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Captulo 1
Biologia celular e ultraestrutura
Helene Santos Barbosa
Suzana Crte-Real
istrico
1. H
Histrico

Citologia, ou biologia celular, a cincia que estuda os vrios sistemas


celulares, a maneira como as clulas so reguladas e a compreenso do funcionamento de suas estruturas. A construo dos microscpios pticos foi um
passo decisivo para a descoberta das clulas, e acredita-se que o primeiro
tenha sido inventado em 1592, por Jeiniere da Cruz e seu pai, Zacharias
Jansen, dois holandeses fabricantes de culos. Tudo indica, porm, que o
primeiro a fazer observaes microscpicas de materiais biolgicos foi o holands Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723). O microscpio simples com
apenas uma lente, construdo por Leeuwenhoek, foi aprimorado por Robert
Hooke em 1665, ganhando mais uma lente.
A partir dos estudos de Hooke em biologia, publicados em um livro
intitulado Micrographia (1665), que analisou cortes finos de cortia obtidos
da casca do sobreiro, verificou que estes eram constitudos por pequenas
cavidades polidricas (no latim, cella), as quais foram denominadas clulas.
Estes compartimentos representavam as paredes das clulas vegetais mortas. Em

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1838, o botnico alemo Matthias Schleiden descreveu que a clula era a


unidade bsica de todas as plantas e, mais tarde, em 1839, o zologo alemo
Theodor Schwann chegou mesma concluso para os animais. Com base
nestes conhecimentos, elaborou-se a teoria celular que foi proposta por Schleiden
e Schwann. Posteriormente, a associao de tcnicas de colorao e de
citoqumica foi capaz de revelar as estruturas e a fisiologia das clulas.
O grande avano no conhecimento da biologia celular, sem dvida, foi
a inveno dos microscpios eletrnicos em 1931, por dois engenheiros
alemes Ernst Ruska e Max Knoll , o que possibilitou a visualizao das
organelas celulares em grande detalhe.
A clula uma unidade funcional que estabelece interao entre seus
componentes, sob o aspecto fisiolgico, biossinttico e reprodutivo. A dinmica celular para a manuteno da vida regida por um processo de
automanuteno, que compreende a modificao de estruturas, a substituio
de componentes, de tal forma articulada que garanta a sua organizao estrutural e funcional.
2. Clulas procariticas e eucariticas

A divergncia entre procariontes e eucariontes deve ter ocorrido aps


serem estabelecidos os mecanismos de replicao e transcrio do cido
desoxirribonucleico (DNA), a traduo, o sistema de cdons e os metabolismos energticos e biossintticos. O principal critrio de distino entre estes
grupos a sua organizao celular. As clulas procariticas (do latim proprimeiro e cario-ncleo) so relativamente simples e se caracterizam por no
apresentarem membrana, segmentando os cidos nucleicos DNA) e ribonucleicos
(ARN) do citoplasma. Alm disso, algumas destas clulas apresentam uma
membrana plasmtica circundada externamente pela parede celular. As clulas
eucariticas (do latim eu-verdadeiro e cario-ncleo) constituem o tipo celular
da constituio dos fungos, protozorios, animais e plantas. Estruturalmente,
so clulas mais complexas, ricas em membranas que formam compartimentos,

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ou seja, uma diviso de funes metablicas entre as organelas citoplasmticas


e o ncleo, circundado pelo envoltrio nuclear, onde est contido todo seu
material gentico. Para os eucariontes, a compartimentalizao de atividades
celulares em organelas circundadas por membranas fosfolipdicas foi decisiva
para a homeostase celular.
Os componentes das clulas eucariticas (Figura 1) compreendem: a membrana citoplasmtica, o citoplasma, o ncleo, o retculo endoplasmtico, o complexo de Golgi, os lisossomos, as mitocrndrias, os peroxissomos, as incluses lipdicas,
o glicognio, o citoesqueleto, os centrolos, o centrossomo, os cloroplastos (encontrados em vegetais) e a parede celular, sendo esta ltima encontrada em fungos
e vegetais. As caractersticas morfolgicas e fisiolgicas das principais estruturas
encontradas nas clulas eucariticas sero apresentadas a seguir.
Figura1. Clula eucaritica mostrando membrana plasmtica, ncleo (N) e organelas.

