilizados em cromatografia
de permuta aninica e permitem a deteco quer de acares redutores quer
de no redutores.

63

Introduo Qumica Alimentar

2009

A derivatizao dos hidratos de carbono pr-coluna ou ps-coluna permite


aumentar a sensibilidade de deteco por detectores de absoro electrnica
ou de fluorescncia.
A cromatografia gasosa permite a anlise quantitativa e qualitativa de
hidratos de carbono, com a limitao de que estes tm que sofrer uma
derivatizao (em dois passos) para serem convertidos em compostos volteis.
A deteco habitualmente efectuada por detectores de ionizao de chama
(FID).
O processo de derivatizao diferente para acares neutros e para
amostras contendo cidos urnicos.
Vrios mtodos enzimticos tm sido empregues para a determinao de
hidratos de carbono, em particular do amido. Estes mtodos apresentam a
vantagem de serem frequentemente especficos para a substncia a ser
estudada.
recomendado que as amostras destinadas a serem determinadas por
mtodos enzimticos sofram um tratamento prvio que permita a quebra de
emulses, precipitao de protenas e absoro de cores. Este tratamento de
Carrez envolve a adio de hexacianoferrato de potssio (K4[Fe(CN)6]), seguida
da adio de sulfato de zinco (ZnSO4) e de hidrxido de sdio (NaOH).
Na determinao enzimtica de D-glucose, esta quantitativamente
oxidada pela enzima glucose oxidase a D-glucono-1,5-lactona e H2O2. O
perxido de hidrognio reage com um pigmento na presena de peroxidase e
origina a formao de um composto corado, o qual medido
espectrofotometricamente, permitindo a quantificao da D-glucose.
O nico mtodo de confiana para determinao do teor total em amido
baseia-se na converso total de amido em D-glucose por enzimas (amilases) e
posterior determinao da D-glucose por uma enzima especfica.
Este mtodo apresenta problemas de quantificao com o amido
resistente (amido e produtos de degradao do amido que resistem digesto
no intestino delgado). Existem quatro tipos de amido resistente: a) amido preso
em matrizes alimentares, fisicamente inacessvel a amilases; b) amido que
resiste hidrlise enzimtica devido natureza dos seus gros (amido de
batata, ...); c) amido que recristalizou aps gelatinizao (ex: batatas cozidas e
arrefecidas); d) amido que foi estruturalmente modificado, de maneira a torn-lo menos susceptvel digesto.
O problema causado pelo amido resistente pode ser, em parte,
solucionado por disperso do amido em DMSO (dimetil sulfxido) e posterior

64

Introduo Qumica Alimentar

converso quantitativa em D-glucose por tratamento com


conseguindo-se assim a despolimerizao e solubilizao do amido.

2009

-amilase,

Fig. 9.7 Determinao enzimtica da D-glucose.


Para determinar o amido total, uma amostra finamente triturada,
colocada num tubo de ensaio e -lhe adicionado etanol a 80%. Adiciona-se
DMSO e agita-se vigorosamente. Aquece-se em gua a ferver, retira-se do
banho e adiciona-se uma soluo de -amilase. Agita-se bem e volta a colocar-se no banho de gua. Ao fim de 5 minutos, o tubo levado a 50 C, adiciona-se tampo de acetato de sdio (pH 4.5) e amiloglucosidase. Agita-se e incuba-se a 50 C. De seguida, o contedo do tubo transferido para um balo
volumtrico, ajustando-se o volume com gua destilada. Aps agitao
vigorosa, retiram-se alquotas, adiciona-se uma mistura de glucose
oxidase/peroxidase (reagente GOPOD) e incuba-se a 50 C. Finalmente, mede-se a bsorvncia da amostra contra um branco do reagente GOPOD.
Utilizam-se glucose e um amido com baixo teor de protenas e lpidos
como padres, aps determinao dos respectivos teores de humidade.
No existe um mtodo oficial para determinao de pectina, mas existem
alguns mtodos publicados, baseados na sua precipitao com etanol, em
alimentos em que o nico polissacrido presente.
O cido D-galacturnico um elemento constante na composio das
pectinas (frequentemente mais de 80%). As ligaes dos cidos urnicos so
difceis de hidrolisar sem degradao da molcula, pelo que os mtodos que
utilizam hidrlise cida e cromatografia no so aplicveis anlise de pectinas.

65

Introduo Qumica Alimentar

2009

Um dos mtodos usados faz saponificao da amostra em NaOH, seguida


da sua acidificao e adio de Ca2+, para precipitar a pectina. O pectato de
clcio precipitado recolhido, lavado, seco e pesado.
Define-se fibra diettica como a soma dos componentes no digerveis de
um alimento. Na sua maioria composta de polissacridos (celulose,
hemiceluloses e lenhina). A fibra diettica composta por uma parte de fibra
solvel e outra de fibra insolvel. A fibra insolvel composta por celulose,
celulose microcristalina usada como aditivo alimentar, lenhina, hemiceluloses
presas na matriz linhocelulsica e amido resistente. Os restantes polissacridos,
incluindo diversas hemiceluloses, a maioria da pectina e a maioria das
gomas/hidrocolides compem a fibra solvel.
O teor em fibra diettica de um alimento pode ser calculado por dois
processos: gravimtrico e qumico. Nos mtodos gravimtricos, os hidratos de
carbono digerveis, lpidos e protenas so removidos por catlise enzimtica ou
solubilizados selectivamente. A parte no digerida ou no solubilizada filtrada
e pesada. Nos mtodos qumicos, os hidratos de carbono digerveis so
removidos por digesto enzimtica e os componentes da fibra hidrolisados em
meio cido. De seguida, medem-se os monossacridos libertados, considerando
que o seu teor corresponde ao teor de fibra.
Todos os mtodos usados para determinao de fibras incluem um passo
de aquecimento a 80-130 C (10 min a 3 h) para gelatinizar os grnulos de
amido, tornando-os passveis de ser hidrolisados. S o amido resistente no
ser hidrolisado.
As medidas de fibra requerem que as amostras sejam secas e finamente
trituradas e funcionam melhor em amostras com menos de 10% de lpidos.
Quando a amostra possui um teor lipdico superior, os lpidos so removidos por
extraco com ter de petrleo ou hexano. A amostra depois seca em estufa
de vcuo a 70 C e triturada.
As amostras no slidas com menos de 10% de fibra devem ser
analisadas aps liofilizao. Se tiverem mais de 10% de fibra, forem
homogneas, com tamanho de partcula suficientemente pequeno para permitir
uma remoo eficaz de hidratos de carbono digestveis e de protena e
possuirem um baixo teor de lpidos, podem ser analisadas sem secagem.
Entre os mtodos gravimtricos inclui-se o mtodo para determinao de
fibra bruta. Este um mtodo antigo, que foi utilizado at dcada de 1970
para determinar o teor de fibra em alimentos para humanos. A fibra bruta
determinada por extraco sequencial da amostra com H2SO4 1.25% e NaOH
1.25%. O resduo insolvel recolhido por filtrao, seco, pesado e incinerado,

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Introduo Qumica Alimentar

2009

de modo a corrigir para a eventual contaminao por minerais. Este mtodo


no tem em conta as hemiceluloses, pectinas e gomas/hidrocolides, j que
estes so solubilizados e removidos.
Os mtodos com detergentes cido e neutro foram desenvolvidos para
obter uma determinao mais correcta de fibra. O mtodo com detergente
cido mede a lenhina e a celulose e o mtodo com detergente neutro mede
lenhina, celulose e hemiceluloses. Nenhum destes mtodos permite medir
pectinas ou gomas. No entanto, como os componentes no medidos esto
geralmente presentes em muito pequenas quantidades, estes mtodos so
aceites para analisar raes para animais.
O mtodo gravimtrico de referncia para medir fibras em alimentos para
consumo humano faz a medida das fibras total, solvel e insolvel. Este mtodo
usa amostras secas, livres de lpidos e trituradas. As amostras so digeridas
com -amilase, glucoamilase e protease, para remover amido e protenas. A
fibra insolvel recolhida por filtrao e a fibra solvel precipitada por adio
de etanol a 78% e depois recolhida por filtrao. Este resduo lavado com
etanol e acetona, seco na estufa e pesado. De seguida analisado para
verificar da existncia de protena e cinzas [fibra = peso do resduo - (peso de
protenas + peso das cinzas)].
Para determinar os teores de fibra solvel e insolvel, depois do
tratamento com glucoamilase, filtra-se a mistura sobre Celite (ajuda a filtrao).
A fibra insolvel, retida no filtro, lavada com gua e o filtrado ser a fibra
solvel. Para a precipitar, adiciona-se etanol a 95% e gua. Aps filtrado, o
precipitado ser lavado com etanol a 78%.
No final, o resduo de fibra (total, insolvel ou solvel) lavado com
etanol a 95% e acetona, seco em estufa e pesado. O teor de fibra tem que ser
corrigido para a presena de protenas e minerais complexados com
constituintes das paredes celulares. Pode determinar-se o teor de amido
resistente suspendendo o resduo em KOH 2M. A base vai solubilizar o amido
resistente, o qual depois digerido com glucoamilase (aps ajuste do pH a um
valor entre 4.0 e 4.7). A glucose libertada determinada por via enzimtica ou
colorimtrica.
Durante todo este procedimento experimental, necessrio preparar
brancos dos reagentes em duplicado, de modo a efectuar os clculos (Fig. 9.8).

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 9.8 Determinao dos teores de fibra total, insolvel e


solvel.
B=

R1 R2
2P A

(9.1)

R1 R2
P A B
2
%Fibra =
x 100
m1 m2
2

(9.2)

Nas equaes 9.1 e 9.2, B o valor do branco, P o da protena, A o das


cinzas, m1 e m2 so os pesos das amostras em duplicado e R1 e R2 os pesos dos
resduos, tambm em duplicado. A fibra total igual soma da fibra insolvel
com a fibra solvel.
A fibra total tambm pode ser determinada directamente por pesagem do
produto de digesto com glucoamilase, aps adio de etanol a 95%, aquecido
a 60 C e seguindo o procedimento usado para determinao da fibra solvel.
Nos mtodos qumicos, o teor em fibra dado pela soma de todos os
monossacridos no provenientes do amido mais a lenhina. Os monossacridos
podem ser medidos por mtodos colorimtricos ou cromatogrficos (HPLC, GC).
A soma das hexoses, pentoses e cidos urnicos d o teor total em
polissacridos.
O principal mtodo qumico para determinao de fibra o mtodo
Englyst-Cummings, no qual o amido gelatinizado e digerido por enzimas. Os
restantes polissacridos so hidrolisados com cido sulfrico. Os acares
neutros so determinados por cromatografia e os cidos urnicos por
colorimetria. Em alternativa, todos os monossacridos podem ser medidos por
colorimetria.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

No mtodo Englyst-Cummings, as amostras so misturadas com DMSO e


aquecidas em gua a ferver, de modo a gelatinizar o amido. O amido ser
digerido com pululanase e a protena com pancreatina. A digesto do amido
ser completada pela adio de glucoamilase. A fibra ser precipitada pela
adio de etanol a 100% seguida de refrigerao. Por centrifugao separa-se
o resduo de fibra. Segue-se a lavagem da fibra com, sucessivamente, etanol, a
85% (2 vezes), etanol a 100% e acetona, em cada caso seguida de
centrifugao. O resduo final seco e os polissacridos presentes so
hidrolisados por incubao em H2SO4 concentrado a 35 C, posteriormente
diludo para 2 M e a mistura aquecida em gua a ferver durante 1 h. A fraco
hidrolisada usada para anlise de acares, uma parte para determinao
cromatogrfica dos acares neutros e a restante para determinao de cido
urnico por colorimetria. O peso de fibra dado pela soma dos acares
neutros com o cido urnico.
Estes mtodos so usados para determinar teores de fibra total. Quando
se pretende determinar o teor de fibra insolvel, substitui-se o etanol absoluto
por um tampo de pH 7 e a fibra hidrossolvel extrada por aquecimento,
durante 30 min, da mistura digerida em gua a ferver. A fibra insolvel
separada por centrifugao, lavada, seca e hidrolisada com cido. O teor em
fibra solvel ser obtido por subtraco do teor de fibra insolvel da fibra total
(fibra solvel = fibra total fibra insolvel).
possvel determinar o teor em celulose na fibra total se no se efectuar
o passo de hidrlise com H2SO4 concentrado, passando directamente para a
hidrlise dos restantes polissacridos com H2SO4 2 M. O peso dos
monossacridos resultantes desta hidrlise igual ao peso dos polissacridos
no celulsicos e o teor em celulose dado por fibra total polissacridos no
celulsicos.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Captulo 10
gua

gua a molcula mais abundante na superfcie terrestre e o

principal constituinte de muitos alimentos. Influencia directamente a sua


degradao e a sua textura. o meio em que ocorrem diversas reaces
qumicas e um reagente nos processos hidrolticos. uma estrutura molecular
simples. Cada tomo de hidrognio est ligado covalentemente ao tomo de
oxignio atravs de um par de electres partilhados. O oxignio possui ainda
um outro par de electres no partilhados.
A gua uma molcula polar, ou seja possui uma distribuio desigual da
sua densidade electrnica. A molcula possui uma carga negativa parcial (-)
perto do tomo de oxignio, devida a um par de electres no partilhados e
cargas positivas parciais (+) junto dos tomos de hidrognio.

Fig. 10.1 Representao esquemtica do dipolo formado por


uma molcula de gua.
A molcula da gua possui uma estrutura tetradrica ligeiramente
deformada. Cada molcula de gua est coordenada com quatro outras
molculas de gua atravs de ligaes de hidrognio.
A estrutura da gua desestabilizada pela solubilizao de sais ou
molculas com grupos polares e/ou hidrofbicos.
Esta estrutura tridimensional fortemente organizada est na base de
muitas das propriedades invulgares da gua, tais como a sua grande
estabilidade e elevados pontos de fuso e ebulio.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

A molcula de gua pode sofrer uma auto-ionizao, com a formao dos


ies H3O+ e OH-.
2H2O H3O+ + OH-

(10.1)

Fig. 10.2 Estrutura tetradrica de molculas de gua, ligadas


por pontes de hidrognio.
Sendo um processo reversvel, pode definir-se uma constante de
equilbrio, K w.
H3O+ OH -
K
H 2O
'
w

(10.2)

Como [H2O] constante, pode escrever-se Kw=[H3O+][OH-]=10-14. Daqui


deriva o conceito de pH=-log[H3O+].
A gua afecta a conservabilidade dos alimentos, no devido ao seu teor
mas sim sua actividade. A actividade da gua (aw) define-se como a presso
de vapor da gua acima de uma dada substncia dividida pela presso de vapor
da gua pura, mesma temperatura e varia entre 0 e 1.
aw

P
P0

(10.3)

Na prtica, a actividade da gua descreve a quantidade de gua em


equilbrio disponvel para a hidratao de uma dada substncia. Um valor igual
a 0 indica a total ausncia de molculas de gua livre disponveis, enquanto que
um valor de 1 indica gua pura.
A relao entre o teor de gua e a actividade da gua indicada pelas
isotermas de soro da substncia. Estas apresentam uma forma sigmide, com

71

Introduo Qumica Alimentar

2009

pequenas variaes conforme a estrutura fsica, a composio qumica, a


temperatura e a capacidade de reteno de gua do alimento. Quando
aw < 0.3, estamos na zona de absoro primria, onde as molculas de gua
podero estar ligadas a pontos de absoro primrios (-COOH) que por sua vez
se ligam a outras molculas de gua por pontes de hidrognio. Para valores de
aw entre 0.4 e 0.8, existe a possibilidade de reaces qumicas e enzimticas
rpidas, devido ao aumento da concentrao dos reagentes. Nesta zona, o
crescimento de microrganismos nulo ou muito rduzido. Acima de 0.9, as
reaces qumicas e enzimticas podem ver a sua velocidade reduzida pela
baixa concentrao dos reagentes e havero condies para crescimento
microbiano.

Fig. 10.3 Isotermas de soro, mostrando as trs diferentes


zonas.
O teor de humidade nos alimentos apresenta grandes variaes,
dependendo do alimento. Em funo dessa variedade, so tambm vrios os
mtodos disponveis para a sua determinao. Dependendo da forma em que a
gua se encontra no alimento (livre, adsorvida ou gua de hidratao) o
mtodo escolhido poder medir mais ou menos da humidade presente.
Durante a preparao duma amostra para determinao do seu teor em
humidade, ser necessrio minimizar percas ou ganhos de humidade
acidentais: reduzindo a exposio atmosfrica; minimizando aquecimento por
frico durante a triturao da amostra; reduzindo o volume do espao de
cabea no recipiente de armazenamento, para minimizar as percas por
equilbrio da humidade com o ambiente; reduzindo variaes de temperatura.
Os mtodos mais simples para determinao do teor de humidade
baseiam-se na secagem em estufa e medio da perca de peso. Nestes

72

Introduo Qumica Alimentar

2009

mtodos, a quantidade de humidade medida depende do tipo de estufa usada,


das condies no interior da estufa, do tempo e da temperatura de secagem.
Estes mtodos tm por base o ponto de ebulio da gua que inferior aos da
generalidade dos outros componentes alimentares. No entanto, alguns desses
componentes degradam a 100 C, como o caso dos hidratos de carbono,
libertando gua (10.4). A gua determinada nestes casos ser sobreavaliada
relativamente ao verdadeiro valor.
C6H12O6 6C + 6H2O

(10.4)

Outras reaces, como por exemplo a hidrlise da sacarose (10.5), reduzem o


teor de humidade medido.
Sacarose + H2O Glucose + Frutose

(10.5)

Outros problemas, embora menos srios, resultam da perca de componentes


volteis, contribuindo para a perca de peso da amostra. Por outro lado, pode
ocorrer ganho de peso devido oxidao de cidos gordos insaturados e de
outros compostos.
Existem trs tipos de estufas usadas para determinao do teor de
humidade, estufas de conveco, com ventilao forada e de vcuo. As
estufas de conveco so as menos precisas, j que podem existir variaes de
temperatura no seu interior de ~10 C. Nas estufas de ventilao forada essa
variao inferior a 1 C. As estufas de vcuo tm pequenas variaes de
temperatura no seu interior e a vantagem de eliminar a humidade interior.
Fazendo a secagem sob presso reduzida, possvel obter, num prazo mais
curto, uma mais completa remoo de gua e volteis sem decomposio da
amostra.
Os recipientes utilizados para secagem de amostras so de diversas
formas e materiais, podendo ter tampa ou no. As tampas impedem a perca de
material durante o aquecimento. Sempre que possvel, aconselhvel o uso de
material descartvel. Estes recipientes devem ser sempre manipulados com o
auxlio de pinas, de modo a no deixar dedadas (iriam influir no peso) e
devem ser sempre bem secos em estufa antes de serem utilizados.

