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INTROCUCCION
Los resultados de produccin in vitro de embriones en distintas especies fueron
mejorando significativamente a medida que avanzaron los conocimientos
acerca de sus requerimientos. Para ello, fue necesario transformar los medios
de cultivos primitivos, muy complejos y suplementados frecuentemente con
suero, en medios ms definidos, en los cuales cada uno de sus componentes
pudiera ser estudiado en funcin del efecto que genera sobre el desarrollo
embrionario, su sobrevida poscriopreservacin, la tasa de gestacin y el
porcentaje de cras viables.

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FERTILIZACION IN VITRO

La fertilizacin in vitro es una biotecnologa reproductiva de alta complejidad,

con la cual se obtienen embriones viables en condiciones de laboratorio que
pueden ser implantado en teros con ciclos sincronizados, aptas para la
gestacin.
Para esta tcnica se utilizan ovocitos inmaduros de un ovario sin tener en
cuentas las caractersticas fisiolgicas de la hembra
EQUIPOS DE LABORATORIO
1.
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3.
4.
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6.
7.
8.
9.

Heladeras
Autoclave
Horno
Destilador de agua
Ultra purificador de agua
Balanza de precisin
Micro pipetas automticas
Bao mara
Plantillas calientes

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10. Mechero
11. Lupas estereoscpicas y microscpicas
12. Centrifuga
13. Termo de nitrgeno
14. Cabina de flujo laminar
15. Estufa de flujo de conexin a CO2
16. Congelador automtico de embriones

Tcnica de aspiracin folicular OPU

Esta tcnica permite recoger ovocitos en las hembras de ms de seis meses de
edad, durante los primeros tres meses de gestacin y a partir de las 2-3
semanas del postparto, por lo que no interfiere con los ciclos productivos o
reproductivos de las hembras donantes.
La aspiracin transvaginal guiada por ultrasonido es la tcnica de recoleccin
de ovocitos de hembras vivas usada regularmente. La aspiracin folicular
puede ser repetida en el mismo animal durante 5-6 meses y una periodicidad
de dos aspiraciones por semana o una semanal, sin ningn efecto sobre la
reproduccin o el bienestar animal.

LOS PASOS PARA LA ASPIRACIN FOLICULAR (OPU)

1. se llevara a cabo con el animal en pie en un potro de contencin

2. posteriormente, se debe administrar anestesia va epidural para reducir los
esfuerzos expulsivos y facilitar la manipulacin del ovario.
3. Vaciamiento del recto, limpieza y desinfeccin de la vulva y rea perineal
4. Se introduce el transductor en la vagina convenientemente lubricado y
protegido por una cubierta sanitaria de ltex. (Introduccin del transductor.
Sujecin del ovario (mano izquierda) y manejo del mango de OPU (mano
derecha).

Para la visualizacin de los folculos ovricos empleamos un ecgrafo equipado

con una sonda transvaginal de 5-75 MHz y un handgrip o mango de OPU de

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60 cm de longitud donde se colocara la gua de puncin. Por la gua se
introducir una aguja de puncin desechable (20 G, 09 x 70mm) conectada a
un tubo estril de 50 ml mediante una conduccin de Tefln. El equipo de OPU
se completa con una bomba de vacio accionada por pedal con la que se
aplicara una aspiracin constante de 50-53 mm Hg (20 ml/min). El tubo de
recogida debe mantenerse atemperado a 37oC en bao termosttico
5. Los ovarios se posicionaran va rectal delante de la sonda para ovricos
visibles de ms de 3 mm de dimetro. Antes de iniciar la sesin de
puncin se drenara el sistema aspirando una pequea cantidad de medio
de recogida. Tras la aspiracin de cada 3-4 folculos se realizara un lavado
exhaustivo del fluido folicular en la aguja de aspiracin y en el sistema de
recoleccin con medio de lavado y recogida [PBS suplementado con
heparina sdica (22 UI/ml) y suero fetal bovino (1%)]
6. El fluido obtenido de cada animal contenido en un tubo de recogida de 50
ml ser inmediatamente filtrados restos de sangre sern eliminados por
continuos lavados en PBS fresco y se pasara a una placa de Petri para
localizar y evaluar morfolgicamente bajo estereomicroscopio los
complejos cumulus ovocito (COCs) aspirados

Se Clasifican los COCs obtenidos en cinco categoras, segn homogeneidad,

morfologa del citoplasma y compactibilidad de las clulas del cumulo:
Categora I: Ovocitos con ms de tres capas de clulas de cumulo compactas
y con citoplasma homogneo uniformemente granulado
Categora II: Ovocitos con menos de tres capas de clulas del cumulo y
citoplasma generalmente homogneo
Categora III: Ovocitos con una sola capa de clulas del cmulo y citoplasma
de aspecto irregular con reas oscuras
Categora IV: Ovocitos denudados
Categora V: Ovocitos madurados in vivo, con cumulo expandido.

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SISTEMAS DE PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES.