2.1. Membrana celular

A membrana plasmtica ou celular atua na manuteno de microambientes,


formando uma barreira que impede o contedo celular de escapar e se misturar
com o meio circundante. Esta membrana confere individualidade a cada clula,

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definindo os meios intra e extracelulares. Alm desta funo, a membrana


plasmtica o primeiro contato entre esses meios, traduzindo informaes para
o interior da clula e permitindo que ela responda a estmulos externos que
podem influenciar nas suas funes biolgicas, participando decisivamente das
interaes clula clula e clula matriz extracelular.
A membrana plasmtica e a membrana das diferentes organelas celulares
medem cerca de 7 a 10 m de espessura e so visveis somente ao microscpio eletrnico. Trata-se de uma estrutura trilaminar constituda de duas camadas
eletrondensas (escuras) e uma camada eletronlcida (clara) central. Molecularmente
so formadas por uma bicamada fluda de fosfolipdios (fosfoglicerdeos e
esfingolipdios) e colesterol, onde esto inseridas molculas de protenas. A
membrana plasmtica no uma estrutura esttica, os lipdios movem-se proporcionando fluidez membrana.
Esquema mostrando a bicamada da membrana plasmtica:
Figura 2. A membrana plasmtica formada por molculas de lipdeos (fosfoglicerdeos
e esfingolipdeos), colesterol, protenas perifricas (localizadas somente em uma das
camadas dos fosfolipdeos) e as transmembranares (localizadas nas duas camadas
dos fosfolipdeos, ligando o meio extracelular ao citoplasma). A cadeia de pequenas molculas verdes representa os carboidratos localizados somente no lado externo da membrana plasmtica.

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Os carboidratos presentes nesta estrutura, como, por exemplo, glicose,


manose, fucose e galactose, esto ligados s protenas, formando as glicoprotenas;
ou aos lipdios, resultando nos glicolpidios e nos glicoesfingolipdios. Estes
carboidratos esto presentes apenas na face externa da membrana e fornecem identidade clula.
A membrana apresenta uma propriedade imprescindvel para manuteno da viabilidade celular, que a permeabilidade seletiva, controlando
a entrada e a sada de substncias da clula. A passagem de molculas polares
maiores e os ons requer canais, formados por protenas transmembranares.
O transporte de molculas para o interior das clulas pode ser:
a) transporte passivo por difuso ou por osmose, quando no envolve o consumo de energia do sistema, sendo utilizada apenas a energia
cintica das molculas. Sendo assim, a movimentao dos ons e molculas d-se a favor do gradiente de concentrao (do meio hipertnico
para o meio hipotnico). A difuso pode ser auxiliada por enzimas
(difuso facilitada) ou pode no ter participao de nenhuma delas
(difuso simples). A difuso simples ocorre quando molculas hidrofbicas
pequenas e polares, como O2, CO2, N2 e C6 H6, passam pela
membrana sem serem bloqueadas;
b) transporte ativo quando o transporte das molculas envolve a
utilizao de energia pelo sistema, na forma de adenosina trifosfato
(ATP). A movimentao das substncias se d contra o gradiente de
concentrao, ou seja, do meio hipotnico para o hipertnico, como,
por exemplo, a bomba de sdio e potssio, que tem funo de manter
o potencial eletroqumico das clulas.
Entretanto, partculas maiores no conseguem atravessar a membrana,
mas podem ser incorporadas clula pela prpria estrutura da membrana
celular, ocorrendo, assim, a formao de vesculas. A este processo, no qual a
membrana celular envolve partculas ou fluido do exterior, d-se o nome de
endocitose. Ele ocorre por dois mecanismos:

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a) fagocitose quando ocorre a captao de molculas maiores, partculas ou microrganismos. Neste processo, a partcula a ser ingerida toca
na membrana celular, formando projees chamadas de filopdios;
b) pinocitose processo utilizado pela clula para englobar pores
de fluidos extracelulares e pequenas molculas. Neste caso, a membrana sofre um processo de invaginao, ocorrendo a formao de
pequenas vesculas. Estas so direcionadas para o citoplasma para que
ocorra a absoro dos nutrientes. Por outro lado, para eliminar substncias residuais, a clula utiliza o processo de exocitose, no qual uma
vescula, vinda do citoplasma contendo material que deve ser eliminado, se funde membrana plasmtica, lanando o seu contedo no
meio extracelular.
2.1.1. Especializaes da membrana plasmtica

A comunicao e a coeso entre as clulas so estabelecidas por meio


das membranas, formando trs classes funcionais de junes celulares:
a) juno ancorante ou aderente clula-clula ou clula-matriz, s
quais a fora de estresse transmitida ao citoesqueleto. Existem vrios
tipos desta juno; destacamos, dentre eles, os desmossomas, os
hemidesmossomas e junes que circundam completamente as clulas,
atuando como uma barreira de permeabilidade e tenso;
b) juno apertada ou oclusiva (tight junctions) um tipo de juno
que liga duas clulas vizinhas, selando os espaos entre elas e tornando
essa regio impermevel, no permitindo, assim, a passagem de pequenas molculas ou ons;
c) juno mediada por canais proteicos so as junes comunicantes
(gap junctions) que permitem a passagem de molculas e de ons entre
duas clulas adjacentes.