73

Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 10.4 Estufa de vcuo, utilizada na determinao de


humidade.
Alguns alimentos tendem a formar crostas ou a aglomerar quando secos,
conduzindo a resultados errados. Para impedir que tal suceda, mistura-se areia
seca e previamente pesada.
Usando estes mtodos, os teores de humidade e de slidos totais so
calculados por
%Humidade =

peso da amostra hmida - peso da amostra seca


x 100
peso da amostra hmida

%Slidos totais =

peso da amostra seca


x 100
peso da amostra hmida

(10.6)

(10.7)

As amostras so secas durante um dado perodo de tempo e depois


pesadas ou, em alternativa, so feitas secagens e pesagens sucessivas at
serem obtidas duas medidas seguidas idnticas.
A secagem por micro-ondas permite uma determinao rpida e precisa
do teor de humidade. Os modelos mais recentes permitem um controlo da
temperatura e alguns vm equipados com uma balana no interior, permitindo
seguir a perca de gua durante a secagem. Alguns equipamentos combinam a
secagem por micro-ondas com o efeito do vcuo, permitindo medies muito
rpidas. A amostra tem que ser uniforme e colcada no centro do aparelho de
modo a assegurar uma secagem uniforme e completa.

Fig. 10.5 Medidor de humidade por micro-ondas.


Uma alternativa para secagem rpida de alimentos a secagem por
radiao infra-vermelha.
O teor de humidade em alimentos pode ser determinado por destilao,
usando tcnicas directas ou por refluxo. A humidade de um alimento

74

Introduo Qumica Alimentar

2009

codestilada com um solvente de ponto de ebulio superior e que seja imiscvel


com a gua.
Os mtodos por destilao provocam menor degradao trmica dos
alimentos do que a secagem em estufa a temperaturas mais elevadas. A
destilao por refluxo mais utilizada que a destilao directa.
A destilao por refluxo usa um solvente menos denso que a gua (o mais
utilizado o tolueno). O aquecimento leva formao de uma emulso, na
forma de vapor, de gua em tolueno. Quando o vapor sobe, d-se condensao
e a inverso da emulso, com tolueno disperso na gua. Ao arrefecer, a
turvao vai desaparecendo lentamente. O processo repetido at no se
conseguir destilar mais gua e o volume desta medido.

Fig. 10.6 Montagem para destilao por refluxo da humidade de


um alimento.
O mtodo de Karl Fischer um processo qumico para determinao do
teor de humidade, particularmente adaptado a alimentos que produzem
resultados de m qualidade quando aquecidos ou submetidos a vcuo. Este
mtodo tem por base a reaco de reduo de iodo por SO2 na presena de
gua.
2H2O + SO2 + I2 C5H2SO4 + 2HI

(10.8)

O mtodo foi modificado de modo a incluir metanol e piridina num sistema


que permita a dissoluo do iodo e SO2:
C5H5N.I2 + C5H5N.SO2 + C5H5N + H2O 2C5H5N.HI + C5H5N.SO3

75

(10.9)

Introduo Qumica Alimentar

C5H5N.SO3 + CH3OH C5H5N(H)SO4.CH3

2009

(10.10)

O I2 em excesso que no reage com a gua pode ser visualmente


determinado. O ponto de viragem vermelho-acastanhado e pode tambm ser
determinado, com maiores sensibilidade e rigor, por potenciometria.

Fig. 10.7 Titulador de Karl Fischer para determinao do teor de


humidade.
No mtodo de Karl Fischer, adiciona-se directamente o reagente de Karl
Fischer (KFR) se a humidade na amostra estiver acessvel. No caso de no estar
acessvel, necessrio extra-la primeiro com um solvente apropriado (metanol,
). Esse extracto ser depois titulado com o reagente de Karl Fischer.
Antes de efectuar o clculo do teor de humidade numa amostra,
necessrio determinar a equivalncia de humidade no reagente de Karl Fischer
(KFReq). Este valor representa a quantidade equivalente de humidade que reage
com 1 mL de reagente de Karl Fischer. Como o valor de KFReq varia com o
tempo, a padronizao ter que ser verificada antes de cada utilizao. O valor
de KFReq pode ser determinado com padres de gua, gua em metanol ou
tartarato de sdio. Com tartarato de sdio, o valor de KFReq dado por:

KFReq =

36 g H 2O/mol Na 2C4 H 4 O6 2H 2O x S x 1000


230.08 g/mol x A

(10.11)

em que S o peso do tartarato de sdio e A o volume de reagente necessrio


para a titulao do tartarato de sdio.
Uma vez conhecido o valor de KFReq, determina-se o teor de humidade
usando a equao 10.12:

76

Introduo Qumica Alimentar

%H 2O =

KFR eq x K s
S

2009

(10.12)

x 100

em que Ks o volume de reagente usado para titular a amostra e S o peso da


amostra.
O teor de humidade em alimentos pode ainda ser determinado atravs de
mtodos fsicos, como sejam os mtodos electroqumicos, a hidrometria, a
refractometria, a espectrometria de IV e a medio do ponto de congelao.
Os mtodos electroqumicos baseiam-se na medida da constante
dieltrica, que mais elevada na gua que na maioria dos outros solventes e
na medida da condutividade, que aumenta com o teor de humidade na
amostra. Nestes mtodos h necessidade de calibrar os instrumentos com
padres.
Em alimentos que contenham mais de 30 35 % de humidade no
possvel utilizar mtodos electroqumicos.
A hidrometria mede a densidade com picnmetros, hidrmetros ou a
balana de Westphal.
A refractometria usada para medir teores de humidade em produtos
lquidos ricos em acar e em leite condensado. Como todos os compostos
possuem um ndice de refraco, a refractometria pode ser usada para
identificao de compostos, comparando o valor medido com os da literatura. O
ndice de refraco varia com a concentrao do composto, permitindo calcular
teores de humidade, mas tambm com a temperatura e o comprimento de
onda, pelo que se ter que trabalhar em condies controladas.
A utilizao da espectrometria de IV na determinao do teor de
humidade baseia-se na existncia de bandas de absoro a 1400 1450 nm e
1920 1950 nm, caractersticas do estiramento dos OH da gua.
O ponto de congelao da gua utilizado para determinar o teor de
humidade no leite. Este valor varia entre -0.503 C e -0.541 C, sendo a mdia
-0.517 C. A determinao do ponto de congelao permite identificar
adulteraes por adio de gua e feita atravs da frmula seguinte, em que
T o ponto de congelao da amostra:
%H 2O adicionada =

0.517 - T
x 100
0.517

(10.13)

No caso de se pretender determinar se um alimento perecvel, a


medio do teor de humidade no d uma boa indicao, pois a gua associa-

77

Introduo Qumica Alimentar

2009

-se de diferentes formas com os alimentos. A gua mais fortemente ligada no


est disponvel para o crescimento microbiano, ao contrrio da menos ligada. O
clculo da actividade da gua (aw) uma melhor indicao dessa
disponibilidade da gua para crescimento microbiano.

78

Introduo Qumica Alimentar

2009

Captulo 11
Vitaminas e minerais

As

vitaminas

so compostos

orgnicos

existentes em pequenas

quantidades nos alimentos, mas essenciais como nutrientes. So habitualmente


separadas em lipossolveis (A, D, E e K) e hidrossolveis. No ser humano so
encontradas as 4 lipossolveis e 9 hidrossolveis (8 vitaminas B e vitamina C).
Tabela 11.1
Nome genrico
Vitamina A

Designao qumica
Retinides (retinol, retinides, carotenides)

Vitamina B1

Tiamina

Vitamina B2

Riboflavina

Vitamina B3

Niacina, niacinamida

Vitamina B5

cido pantotnico

Vitamina B6

Piridoxina, piridoxamina, piridoxal

Vitamina B7

Biotina

Vitamina B9

Vitamina C

cido flico, cido folnico


Cianocobalamina, hidroxicobalamina,
metilcobalamina
cido ascrbico

Vitamina D

Ergocalciferol, colecalciferol

Vitamina E

Tocoferis, tocotrienis

Vitamina K

Filoquinona, menaquinonas

Vitamina B12

Designa-se por vitamina um composto que no sintetizado em suficiente


quantidade pelo organismo, tendo que ser obtido atravs da alimentao.
As vitaminas so classificadas quanto s suas actividades biolgica e
qumica, no quanto sua estrutura. Por exemplo, o termo vitamina A usado
para designar os compostos retinal, retinol e diversos carotenides.
As vitaminas possuem diversas funes bioqumicas, incluindo hormonal
(ex. vitamina D), antioxidante (ex. vitamina E) e reguladora (ex. vitamina A). a
maioria das vitaminas (ex. complexo B) funciona como precursores de

79

Introduo Qumica Alimentar

2009

coenzimas, participando no metabolismo. Nalguns casos (ex. biotina), as


prprias vitaminas funcionam como coenzimas, caso do cido flico.
H3C

CH3

CH3

CH3
Retinol

OH
CH3

H3C

CH3

CH3

CH3
Retinal

O
CH3

H3C

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3

-Caroteno

CH3

CH3

H3C

CH3

Fig. 11.1 Trs dos compostos habitualmente designados por


vitamina A.
Os teores em vitaminas podem ser determinados segundo trs
estratgias: ensaios biolgicos em seres humanos e animais, ensaios
microbiolgicos e ensaios fsico-qumicos.
Os ensaios biolgicos apenas sero utilizados se no existir uma outra
alternativa.
Como algumas vitaminas so sensveis luz, ao oxignio, ao calor e a
alteraes de pH, devero ser tidas precaues adequadas na preparao e
armazenamento das amostras.
Em geral, os mtodos de anlise de vitaminas requerem a sua prvia
extraco do alimento. Os mtodos de extraco so quase sempre especficos
para cada vitamina e envolvem tratamentos com cidos, bases, solventes,
enzimas ou aplicao de calor. Em particular, para:

cido ascrbico extraco a frio com cido metafosfrico/cido


actico;
vitaminas B1 e B2 ebulio (ou autoclave) em cido seguida de
tratamento enzimtico;
niacina aquecimento em autoclave em cido (produtos no
derivados de cereais) ou em base (cereais);
vitaminas A, E ou D extraco em solvente orgnico,
saponificao e nova extraco com solvente orgnico. Adicionam-se antioxidantes, para impedir oxidaes.

80

Introduo Qumica Alimentar

2009

A anlise das vitaminas lipossolveis pode exigir a sua saponificao.


Os ensaios microbiolgicos esto limitados s vitaminas hidrossolveis. O
crescimento de um dado microrganismo numa amostra contendo a vitamina a
analisar comparado com o seu crescimento em meio contendo quantidades
conhecidas dessa vitamina. O crescimento pode ser medido em termos de
turbidez, produo de cido, gravimetria ou respirao. Existem mtodos
microbiolgicos oficiais para anlise de niacina e folato.
Os mtodos qumicos permitem analisar um maior nmero de vitaminas:
A, E, C, B1 e B2.
A vitamina A sensvel radiao UV, ar e outros agentes oxidantes,
temperaturas elevadas e humidade, pelo que necessrio trabalhar com
equipamento adequado, sob condies no oxidantes e a temperatura
controlada. O nico mtodo considerado rigoroso para determinao de
vitamina A a cromatografia lquida (HPLC).
A amostra primeiro saponificada (aps adio de pirogalol, que vai servir
de antioxidante) depois a vitamina A extrada com um solvente orgnico e
concentrada, seguindo-se a determinao por HPLC. A cromatografia permite
separar os ismeros trans-retinol e cis-retinol e as respectivas determinaes
so feitas a partir das equaes abaixo.

AT
x WT x DF
AST
trans-retinol =
V

(11.1)

AC
x WC x DF
ASC
cis-retinol =
V

(11.2)

AT a rea do pico de trans-retinol na amostra, AC a rea do pico de cisretinol na amostra, AST e ASC as reas dos picos dos padres de trans e cisretinol, respectivamente, WT e WC os pesos de amostra, DF o factor de diluio
e V o volume da amostra.
A vitamina E encontra-se nos alimentos sob oito formas diferentes, os
tocoferis , , e e os quatro tocotrienis correspondentes (, , e ).
A anlise de vitamina E feita em HPLC de fase normal, com deteco por
fluorescncia, com excitao a 290 nm e leitura da emisso a 330 nm.
Dependendo da origem da amostra, os procedimentos analticos diferem,
fazendo-se, para a generalidade dos alimentos, uma saponificao sob refluxo,
na presena de pirogalol, seguida por uma extraco com hexano e injeco no

81

Introduo Qumica Alimentar

2009

cromatgrafo. No caso de margarinas e outras gorduras vegetais slidas,


dissolve-se a amostra em hexano, adiciona-se MgSO4 para remover a gua,
filtra-se e injecta-se o filtrado em HPLC. Os leos so dissolvidos em hexano e
directamente injectados no HPLC.

Fig. 11.2 As oito formas de vitamina E encontradas nos


alimentos.
A quantificao da vitamina E feita recorrendo ao mtodo do padro
externo.
A vitamina C (cido L-ascrbico e cido L-dehidroascrbico) muito
susceptvel a degradao oxidativa, sobretudo a pH elevado e na presena de
Fe3+ e Cu2+. Deste modo, a sua anlise dever realizar-se a baixo pH e na
presena de um agente quelante. A oxidao suave do cido ascrbico resulta
na formao de cido dehidroascrbico, o qual pode ser reconvertido em cido
ascrbico por reaco com agentes redutores.
A determinao de vitamina C pode ser feita por dois mtodos diferentes,
um titrimtrico e outro com anlise por espectroscopia de fluorescncia.
No mtodo titrimtrico, o cido ascrbico oxidado a cido
dehidroascrbico por um indicador corado. No final da titulao, o indicador em
excesso rosado em meio cido e poder ser quantificado por absoro
electrnica a 545 nm. O clculo do teor em cido ascrbico (mg por g ou mL de
amostra) feito usando a equao 11.3, em que C o peso de cido ascrbico
por mL de indicador, V o volume de indicador usado para titular a amostra
diluda, DF o factor de diluio e WT o peso da amostra.
teor em cido ascrbico = C x V x

DF
WT

82

(11.3)

Introduo Qumica Alimentar

2009

O mtodo microfluorimtrico mede tanto o cido ascrbico como o cido


dehidroascrbico. Aps oxidao do cido ascrbico a cido dehidroascrbico,
faz-se reagir este com o-fenilenodiamina, formando um composto fluorescente,
o qual medido com excitao a 356 nm e emisso a 440 nm. Para compensar
a possvel existncia de interferentes necessrio preparar um branco com
cido brico antes da adio da soluo de o-fenilenodiamina.
O clculo do teor em cido ascrbico (mg por g ou mL) dado pela
equao 11.4, em que A e C so as intensidades de fluorescncia da amostra e
do padro, respectivamente, B e D so as intensidades de fluorescncia dos
brancos da amostra e do padro, respectivamente, S a concentrao do
padro, DF o factor de diluio e WT o peso da amostra.
teor em cido ascrbico =

A B
DF
xS x
CD
WT

(11.4)

A medio do teor em vitamina B1 baseia-se na medida da fluorescncia


da sua forma oxidada, o tiocromo. Como o tiocromo sensvel luz, todos os
passos a seguir oxidao devem ser feitos ao abrigo da luz forte. A prpria
tiamina (vitamina B1) sensvel ao calor, sobretudo em meio alcalino, pelo que
o procedimento deve ser efectuado com rapidez.
A tiamina oxidada por K2Fe(CN)6 e a leitura do tiocromo feita com
excitao a 365 nm e emisso a 435 nm. preparado um branco para corrigir
para a presena de interferentes e a quantificao feita com recurso a
padres da vitamina, usando a frmula seguinte:

teor em tiamina =

S - Sb
C 25 V
x x x o
Std - Std b
A Vp WT

(11.5)

S e Sb so as intensidades de fluorescncia da amostra e do branco da amostra,


respectivamente, Std e Stdb so as intensidades de fluorescncia do padro e
do branco do padro, respectivamente, C a concentrao do padro, A o
volume da alquota usada, 25 o volume final eludo, Vp o volume que atravessa
a coluna cromatogrfica, Vo, o volume de diluio da amostra original e WT o
peso da amostra. O teor em vitamina B1 expresso em mg/g.
A determinao da vitamina B2 (riboflavina) segue tambm um mtodo
fluorimtrico. A riboflavina oxidada por KMnO4 e o produto formado
doseado por fluorescncia, com excitao a 440 nm e leitura de emisso a
565 nm. necessrio ter ateno sensibilidade da vitamina B2 radiao UV.
Para calcular o teor em riboflavina (mg/g) usa-se a frmula:
teor em riboflavina =

A-C
CS
DF
x
x
B -A
V
WT

83

(11.6)

Introduo Qumica Alimentar

2009

A e C so as intensidades de fluorescncia da amostra contendo gua e


hidrossulfito de sdio (redutor), respectivamente, B a intensidade de
fluorescncia da amostra contendo o padro da vitamina, CS a concentrao do
padro, V o volume da amostra usada na medida de fluorescncia, DF o factor
de diluio e WT o peso da amostra.