El proceso de produccin in vitro de embriones bovinos puede dividirse en tres
pasos fundamentales:

-Maduracin de ovocitos
-Fecundacin de ovocitos maduros
-Cultivo de embriones.
Estos tres pasos, comprenden una compleja serie de procesos fisiolgicos,
muchos de los cuales son an desconocidos, condicionando cada uno el xito
o el fracaso del siguiente. Luego de la maduracin in vitro, aproximadamente el
90% de los ovocitos inmaduros puestos a cultivar, alcanzan la metafase II y
expulsan el primer cuerpo polar entre las 16 y 24 hs de comenzada la
maduracin. 21 De estos, aproximadamente el 80% es fecundado y comienzan
a dividirse, al menos, hasta el estadio de 2 a 4 clulas. Sin embargo, slo un
25- 40% alcanza el estadio de blastocisto (B) o blastocisto expandido luego del
cultivo durante 6-7 das. Esto indica que el cultivo embrionario, correspondiente
al paso ms prolongado dentro del proceso de produccin in vitro, es el perodo
en el que se establece el mayor porcentaje de prdidas del sistema. A su vez,
durante esta etapa, se define en gran medida la calidad de los embriones
obtenidos.

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FECUNDACIN DE LOS OVOCITOS.

Consiste en incubar los vulos madurados con espermatozoides vivos y

mviles durante un periodo de 6 a 24 horas, luego de un proceso de seleccin
y capacitacin espermtica que nos permitir a su vez deshacernos de
componentes del plasma seminal, crio protectores y espermatozoides muertos
o con escasa vitalidad. La capacitacin espermtica generalmente se logra
exponiendo los espermatozoides vivos a concentraciones de heparina y
cafena, entre otras. Estas sustancias logran estimular el proceso de
capacitacin del espermatozoide que lo prepara para interaccionar y fecundar
el vulo. Una vez que disponemos de ovocitos maduros, el siguiente objetivo
es lograr la fecundacin de los mismos, para ello se incuban junto con
espermatozoides capacitados en un medio suplementado con fuentes
energticas (piruvato, lactato) y albmina srica. En la especie bovina, la
capacitacin espermtica se ve favorecida por la incorporacin de heparina al
medio. No obstante, para lograr unos resultados ptimos es necesario ajustar
la concentracin de heparina y el nmero de espermatozoides para cada
eyaculado concreto. En el caso de la fecundacin in vitro, los ovocitos
madurados son cocultivados con espermatozoides en medios especiales y en
un ambiente controlado por estufas de cultivo por un tiempo comprendido entre
5-24 hs dependiendo del protocolo, la concentracin de espermatozoides y la
calidad del semen utilizado. Con el fin de lograr los procesos de capacitacin,
reaccin del acrosoma y pasaje a travs de las barreras ovo citaras, el semen
debe ser tratado rpidamente antes de cocultivar los espermatozoides con los
ovocitos. Este tratamiento incluye la eliminacin de todos los elementos
presentes (plasma seminal,
Componentes del diluyente en caso de semen congelado-descongelado,
contaminantes, etc) excepto los espermatozoides y una seleccin de los
espermatozoides vivos y con motilidad progresiva. Esto se logra mediantes
tcnicas basadas en la migracin de los espermatozoides (swim up), la
centrifugacin en gradientes de densidad (percoll) y filtracin (lana de vidrio).
De estas las ms utilizadas son el swim up y el percoll. Posteriormente se
procede a iniciar el proceso de capacitacin espermtica que habitualmente se
establece dentro del tracto reproductor femenino. Los dos elementos que
juegan un rol importante para que esto se logre in vitro son;

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Incorporacin de sustancias inductoras de la capacitacin espermtica

como la heparina.
Utilizacin de semen congelado

-descongelado, proceso que induce cambios procapacitantes en los

espermatozoides as conservados. Por ltimo se efecta la dilucin y el conteo
de los espermatozoides motiles para alcanzar habitualmente una dosis
inseminarte de 1-6 millones de espermatozoides por ml de medio de
CULTIVO Y MEDIOS
En la produccin in vitro de embriones, los elementos constitutivos de los
medios, son de importancia capital. El mayor componente de los medios de
cultivo es el agua, conteniendo tambin iones inorgnicos (con funciones
catalticas y fisiolgicas) (Palas AT y col, 2000); aminocidos, implicados en la
sntesis proteica y vitaminas, que juegan un papel importante como coenzimas
en el metabolismo (Lehninger AL, 1975).