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2.2. Citoplasma

O citoplasma, ou citossol das clulas eucariotas, formado por uma


soluo coloidal, viscosa e de aspecto relativamente uniforme, que contm
gua (80%), ons diversos, aminocidos e protenas. No citoplasma esto
localizados o ncleo e as organelas celulares, o retculo endoplasmtico, o
complexo de Golgi, os lisossomos, as mitocndrias, os peroxissomos e, ainda,
as incluses lipdicas, os grnulos de glicognio e os ribossomos. Estas estruturas so responsveis pelas funes celulares, como digesto, respirao, secreo, sntese e transporte de protenas. No citoplasma esto tambm os elementos do citoesqueleto, responsveis por vrias atividades dinmicas das clulas, e os centrolos, estruturas geradoras dos microtbulos.
2.3. Ncleo

Estrutura extremamente importante para as clulas eucariticas, pois


nele esto contidos os cidos nucleicos (cdigo gentico), protegidos pelo
envoltrio nuclear. no seu interior que ocorre a duplicao do DNA e a
transcrio dos ARNs.
O ncleo tem sua localizao geralmente no centro da clula e a sua
forma pode estar relacionada ao tipo celular. O envoltrio nuclear composto
por duas membranas, uma externa e outra interna, com composies proteicas
distintas, que delimitam um espao varivel que oscila entre 40 e 70 mm. A
membrana interna deste envoltrio se encontra associada lmina nuclear, que,
por sua vez, est ligada fortemente cromatina. A membrana externa do envoltrio
circunda a membrana interna e contnua com a membrana do retculo
endoplasmtico (RE). Este fato faz com que o espao existente entre as membranas do envoltrio seja tambm contnuo luz do RE. Assim como a membrana
do RE, a membrana externa do envoltrio face citoplasmtica apresenta
ribossomos aderidos que esto envolvidos ativamente na sntese proteica. O
envoltrio nuclear interrompido regularmente, formando os poros nucleares.

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Eles tm nmero e densidade bastante variveis, dependendo do tipo celular e


estado metablico da clula. Pelos poros, ocorre o transporte bidirecional seletivo de protenas e ARNs entre o citossol e o ncleo.
No ncleo (Figura 3) de clulas em intrfase encontra-se a cromatina
compactada (heterocromatina) ou frouxa (eucromatina) composta de molculas de DNA, protenas histnicas e no histnicas. As histonas, protenas bsicas
encontradas nos eucariotos, so importantes componentes da estrutura da cromatina,
participando no somente como repressoras, mas tambm como ativadoras na
transcrio do DNA. Por outro lado, as protenas no histnicas desempenham
papel estrutural e enzimtico, participando da atividade gnica.
No ncleo interfsico tambm esto os nuclolos, cuja funo sintetizar
ARNs e envi-los para o citoplasma. Os nuclolos podem ter estrutura reticular
ou compacta e o tamanho e a forma dependem do estado funcional da clula,
variando conforme o tipo celular. Durante o ciclo celular, geralmente os nuclolos
desaparecem a partir do final da prfase, reaparecendo no final da telfase.
A lmina nuclear est presente no ncleo, tendo papel importante na
reorganizao nuclear aps o trmino da diviso celular. Ela est ancorada s
protenas integrais da membrana interna do envoltrio nuclear e ligada fortemente cromatina. constituda por protenas filamentosas intermedirias do
tipos A e B que se polimerizam em uma rede bidimensional.
Da estrutura do ncleo faz parte a matriz nuclear, que forma uma rede
proteica fibrogranular alicerando o ncleo. Ela est associada ao DNA durante os processos de duplicao e regula a transcrio nos eucariotos, juntamente
com as histonas.