Os

minerais so os constituintes que permanecem, sob a forma de

cinzas, aps a combusto de tecidos vegetais e animais. Podem ser divididos


em elementos essenciais, microelementos e ultra-microelementos. Os
elementos essenciais so Na, K, Ca, Mg, Cl e P e possuem essa designao
devido a serem necessrios na dieta humana em teores superiores a 50 mg/dia.
Os microelementos (Fe, I, F, Zn, Se, Cu, Mn, Cr, Mo, Co, Ni) so necessrios
em concentraes inferiores a 50 mg/dia. O seu papel biolgico variado (em
vitaminas, enzimas e outras protenas) e a sua deficincia resulta em problemas
metablicos.
A deficincia nos elementos Al, As, Ba, Bi, B, Br, Cd, Cs, Ge, Hg, Li, Pb,
Rb, Sb, Si, Sm, Sn, Sr, Tl, Ti e W parece estar associada a alguns problemas de
sade, mas no estando completamente estabelecidas relaes causa/efeito
nem as dosagens requeridas, sabendo-se apenas serem muito baixas.
Os elementos essenciais e os microelementos exibem diversas actividades,
como sejam elctrlitos, constituintes de enzimas e constituintes estruturais de
ossos e dentes.
Os teores em minerais nos alimentos variam durante o seu processamento
e a sua absoro pelo organismo depende da presena de outros compostos
(protenas, pptidos, aminocidos, polissacridos, acares, lenhina, fitina e
cidos orgnicos) que a eles se ligam, aumentando ou reduzindo a sua
absoro.
A anlise de minerais em alimentos pode ser feita por diversos processos,
sendo em geral necessrio extrair os minerais previamente da amostra. Um dos
principais problemas existentes, na preparao de uma amostra para anlise de
minerais, a existncia de contaminao causada pelo equipamento, pelo que
devero, sempre que possvel, ser utilizados materiais no metlicos.
O ligando etilenodiaminatetraacetato (EDTA) forma complexos com
diversos ies minerais, permitindo a sua utilizao em titulaes
complexomtricas para anlise de minerais. Os pontos finais das titulaes
podem ser determinados usando outros quelantes, com constantes de

84

Introduo Qumica Alimentar

2009

coordenao menores que o EDTA (menor afinidade para os ies) e que


originam cores diferentes nos estados livre e complexado.

Fig. 11.3 Complexo formado entre Ca2+ e EDTA.


A principal aplicao deste mtodo na anlise de clcio e magnsio para
determinao da dureza da gua, mas tambm utilizado para determinar o
teor de clcio em vegetais e outros alimentos em que os teores de magnsio e
fsforo so baixos.
A titulao por precipitao est na origem de mtodos utilizados pela
indstria alimentar na determinao de minerais.
O mtodo de Mohr para determinao de cloretos um deles e baseia-se
na formao de um slido de cor laranja (cromato de prata) aps o io prata,
proveniente do nitrato de prata adicionado, ter complexado todo o cloreto
disponvel.
Ag+ + Cl- AgCl
2-

2Ag+ + CrO4 Ag2CrO4

(11.7)
(11.8)

Fig. 11.4 Mtodo de Mohr. Titulao antes (esquerda) e aps


(direita) a formao do precipitado.
Uma das aplicaes do mtodo de Mohr na determinao de sal em
alimentos.

85

Introduo Qumica Alimentar

2009

No mtodo de Volhard, um excesso de uma soluo padro de nitrato de


prata adicionada a uma soluo de uma amostra contendo cloreto. O excesso
de prata depois titulado com uma soluo padro de tiocianato de potssio ou
amnio, usando Fe3+ como indicador. FeSCN vermelho, permitindo identificar
a existncia de SCN- no ligado a Ag+. A quantidade de prata, que precipita
com o cloreto presente na soluo da amostra, calculada por subtraco do
excesso de prata do total originalmente adicionado.
Ag+ + Cl- AgCl

(11.9)

Ag+ + SCN- AgSCN

(11.10)

SCN- + Fe3+ FeSCN

(11.11)

A reaco 11.10 permite determinar a quantidade de prata no


complexada com o cloreto.
Os mtodos colorimtricos utilizam compostos que, aps reaco com a
substncia a determinar, formam produtos coloridos. Existem vrios destes
compostos capazes de reagir selectivamente com diversos minerais. O produto
de reaco colorido solvel e pode ser quantificado por espectroscopia de
absoro electrnica, utilizando a lei de Lambert-Beer. A quantificao
habitualmente efectuada com recurso a uma curva de calibrao feita com
padres.
De modo a ter o mineral livre de interferentes, necessrio proceder a
uma prvia incinerao da amostra, obtendo assim as suas cinzas, a partir das
quais se solubiliza o mineral a determinar.
Os mtodos colorimtricos so geralmente muito especficos, podendo ser
executados sem separao dos diversos minerais existentes nas cinzas e, em
muitos casos, permitem obter uma preciso semelhante da absoro atmica.
Foram desenvolvidos diversos elctrodos para medidas selectivas de
vrios anies e caties (brometo, clcio, cloreto, fluoreto, potssio, sdio e
sulfito). Estes elctrodos selectivos de ies permitem determinar a actividade
inica, a qual pode ser considerada prxima da concentrao dos ies medidos.
Esta aproximao s vlida em condies de baixas concentraes e fora
inica controlada.
A relao entre a actividade inica e a concentrao dada por

A = C

(11.12)

86

Introduo Qumica Alimentar

2009

O coeficiente de actividade () varia em funo da fora inica, o que justifica a


utilizao de tampes para ajuste da fora inica nas amostras e nos padres.
A eficcia destes elctrodos afectada pela presena de interferentes,
sobretudo por ies com carga e tamanho semelhantes aos que se pretende
determinar. Como tambm a temperatura afecta a resposta dos elctrodos,
necessrio trabalhar a temperatura constante.
A concentrao do io de interesse pode ser calculada atravs de uma
curva de calibrao, da adio de um padro ou por determinao do ponto
final de uma titulao. O mtodo de adio de padro usado quando existe
um nmero pequeno de amostras, no permitindo o desenvolvimento de uma
curva de calibrao. Os elctrodos selectivos podem ser usados para determinar
o ponto final de uma titulao, usando compostos que formam precipitados ou
complexos fortes com o io a analisar.
Define-se como cinza o resduo inorgnico que resulta da combusto ou
total oxidao da matria orgnica de um alimento. Existem dois tipos de
procedimentos para anlise de cinzas, o mtodo das cinzas secas, usado
sobretudo para determinao do teor em cinzas e anlise de alguns minerais
especficos e o mtodo das cinzas hmidas (oxidao) que serve de preparao
para a anlise de diversos minerais. Os alimentos secos no requerem qualquer
preparao prvia, mas os restantes necessitam uma secagem antes da
obteno das suas cinzas. Os alimentos ricos em gordura podero ter que
sofrer uma prvia extraco de lpidos, para alm da secagem.
As cinzas secas so obtidas numa mufla capaz de atingir 500 600 C. A
gua e os compostos volteis so vaporizados e os compostos orgnicos
degradados, na presena de oxignio do ar, a CO2 e xidos de azoto. A maioria
dos minerais convertida em xidos, sulfatos, fosfatos, cloretos e silicatos.
Alguns elementos (Fe, Se, Pb e Hg) podem ser parcialmente volatilizados, pelo
que este mtodo no adequado se se pretende analisar os componentes
individuais de uma amostra.
Para determinar a composio mineral de um alimento recorre-se ao
mtodo das cinzas hmidas. Neste mtodo, as substncias orgnicas so
oxidadas por cidos, agentes oxidantes ou combinaes de ambos. Os minerais
so solubilizados sem volatilizao.
As amostras podem provir de outras determinaes que necessitam de
usar material seco. A maioria do material vegetal dever ser seco em duas
etapas, primeiro a 55 C e depois a uma temperatura superior, de modo a
impedir a interferncia da lenhina. Se as amostras vegetais tiverem um teor de
humidade inferior a 15% no necessrio sec-las previamente.

87

Introduo Qumica Alimentar

2009

Alguns alimentos requerem tratamentos adicionais, antes da obteno das


cinzas, devido a terem elevados teores de gordura ou humidade (salpicos,
dilatao) ou acares (formao de espuma) o que impede a perca de
amostra. Carnes, acares e compotas devero ser secos num banho de vapor
ou com uma lmpada de infra-vermelhos. Adicionam-se uma ou duas gostas de
azeite (que no produz cinzas) para permitir a sada de vapor medida que se
vai formando uma crosta na amostra.
As cinzas secas so obtidas por incinerao a 525 C ou mais, existindo
diversos tipos de recipientes para o efeito. A escolha do material de que estes
so feitos depende da natureza da amostra. Os de quartzo so resistentes a
cidos e halogneos, mas no a bases, a temperaturas elevadas. Os de Vycor
so estveis a 900 C, mas os de Pyrex apenas at 500 C. Recipientes de
porcelana possuem propriedades semelhantes s dos de quartzo, mas tendem
a quebrar com variaes bruscas de temperatura. Devido ao seu baixo preo,
so frequentemente os escolhidos. Os recipientes de ao so resistentes a
cidos e a bases e so baratos, mas podem originar contaminaes com crmio
e nquel. A platina provavelmente o melhor material, mas muito cara.
Existem tambm recipientes descartveis, de fibra de quartzo, os quais
suportam temperaturas at 1000 C e, sendo porosos, permitem rpidos
aquecimento e arrefecimento.
Aps incinerao, os recipientes devem ser arrefecidos num exsicador,
antes de pesados. O teor em cinzas ser calculado a partir de:

% cinza =

peso aps incinerao - peso do cadinho


x 100
peso da amostra x coeficiente de matria seca

(11.13)

em que:

coeficiente de matria seca =

% slidos
100

(11.14)

No mtodo das cinzas hmidas, no existe um nico cido capaz de,


completa e rapidamente, oxidar um material orgnico. frequente utilizar
combinaes de cidos: ntrico, sulfrico/perxido de hidrognio, perclrico.
So usadas diferentes combinaes para diferentes tipos de amostra. Como o
cido perclrico, embora muito eficaz, de utilizao mais perigosa, existe uma
tendncia para substitu-lo.
Quer o mtodo das cinzas secas, quer o das cinzas hmidas podem ser
realizados em aparelhos de micro-ondas, reduzindo o tempo de preparao de
amostra a alguns minutos. A obteno de cinzas hmidas pode ser feita em
recipiente aberto ou fechado, sendo que neste ltimo podem ser aplicadas

88

Introduo Qumica Alimentar

2009

presso e temperatura elevadas, o que aumenta a eficcia do sistema.


Concretamente, pode ser utilizado apenas cido ntrico para a digesto,
tornando o processo mais seguro.
As muflas por micro-ondas, usadas para obteno de cinzas secas, so
muito mais rpidas que as muflas convencionais (at 97% mais rpidas) j que
conseguem operar a temperaturas at 1200 C.
Para alm das cinzas secas e hmidas, existem outros tipos de mtodos
com cinzas aplicveis anlise de alimentos:

cinzas solveis e insolveis, aplicadas a frutos;


cinzas insolveis em cido, para determinao de contaminantes
insolveis em cido;
alcalinidade das cinzas, para distinguir entre cinzas de frutos e
legumes (alcalinas) e de carnes e alguns cereais (cidas);
cinzas sulfatadas, aplicadas a acares, xaropes e corantes.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Captulo 12
Aditivos Alimentares

Aditivos

alimentares

so

substncias

adicionadas,

em

pequenas

quantidades, aos alimentos, intervindo na sua produo, processamento,


embalagem e/ou armazenamento. Habitualmente, os aditivos ou as substncias
resultantes da sua degradao permanecem nos alimentos, embora por vezes
sejam removidos durante o processamento.
Podem usar-se aditivos para:

alterar o valor nutritivo de um alimento vitaminas, minerais,


aminocidos e seus derivados, mas tambm espessantes,
emulsificantes, edulcorantes, etc. para certos tipos de dietas;
alterar as propriedades sensoriais de um alimento corantes,
aromatizantes e potenciadores de sabor so usados para corrigir
percas sensoriais durante o processamento e armazenamento dos
alimentos. Estabilizantes, antioxidantes e outros compostos
tambm podem ser usados para impedir essas percas;
aumentar o tempo de prateleira de um alimento aditivos para
proteger contra a degradao microbiana e agentes que impedem
ou retardam alteraes qumicas ou fsicas, tais como reguladores
de pH e espessantes;
alterar o valor prtico de um alimento compostos usados para
permitir a produo de alimentos de preparao culinria mais fcil
e mais rpida.

Os aditivos alimentares e os seus produtos de degradao no podero


ser txicos nas concentraes em que so utilizados. A sua utilizao
regulamentada, embora essa regulamentao varie um pouco de pas para
pas. No entanto, h correntemente um esforo de harmonizao internacional,
baseada simultaneamente nos conhecimentos de toxicologia e nas
necessidades tecnolgicas modernas.
Na Europa, atribudo um n E aos aditivos alimentares aprovados. Essa
aprovao atribuda apenas aps uma avaliao da segurana do aditivo nas
condies de utilizao pretendidas.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

So apresentadas de seguida algumas das principais propriedades dos


aditivos alimentares.

12.1 Potenciadores de sabor


So compostos que intensificam o aroma de um alimento, embora eles
prprios no exibam aroma nem gosto, nas concentraes utilizadas. O seu
efeito intensificar e acelerar a percepo do aroma.
Encontram-se neste grupo aditivos como o glutamato monosdico e o
maltol.

12.2 Substitutos do acar


Encontram-se neste grupo as substncias que so usadas como
edulcorantes, mas que so metabolizados sem a influncia da insulina. Alguns
exemplos so os lcoois de acar ou poliis, sorbitol, xilitol e manitol.

12.3 Edulcorantes
So compostos naturais ou sintticos que transmitem uma sensao de
doura, possuindo pouco ou nenhum valor nutricional. No se incluem neste
grupo os hidratos de carbono.

12.4 Conservantes
So sobretudo compostos com actividade antimicrobiana, cujo uso se
destina a substituir ou complementar processos fsicos de eliminao da
microflora contaminante dos alimentos. Tem havido pouca evoluo nas
substncias utilizadas, pois difcil encontrar compostos simultaneamente com
largo espectro antimicrobiano, baixa toxicidade e custo razovel. A maioria
destes so cidos fracos, como os cidos srbico, benzico, propinico e actico
e seus derivados. Tambm utilizados para este efeito so o SO2 e os sulfitos,
nitritos e nitratos.

12.5 Antioxidantes
A oxidao lipdica pode ser retardada pela remoo do oxignio ou pela
adio de antioxidantes. Estes so, na maioria, compostos fenlicos (naturais
ou sintticos) e so mais eficazes se usados em simultneo com um agente
quelante. Os antioxidantes mais importantes so os tocoferis, steres do cido
ascrbico, steres do cido glico, BHT (butilhidroxitolueno) e BHA
(butilhidroxianisole). Os agentes quelantes contribuem para a estabilizao das

91

Introduo Qumica Alimentar

2009

cores, aromas e texturas, devido sua capacidade para se ligarem a ies


metlicos, os quais actuam como catalisadores da oxidao de gorduras.
Diversos constituintes dos alimentos possuem essa capacidade, tais como os
cidos carboxlicos e polifosfricos, os aminocidos, pptidos, protenas e
porfirinas.

12.6 Agentes tensioactivos


Os agentes tensioactivos, naturais e sintticos, so usados no
processamento de alimentos quando necessria a reduo da sua tenso
superficial, como por exemplo na produo e estabilizao de disperses. Estas
disperses incluem emulses, espumas, aerossis e suspenses. Em todos os
casos existem duas fases distintas, uma externa e contnua e outra interna e
descontnua, a fase dispersa.

12.7 Substitutos de gorduras


Compostos que se destinam a substituir as gorduras tradicionais, devido
ao elevado valor energtico destas. No entanto, nenhum dos substitutos
consegue preencher todas as funes das gorduras. Os substitutos podem ser
divididos em dois grupos, os naturais (mimticos das gorduras) e os sintticos
(substitutos das gorduras).
Reduzindo o tamanho de partcula das protenas a 0.1 3 m d-lhes
uma textura cremosa, permitindo a sua utilizao na substituio de gorduras
em alimentos que no requeiram exposio a temperaturas elevadas (gelados,
sobremesas, etc.).
Alguns oligossacridos, que se dissolvem completamente em gua quente,
podem ser obtidos a partir do amido. Aps arrefecimento destas solues,
obtm-se um gel, cuja textura semelhante dos leos alimentares, podendo
ser usados como substitutos da gordura em margarinas, por exemplo.

12.8 Espessantes, gelificantes e estabilizantes


Diversos polissacridos e seus derivados provocam um aumento de
viscosidade, a formao de gis e a estabilizao de emulses, espumas e
suspenses. Estes compostos tambm so inibidores da cristalizao (produtos
de confeitaria, gelados, etc.) e so usados para encapsular aromas, em
alimentos desidratados.
A gelatina uma protena com actividade gelificante, usada em diversos
alimentos.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

12.9 Humectantes
Alguns poliis, como o glicerol e o sorbitol, possuem propriedades
higroscpicas especficas, o que possibilita a sua utilizao como humectantes,
isto agentes que retm a textura e suavidade de um alimento, impedindo
tambm a cristalizao.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Captulo 13
Contaminantes Alimentares

Os

alimentos podem sofrer contaminao por compostos txicos de

diversas provenincias:

Poluentes derivados da queima de combustveis fsseis, de


radionucldeos ou de emisses originadas em processos industriais
(microelementos txicos, PAHs, dioxinas, etc.).
Componentes do material de embalagem, detergentes,
desinfectantes, etc.
Metabolitos txicos produzidos por microrganismos.
Resduos de produtos usados na proteco de culturas.
Resduos originados na criao de aves e de gado (medicamentos e
aditivos usados em raes).