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Figura 3. (A) Moncitos mostrando o ncleo ocupando grande extenso do


citoplasma da clula; (B) clula eucaritica, apresentando ncleo com poros
(setas) e mitocndrias (M).
(A)

(B)

2.4. Retculo endoplasmtico

O retculo endoplasmtico (RE) encontrado na maioria das clulas,


ocupando cerca de 10% do volume celular. formado por uma rede de
membranas interconectadas na forma de tubos ou cisternas. Dois tipos de
retculo endoplasmtico so observados: liso (ou agranular) e rugoso (ou
granular), os quais apresentam caractersticas morfolgicas e funcionais distintas.
O retculo endoplasmtico liso, ou agranular, caracterizado pela ausncia de ribossomos aderidos sua membrana e apresenta-se como uma rede
de delgados tbulos que se anastomosam entre si. As funes desse retculo
so muito variadas, dentre elas a sntese de hormnios e de lipdios, a
desintoxicao celular com a converso de substncias nocivas lipossolveis
ou insolveis em compostos hidrossolveis e o armazenamento de clcio.
O retculo endoplasmtico rugoso (Figura 4), ou granular, caracterizado pela presena de polirribossomos (ribossomos e ARNm) aderidos ao lado
externo da membrana. Esta organela apresenta formas variadas, frequentemente
em forma de tbulos achatados e longos ou bem dilatados, podendo estar

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localizada em vrios pontos da clula ou concentrada em determinadas reas


do citoplasma. O RE rugoso, em parceria com os polirribossomos, tem um
importante papel na sntese e exportao de protenas. As protenas so capturadas pelo RE, por receptores presentes na sua membrana, assim que comeam a
ser sintetizadas pelo complexo de ribossomos e ARNm. As protenas sintetizadas podem ter dois destinos: como protenas transmembranares ou protenas
hidrossolveis. As protenas transmembranares podem permanecer na membrana do retculo ou serem destinadas membrana plasmtica e membrana de
outras organelas. Por outro lado, protenas hidrosolveis, quando sintetizadas,
podem ser direcionadas para o complexo de Golgi ou encaminhadas ao lmen
de alguma organela e secretadas no meio extracelular.
Figura 4. Retculo endoplasmtico rugoso (RE) dilatado de fibroblasto, apresentando ribossomos aderidos membrana.

2.5. Complexo de Golgi

O complexo de Golgi, aparelho de Golgi ou simplesmente Golgi


(Figura 5) foi descrito em 1898 pelo bilogo italiano Camilo Golgi e
formado por vesculas e tbulos achatados empilhados e organizados, chama-

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dos de cisternas (cerca de 4 a 8 cisternas). As cisternas voltadas para o


retculo endoplasmtico so convexas (cisternas cis). As centrais so denominadas cisternas medianas, e as mais prximas ao stio de secreo so cncavas
(cisternas trans). O complexo de Golgi apresenta como principais funes o
processamento de lipdeos e protenas (denominados de glicosilao, sulfatao
e fosforilao) e a separao e o endereamento de molculas sintetizadas
fazendo parte da via biossinttica secretora (RE sntese; Golgi processamento
e seleo; vesculas transporte). As vias secretoras compreendem o transporte de lipdeos, protenas e polissacardeos aos destinos finais e o empacotamento
das macromolculas em diferentes vesculas de transporte. Essas vesculas transportadoras direcionam protenas/lipdeos/hormnios do retculo endoplasmtico
para o complexo de Golgi (face cis); o transporte de protenas/lipdeos (modificados) do complexo de Golgi para o retculo endoplasmtico (face cis) e
para a superfcie celular (face trans) e, ainda, o transporte das molculas que
originam os lisossomos (face trans).
Figura 5. Citoplasma de clula eucaritica apresentando complexo de Golgi
(G) com suas cisternas empilhadas, vesculas e mitocndrias.

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2.6. Lisossomos

Os lisossomos so estruturas geralmente esfricas, delimitados por uma


membrana, que apresentam uma grande variao no seu tamanho. Eles so
formados no complexo de Golgi, e em seu interior se encontram acumuladas
cerca de quarenta enzimas hidrolticas com propriedade de digerir uma grande
gama de substratos, incluindo nucleases, proteases, glicosidases, lipases,
fosfolipases e sulfatases. Estas hidrolases tm um pH timo entre 3 e 6, e,
assim, o interior dos lisossomos cido. A acidificao realizada por bombas
de H+, que usam ATP. As suas enzimas so glicoprotenas provenientes do
Golgi, que saem da sua face trans em vesculas especficas. A compartimentalizao
destas enzimas impede a lise indiscriminada dos contedos celulares. A principal funo do lisossomo a digesto intracelular, permitindo, assim, que a
clula seja capaz de degradar partculas, macromolculas, microrganismos ou
outras clulas provenientes da endocitose. Alm disso, os lisossomos agem na
eliminao de organelas ou partes danificadas da prpria clula, por um processo denominado autofagia. A formao dos autolisossomos se inicia quando uma poro de RE envolve uma organela que deve ser destruda, formando
uma vescula em seu redor. Esta vescula posteriormente acidificada e fundese com um lisossomo primrio, que inicia a degradao. Na heterofagia, os
lisossomos fundem-se com endossomos (provenientes da endocitose) ou
fagossomos (provenientes da fagocitose).
2.7. Mitocndrias