Outros contaminantes podem ser formados no prprio alimento ou no


aparelho digestivo, devido a reaces de alguns ingredientes e aditivos
alimentares, caso das nitrosaminas.
Entre os contaminantes mais relevantes contam-se os microelementos
arsnico, mercrio, chumbo e cdmio. Relativamente aos radionucldeos, os
radioistopos 137Cs e 90Sr contam-se entre os mais perigosos.
A actividade txica microbiana atribuda s enterotoxinas produzidas por
bactrias. Estes compostos so maioritariamente protenas com actividade
antignica e muito venenosas. Contam-se entre estas as toxinas produzidas por
Clostridium botulinum, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus.
Tambm os fungos produzem toxinas alimentares, designadas por
micotoxinas. As mais estudadas e txicas so as aflatoxinas produzidas pelo
gnero Aspergillus spp. A aflatoxina B1 o mais forte carcinognico conhecido.
Estas toxinas provm principalmente dos frutos e frutos secos, sendo os
pistachios uma das fontes mais importantes.
Os produtos utilizados na proteco de culturas compreendem os
herbicidas, fungicidas e insecticidas, mas tambm outros pesticidas menos
frequentemente utilizados e ainda os reguladores do crescimento das plantas.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Os alimentos de origem vegetal podem ser directamente contaminados


devido ao tratamento das plantas ou por absoro a partir do solo, a partir da
atmosfera ou a partir de locais de armazenamento previamente tratados. Os
alimentos de origem animal so contaminados devido a ingesto, por parte do
animal, de alimentos contendo agentes de limpeza ou por contacto dos animais
com materiais tratados, com medicamentos ou por ingesto de raes contendo
material vegetal desinfectado.

Fig. 13.1 Estrutura da aflatoxina B1, produzida por Aspergillus


spp.
Diversos
medicamentos,
como
antibiticos,
antihelmnticos
e
coccidiostticos so habitualmente usados no tratamento de animais, podendo
esse uso resultar em contaminao alimentar.
Os bifenilos policlorados (PCBs) so misturas complexas de substncias
usadas em diversas indstrias que, devido sua ampla utilizao, entram em
contacto com os alimentos. Sendo muito persistentes e lipossolveis tendem a
acumular em alimentos gordos. Acresce que estes compostos podem produzir,
por combusto, dioxinas fortemente txicas. Devido a estes factos, a sua
produo e aplicao encontram-se interditas.
A queima de matria orgnica como madeira, leo ou carvo resulta em
reaces de pirlise e na formao de hidrocarbonetos policclicos aromticos
(PAHs), com efeito carcinognico. Estes compostos podem contaminar os
alimentos, quer atravs dos processos de preparao dos mesmos, quer
atravs de transporte pela atmosfera. Sendo compostos lipossolveis, tendem a
acumular em tecidos gordos.
O nitrato provm principalmente dos alimentos de origem vegetal, mas
tambm de alguma carne e peixe, enquanto que o nitrito originrio,
sobretudo, de carne e produtos crneos curados. A toxicidade do nitrato deriva
da sua oxidao a nitrito, causada por bactrias.
As nitrosaminas e nitrosamidas so potentes carcinognicos, provenientes
de alimentos curados ou sujeitos a temperaturas elevadas.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

As dioxinas, dibenzo-p-dioxinas policloradas e dibenzofuranos policlorados,


ocorrem associados a diversos produtos clorados e bromados. Tambm podem
ser formadas por processos trmicos, na presena de compostos halogenados.
So compostos que se concentram na fase gorda dos alimentos (ex. leite) e de
toxicidade varivel.
Existem diversos mtodos analticos para determinao de resduos de
pesticidas, podendo ser quantitativos (resduo nico ou multi-resduos), semi-quantitativos ou ainda qualitativos (Tabela 13.1).
Tabela 13.1
Quantitativo
Multi-resduos
Resduo nico

Semi-quantitativo ou qualitativo
TLC
Inibio enzimtica

GC
HPLC
GC
HPLC
Ensaios imunolgicos

Os mtodos multi-resduos so usados para detectar e medir diversos


resduos numa variedade de alimentos. So suficientemente rigorosos para
permitir boas estimativas de teores de resduos para muitos pesticidas, aos
nveis (ou mesmo abaixo) legalmente permitidos.
Estes mtodos utilizam passos de preparao da amostra, extraco,
eliminao de interferentes (cleanup), separao cromatogrfica e quantificao
com a ajuda de detectores muito selectivos. Nenhum destes mtodos capaz
de detectar todos os resduos de pesticidas em todos os tipos de plantas. Na
prtica, representam um compromisso entre o nmero de resduos que podem
ser detectados, a gama de alimentos em que podem ser empregues e os nveis
de resduos que podem ser medidos.
Os mtodos de resduo nico envolvem os mesmos passos que os para
multi-resduos, mas com cada passo optimizado para o resduo de interesse. O
seu objectivo medir um nico analito e, frequentemente, os seus principais
metabolitos e produtos de transformao com importncia toxicolgica.
Os mtodos quantitativos seguem os passos gerais de preparao da
amostra, extraco, eliminao de impurezas, separao, deteco e
quantificao. A escolha do mtodo a utilizar depende das propriedades da
amostra e do analito de interesse e dos equipamentos analticos disponveis.
conveniente dividir os alimentos em quatro grupos, segundo os seus teores em
gordura e humidade: 1) humidade elevada, gordura baixa (frutos e legumes);

96

Introduo Qumica Alimentar

2009

2) humidade e gordura elevadas (carnes); 3) humidade e gordura baixas


(frutos secos); 4) humidade baixa, gordura elevada (gros de cacau).
Os pesticidas encontram-se distribudos superfcie das plantas, de um
modo no uniforme. Os frutos e legumes frescos no devem ser lavados antes
da anlise e apenas devero ser removidas as partes externas danificadas.
Quando as partes externas dos vegetais no so habitualmente consumidas,
estas so removidas antes da anlise. Deve ter-se cuidado com alguns
pesticidas que podem ser degradados pela triturao ou pela macerao da
amostra, durante a sua preparao.
A extraco habitualmente feita com um solvente orgnico (acetonitrilo
ou acetona) sendo adicionado um sal anidro (NaCl ou Na2SO4) para absorver
gua. Noutros casos, pode ser adicionada uma pequena quantidade de gua
para facilitar a purificao do extracto numa subsequente partio contra outro
solvente orgnico. No final, o solvente separado da fraco slida por
filtrao.
O extracto obtido , frequentemente, submetido a uma purificao parcial
(cleanup) antes dos passos de separao e quantificao. Neste passo tenta
eliminar-se os interferentes, podendo usar-se mtodos cromatogrficos
(adsoro ou excluso molecular). Mais recentemente, foram introduzidas
tcnicas alternativas, com menor consumo de solventes e uma maior rapidez de
execuo. A extraco em fase slida (SPE) usa uma pequena quantidade de
um material de empacotamento, contido em pequenas colunas ou em discos, o
qual permite purificar, concentrar ou derivatizar os analitos antes do passo de
separao cromatogrfica. A microextraco em fase slida (SPME) envolve a
utilizao de uma fibra revestida com um polmero adsorvente, a qual imersa
num extracto aquoso ou colocada no espao de cabea de um recipiente
contendo a amostra, de modo que os analitos difundem para o revestimento da
fibra. Aps atingir o equilbrio, a fibra transferida para o injector de um GC e
os analitos sofrem uma desoro trmica para o interior da coluna. A extraco
com solvente assistida por micro-ondas tambm permite reduzir o tempo de
extraco e a quantidade de solvente utilizada. Tal deve-se utilizao de
temperaturas superiores aos pontos de ebulio dos solventes. A extraco
acelerada com solventes utiliza pequenas quantidades de solventes
convencionais a temperatura e/ou presso elevadas.
Por vezes til ou necessrio derivatizar os analitos para facilitar a sua
separao e deteco. Esta derivatizao habitualmente efectuada antes da
entrada na coluna cromatogrfica (derivatizao pr-coluna) mas pode tambm
ser feita aps sada da coluna (derivatizao ps-coluna). Esta tcnica tem

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Introduo Qumica Alimentar

2009

aplicao limitada aos mtodos de resduo nico ou queles que determinam


um pequeno grupo de resduos com estrutura qumica semelhante.
A cromatografia gasosa a tcnica mais utilizada para separao e
determinao de pesticidas. Existem processos descritos para colunas de
empacotamento e capilares, bem como para colunas megabore, as quais
possuem caractersticas intermdias entre as de empacotamento e as capilares.
A maioria dos pesticidas contm heterotomos (outros que no C, H e O) na
sua estrutura, o que explorado pelos detectores que respondem a esses
tomos: de chama (FID) para deteco de S e P, de captura electrnica (ECD)
e de condutividade para halogneos, S e N, trminico (TID) para N e P. A
espectrometria de massa (MS) um mtodo fortemente selectivo para
identificao e quantificao de pesticidas.
Os componentes separados em GC so comparados com padres, com
base nos respectivos tempos de reteno e frequentemente os seus tempos de
reteno so referidos relativamente ao do padro interno, clorpirifos. Este
composto contm tomos de P, S, N e Cl, para alm de C, H e O, o que permite
a sua deteco em todos os detectores usados em GC.

Fig. 13.2 Estrutura do pesticida clorpirifos.


A aplicao de cromatografia HPLC anlise de pesticidas restringe-se aos
analitos que no so suficientemente volteis ou no possuem estabilidade
trmica que lhes permita ser analisados por GC. Uma vantagem desta tcnica
a no necessidade de um passo de eliminao de interferentes to extenso. A
deteco normalmente feita por absoro electrnica ou por fluorescncia. Os
compostos que no so naturalmente fluorescentes, so derivatizados, quer pr
quer ps-coluna.
Os ensaios imunolgicos utilizam anticorpos com elevadas afinidade e
especificidade para o pesticida a analisar. Estes mtodos so simples, rpidos e
relativamente baratos e tm aplicao analtica se a interaco entre o
anticorpo e o pesticida puder ser detectada e, preferivelmente, quantificada.
Uma das principais desvantagens dos ensaios imunolgicos relaciona-se com o
carcter no polar dos pesticidas, que os tornam pouco solveis nos tampes
aquosos habitualmente enpregues nestes ensaios.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

As anlises semi-quantitativas e qualitativas so, em geral, capazes de


detectar um nmero limitado de resduos de pesticidas semelhantes entre si.
So tambm designados por mtodos de varrimento, j que so capazes de
analisar um grande nmero de amostras, num tempo relativamente curto.
Enquanto os mtodos semi-quantitativos permitem uma estimativa de uma
gama de concentraes para um resduo, os mtodos qualitativos detectam a
presena de um resduo acima de determinado valor. Estes so mtodos
rpidos, simples e baratos, que utilizam sobretudo as tcnicas de TLC, inibio
enzimtica e ensaios imunolgicos.
Apesar das suas limitaes, a cromatografia em camada fina (TLC)
usada como mtodo semi-quantitativo de varrimento para um grupo limitado de
pesticidas. Uma melhoria na capacidade de resoluo pode ser conseguida por
HPTLC.
A obteno de uma amostra representativa da distribuio de micotoxinas
num alimento particularmente difcil. Os mtodos analticos empregues para a
sua anlise podem ser quantitativos ou de varrimento. Os mtodos no
quantitativos incluem o uso de mini-colunas e de TLC.
As mini-colunas tiram partido da fluorescncia natural das aflatoxinas
zearalenona e ocratoxina A. So usadas pequenas colunas cromatogrficas em
vidro (dimetro interno de 4 6 mm) contendo diversas substncias
adsorventes, disponveis comercialmente, capazes de detectar as citadas
micotoxinas. Aps um passo inicial de cleanup, o extracto adicionado ao topo
da coluna e depois eludo com diversos solventes. No passo final, o analito
eludo da camada superior do adsorvente para um nvel inferior contendo
Florisil. Quando submetido a uma luz de 365 nm, o analito exibe
fluorescncia.
A utilizao preliminar de placas de TLC permite a anlise simultnea de
vrias amostras. A utilizao de TLC em duas dimenses permite a obteno de
resultados de maior confiana, mas com uma reduo na quantidade de
amostras analisadas por placa.
Os mtodos quantitativos para anlise de micotoxinas seguem os mesmos
passos gerais que os indicados para os pesticidas, com pequenas diferenas. A
tcnica mais popular para separao de micotoxinas o HPLC e a maioria
destes compostos detectada por espectroscopia de absoro electrnica ou
de fluorescncia.
Os mtodos bioqumicos usados para determinao de micotoxinas tm
sofrido grandes desenvolvimentos, existindo actualmente processos de anlise

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Introduo Qumica Alimentar

2009

para diversos destes contaminantes que recorrem a ensaios rdio-imunolgicos


(RIA) e a ensaios imunoenzimticos (ELISA).

Fig. 13.3 Anlise de aflatoxinas por TLC.


Uma tcnica mais recente, para o isolamento de aflatoxinas a partir de
matrizes biolgicas, faz uso de anticorpos ligados covalentemente a uma matriz
de agarose, contida numa coluna descartvel de plstico. O material de
empacotamento da coluna adsorve selectivamente as aflatoxinas, sendo estas
depois libertadas da coluna com a ajuda de um solvente orgnico polar. Este
mtodo de cromatografia de imunoafinidade com anticorpos monoclonais
permite um cleanup mais eficaz que os mtodos mais tradicionais.

Fig. 13.4 Esquema ilustrativo de um ensaio rdio-imunolgico.

100

Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 13.5 Cromatograia de imunoafinidade com anticorpos


monoclonais, aplicada ao isolamento de micotoxinas.
O crescimento de microrganismos, num meio de cultura transparente,
pode ser seguido pelo aumento da turvao do meio ou, em alternativa, se
colocado num meio de cultura slido, forma-se uma zona de inibio de
crescimento ao redor do agente inibidor de crescimento. Esta uma forma
comum de deteco de agentes inibidores em alimentos.

Fig. 13.6 Ensaio de inibio de crescimento microbiano.


As determinaes quantitativas de resduos de medicamentos seguem
tambm os passos de preparao de amostra e isolamento dos analitos de
interesse indicados para os outros contaminantes atrs mencionados. O mtodo
mais utilizado para a separao e quantificao de resduos de medicamentos
a cromatografia em HPLC. Este mtodo tem a vantagem de no exigir uma
preparao de amostra muito complexa. Actualmente, existem alguns
procedimentos capazes de analisar resduos mltiplos de antibiticos.

101

Introduo Qumica Alimentar

2009

Captulo 14
Aromas

As

substncias com aroma so compostos volteis reconhecidos pelos

receptores olfactivos. Esto referenciados mais de 7000 compostos volteis em


cerca de 450 alimentos, mas apenas um pequeno nmero destes (5%)
relevante para o aroma. Aqueles cuja concentrao est abaixo do limiar
sensorial de percepo no so reconhecidos como aromas.
Podem existir alteraes aos aromas dos alimentos causadas por reaces
enzimticas ou no enzimticas. Alteraes no enzimticas de aromas,
temperatura ambiente, apenas se verificam aps armazenamento prolongado
do alimento. Essa alterao deve-se peroxidao lipdica, reaco de
Maillard e degradao de aminocidos (degradao de Strecker) com ela
relacionada. Estes processos so acelerados durante o processamento trmico
dos alimentos.
Os compostos volteis mais relevantes formados por reaces no
enzimticas so carbonilos, piranonas, furanonas, tiis, tioteres, dissulfuretos
e trissulfuretos, tiazis, pirris, piridinas, pirazinas, aminas e fenis.

Fig. 14.1 Estruturas de uma piranona (1) e de uma furanona


(2),
compostos
formados
por
reaces
no
enzimticas.
Outros aromas podem ser formados a partir de reaces enzimticas
originadas na alterao dos tecidos do alimento (corte ou triturao de frutos e
vegetais, por exemplo). Tambm existem aromas formados por interveno
indirecta de protenas, como nos casos de formao de aminocidos por
hidrlise de protenas ou formao de acares a partir de polissacridos. Estes
compostos so depois convertidos em volteis por reaces no enzimticas. O

102

Introduo Qumica Alimentar

2009

po, a cerveja e o ch so exemplos de alimentos em que ocorre este


fenmeno.

Fig. 14.2 Estruturas de um tiazole (1) e de uma pirazina (2),


compostos formados por reaces no enzimticas.
Entre os compostos mais importantes formados por via enzimtica
contam-se os carbonilos, lcoois, hidrocarbonetos, steres, lactonas, terpenos,
compostos sulfurados, pirazinas, escatol e p-cresol.

Fig. 14.3 Estruturas de um terpeno (1) e do escatol (2),


compostos formados por reaces enzimticas.
Aromas defeituosos podem provir de susbtncias estranhas ao alimento,
por perca de compostos volteis relevantes, ou alteraes nas concentraes
relativas dos compostos volteis.
A intensidade e qualidade dos aromas depende tambm da interaco
com outros constituintes dos alimentos, nomeadamente lpidos, protenas e
hidratos de carbono.
Aditivos aromatizantes, naturais e sintticos, tm sido utilizados com os
objectivos de substituir aromas naturais caros ou pouco intensos e de
compensar as percas de aromas verificadas durante o processamento dos
alimentos.
Entre os aditivos naturais, a larga maioria provm de material vegetal, nas
formas de leos essenciais, extractos e destilados. Os compostos sintticos
podem ser idnticos aos naturais, derivados dos naturais ou estritamente
sintticos.

103

Introduo Qumica Alimentar

104

2009

Introduo Qumica Alimentar

2009

Captulo 15
Tcnicas de Separao

Para analisar compostos individuais numa mistura complexa necessrio


isol-los e concentr-los. Para esse efeito existem diversas tcnicas, ditas
separativas. Estas tcnicas exploram diferenas nas propriedades fsico-qumicas entre os diferentes componentes de uma mistura. As propriedades
mais teis para essa finalidade so a volatilidade, solubilidade, carga, tamanho
da molcula, forma e polaridade.
A maioria das tcnicas de separao depende da transferncia selectiva de
materiais entre duas fases imiscveis. As tcnicas mais utilizadas e os sistemas
de fases a elas associados esto resumidos na tabela 15.1.
Tabela 15.1
Tcnica
Extraco por solventes
Extraco em fase slida
Cromatografia gasosa
Cromatografia lquida
Cromatografia em camada fina
Cromatografia de permuta inica
Cromatografia de excluso molecular
Cromatografia com fluidos
supercrticos
Electroforese
Electrocromatografia capilar

Sistema de fases
Lquido-lquido
Lquido-slido
Gs-lquido
Gs-slido
Lquido-lquido
Lquido-slido
Lquido-slido
Lquido-lquido
Lquido-slido
Lquido-lquido
Fluido supercrtico-lquido ou slido
Lquido
Lquido-slido

A extraco por solventes permite a transferncia selectiva de materiais


em pequenas quantidades (g g) entre duas fases lquidas imiscveis,
baseada na diferena de solubilidades.
A separao pode ser efectuada em regime descontnuo, em mpolas de
decantao, mas tambm em contnuo, utilizando um sistema de refluxo. O
primeiro o mtodo mais simples, em que as duas fases so agitadas na
mpola, at se alcanar um equilbrio e depois deixa-se em repouso at

105

Introduo Qumica Alimentar

2009

separao das fases. O soluto pode ser quantitativamente transferido numa


nica extraco ou serem necessrias vrias extraces.

Fig. 15.1 mpola de decantao utilizada em extraco


descontnua por solventes.
Na extraco em contnuo, destila-se o solvente orgnico contido num
balo, seguindo-se a sua condensao e passagem atravs da fase aquosa,
regressando ao balo para ser reciclado.

Fig. 15.2 Montagens para extraco em contnuo por solventes.


(a) Solvente mais leve que a gua; (b) Solvente mais
pesado que a gua.
A extraco por solventes habitualmente utilizada para isolar uma
determinada espcie qumica, antes da sua quantificao e, menos

106

Introduo Qumica Alimentar

2009

frequentemente, para concentrao de muito pequenas quantidades. A


aplicao mais vulgar a concentrao e determinao de metais e compostos
orgnicos. Outra das suas vantagens a aplicabilidade a uma vasta gama de
amostras e concentraes. Uma das principais desvantagens a necessidade
de utilizar elevadas quantidades de solventes orgnicos; outra desvantagem
uma fraca resoluo de misturas de substncias orgnicas.
A extraco em fase slida (SPE) utilizada para transferir selectivamente
materiais em muito pequenas quantidades ( sub-g mg) entre um sorvente
slido e uma fase lquida. A eficincia da separao depende das diferentes
afinidades relativas para as duas fases, baseadas na adsoro, no tamanho ou
na carga do composto.
Esta tcnica tem aplicao crescente numa purificao prvia da amostra
antes de uma anlise cromatogrfica e em pr-concentrao de quantidades
diminutas de analitos. Tende a substituir, com vantagem, a extraco por
solventes.
A principal desvantagem da extraco em fase slida prende-se com a
reduzida eficincia de algumas fases slidas. O mtodo alternativo,
microextraco em fase slida, apresenta dificuldades de calibrao e
replicabilidade.
A extraco em fase slida pode ser executada em diversos suportes.
Entre os mais frequentemente utilizados contam-se os tubos de seringa de
polipropileno, nos quais o sorvente retido por discos de polietileno.

Fig. 15.3 Extraco em fase slida, usando como suporte tubos


de seringa.

107

Introduo Qumica Alimentar

2009

Em alternativa podem usar-se discos de fibra de vidro ou PTFE, nos quais


esto embebidas as partculas de sorvente, ou ainda pontas de pipetas de
plstico, cheias com pequenas esferas de sorvente.
A extraco em fase slida pode ser completa ou parcialmente
automatizada, de modo a aumentar a quantidade de amostras processadas,
mas tambm a preciso e o rigor.

Fig. 15.4 Sistema automatizado para extraco em fase slida.


A microextraco em fase slida (SPME) uma variante que permite a
determinao de quantidades reduzidas de analitos em amostras lquidas ou
gasosas, atravs da concentrao destas em fibras pticas revestidas com uma
camada de uma substncia polimrica, usada como fase estacionria em
cromatografia gasosa. Deste modo, a fibra pode ser directamente inserida num
cromatgrafo gasoso.
Todas as tcnicas cromatogrficas tm por base o mesmo princpio: a
variao na velocidade de migrao de diferentes componentes de uma
amostra, atravs de uma fase estacionria, sob a influncia de uma fase mvel.
A velocidade de migrao varia devido a diferenas nas razes de distribuio
entre as fases.
Durante uma separao cromatogrfica, as molculas do soluto movem-se
continuamente entre as fases mvel e estacionria. Enquanto permanecem na
fase mvel, so empurradas por esta, mas permanecem quase estacionrias
enquanto esto na fase estacionria. A velocidade de migrao de cada soluto
assim determinada pela proporo de tempo em que permanece na fase mvel.
As separaes cromatogrficas podem ser classificadas segundo quatro
diferentes mecanismos de soro: adsoro superfcie, partio, permuta
inica e excluso.

108

Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 15.5 Princpio de funcionamento da microextraco em


fase slida.
No mecanismo de adsoro superfcie, as polaridades relativas do soluto
e da fase estacionria slida determinam a velocidade do movimento do soluto
atravs de uma coluna ou de uma superfcie.
Se a fase estacionria for constituda por um suporte slido inerte
revestido superfcie por um lquido, o movimento do soluto ser determinado
apenas pela sua solubilidade relativa nas duas fases, ou pela sua volatilidade,
se a fase mvel fr um gs. Este mecanismo designado por partio.

Fig.

15.6

Diagramas dos mecanismos de separao


cromatogrfica por adsoro e por partio.

109

Introduo Qumica Alimentar

2009

Os mecanismos de adsoro e partio podem ocorrer em simultneo,


sendo a contribuio de cada um deles determinada pelas naturezas das fases
estacionria e mvel, do suporte slido e do soluto.
Na separao por permuta inica, a fase estacionria um polmero slido
permevel, ao qual esto ligados grupos carregados e contra-ies mveis, os
quais podem permutar com os ies do soluto, transportados pela fase mvel.
O processo de excluso no um verdadeiro processo de soro, pois os
solutos ficam permanentemente na fase mvel. A separao d-se devido
diferente difuso dos solutos atravs de uma fase estacionria inerte mas
porosa. Esta habitualmente um gel, com pequenos poros, atravs dos quais
apenas molculas pequenas conseguem passar, sendo retardadas no
atravessamento da coluna. Molculas maiores so excludas e atravessam
livremente a coluna.

Fig.

15.7

Diagramas dos mecanismos de separao


cromatogrfica por permuta inica e por excluso.

Um grfico da concentrao do soluto na fase mvel em funo da sua


concentrao na fase estacionria, a temperatura constante, deveria ser linear
e o perfil de concentrao simtrico. Em sistemas no ideais ocorrem
distores, designadas por tailing e fronting. A ocorrncia destes efeitos
indesejvel, pois conduz a ms separaes e quantificaes imprecisas. O
fenmeno de tailing tem tendnccia a ocorrer em processos de adsoro,
enquanto que o de fronting ocorre mais frequentemente em mecanismos de
partio. A causa mais frequente de ambos uma sobrecarga da coluna com
amostra em excesso.
A velocidade de um soluto dada pelo seu coeficiente de distribuio.
D

Cfase estacionria
Cfase mvel

(15.1)

110

Introduo Qumica Alimentar

2009

Este indica que, quanto maior D, mais lento ser o progresso do soluto
atravs do sistema cromatogrfico.

Fig. 15.8 Isotermas de soro e perfis de concentrao em


cromatografia. (a) Isoterma linear; perfil Gaussiano.
(b) Isoterma curva; tailing. (c) Isoterma curva;
fronting.
Em cromatografia em coluna, mede-se o volume de reteno (VR) definido
como o volume que atravessa a coluna entre o momento de aplicao da
amostra no seu topo e a sada do soluto no outro extremo. VM o volume de
fase mvel na coluna (designado por volume morto) e k o factor de reteno,
directamente proporcional a D.

VR VM kVM

(15.2)

Para um fluxo F constante de fase mvel

VR FtR

(15.3)

No caso de o fluxo ser conhecido, o tempo de reteno tR pode ser usado


como medida de VR.
Nas cromatografias em papel e em camada fina, o processo de separao
parado numa fase em que os componentes separados ficam no suporte, sob
a forma de manchas. A velocidade do soluto pode ser medida pelo factor de
reteno, Rf.

Rf

distncia percorrida pelo centro da mancha do soluto


distncia percorrida pela frente da fase mvel

111

(15.4)

Introduo Qumica Alimentar

2009

As distncias so medidas a partir do ponto de aplicao da amostra. Rf


tem uma relao inversa com D.
Numa anlise cromatogrfica ideal, os componentes de uma mistura
deveriam estar completamente separados uns dos outros no mais curto perodo
de tempo possvel. O desempenho de um processo cromatogrfico pode ser
avaliado pela sua eficincia e resoluo e pela assimetria dos picos.
A largura de uma banda ou pico uma medida da eficincia do processo,
e a resoluo determinada pela capacidade de resolver picos de componentes
com valores de tR ou Rf semelhantes.

Fig. 15.9 Exemplo de um cromatograma e respectivos


parmetros.
A eficincia da separao, numa coluna, est relacionada com o tempo de
reteno e a largura do pico e dada pelo nmero de pratos tericos, N. O
modelo dos pratos tericos considera transferncias sucessivas entre as quais
se estabelece um equilbrio termodinmico. Cada volume assim definido um
prato terico.

L
H

(15.5)

112

Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 15.10 Diagrama ilustrativo do modelo dos pratos tericos.


Nesta equao, L o comprimento da coluna e H a altura equivalente de
cada prato terico. Considerando que um pico representa uma distribuio
aproximadamente Gaussiana, a eficincia pode ser dada por

t
N 16 r
l

2
(15.6)

em que l representa a largura do pico na base. Alternativamente, como


frequentemente mais fcil medir a largura a meio do pico, lh/2, pode usar-se a
equao 15.7 para determinar a eficincia.

tr

N 5.54
l
h
2

2
(15.7)

A resoluo, RS, de uma coluna mede a capacidade de separar dois


solutos e medida a partir do cromatograma, relacionando a separao entre
dois picos adjacentes com a mdia da sua largura.

Rs

2 tr tr
l A lB
B

(15.8)

Fig. 15.11 Ilustrao do conceito de resoluo. WA e WB so as


larguras dos picos, correspondentes s notaes lA e lB.

113

Introduo Qumica Alimentar

2009

aceite que um valor de RS 1.5 indicativo de uma boa separao.


A resoluo de uma coluna pode tambm ser dada pela expresso 15.9,
em que N o nmero de pratos tericos para o segundo soluto, kB o seu factor
de reteno e o factor de separao, ou selectividade.

RS

tr'B
tr' A

N 1 kB

4 1 kB

k B'
k A'

(15.9)

(15.10)

A largura de um pico determinada pela difuso total do soluto, durante o


seu movimento atravs do sistema cromatogrfico e pela velocidade de
transferncia de massa entre as duas fases. Os dois efeitos so
interdependentes e complexos. Tratando-se de efeitos cinticos , a sua
influncia na eficincia determinada pela velocidade da fase mvel atravs do
sistema.

Fig. 15.12 Efeitos da difuso e transferncia de massa na


largura do pico. (a) Perfis de concentrao do soluto
no incio da separao. (b) Perfis de concentrao do
soluto aps atravessar parte do sistema.
A chamada equao de van Deemter usada para definir eficincia em
termos cinticos. A o termo anisotrpico, que traduz a existncia de vrios
trajectos possveis e reflecte a homogeneidade da fase estacionria. O seu
efeito minimizado pela reduo do tamanho da partcula, mas aumenta com o
comprimento da coluna. u representa a velocidade linear da fase mvel. O
termo B/u representa a difuso longitudinal e reflecte a difuso das molculas
de soluto na fase mvel, causada por gradientes locais de concentrao. A
difuso atravs da fase estacionria tambm contribui para este termo, o qual
apenas significativo para fluxos reduzidos e aumenta com o comprimento da
coluna. um termo inversamente proporcional ao fluxo. C.u o termo que
representa a transferncia de massa e resulta do tempo que as molculas de

114

Introduo Qumica Alimentar

2009

soluto demoram a deslocar-se entre as duas fases. Tem em conta os factos de


que: molculas colocadas no centro do fluxo avanam mais rapidamente que as
restantes; a fase estacionria no tem uma forma regular, o que provoca
diferenas na reteno das molculas. O efeito deste termo mnimo para
pequenos dimetros de partcula e aumenta com o fluxo e o comprimento da
coluna.
H A

B
C.u
u

(15.11)

Fig. 15.13 Eficincia como funo da velocidade da fase mvel e


efeito de cada termo da equao de van Deemter.
Da anlise do grfico da Fig. 15.13 pode concluir-se que: a separao
mxima para H mnimo; B domina para u baixos e C domina para u elevados; a
difuso muito menos significativa em cromatografia lquida (HPLC); A
menor em cromatografia lquida, pelo que Hmin cerca de 10 vezes menor que
em cromatografia gasosa e obtm-se para valores de u cerca de 10 vezes
inferiores; os picos tendem a alargar mais em cromatografia gasosa que em
cromatografia lquida.
O coeficiente de distribuio dos solutos, D, depende da temperatura, pelo
que a escolha da temperatura de operao tem um enorme efeito sobre a
separao cromatogrfica. Um aumento na temperatura causa uma diminuio
em D e um correspondente decrscimo no tempo de reteno. Assim, um
aumento de temperatura torna a cromatografia mais rpida mas tal pode ter
como consequncia uma pior resoluo, pelo que ter sempre que se procurar
um compromisso entre ambos.
A eluio com gradiente um procedimento em que as condies de
eluio da amostra variam progressivamente, de modo a acelerar o processo.
Para tal pode alterar-se a composio da fase mvel, aumentar a temperatura

115

Introduo Qumica Alimentar

2009

ou o fluxo. O efeito uma mais rpida eluio dos componentes no final da


cromatografia e uma melhoria no perfil de eluio.
Na cromatografia em fase gasosa (GC), a separao dos componentes
conseguida por vaporizao da amostra numa fase mvel gasosa, atravs de
uma coluna contendo uma fase estacionria lquida (cromatografia gs-lquido)
ou slida (cromatografia gs-slido). Os componentes da amostra migram com
velocidades dependentes do ponto de ebulio, da solubilidade ou da adsoro.
Na cromatografia gs-lquido (GLC) o processo dominante a partio,
enquanto na cromatografia gs-slido, a adsoro o principal processo de
separao. Em ambos os casos, as amostras tero que ser volteis e
termicamente estveis temperatura de trabalho.

Fig. 15.14 Diagrama de um cromatgrafo gasoso.


Os gases mais frequentemente utilizados na fase mvel so o azoto, hlio
e hidrognio, sendo a escolha feita em funo do tipo de coluna
(empacotamento ou capilar) utilizada, do preo e do detector utilizado. Hlio e
hidrognio so preferidos para colunas capilares, j que se adaptam melhor a
fluxos mais elevados.
A introduo da amostra no cromatgrafo pode ser realizada por diversas
tcnicas:

injeco em split uma vlvula desvia a maior parte da amostra


injectada para a atmosfera, passando apenas 2% ou menos para a
coluna. No caso de amostras com componentes tendo pontos de
ebulio muito diferentes, estes tendem a ser separados em

116

Introduo Qumica Alimentar

2009

diferentes propores, o que constitui uma limitao da tcnica.


Esta tcnica de injeco s aplicvel quando no se pretende
uma sensibilidade elevada, j que a maioria da amostra no
analisada.
injeco em splitless amostra colocada no injector a uma
temperatura inferior ao ponto de ebulio do componente mais
voltil, sendo depois aquecida de modo a eluir sequencialmente os
componentes. A tcnica s se aplica no caso de todos os
componentes da amostra possuirem pontos de ebulio
relativamente elevados.
injeco on-column permite a introduo directa de amostras
lquidas muito pequenas no topo da coluna fria. Esta tcnica reduz
o risco da decomposio de compostos termo-sensveis.

Fig. 15.14 Diagrama de um injector em split para coluna


capilar.
A coluna pode ser feita de ao inoxidvel, vidro ou quartzo, tendo de 1 m
a 100 m de comprimento e um dimetro interno entre 0.1 mm e 3 mm. A
coluna colocada num forno, cuja temperatura pode ser controlada, operando
em condies isotrmicas (temperatura constante durante a separao) ou de
gradiente (temperatura sobe durante a separao).
As colunas de empacotamento so mais curtas e mais grossas e
fabricadas em ao inoxidvel ou vidro. Em GLC so preenchidas com um slido

117

Introduo Qumica Alimentar

2009

inerte e poroso, que serve de suporte a uma fase estacionria lquida ou semi-lquida. Para utilizao em GSC, as colunas tm uma fase estacionria slida.
Estas colunas so mais baratas que as capilares, mas possuem menor eficincia
de resoluo.

Fig. 15.15 Diagrama de um injector on-column.