As mitocndrias (Figura 6) esto presentes no citoplasma das clulas


eucariticas, sendo caracterizadas por uma srie de propriedades morfolgicas,
bioqumicas e funcionais. Geralmente, so estruturas cilndricas, podendo ser
esfricas, ovoides e alongadas, com aproximadamente 0,5 mm de dimetro e
vrios micrmetros de comprimento. Possuem grande mobilidade, localizandose em stios intracelulares onde h maior necessidade de energia, pois sua
funo principal a produo de ATP. Uma clula heptica normal pode

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conter de 1.000 a 1.600 mitocndrias, enquanto alguns ovcitos podem


conter at 300 mil. Possuem organizao estrutural e composio lipoproteica
caractersticas, e contm um grande nmero de enzimas e coenzimas que
participam das reaes de transformao da energia celular. Esta organela
caracterizada pela presena de um envoltrio formado por duas membranas
estrutural e funcionalmente distintas, as quais delimitam dois espaos. Existe um
espao intermembranar separando as membranas interna e externa, e um segundo gerado pela membrana interna, delimitando a matriz mitocondrial. A membrana interna apresenta uma srie de invaginaes para o interior da mitocndria,
gerando as cristas mitocondriais, onde esto presentes os componentes da
cadeia respiratria responsveis pela sntese de ATP. As mitocndrias apresentam uma molcula de DNA circular, semelhante quelas encontradas nas bactrias. Alm disso, contm todo mecanismo necessrio para replicao e transcrio do DNA e traduo de protenas. Entretanto, apenas uma pequena
quantidade de protenas codificada pelo DNA mitocondrial. Com base
nessas evidncias, surge a teoria endossimbitica.
A mitocndria considerada a usina da clula, uma vez que esta
capaz de processar oxignio e glicose e convert-los em energia na forma de
ATP, por meio do ciclo de Krebs e da cadeia respiratria.
Figura 6. Fibroblasto: mitocndrias apresentando a matriz mitocondrial eletrodensa,
cristas mitocondriais e a dupla membrana.

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2.8. Peroxissomos

Os peroxissomos (Figura 7) so organelas envolvidas por apenas


uma membrana e no contm DNA e nem ribossomos; todas as suas
protenas devem ser importadas do citosol. Apresentam em seu interior um
contedo granuloso fino e so geralmente arredondadas, medindo cerca
de 0,5mm de dimetro. No seu interior, comum se observar a presena
de uma poro fortemente eletrodensa, o nucleoide. Dentre as enzimas
encontradas nos peroxissomos destacam-se a catalase, a urato oxidase, a Daminocido oxidase e as enzimas responsveis pela beta oxidao dos cidos
graxos. Os peroxissomos assemelham-se ao retculo endoplasmtico porque
se autorreplicam sem possuir genomas prprios. Nas clulas animais, os
peroxissomos participam da biossntese de precursores de glicerolipdeos, do
colesterol e do dolicol. O nmero relativo de peroxissomos na clula pode
variar rapidamente em resposta s mudanas ambientais e s condies fisiolgicas. Os processos de sequestro e degradao dos peroxissomos so denominados macroautofagia e microautofagia.
2.9. Incluses lipdicas

Incluses lipdicas (tambm chamadas de corpos lipdicos, gotas lipidcas


ou adipossomas) so organelas ricas em lipdios presentes em todos os organismos, incluindo fungos, procariotos e eucariontes. Elas variam de tamanho, tm
aspecto circular e esto distribudas por todo o citoplasma das clulas.
Os corpos lipdicos so circundados no pela clssica bicamada de
membrana, mas por uma monocamada de fosfolipdios, a qual, no mnimo em
algumas clulas, deve ter uma nica composio de cidos graxos. O ncleo
interno dos corpos lipdicos rico em lipdios neutros, mas estudos com
leuccitos tm demonstrado que os corpos lipdicos no so simples sacos de
lipdios neutros. Considera-se atualmente que sejam organelas funcionalmente
ativas, altamente reguladas e dinmicas. Pelo uso de tcnicas para identificao

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subcelular de fraes enriquecidas de corpos lipdicos, combinado com


imunodeteco de protenas por microscopia eletrnica e de luz, tem sido
demonstrado que corpos lipdicos compartimentalizam enzimas envolvidas na
biossntese, transporte e catabolismo de lipdios, caveolina e de protenas
envolvidas no transporte vesicular. A formao regulada de corpos lipdicos,
seus contedos proteico e lipdico, e sua associao com outras organelas
intracelulares, em algumas clulas especializadas, atuam na sinalizao e ativao
celulares, regulao do metabolismo de lipdios, trfego de membrana e controle da sntese e secreo de mediadores inflamatrios.
Figura 7. Incluses lipdicas.

2.10. Glicognio

O glicognio (Figura 8) um polissacardeo constitudo por subunidades


de glicose com uma ramificao a cada oito ou dez unidades. Ocorre internamente, na forma de grandes agregados ou grnulos no citoplasma. o meio
de armazenamento mais importante nas clulas animais, servindo de reservatrio
de glicose. Os hepatcitos so responsveis pela manuteno da glicemia, ao

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mesmo tempo em que fornecem glicognio para outras clulas do organismo.


Principal fonte de energia no crebro, os glicognios produzidos pelos astrcitos
so mobilizados para atividade neuronal.
Figura 8. Glicognio distribudo no citoplasma de clula eucaritica.

2.11. Citoesqueleto

O citoesqueleto confere s clulas eucariticas a manuteno da diversidade de formas, a realizao de movimentos coordenados e direcionados e
sua estruturao interna. Esse citoesqueleto depende de uma complexa rede
de filamentos de protenas que se estende por todo o citoplasma, sendo
constitudo por trs principais tipos de estruturas: os microtbulos, os filamentos
intermedirios e os filamentos de actina.
Os microtbulos so formados por subunidades: b-tubulina e a-tubulina,
as quais se associam uma s outras, conferindo-lhe assim uma forma cilndrica,
com o dimetro de 25 mm. Os microtbulos direcionam o deslocamento de
vesculas, participam da diviso celular com a formao do fuso mittico para o
deslocamento dos cromossomos e esto presentes na manuteno da estrutura
celular e na morfologia dos clios e flagelos.

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Os filamentos intermedirios recebem esta denominao por apresentarem um dimetro intermedirio entre filamentos de actina e microtbulos (10
mm de dimetro). Sua composio proteica, formando uma rede estrutural
por toda a clula.
Os filamentos de actina (Figura 9) esto distribudos por todo o citoplasma
das clulas eucariticas e apresentam dimetro de 5 mm. Eles so formados por
uma protena globular, a actina, que apresenta as isoformas: a, b e g. Estes
filamentos, nas clulas epiteliais, esto concentrados nos prolongamentos
citoplasmticos, participando, juntamente com os desmossomos, do contato
com outras clulas e com a membrana basal, mantendo, assim, a integridade
organizacional do epitlio. Nos miofibroblastos, importantes clulas do tecido
muscular, os filamentos de actina esto organizados paralelamente membrana
plasmtica, mantendo estas clulas tensionadas ao substrato e so, ento,
denominados fibras de estresse.
Figura 9. Fibra estresse (asterisco) localizada abaixo da membrana, formada por
microfilamentos de actina.

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2.12. Centrossomo

O centrossomo, principal centro organizador de microtbulos, est localizado prximo ao ncleo da clula em intrfase e contm um par de formaes cilndricas e curtas dispostas perpendicularmente entre si e envolvidas por
material pericentriolar, denominadas centrolos. Estas estruturas so formadas
por nove triplex de microtbulos, semelhantes aos corpos basais de flagelos e
clios. Esto presentes na maioria das clulas animais, porm ausentes nas
clulas vegetais.
3. Tcnicas para visualizao das organelas celulares
3.1. Protocolos para revelao do ncleo

O ncleo pode ser visualizado tanto por microscopia de campo claro,


com a utilizao do corante Giemsa, quanto por microscopia de fluorescncia,
utilizando o corante fluorescente DAPI (4,6-diamidino-2-phenilindole). Por
ME, ele pode ser visualizado quando se utiliza acetato de uranila, que torna a
cromatina eletrodensa.
3.1.1. Marcao nuclear com DAPI

1- Fixar com 4% de PFA por 20 minutos a 4C;


2- Lavar duas vezes com PBS;
3- Lavar duas vezes com soluo de BSA 1% diluda em PBS
por 10 minutos cada;
4- Incubar com DAPI 1:10.000 em 0,85% NaCl por 5 minutos
em temperatura ambiente;
5- Lavar trs vezes com soluo de BSA 1% diluda em PBS
por 10 minutos cada;
6- Montar com DABCO;
7- Selar com esmalte.