Nas colunas capilares a fase estacionria lquida reveste ou est ligada
parede interior do tubo de quartzo. O exterior da coluna pode ser revestido com
alumnio ou um polmero plstico, para proteco. A sua maior resoluo fruto
de um muito maior nmero de pratos tericos.
O detector dever responder a modificaes na composio do gs que
emerge da coluna, medida que os solutos vo eluindo. Um detector ideal
deveria: responder rapidamente presena de um soluto; dar uma resposta
linear numa vasta gama de concentraes; possuir uma elevada sensibilidade;
ser estvel. Apesar de existirem mais de doze tipos de detectores disponveis
para GC, apenas aqueles que usam a condutividade trmica, ionizao de
chama e captura electrnica so frequentemente usados.
Compostos no volteis ou termo-sensveis podem ser derivatizados para
aumentar a sua volatilidade ou estabilidade. Compostos com grupos funcionais

118

Introduo Qumica Alimentar

2009

hidroxilo, carbonilo e amino podem ser feitos reagir com reagentes adequados,
de modo a converter esses grupos polares em derivados menos polares e mais
volteis (metilo, trimetilsililo ou trifluoroacetilo). Entre os compostos mais
frequentemente sujeitos a derivatizao para anlise em GC contam-se os
cidos gordos, hidratos de carbono, fenis e aminocidos.
A identificao dos compostos separados em cromatografia gasosa pode
ser efectuada por comparao dos seus tempos de reteno com padres, por
recolha e posterior anlise com outras tcnicas ou hifenando outros mtodos
com o GC, atravs de uma interface.
Uma dessas tcnicas hifenadas a espectrometria de massa. A principal
dificuldade em juntar estes dois mtodos o facto de que o espectrmetro de
massa trabalha a baixa presso enquanto o gs sado do cromatgrafo vem
presso atmosfrica. No entanto, a evoluo tecnolgica permite que hoje em
dia esta seja uma das tcnicas mais relevantes para identificao de compostos
em GC.
Uma outra a juno da espectroscopia de Infra-vermelho com a
cromatografia gasosa, embora a sua menor sensibilidade contribua para um
reduzido sucesso da tcnica.
A quantificao dos compostos conseguida por integrao dos picos no
cromatograma, sendo que a rea do pico directamente proporcional
concentrao do soluto. Para que tal mtodo possa ser utilizado, necessrio
que as condies de operao sejam padronizadas e que sejam conhecidos os
factores de resposta dos detectores.
Se os componentes de uma mistura forem todos idnticos e forem todos
detectados, pode determinar-se o teor em percentagem de cada um deles

%x

rea do componente x
rea total de todos os componentes

(15.12)

Esta frmula s ser vlida se a sensibilidade do detector for a mesma


para todos os componentes. Caso contrrio, a resposta para cada componente
ter que ser determinada com o recurso a padres. Neste caso, as reas
determinadas sero multiplicadas pelos factores de correco obtidos.
Podem usar-se dois mtodos de quantificao por adio de padro:

padro interno adiciona-se uma quantidade conhecida do padro


amostra, antes de esta ser cromatografada. Calcula-se a razo
das reas do pico do padro sobre a do pico do componente e
converte-se esta razo no peso do componente atravs de uma

119

Introduo Qumica Alimentar

2009

curva de calibrao previamente preparada. O padro interno


dever ter um tempo de reteno prximo do dos componentes a
determinar, mas com uma boa separao. Dever ainda estar
presente na mesma gama de concentraes.
adio de padro se estiver disponvel uma amostra pura do
componente
a
determinar,
essa
amostra
poder
ser
cromatografada antes e aps a adio de uma quantidade
conhecida do componente puro. O seu teor na amostra obtido a
partir da razo das reas dos picos nos dois cromatogramas.

Em cromatografia lquida (LC) e mais em particular em cromatografia


lquida de alta eficincia (HPLC) possvel separar componentes de misturas
em quantidades entre g e g por passagem da mesma atravs de uma coluna
contendo uma fase estacionria slida. A fase mvel um lquido a presso
elevada. A separao dos componentes baseada nas diferenas de afinidade
para as fases mvel e estacionria devido a propriedades de adsoro, tamanho
e carga.
Em cromatografia lquida clssica so utilizadas colunas presso
atmosfrica, com as desvantagens de ms separaes e longo tempo de
operao. Uma melhor separao pode ser conseguida usando fases
estacionrias com menor dimetro de partcula e uma reduo no tempo de
anlise conseguida usando fluxos mais elevados e trabalhando a presses
superiores. A tcnica de HPLC mais verstil que GC, j que no se limita a
compostos volteis e termo-estveis e tambm as fases mveis e estacionrias
so mais diversificadas.

Fig. 15.16 Diagrama de um cromatgrafo HPLC.

120

Introduo Qumica Alimentar

2009

Em HPLC, a injeco quase sempre realizada atravs de uma vlvula, a


qual permite uma elevada reprodutibilidade. As colunas mais vulgares so
fabricadas em ao inoxidvel. A grande versatilidade de fases estacionrias
disponveis permite tirar partido de todos os mecanismos cromatogrficos de
separao.
Em HPLC, a escolha de uma fase mvel adequada crucial para a
eficincia da separao. Quando o sistema funciona em fase normal (fase
estacionria polar fase mvel no polar) a capacidade de eluio aumenta
com o aumento da polaridade do solvente, enquanto que em fase reversa (fase
estacionria no polar fase mvel polar) a capacidade de eluio diminui com
o aumento de polaridade do solvente. frequente que a utilizao de misturas
de mais que um solvente produza melhores resultados que a utilizao de um
nico solvente.
Quando se trabalha com um nico solvente ou uma mistura de solventes
com composio fixa, diz-se que se trata de operao em condies isocrticas
e quando essas condies variam designa-se por eluio com gradientes.
O detector ideal em HPLC dever apresentar as mesmas caractersticas
que para GC, nomeadamente resposta rpida e reprodutvel para os solutos,
resposta linear para uma ampla gama de concentraes, elevada sensibilidade
e estabilidade. Os detectores mais vulgares so os de absoro electrnica e de
ndice de refraco. Outros detectores mais sensveis, mas mais especficos so
os de fluorescncia e condutividade elctrica. Existem outros ainda, mas com
aplicao mais limitada.
De modo semelhante GC, a anlise qualitativa em HPLC feita por
comparao dos dados de reteno. A recolha de componentes isolados para
posterior anlise por outras tcnicas (IV, MS, NMR) fcil de realizar, mas os
mtodos hifenados tendem a sobrepor-se a essa prtica. A anlise quantitativa
tambm efectuada de modo semelhante indicada para GC.
A interface entre um HPLC e um detector de espectrometria de massa
tambm coloca algumas dificuldades, existindo diversas solues possveis e
tambm diversos processos de ionizao dos componentes separados em HPLC.
Uma variante de HPLC, designada por cromatografia inica, foi
desenvolvida para a separao de ies inorgnicos e tambm de alguns
orgnicos. Para tal, so utilizadas colunas de permuta inica e os ies so
detectados atravs da sua condutividade ou, em alternativa, por espectroscopia
de absoro electrnica.

121

Introduo Qumica Alimentar

2009

Para separar anies, a coluna tem uma fase estacionria de permuta


aninica, com ies HCO. Para a anlise de caties, utilizam-se resinas
catinicas na forma de H+.
A cromatografia com fluidos supercrticos uma tcnica mais recente, a
qual utiliza um fluido supercrtico como fase mvel. Para atingir o estado
supercrtico, o solvente sujeito a elevadas temperatura e presso, o que
provoca alteraes na sua densidade, viscosidade e coeficiente de difuso. O
solvente mais utilizado o CO2. A aparelhagem utilizada tem por base
elementos usados em GC e HPLC. Para optimizar a separao frequente
utilizar gradientes de presso. Podem ser utilizados detectores tpicos de GC,
como os de ionizao de chama, ou de HPLC, como os de UV ou de
fluorescncia.
Em cromatografia com fluidos supercrticos tambm so utilizados
detectores hifenados, tais como IV e MS.
A cromatografia em camada fina (TLC) utiliza camadas finas de uma fase
estacionria aplicadas sobre suportes de vidro, plstico ou alumnio. Quando
um solvente atravessa essa superfcie, por capilaridade, provoca o
arrastamento dos componentes de uma dada mistura com diferentes
velocidades, dependendo das suas propriedades de solubilidade, adsoro,
tamanho ou carga. A distncia percorrida medida ou as manchas produzidas
so removidas para posterior anlise por mtodos espectromtricos.

Fig. 15.17 Exemplo de um cromatograma em TLC.


Os materiais utilizados para fase estacionria em cromatografia em
coluna, de permuta inica ou de excluso, tambm podem ser usados em TLC.
A fase mvel escolhida, sobretudo, com base em experincia prvia.

122

Introduo Qumica Alimentar

2009

A identificao de componentes pode ser feita apenas com base nos


valores de Rf, comparando-os com os de padres, analisados em condies
idnticas. Em alternativa, as manchas podem ser removidas da placa e
analisadas por mtodos qualitativos. A anlise quantitativa s pode ser
efectuada em circunstncias particulares e nunca muito rigorosa.
Um processo semelhante cromatografia a separao por excluso
molecular. Utiliza-se um gel que separa os componentes segundo o seu peso
molecular e a sua forma. Os poros do gel excluem molculas maiores que um
certo tamanho crtico, permitindo a difuso atravs do gel das menores. As
molculas maiores saem mais rapidamente, enquanto as restantes eluem a
velocidades dependentes do seu grau de permeao atravs do gel. Existem
gis hidroflicos e hidrofbicos, permitindo a separao de uma vasta gama de
compostos.
Um outro mtodo de separao com crescente aplicao na qumica
alimentar a electroforese. O mecanismo de separao baseia-se na migrao
diferencial de substncias com carga, atravs de uma superfcie ou de uma
coluna, devido aco de um gradiente de potencial. A velocidade de migrao
depende do tamanho, carga e forma da molcula.
A electroforese tradicional realizada sobre suporte de papel, acetato de
celulose ou gis polimricos. Mais recentemente foi introduzida a electroforese
capilar que se efectua em tubos capilares de slica.
Na electroforese tradicional, a amostra colocada no centro do suporte e
os componentes so separados em manchas individuais. A deteco
efectuada atravs de reagentes reveladores, os quais permitem visualizar o
electroferograma obtido.

Fig.

15.18 Princpio
electroforese.

de

123

operao

da

separao

por

Introduo Qumica Alimentar

2009

A mobilidade das substncias afectada pela temperatura, pH e fora


inica, pelo que necessrio controlar estes parmetros, de modo a obter
resultados reprodutveis e comparveis.
Duas variantes desta tcnica so a focagem isoelctrica e a imuno-electroforese. A primeira complementa a separao por gradiente de potencial
com gradientes de pH e de densidades; a segunda utiliza interaces
especficas antigene-anticorpo.
Na electroforese capilar, aplica-se uma tenso de corrente mais elevada e
detectores semelhantes aos usados em HPLC (absoro electrnica,
fluorescncia, ...), o que origina a obteno de perfis semelhantes aos picos
cromatogrficos, embora mais estreitos. Nesta verso da electroforese, a
introduo da amostra faz-se pelo extremo do tubo oposto ao do detector, por
via hidrodinmica ou electrocintica. No primeiro caso, a amostra introduzida
no tubo por gravidade, presso positiva ou vcuo; no segundo, a amostra entra
por efeito de uma diferena de potencial aplicada.

Fig. 15.19 Mtodos de operao em electroforese capilar. (a),


(b) e (c) Hidrodinmica. (d) Electrocintica.
A electrocromatografia capilar uma tcnica hbrida entre a electroforese
capilar e HPLC. Utiliza colunas de elctroforese capilar empacotadas com fase
estacionria tpica de HPLC e um tampo de pH > 4. Estabelece-se um fluxo
electroosmtico do tampo, devido aplicao de uma corrente elctrica, em
direco ao extremo catdico do capilar. Esta tcnica apresenta as vantagens

124

Introduo Qumica Alimentar

2009

de uma maior eficincia e menor consumo de solvente que HPLC e maior


facilidade em ligar um detector de espectrometria de massa.

125

Introduo Qumica Alimentar

2009

Captulo 16
Mtodos Espectromtricos

Todas as tcnicas espectromtricas dependem da absoro ou emisso


de radiao electromagntica e das variaes de energia associadas, em
sistemas atmicos ou moleculares. As variaes de energia esto associadas
aos nveis discretos de energia atribudos a tomos e molculas. As transies
entre esses nveis energticos permitem obter informao quantitativa e
qualitativa sobre as espcies qumicas.
A radiao electromagntica tem carcter ondulatrio, mas as suas
absoro e emisso possuem uma natureza quntica. Uma onda pode ser
caracterizada em termos de frequncia (), comprimento () e amplitude (A). A
energia proporcional frequncia da radiao e inversamente proporcional ao
comprimento de onda.

Fig.

16.1

Representao
electromagntica.

esquemtica

de

uma

onda

A frequncia e o comprimento de onda esto relacionados pela expresso

(16.1)

em que c a velocidade de propagao da onda no vcuo (2.998x108 ms-1).


A teoria quntica considera a radiao como um fluxo de fotes (ou
quanta) que se deslocam no espao a velocidade constante (c). A energia de
um foto dada por

126

Introduo Qumica Alimentar

E h

2009

(16.2)

em que h a constante de Planck (6.6x10-34 Js).


A energia total de um tomo ou de uma molcula inclui diversas
contribuies: do interior do ncleo (energia nuclear), de interaces entre
electres e o ncleo (energia electrnica), dos spins electrnico e nuclear, dos
movimentos rotacionais e vibracionais das molculas e da translaco de
tomos ou molculas atravs do espao. Todas estas formas de energia,
excepto a translaccional, so descontnuas. Para cada forma de energia, um
tomo ou molcula podem existir em nveis discretos de energia, definidos por
nmeros qunticos e de acordo com uma formulao matemtica. A dimenso
das vrias formas de energia e as diferenas entre os nveis adjacentes so
muito diferentes. Os nveis energticos que um tomo ou uma molcula podem
ocupar, em condies ambientes, so determinados pelas regras da teoria
quntica e pela equao de Maxwell-Boltzmann (16.4). Estes so designados
por nveis do estado fundamental, os de maior energia so chamados nveis do
estado excitado.

Fig. 16.2 Nveis energticos electrnico, vibracional e rotacional


(escala no real).
Quando uma substncia irradiada com radiao electromagntica, a
energia dos fotes incidentes pode ser transferida para os seus tomos e
molculas, obrigando-os a passar do estado fundamental para um estado
excitado. Este processo de absoro pode ser traduzido pela equao

E2 E1 E h

(16.3)

127

Introduo Qumica Alimentar

2009

em que E1 e E2 so os dois nveis de energia. A energia absorvida


rapidamente perdida por colises, permitindo que o sistema reverta para o
estado fundamental. Se, em alternativa, a energia for reemitida, o processo
designa-se por fluorescncia.

Fig. 16.3 Ilustrao dos processos de absoro (esquerda) e de


emisso de fluorescncia (direita).
A informao que pode ser obtida sobre estas transies de energia,
apresentada sob a forma de espectros, representaes grficas do grau de
absoro ou da intensidade de emisso da radiao, em funo da frequncia,
comprimento de onda ou nmero de onda. As riscas espectrais resultantes de
transies em tomos ou molculas no estado gasoso so estreitas, tal como
aquelas originadas em transies de spin nuclear ou electrnico. J os
espectros de absoro molecular nas regies do ultra-violeta, vsivel e infravermelho apresentam conjuntos de riscas no completamente resolvidas
(bandas) devido s colises entre as molculas do soluto e do solvente e a
limitaes instrumentais.
As populaes relativas de cada nvel energtico, ou seja as propores do
analito que os ocupam, tm uma influncia directa nas intensidades das riscas e
so determinadas pelo espaamento dos nveis e pela temperatura. Estas
relaes so definidas pela equao de Maxwell-Boltzmann.

n2 g 2
E
exp

n1 g1
kT

(16.4)

n1 e n2 so o nmero de espcies nos estados de energia E1 e E2, separados


por E, g1 e g2 so factores estatsticos, k a constante de Boltzmann
(1.38x10-23 JK-1) e T a temperatura.

128

Introduo Qumica Alimentar

2009

A partir desta equao, verifica-se que os espectros de absoro nas


regies do UV, visvel e IV resultam sempre e unicamente de transies a partir
do estado fundamental.
A anlise quantitativa em espectrometria possvel devido existncia de
uma proporcionalidade directa entre a intensidade de uma risca ou banda e o
nmero de tomos ou molculas envolvidos na transio. Informao
qualitativa sobre a composio e estrutura de uma amostra obtida atravs da
posio e intensidades relativas das riscas ou bandas do espectro.
Apesar de bastante diferentes entre si, os aparelhos usados em
espectrometria possuem trs elementos caractersticos:

gerador de radiao com frequncia apropriada s variaes de


energia pretendidas na amostra;
anlise do espectro produzido por essa radiao, de modo a obter
informao qualitativa;
medio da intensidade da radiao nas frequncias seleccionadas,
para obteno de informao quantitativa.

As tcnicas de espectrometria atmica permitem anlise quantitativa e


qualitativa, dado que produzem espectros caracterizados por riscas estreitas,
cujos comprimentos de onda so caractersticos de cada elemento e cujas
intensidades so proporcionais ao nmero de tomos associados transio.
Tratando-se de tcnicas muito sensveis, a sua principal utilizao na
anlise elementar de compostos em baixas concentraes.
De acordo com a teoria quntica, os electres de um tomo ocupam
orbitais segundo um conjunto de quatro nmeros qunticos, cujos valores
permitidos (Tabela 16.1) so determinados por regras matemticas. Os
electres tendem a ocupar as orbitais com a mais baixa energia possvel,
seguindo o princpio de excluso de Pauli, o qual diz que num tomo no
existem dois electres que possam ser definidos pelo mesmo conjunto de
valores para os quatro nmeros qunticos n, l, ml e s. As formas e energias dos
orbitais so determinadas pelos valores dos nmeros qunticos e por efeitos
interelectrnicos.
A espectrometria de emisso atmica baseia-se na emisso de radiao
electromagntica nas regies do UV e do vsivel a partir de tomos e de ies,
aps excitao electrnica. utilizada para a deteco de minerais em
pequenas quantidades e para anlise quantitativa de metais, sobretudo em

129

Introduo Qumica Alimentar

2009

amostras slidas. Embora a preciso seja moderada, esta tcnica bastante


usada devido rapidez de processamento dos resultados obtidos.
Tabela 16.1
Nmero quntico
principal
secundrio
magntico
spin

Smbolo

n
l
ml
s

Parmetro
distncia radial
ngulo
ngulo
spin

Valores permitidos
inteiro de 1 a
inteiro de 0 a (n-1)
inteiro de 0 a 1

Uma alternativa mais recente a esta tcnica faz uso de plasma gasoso a
alta temperatura ou de um laser como fontes de excitao, o que permite uma
maior preciso quer na anlise quantitativa quer na qualitativa. As principais
desvantagens da espectrometria de emisso por plasma so a necessidade de
dissoluo da amostra e o preo elevado do equipamento.

Fig. 16.4 Diagrama de nveis de energia para o tomo de sdio.


Os nveis esto identificados pelo nmero quntico
principal n, pelo nmero quntico de orbital l e pelo
nmero quntico de spin s.
A excitao por plasma induzido tambm pode ser acoplada
espectrometria de massa, dando origem a uma tcnica designada por ICP-MS
(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry), com a qual se pode obter
informao qualitativa por separao dos ies atmicos formados e quantitativa
por medio da corrente inica gerada. A amostra introduzida por um

130

Introduo Qumica Alimentar

2009

nebulizador, vaporizao com laser ou aquecimento elctrico e os ies


produzidos so analizados no espectrmetro de massa. utilizada na anlise de
elementos em baixas concentraes (ppb), embora sofra de uma preciso nem
sempre elevada e seja uma tcnica cara.

Fig. 16.5 Esquema de um espectrmetro de emisso atmica.


A espectrometria de absoro atmica baseia-se na absoro de radiao
electromagntica, nas regies do UV e do vsivel, por tomos. As resultantes
alteraes na estrutura electrnica so medidas, de modo a obter informao
quantitativa. A deteco faz-se a partir da passagem de radiao caracterstica
de um dado elemento atravs do vapor atmico da amostra. Este vapor
produzido por aspirao de uma soluo para uma chama ou por evaporao a
partir de uma superfcie aquecida por corrente elctrica. uma tcnica muito
utilizada para determinao quantitativa de metais em baixas concentraes
(0.1-100 ppm) e com uma razovel preciso. A absoro medida proporcional
concentrao do elemento na amostra.

Fig. 16.6 Esquema de um sistema ICP-MS.


As principais limitaes desta tcnica so a necessidade de uma amostra
lquida e a necessidade de uma lmpada de deteco para cada elemento.

131

Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 16.7 Esquema de um espectrmetro de absoro atmica.


As medidas quantitativas podem ser realizadas com o recurso a curvas de
calibrao previamente preparadas ou atravs da adio de padro, sendo
necessrio que a resposta instrumental seja linear na gama de concentraes
considerada.
Na espectrometria de fluorescncia atmica detecta-se a radiao de
fluorescncia caracterstica emitida pelo vapor atmico de um analito, aps a
sua irradiao com radiao UV/vsivel. Na prtica, esta tcnica est limitada ao
elemento voltil Hg e a outros que podem ser tornados volteis (As, Se, Te, Bi,
Cd). Tem uma sensibilidade na gama das ppb e razoavelmente precisa.
A intensidade da emisso de fluorescncia directamente proporcional
concentrao dos tomos, mas reduzida devido a colises entre os tomos
excitados e outras espcies (extino de fluorescncia).
Na espectroscopia de emisso de raios X, observa-se radiao emitida por
transies envolvendo electres K e L. Fazem-se medidas qualitativas a partir
dos comprimentos de onda e quantitativas a partir das intensidades das
emisses. uma tcnica que permite a anlise no destrutiva de amostras
slidas ou lquidas, mas com uma sensibilidade e preciso no muito elevadas.
As transies electrnicas nas camadas internas de um tomo envolvem
variaes de energia consistentes com a absoro ou emisso de radiao com
elevada energia (baixo comprimento de onda). Tal conduz obteno de
espectros simples e caractersticos dos elementos presentes.

132

Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 16.8 Um electro


da esfera K ejectado do
tomo por uma fonte
externa
de
excitao
(raios X) criando uma
vaga. Um electro das
camadas L ou M salta
para preencher a vaga.
Ao faz-lo emite um raio
X
caracterstico
do
elemento,
produzindo
uma vaga nas camadas L
ou
M
e
assim
sucessivamente.

As tcnicas de espectrometria molecular so mais variadas e


completas quanto informao analtica que proporcionam. Incluem
contribuies de movimentos translaccionais, rotacionais e vibracionais a partir
de electres que ocupam os orbitais moleculares e de spins nucleares. A
separao entre os nveis qunticos de energia varia na ordem
Eelectrnica Evibracional Erotacional Espin nuclear

os nveis translaccionais no esto incluidos, pois so demasiado prximos, no


permitindo a sua quantizao.

133

Introduo Qumica Alimentar

2009

Em anlise, existem trs tcnicas com maior relevo: espectrometria no


ultra-violeta e vsivel (electrnica), espectrometria no infra-vermelho
(vibracional) e espectrometria de ressonncia magntica nuclear (spin nuclear).
A espectrometria de massa fornece informao estrutural semelhante, mas
uma tcnica destrutiva que funciona segundo princpios diferentes.
Os mtodos quantitativos baseados na absoro de radiao
electromagntica envolvem a medida da radiao transmitida pela amostra, a
qual proporcional concentrao da espcie que absorve a radiao, na
amostra. Esta relao descrita pela lei de Beer-Lambert.
I
log 0 A cl
I

(16.5)

I0 e I so, respectivamente, as intensidades das radiaes incidente e


transmitida, A a absorvncia, c a concentrao da espcie que absorve a
radiao, l a espessura do meio que absorve a radiao (na prtica, o trajecto
ptico da cuvette) e uma constante designada por coeficiente de absoro
molar.
O valor de depende da natureza da espcie e do comprimento de onda
da radiao incidente. A absorvncia est relacionada com a fraco de
radiao transmitida (transmitncia, T) pela espcie, de acordo com
A log

1
T

(16.6)

A absorvncia uma propriedade aditiva, pelo que, a um dado


comprimento de onda, a absoro total de uma soluo contendo vrios
componentes que absorvem radiao dada por

Atotal 1c1l 2c2l ...

(16.7)

considerando que no existem interaces entre as espcies.


Para aplicar a lei de Beer-Lambert, deve preparar-se previamente uma
recta de calibrao da absorvncia de diversos padres em funo da sua
concentrao. Esta recta dever passar pela origem e ter um declive igual a l.
As medidas de absorvncia so habitualmente feitas no valor mximo da curva,
de modo a minorar erros.
A lei de Beer-Lambert aplicvel apenas a solues diludas e a radiao
monocromtica. Para concentraes elevadas (~>0.01 M) ocorrem desvios.
Se se quiser analisar apenas uma substncia, obtm-se bons resulatados
com um simples fotmetro. Quando aplicada na zona do vsivel, esta tcnica

134

Introduo Qumica Alimentar

2009

denominada colorimetria. Nesta tcnica simples no vlida a lei de LambertBeer e no existe compatibilidade entre equipamentos diferentes. Devido a
estas limitaes mais frequente a utilizao da espectrofotometria.
A espectrometria no ultra-violeta e vsivel resulta da absoro de radiao
nessas regies do espectro, a qual origina alteraes na estrutura electrnica
de ies e molculas. uma tcnica apenas vlida para amostras em soluo e
com dificuldades de aplicao em misturas no previamente separadas.
A absoro de radiao nas regies vsivel e ultra-violeta origina transies
electrnicas entre os orbitais moleculares e, devido s relativamente elevadas
variaes de energia, ocorrem simultaneamente variaes nas energias
vibracional e rotacional. temperatura ambiente, todas as molculas estaro
no estado electrnico fundamental e, provavelmente, no nvel vibracional mais
baixo. A absoro de energia provoca transies para qualquer nvel vibracional
no primeiro estado excitado. Devido s interaces entre as molculas do soluto
e as do solvente, no so observadas riscas, mas sim bandas largas. Estas
bandas so caracterizadas pela posio do seu mximo de absorvncia (max) e
correspondente absorptividade molar. Para molculas poliatmicas e complexos
metlicos, o espectro pode ter diversas bandas, resultantes de diversas
transies electrnicas e estruturas vibracionais e rotacionais associadas.
De acordo com a teoria dos orbitais moleculares, a interaco entre
orbitais atmicos conduz formao de orbitais moleculares ligantes e anti-ligantes. Estes podem ser dos tipos ou . Existem ainda orbitais moleculares
no ligantes n, ocupados por electres que no participam na ligao.

Fig. 16.9 Formas, energias relativas dos orbitais moleculares e


transies possveis entre eles.

135

Introduo Qumica Alimentar

2009

Na maioria dos compostos orgnicos, os orbitais ligantes e no ligantes


esto preenchidos e os anti-ligantes desocupados. As transies de menor
energia (bandas no vsivel e UV prximo) so aquelas entre orbitais no
ligantes e orbitais anti-ligantes, n*. As transies n* e * possuem
energias semelhantes entre si e do origem a bandas a comprimentos de onda
superiores. As transies * ocorrem a menos de 200 nm e tm pouca
utilidade analtica. Os hidrocarbonetos saturados que so transparentes nas
zonas do vsivel e UV prximo so bons solventes para esta tcnica. As bandas
mais intensas so produzidas pelas transies * e *, enquanto as
resultantes de transies n* e n* so mais fracas.
Molculas no saturadas (cromforos) so responsveis pelas absores
n* e * adequadas a anlise quantitativa, j que produzem bandas nas
zonas do vsivel e UV prximo.
A espectrometria no ultra-violeta e vsivel usada em anlise quantitativa,
por comparao das absorvncias de padres com as das amostras, a um dado
comprimento de onda. Esta a principal aplicao desta tcnica, podendo
mesmo ser aplicada a misturas no muito complexas, devido propriedade
aditiva das absorvncias. Outras aplicaes desta espectrometria incluem a
determinao da estabilidade termodinmica ou cintica de compostos, para
estudos fundamentais ou com objectivos analticos.

A absoro de radiao electromagntica na zona do UV/vsivel seguida


pela relaxao dos estados excitados para o estado fundamental,
maioritariamente atravs de diversos processos no radiativos (relaxao
vibracional,
converso
interna
e
cruzamento
inter-sistemas).
A
fotoluminescncia um outro tipo de relaxao em que radiao de menor
energia que aquela originalmente absorvida reemitida aps a relaxao
vibracional. A fluorescncia e a fosforescncia so duas formas de
fotoluminescncia, com aplicao analtica.
Um espectro de emisso de fluorescncia resulta de transies entre o
nvel vibracional de menor energia do primeiro estado excitado e diversos nveis
vibracionais do estado fundamental (Fig. 16.10). O espectro resultante
aproximadamente uma imagem reflectida do espectro de absoro, mas
deslocado para um comprimento de onda superior devido perca inicial de
energia, causada pela relaxao vibracional. Poucos compostos so capazes de
relaxar por fluorescncia. Quase s as molculas orgnicas rgidas e estruturas
aromticas o fazem. A intensidade da emisso de fluorescncia depende do
rendimento quntico (F) o qual varia entre zero (no h fluorescncia) e um

136

Introduo Qumica Alimentar

2009

(todas as molculas no estado excitado relaxam por fluorescncia). O


rendimento quntico influenciado por factores estruturais da molcula e pela
natureza do solvente usado.

Fig. 16.10 Processos de relaxao a partir dos estados


excitados.
Existe uma relao linear entre a concentrao C de um composto
fluorescente e a intensidade da emisso IF,

I F 2.303 F I0 Cl

(16.8)

Se a intensidade da radiao incidente I0 e l forem constantes e a absorvncia


baixa (i. e. concentrao do analito reduzida) tem-se

I F kC

(16.9)

137

Introduo Qumica Alimentar

2009

A fluorimetria menos usada que a espectroscopia de absoro devido ao


limitado nmero de compostos naturalmente fluorescentes. No entanto, muitos
destes compostos podem ser derivatizados de modo a obter substncias
fluorescentes, permitindo a sua anlise. A sua utilizao predominante em
anlise quantitativa, sendo mais sensvel que a espectroscopia de absoro.

A espectrometria no infravermelho (IV) baseia-se na absoro de radiao


electromagntica na regio do infravermelho, o que provoca alteraes na
energia vibracional das molculas. Pode ser aplicada identificao e anlise
estrutural de molculas orgnicas, sendo menos usada que as duas tcnicas
anteriores para fins quantitativos. Aplica-se quer a amostras slidas, quer a
lquidas.
Uma molcula capaz de absorver energia apenas se no existir variao
no momento dipolar durante uma vibrao. A quase totalidade das molculas
poliatmicas preenche este requisito.
A espectrometria no IV apresenta dificuldades na anlise de misturas e
requer cuvettes especiais para anlise de amostras aquosas.
A complexidade dos espectros de infravermelho permite a sua utilizao
na identificao de compostos desconhecidos e na investigao de pormenores
estruturais. Os espectros so utilizados de modo emprico, por comparao com
padres e com valores encontrados na literatura.

Fig. 16.11 Espectro de IV do formaldedo, H2C=O, mostrando as


absores caractersticas.

A absoro de radiao electromagntica na regio das frequncias de


rdio d origem a variaes na orientao do spin nuclear num campo
magntico, dando origem espectrometria de ressonncia magntica nuclear

138

Introduo Qumica Alimentar

2009

(NMR). Esta tcnica permite a identificao e anlise estrutural de compostos


orgnicos e estudos cinticos, sobretudo a partir da anlise de ncleos de 1H e
13
C. Tambm apresenta potencial para estudos quantitativos, embora seja
raramente utilizada para tal fim. As suas principais limitaes so a
complexidade da tcnica, o elevado custo do equipamento e a necessidade de
utilizar solventes deuterados para a apalicao mais vulgar dos ncleos de 1H.

Fig. 16.12 Esquema geral de um espectrmetro de NMR.


As variaes de energia esto associadas orientao do eixo nuclear no
espao, relativamente a um campo magntico externo aplicado.
Todos os ncleos atmicos possuem um nmero atmico de spin I, o qual
pode ser 0, ou 1. Apenas aqueles com valor diferente de zero originam um
espectro de NMR. Como o ncleo possui uma carga, ao girar sobre o seu eixo
produz um dipolo magntico ao longo do eixo. O ncleo tambm possui um
momento angular I e, em cada istopo, os valores relativos de I e
determinam a frequncia de absoro de energia. A sensibilidade da tcnica
tambm determinada pelo valor de . 1H possui a mais elevada sensibilidade
relativa e 12C e 16O so inactivos devido possuirem I=0.
Na presena de um campo magntico aplicado, o vector do momento
pode apenas assumir um nmero limitado de orientaes espaciais. Isto , a
sua componente na direco desse campo ser um integral ou um semi-integral
I z mI

h
2

(16.10)

Iz representa a dimenso do componente do momento angular na direco do


campo z, mI = 0, , 1, , ... e h a constante de Planck. O nmero total
de valores para mI, o nmero quntico magntico, dado por 2I+1.

139

Introduo Qumica Alimentar

2009

A energia de interaco entre um ncleo e o campo magntico aplicado B


dada por
E mI

h
B
2

(16.11)

em que a razo giromagntica.

z
Iz

(16.12)

Num ncleo 1H ou 13C I , portanto mI s pode ter valores o que


origina dois nveis de energia ou estados de spin.

Fig. 16.13 Nveis de energia para 1H ou 13C.


Pode demonstrar-se que a frequncia de absoro directamente
proporcional fora do campo magntico aplicado. Na prtica, os espectros so
obtidos fazendo variar a frequncia da radiao com um campo magntico
constante ou vice-versa. Quando os ncleos dissipam energia, voltando para
um nvel inferior, emitem um sinal que tratado pelo equipamento, originando
bandas estreitas (mais largas no caso de slidos).
Os espectros de NMR de 1H e 13C exibem habitualmente vrios sinais de
absorvncia, cada qual correspondente a um ncleo ou grupo de ncleos, cuja
posio no espectro depende do ambiente qumico que rodeia o ncleo. Esta
caracterstica medida pelo desvio qumico. Cada um dos sinais produzidos
pode sofrer desdobramentos, causados por interaces com ncleos vizinhos.
Outra informao que se pode tirar de um espectro est relacionada com o
facto de que a rea de cada pico directamente proporcional ao nmero de
ncleos responsveis pelo sinal, permitindo a utilizao desta tcnica em
anlise quantitativa.
De acordo com a teoria, todos os protes (ncleos 1H) absorvem energia
com o mesmo valor do campo magntico aplicado. No entanto, o campo
sentido por um dado ncleo difere em grandeza do campo aplicado, devido ao
efeito de blindagem dos electres vizinhos. Devido s diferenas de blindagem
que os protes sofrem em diferentes ambientes qumicos, estes absorvem a

140

Introduo Qumica Alimentar

2009

valores diferentes do campo aplicado. Estas diferenas de absoro so


designadas desvios qumicos.
Os electres que rodeiam um ncleo criam um pequeno campo magntico
localizado, oposto ao campo aplicado. A dimenso do campo oposto
proporcional densidade electrnica, a qual determinada, por sua vez, pelas
electronegatividades dos ncleos vizinhos. Quanto mais electronegativo for o
tomo ao qual est ligado o proto, menor a blindagem e menor ser o campo
magntico aplicado necessrio para alcanar a condio de ressonncia. Os
desvios qumicos so medidos em unidades de frequncia (Hz) relativamente a
um padro, sendo o tetrametilsilano (TMS) o mais usado para este efeito. Na
prtica, o desvio qumico expresso em unidades adimensionais , resultantes
da diviso da frequncia do sinal pela frequncia de operao do aparelho.
Multiplicando o valor de por 106, obtm-se valores entre 0 e 15 para a maioria
dos protes orgnicos, vindo assim os desvios qumicos expressos em ppm.
O efeito de desdobramento de sinal pode ser explicado a partir do
exemplo simples da molcula C2H6. Considerando dois protes HA e HX ligados a
tomos de carbono adjacentes, possuindo diferentes desvios qumicos. O
campo sentido por HA aumenta ou diminui ligeiramente devido aos dois spins
permitidos de HX (up e down ). Deste modo, o pico de HA divide-se num
dobleto, com intensidades 1:1. O efeito recproco e os dois estados de spin de
HA causam a diviso do pico de HX num dobleto. O espao entre cada dobleto
designado por constante de acoplamento JAX, medido em Hz. Esta constante
independente do campo aplicado.
De uma forma mais geral, o nmero de picos num multipleto
determinado pelo nmero de protes no grupo adjacente n e igual a n+1.
Geralmente, protes ligados ao mesmo tomo de carbono e aqueles ligados a
tomos adjacentes mas possuindo o mesmo desvio qumico, so considerados
equivalentes e no sofrem desdobramento de sinal. As excepes a esta regra
no sero aqui consideradas.