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3.1.2. Colorao com Giemsa

1- Fixar com Bouin por 5 minutos em temperatura ambiente;


2- Lavar trs vezes com lcool etlico a 70%;
3- Lavar uma vez com gua destilada;
4- Corar com Giemsa (6 gotas de corante para cada 1mL de tampo

fosfato 0,2M soluo de uso filtrado), por 15 minutos em temperatura ambiente;


5- Lavar duas vezes em gua destilada. Para clarificao, passar em

srie de acetona / xilol (acetona 100% duas vezes, acetona 70% /


xilol 30%, acetona 50% / xilol 50%, acetona 30% / xilol 70%,
xilol 100% duas vezes);
6- Montar com Permount.

Preparao do tampo fosfato 0,2M:


Soluo A:
NaH2PO4 . 1 H2O (fosfato de sdio monobsico) ................. 27,6 g
gua tridestilada.......................................................................... 1 L
Soluo B:
Na2HPO4 (fosfato de sdio bibsico)...................................... 39,4 g
gua tridestilada.............................................................................1L
Soluo estoque do tampo:
Soluo A................................................................................28 mL
Soluo B.................................................................................72 mL
Soluo de uso:
Diluir 1:10 (soluo estoque: gua tridestilada).

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3.2. Protocolo de marcao do retculo endoplasmtico

O RE pode ser observado por microscopia de fluorescncia pela utilizao de marcador fluorescente especfico, o ER-Tracker. E, por microscopia
eletrnica de transmisso, utilizando-se citoqumica ultraestrutural, revelando a
enzima glicose-6-fosfato.
3.2.1. ER-Tracker

Preparao de reagentes
O ER-Tracker Green fornecido liofilizado em 100 mg. Preparar uma
soluo estoque de 1mM. Para isso, deve-se diluir todo o contedo do frasco
liofilizado em 128 mL de DMSO. recomendado que esta soluo seja
separada em alquotas e estocada em freezer com dessecante.
Preparo da soluo de marcao
Diluir a soluo estoque de ER-Tracker a 1 mm para a concentrao
recomendada de 500 mm em meio simples;
Para clulas aderidas, remover o meio da cultura, lavar trs vezes com

meio simples e adicionar a soluo de marcao pr-aquecida. Incubar


as clulas por 30 minutos a 37 C. Substituir a soluo de marcao
por meio de cultura e visualizar as clulas, utilizando microscpio de
fluorescncia. Se as clulas a serem marcadas precisarem ser fixadas,
consultar as etapas de marcao a seguir.
Fixao das clulas ER-Tracker Green
Lavar as clulas em meio simples por trs vezes. Fixar com PFA 4% por
20 minutos em temperatura ambiente. Lavar trs vezes com PBS, montar entre lmina e lamnula com DABCO.

Biologia Celular e Ultraestrutura

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3.3. Protocolo para marcadores seletivos de mitocndria

Mitocndrias podem ser reveladas com marcadores fluorescentes especficos, como MitoTracker e Rhodamine 123, os quais so visualizados por
microscopia de fluorescncia. Graas sua morfologia tpica, so facilmente
identificadas durante as anlises por microscopia eletrnica.
3.3.1. Mito-Tracker
Preparando a soluo estoque

Dissolver o produto liofilizado em DMSO de alta qualidade para uma


concentrao final de 1 m; o peso molecular indicado no rtulo do
produto. Solues em que se utilizam derivados di-hidro devem ser
preparadas no dia do uso. A soluo estoque pode ser armazenada em
freezer a -20 C, protegida da luz.
Preparando soluo de marcao

A concentrao para uma boa marcao varia de acordo com a sua


aplicao. As condies sugeridas aqui podem necessitar de modificaes baseadas nos tipos celulares utilizados ou em outros fatores, tais
como permeabilidade das clulas ou dos tecidos a serem marcados.
Diluir a soluo estoque de MitoTracker a 1 mm para uma soluo de
uso com meio de crescimento Dulbeccos modified Eagle medium
(D-MEM), sem soro, ou de acordo com o meio em que as clulas
esto crescendo. Para marcao em clulas vivas, usar uma concentrao
de 100 mm.
Marcando clulas aderidas

Crescer as clulas em lamnulas dentro de uma placa de Petri coberta


pelo meio de cultura apropriado. Quando as clulas alcanarem a confluncia desejada, remover o meio da placa, lavar trs vezes em meio
simples e adicionar o meio pr-aquecido (37 C) contendo MitoTracker.
Incubar as clulas por 30 minutos sob condies de crescimento apro-

40 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

priadas para cada tipo celular. Substituir o meio com marcador por meio
pr-aquecido e observar as clulas em microscpio de fluorescncia,
utilizando o filtro adequado. Para fixar as clulas, deve-se retirar o meio
com marcador e lav-las com meio simples. Fixar com PFA 4% por 20
minutos em temperatura ambiente, lavar trs vezes com PBS e montar
entre lmina e lamnula com DBCO.
3.4. Protocolo de marcao de grnulos de glicognio

Para caracterizar a expresso de polissacardeos grnulos de glicognio ,


utilizamos mtodos citoqumicos ultraestruturais, empregando a tcnica de Thiry.
O material deve ser processado de acordo com o protocolo de microscopia
eletrnica de transmisso, sendo as amostras includas em resina Epon. Os
cortes ultrafinos so obtidos e recolhidos em grades de ouro e submetidos ao
seguinte protocolo:
3.4.1. Thiry

1- As clulas so oxidadas por 20 minutos com 1% de cido peridico;


2- Lavadas rapidamente por duas vezes em gua destilada;
3- Incubadas por 30 minutos, 24, 48 ou 72 horas, em cmara mida,
com 2% de tiocarbohidrazida diluda em 20% (v/v) de cido actico;
4- Lavadas sucessivamente em concentraes decrescentes de cido
actico (10%, 5%, 3% e 1%) por 1 minuto cada;
5- Reveladas com 1% de proteinato de prata diludo em soluo aquosa
por 30 minutos. OBS: metodologia alternativa, aps as etapas descritas
anteriormente, a revelao ser realizada pelo vapor de tetrxido de
smio por 1 minuto;

Biologia Celular e Ultraestrutura

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6- Lavadas com gua (uma vez rapidamente), seguidas de uma lavagem


por 10 minutos, trocando a gua sucessivas vezes;
7- Ao final, os cortes sero examinados diretamente ao microscpio
eletrnico EM10C da Zeiss, sem prvia contrastao.
Os controles da reao sero feitos por:
a) Omisso de tiocarbohidrazida;
b) Omisso da oxidao com cido peridico;
c) Omisso dos agentes reveladores.
3.5. Protocolo para marcao de compartimentos
intracelulares cidos

A marcao de compartimentos intracelulares cidos lisossomos


pode ser feita utilizando os marcadores laranja de acridina e Lysotraker:
1- Diluir a soluo estoque a 1 mM para uma soluo de uso a uma
concentrao de 75 nM. A diluio deve ser feita em meio de cultura
simples;
2- Remover o meio da placa, lav-la com meio simples trs vezes e
adicionar o meio pr-aquecido (37 C) contendo o marcador;
3- Incubar as clulas com laranja de acridina ou Lysotraker diluda em
meio utilizado para o cultivo celular na concentrao de 10mg/ml e
75 nM, respectivamente, por 30 minutos a 37 C, sob condies
apropriadas para crescimento de cada tipo celular;
4- Aps incubao, lavar duas vezes em salina tamponada com fosfato
(PBS) e observar as clulas em microscpio de fluorescncia com o
filtro adequado;
5- Fixar com 2% paraformaldeido durante 20 minutos a 4 C e, em
seguida, lavar trs vezes com PBS;

42 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

6- Em seguida, incubar com 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)


para visualizao do ncleo por cinco minutos temperatura ambiente;
7- Lavar com PBS;
8- Montar a lmina com antifading 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane
(DABCO).
Referncias bibliogrficas
ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da clula. 4. ed. Porto Alegre: Artes Mdicas,
2004.
CARVALHO, H. F.; RECCO-PIMENTEL, S. M. A Clula. So Paulo: Manole, 2001.
GIEMSA, G. Eine Vereinfachung und Vervollkommung meiner Methylenblau-EosinFrbemethode zur Erzielung der Romanowsky-Nochtschen Chromatinfrbung. Centralblatt
fr Bakteriologie, I, Abteilung Originale, v. 32, p. 307-313, 1904.
THIRY, J. P.; RAMBOURG, A. Cytochimie des polysaccharides. J. Microscopie, v.
21, p. 279-282, 1974.