Fig. 16.14 Exemplo do desdobramento de sinais em 1H-NMR de


C2H6.
As intensidades dos picos num multipleto seguem o tringulo de Pascal e
so resultado da distribuio estatstica das vrias combinaes possveis dos
dois estados de spin para os protes do grupo adjacente.

141

Introduo Qumica Alimentar

2009

Fig. 16.15 Desdobramento de sinais em NMR, segundo


tringulo de Pascal.
Os espectros de 13C so mais simples que os de 1H por dois motivos: a) os
desvios qumicos entre ncleos de 13C em diferentes ambientes qumicos podem
diferir at 200 ppm, enquanto que em 1H so raramente superiores a 10 ppm;
b) sendo um istopo muito menos abundante, no se observam acoplamentos
entre si.
No entanto, ocorre acoplamento entre ncleos de 13C e 1H, embora
possam ser eliminados pelo equipamento, obtendo-se assim espectros mais
simples. Este procedimento no sempre aplicado, j que em certas situaes,
este acoplamento pode fornecer informao til.

Fig. 16.16 Espectro de 13C do butano-2-ol.


Aplicando o tratamento das transformadas de Fourier (FT)
espectrometria de NMR possvel obter uma maior sensibilidade e uma maior
qualidade de informao estrutural.
A espectrometria de 1H-NMR muito til para identificao e anlise
estrutural de compostos orgnicos, sendo a interpretao dos espectros feita
por comparao com espectros de referncia e atravs da utilizao de tabelas

142

Introduo Qumica Alimentar

2009

de desvios qumicos. Esta tcnica menos utilizada em anlise quantitativa,


apesar de existir uma proporcionalidade directa entre as reas dos picos e a
concentrao do composto.

A espectrometria de massa (MS) baseia-se na ionizao e fragmentao


de materiais, atravs de diversos processos. A anlise dos fragmentos
produzidos permite obter dados estruturais e quantitativos.
As molculas so caracterizadas segundo o seu padro de ionizao e
fragmentao quando bombardeadas com electres de elevada energia, ou
ionizadas com menor fragmentao se forem utilizadas as chamadas tcnicas
suaves. No um verdadeiro mtodo espectromtrico, pois a radiao
electromagntica no absorvida nem emitida, mas os dados so obtidos em
forma de espectro, com a abundncia relativa dos fragmentos representada
como linhas. O processo de bombardeamento produz geralmente fragmentos
com carga +1, facilitando a sua separao e deteco por processos elctricos
e magnticos. Os espectros devem ser registados em condies de vcuo, de
modo a impedir a perca de fragmentos por coliso com molculas componentes
da atmosfera.

Fig. 16.17 Esquema de um espectrmetro de massa com


ionizao por impacto de electres.
Existem diversos mtodos de ionizao, adequados a diversos tipos de
molculas, das mais simples s mais complexas e com diversas gamas de
sensibilidade. Aps ionizao e fragmentao da amostra, os fragmentos
inicos so acelerados para o analisador. Os fragmentos so separados,
fazendo-os deslocar-se atravs de um campo magntico e/ou electrosttico ou
medindo o tempo que demoram a chegar ao detector.

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Introduo Qumica Alimentar

2009

Um avano que veio permitir maior fragmentao e estudo de ies


seleccionados foi a espectrometria de massa sequencial (MS/MS), a qual
envolve processos secundrios de fragmentao, geralmente induzidos por
colises com molculas de um gs inerte, contido numa clula colocada entre
dois analisadores. Se houver reciclagem de ies no sistema ou forem
adicionados mais analisadores, o processo estendido e passa a ser designado
por (MS)n.
O princpio da separao atravs de um analisador magntico pode ser
racionalizado em termos da energia cintica dos ies fragmentados, da
voltagem de acelerao V e do campo magntico B. A equao 16.13 mostra
que, para ies com carga (z) +1, a massa m directamente proporcional ao
quadrado do raio da curvatura r.

m B2r 2

z
2V

(16.13)

Num espectro de massa, o padro de fragmentao caracterstico de


cada substncia e pode ser usado para identificao da mesma. O pico derivado
do io mais abundante designado pico base. Uma ferramenta til para a
identificao de um composto a capacidade de determinar a massa molecular
relativa e estabelecer uma frmula molecular emprica. A massa molecular
relativa depende da identificao do pico do io molecular M, produzido quando
um electro ejectado da molcula (M + e- M+ + 2e-). A frmula emprica
pode ser obtida calculando as intensidades dos picos dos istopos M+1, M+2,
etc. relativamente ao pico do io molecular. Um outro auxiliar de interpretao
a regra do azoto, a qual diz que uma molcula com peso molecular par deve
conter um nmero par de tomos de azoto ou nenhum tomo de azoto.

Fig. 16.18 Espectro de massa tpico de um hidrocarboneto.

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Introduo Qumica Alimentar

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Introduo Qumica Alimentar

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Captulo 17
Ensaios Imunolgicos

Diversos procedimentos para anlise de alimentos recorrem utilizao


de ensaios imunolgicos, devido s suas especificidade, sensibilidade e
simplicidade. So empregues na anlise de resduos, identificao de bactrias
e vrus e deteco de protenas. A deteco de protenas importante no
contexto da determinao de alergnios, autenticao de espcies de carne e
deteco de plantas geneticamente modificadas.
Os antignios e os anticorpos so as duas componentes fundamentais de
qualquer ensaio imunolgico. Um antignio uma molcula que induz a
formao de anticorpos. Anticorpos so protenas produzidas por animais em
resposta a um antignio. Estas protenas ligam-se, com uma elevada afinidade,
ao antignio responsvel pela sua induo.
Um anticorpo uma molcula em forma de Y, constituda por quatro
cadeias de polipeptdeos, ligadas entre si por pontes dissulfito. Duas das
cadeias de polipeptdeos so idnticas e aproximadamente duas vezes maiores
que as outras duas, tambm idnticas entre si. O antignio liga-se em dois
stios de ligao idnticos.

Fig. 17.1 Regies estruturais de um anticorpo.

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O anticorpo liga-se parte externa do antignio numa regio especfica


(eptopo). A ligao do anticorpo ao antignio no envolve ligaes covalentes,
mas sim interaces electrostticas e de van der Waals e pontes de H.

Fig. 17.2 Representao da ligao antignio-anticorpo.


Qualquer ensaio imunolgico requer duas condies: 1) tem que existir
um mtodo para separar ou diferenciar um antignio livre de um antignio
ligado; 2) ou o antignio ou o anticorpo tm que ser quantificveis em baixas
concentraes.
A deteco em muito baixas concentraes requer marcadores muito
activos. Um dos primeiros a ser desenvolvido utiliza iodo radioactivo (131I) e
designa-se ensaio radioimunolgico (RIA).
Nos ensaios imunolgicos utilizam-se recipientes de plstico, tirando
partido da existncia de interaces hidrofbicas entre as protenas e as suas
superfcies. So habitualmente utilizadas microplacas com 96 cavidades, sendo
colocada uma amostra em cada cavidade.

Fig. 17.3 Microplaca usada em ensaios imunolgicos.

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Devido aos perigos associados aos marcadores radioactivos, foram


desenvolvidos marcadores enzimticos para os substituir. O mais popular o
ensaio imunoenzimtico ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), no qual
se usa uma enzima que deve ser muito estvel, ligar-se facilmente a antignios
ou anticorpos e catalisar rapidamente uma alterao visvel num substrato
simples. Existem trs variantes deste ensaio: sandwich, competitivo e indirecto.
Um ensaio indirecto pode ser efectuado tanto na variante sandwich como na
competitiva.
No ensaio sandwich, o antignio fica entre dois anticorpos. Este o ensaio
imunolgico mais utilizado para a identificao de protenas. Na anlise de
alimentos, este tipo de ensaios pode ser utilizado para identificar adulterantes
ou alergnios. O anticorpo de captura imobilizado num suporte e a soluo do
alimento a ser analisada -lhe adicionada. Esta soluo contm uma protena
que se comporta como um antignio especfico para o anticorpo de captura.
Aps formado o complexo anticorpo de captura-antignio, a restante soluo
removida. Aps este passo de lavagem, adiciona-se outro anticorpo ligado a
uma enzima. Este anticorpo, denominado anticorpo de deteco, tambm
reconhece o antignio. O excesso desta soluo de deteco removido e
adiciona-se um substrato incolor, que ir mudar de cor ao ligar-se enzima.
Quanto mais intensa a cor, maior o teor de antignio presente.
Para analisar componentes mais pequenos que as protenas, como
resduos de toxinas, antibiticos e pesticidas, mais adequado utilizar um
ensaio competitivo. Neste formato, o primeiro passo a imobilizao da
pequena molcula, covalentemente ligada a uma molcula maior. Esta
molcula, geralmente uma protena, funciona como transportadora e o conjunto
designado por hapteno. Em alternativa, pode imobilizar-se o anticorpo. Aps
a imobilizao, remove-se o material em excesso. De seguida, adiciona-se um
extracto de alimento e passa a existir uma competio, entre o hapteno e a
molcula livre existente no extracto, para ligao a um anticorpo marcado com
uma enzima. Aps um passo de lavagem, o anticorpo ligado ao hapteno
imobilizado permanece no meio. Quanto mais molculas alvo existirem no
extracto do alimento, mais anticorpos se ligam s pequenas molculas livres,
sendo este complexo removido no prximo passo de lavagem, pois no se
encontra imobilizado. O anticorpo ligado ser quantificado por adio do
substrato da enzima e observao da alterao de cor produzida. Neste caso,
haver uma relao inversamente proporcional entre a quantidade de analito
no extracto e a intensidade de cor.
Numa variante do ensaio competitivo, mais sensvel, liga-se uma
quantidade limitada de anticorpo placa e criada uma competio entre o
hapteno ligado enzima e a molcula livre no extracto de alimento. O passo

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2009

final, aps remoo do excesso da amostra, passa pela determinao da


quantidade de hapteno ligado enzima, atravs da medio da cor produzida.

Fig. 17.4 Ensaio imunolgico de tipo sandwich.


No ensaio imunolgico indirecto, mede-se a quantidade de anticorpo ou
hapteno indirectamente, utilizando frequentemente anticorpos anti-espcie.
Nesta variante, podem realizar-se ensaios sandwich ou competitivos. Os
anticorpos anti-espcie so obtidos a partir de anticorpos de um animal
posteriormente injectados num animal de outra espcie, estimulado o sistema
imunitrio deste de modo a produzir anticorpos que se liguem aos eptopos dos
anticorpos do primeiro animal. Depois do passo competitivo, o material em
excesso removido e adiciona-se o anticorpo anti-espcie, marcado com uma
enzima, para detectar a presena do anticorpo do primeiro animal. Este mtodo
possui elevada sensibilidade, o que em conjunto com a existncia no mercado
de diversos anticorpos anti-espcie com vrios marcadores, torna esta variante
muito til em diversos ensaios.

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Existe uma tendncia para a automao dos ensaios imunolgicos, de


modo a melhorar a sua produtividade.

Fig. 17.5 Ensaio imunolgico competitivo.


A especificidade de ligao dos anticorpos tambm permite o seu uso em
tcnicas de purificao. Na purificao por imunoafinidade, o anticorpo
imobilizado sobre um suporte (agarose ou gel de slica), servindo de fase
estacionria para separaes cromatogrficas. Estas fases podem ser
regeneradas e reutilizadas.

Fig. 17.6 Exemplo de ensaio imunolgico indirecto.


A separao por imunoafinidade tem sido utilizada para separar pequenas
molculas, como as aflatoxinas, mas tambm materiais de maiores dimenses
como clulas.

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Introduo Qumica Alimentar

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Fig. 17.7 Purificao por imunoafinidade. O antignio liga-se ao


anticorpo imobilizado na coluna, o restante material
removido e, finalmente, liberta-se o antignio por
variao do pH ou do solvente utilizado.

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Introduo Qumica Alimentar

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Captulo 18
Mtodos Analticos em Biotecnologia

Devido

crescente

introduo

de

alimentos

provenientes

da

biotecnologia agrcola, ou organismos geneticamente modificados (OGM), que


requerem anlise por motivos de segurana, nutricionais e alergnicos, tm-se
desenvolvido mtodos analticos para detectar genes inseridos, partes do ADN
ou as protenas expressadas pelos novos genes. O mtodo mais utilizado para
anlise de ADN a reaco em cadeia da polimerase (polymerase chain
reaction PCR) e para deteco de protenas utilizam-se ensaios imunolgicos
(ELISA) e com tiras de fluxo lateral (lateral flow strips - LFS).
Ao inserir novas seces de ADN nas plantas, so sintetizadas pequenas
quantidades de novas protenas e necessrio desenvolver mtodos analticos
para as diferenciar das restantes protenas, presentes em grandes
concentraes. Os mtodos usados incluem HPLC, electroforese capilar, ensaios
imunolgicos e espectrometria de massa.
Os ensaios imunolgicos, ELISA e LFS so habitualmente utilizados na
variante sandwich. Existem kits no comrcio destinados a analisar as mais
importantes culturas sujeitas a modificao gentica.
O ensaio LFS permite determinar se a concentrao de uma determinada
protena se encontra acima ou abaixo de um determinado valor. Em vez de usar
uma enzima e o seu substrato para obter um produto de reaco colorido,
como nos ensaios ELISA, o mtodo LFS utiliza pequenas partculas esfricas e
coloridas ligadas ao anticorpo, para gerar um sinal positivo. A separao da
protena alvo conseguida atravs da imobilizao do anticorpo de captura
numa zona da tira. A amostra vai atravessar essa zona por capilaridade. Um
segundo anticorpo capaz de se ligar protena de interesse ligado superfcie
das pequenas partculas coloridas. Estas partculas, revestidas com o anticorpo,
so secas numa zona da tira situada a jusante da zona de ensaio. Quando a
amostra lquida reconstitui as partculas, estas seguem o fluxo capilar da
amostra ao longo da tira. Na extermidade inicial da fibra colocado um filtro
para reter partculas de grandes dimenses que possam existir na amostra e na
outra extermidade existe uma zona absorvente.
A amostra, contendo a protena alvo, colocada em contacto com uma
amostra lquida e conduzida para a tira por capilaridade. A amostra atravessa

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Introduo Qumica Alimentar

2009

o filtro e alcana a zona em que a protena alvo se liga ao conjunto partcula


colorida anticorpo. O complexo formado flui por capilaridade e capturado
pelo anticorpo imobilizado na zona de ensaio. medida que mais complexos
vo sendo capturados, torna-se evidente uma linha colorida, indicando a
presena do antignio na amostra. Uma zona de controlo a jusante desta,
contm um reagente capaz de se ligar ao excesso de partculas que atravessa a
zona de ensaio e serve para indicar o correcto funcionamento do ensaio.

Fig. 18.1 Funcionamento de um ensaio imunolgico utilizando


tiras de fluxo lateral.
A sensibilidade dos ensaios LFS depende, sobretudo, da afinidade dos
anticorpos utilizados e , em geral, inferior dos ensaios ELISA.
O western blot um mtodo que combina dois procedimentos analticos, a
electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e um ensaio imunolgico. A
electroforese separa as protenas existentes numa mistura complexa, aps
desnaturao das mesmas, segundo o seu peso molecular. De seguida, as
protenas so transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose e o
ensaio imunolgico detecta uma dada protena, aps a separao. Para a
deteco usado, normalmente, um anticorpo marcado com uma enzima,
dando origem a uma risca colorida no local de imobilizao da protena.
A presena de caractersticas transgnicas num alimento pode tambm ser
efectuada por identificao de sequncias especficas de ADN. Os ensaios que
utilizam a reaco em cadeia da polimerase podem ter objectivos qualitativos
ou quantitativos, sendo que so mais frequentemente usados como ensaios de
varrimento. Estes servem para procurar as extremidades do fragmento de ADN
inserido.

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2009

Fig. 18.2 Ensaio western blot.


O ADN tem que ser extrado da amostra na forma mais pura possvel e
com uma boa qualidade para permitir aplicar o mtodo PCR. Aps extraco, o
ADN alvo amplificado por utilizao da PCR. Este procedimento usa uma
cadeia sinttica de ADN, com uma sequncia complementar da cadeia alvo. A
cadeia sinttica incubada com os reagentes necessrios replicao da rea
alvo. Este ADN sinttico designado por primer. Esta replicao levada a
cabo at ser produzido um nmero suficiente de cpias que permita a
deteco, usando uma reaco de separao e colorao. Esta reaco permite
obter quer a quantidade quer o tamanho da cadeia de ADN. A sequncia de
ADN pode ser posteriormente caracterizada por outros mtodos analticos que
usam enzimas de restrio ou hibridizao com sondas marcadas.
Existem diversos mtodos quantitativos, baseados na PCR em tempo real
(real-time PCR). Nesta verso, a reaco realizada num tubo fechado e a
variao na concentrao dos produtos visualizada com a ajuda de sondas
fluorescentes, as quais vo hibridizar com seces das cadeias de ADN
formado. Quando se d a ligao das cadeias, produz-se um sinal fluorescente,
o qual gravado e usado para seguir o progresso da reaco. Os dados

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permitem concluir a quantidade relativa de ADN modificado comparativamente


de ADN original.

Fig. 18.3 Amplificao de ADN atravs de PCR.

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Bibliografia

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