Diversos autores han estudiado el efecto de la adicin de hormonas, tales

como LH, FSH y 17 estradiol, en los medios de maduracin y desarrollo.
Como alternativa, se pueden emplear suero de vaca en celo (SVC) y/o licor
folicular bovino (LFb), componentes biolgicos, ms econmicos (Larocca y
col; 1993; 1997). Se ha estudiado el efecto de adicionar LFb a diferentes
concentraciones y proveniente de diferentes fuentes al medio de maduracin
y/o de desarrollo, encontrndose efectos positivos (Larocca y col, 2004).
El LFb contiene esteroides,glucosaminoglicanos y muchos otros metabolitos
sintetizados por las clulas de lateca folicular (Romero y Sidel, 1994; Sirard y
col, 1995).Una forma de suplementar protenas a los embriones in vitro es
mediante la adicin al medio de suero fetal bovino (SFb) o de albmina de
suero bovino (BSA).(Palasz AT y col, 2000). El SFb y la BSA afectan al pH del
medio y actan como quelantes de iones metlicos, contienen factores de
crecimiento y ciertas cantidades variables de hormonas que inciden en la
diferenciacin y proliferacin celular (Ball y col, 1985).
Los medios de cultivo suelen ser complementados de forma estandarizada con
antibiticos para suprimir el crecimiento de microorganismos contaminantes.
Otros requerimientos de cultivo son la temperatura, el pH, dixido de carbono y
tensin de oxgeno, osmolaridad y humedad relativa. La osmolaridad ptima en
medios de cultivo de embriones bovinos est en el rangode 275 a 285 mOsm.
(Gordon, 1994).

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El pH del medio de cultivo debe estar entre 7,2 y 7,4, mientras que en los
mediosde fecundacin, se recomienda ligeramente superior (7,6-7,8) (Palasz
AT y col,2000). Las condiciones habituales de las distintas etapas de cultivo de
embriones son 5%de CO2 y 95% de aire. El dixido de carbono resulta
necesario para la regulacindel pH intracelular (Carner y Bavister, 1986).La
temperatura de cultivo utilizada en general por los investigadores es de
38,5Ccon 100% de humedad.
MADURACIN IN VITRO
La meiosis permanece detenida en los ovocitos que se encuentran en los
folculos hasta que estos son expuestos a gonadotrofinas que permiten su
continuacin. La meiosis in vivo es detenida por sustancias foliculares que an
no estn bien definidas. Sin embargo, los COCs que son removidos desde los
folculos, comienzan la meiosis espontneamente
En el proceso de maduracin in vivo de los ovocitos, intervienen la hormona
folculo estimulante (FSH) en el crecimiento folicular, la hormona
luteinizante(LH), que induce la maduracin final y la ovulacin del ovocito
seleccionado (12,38, 44).
Varios autores han indicado que para que el proceso de maduracin se lleve a
cabo debe existir un balance hormonal en el folculo (particularmente de los
esteroides) (25). En un sistema in vitro, este balance natural es imitado
agregando las hormonas FSH, LH y estradiol 17 al medio de maduracin
(TCM-199).
En algunos laboratorios la adicin directa de estas hormonas ha sido
substituida agregando suero de vacas en celo (SVC) y licor folicular bovino
(LFb).
Estos componentes biolgicos son suficientes para producir maduracin
(nuclear y citoplasmtica), expansin de las clulas del cmulus y futuro
desarrollo del cigoto.

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1. Transferencia de embriones
Obtencin de ovocitos

Donantes
de
ovocitos

Dia 1

Aspiracin
intravagina
l de
ovocitos

Seleccin
de ovocitos

Maduraci
n de
ovocitos

2. Maduracin de
3. ovocitos
Fertilizacin In vitro

Dia 2

Dia 3

Fecundacin de
los ovocitos
maduros

Capacitacin de
espermatozoides

Lavado de los cigotos

(eliminacin de
clulas del cumulus y
espermatozoides)

Seleccin de cigotos
fertilizados y
colocacin del cultivo
4. Maduracin de
embriones

Dia 4-5

Dia 6

Cultivo de los cigotos

y cambio cada 48
horas los medios de
cultivo

Seleccin de
receptoras y seleccin
de blastocitos

Da 7

Transferencia de
embriones

5. Transferencia de embriones

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Ventajas.
Evaluacin eficiente de la capacidad fertilizante de espermatozoides y
ovocitos.
Difusin del uso de semen valioso y escaso.
Prolongacin de la vida reproductiva de animales genticamente
valiosos, inmaduros o muy viejos.
Creacin de bancos de gametos provenientes de animales
seleccionados por excelencia productiva y/o adaptabilidad.
Determinacin y seleccin del sexo de embriones.
Control de enfermedades de la esfera reproductiva.
Aplicacin de la transferencia de embriones en especies exticas y en
peligro de extincin
Permite obtener descendientes de hembras de elevada calidad
gentica que deban ser sacrificadas por padecer enfermedades,
infertilidad, por su avanzada edad o durante los programas de
erradicacin de enfermedades infecciosas (tuberculosis, brucelosis,
leucosis).
Permite el aprovechamiento de animales con determinadas formas de
infertilidad: machos con oligospermias severas, hembras con
alteraciones estructurales o funcionales del tracto genital.
Desventajas.
Bajo rendimiento, el porcentaje de ovocitos capaces de transformarse
en embriones transferibles se encuentra estancado entre el 30 y 40%.
Los embriones producidos in vitro son de menor calidad que los
obtenidos in vivo.
Reduccin del potencial de desarrollo pre y postimplantacional,
ocasionando bajos porcentajes de gestacin (30 a 40%).
Existe una escasa resistencia a la Criopreservacin, dificultando su
conservacin a largo plazo.
Incremento de la mortalidad embrionaria, abortos, problemas
gestacionales como el hidroalantoides y alargamiento de la gestacin.
Nacimiento de terneros muy voluminosos, con anomalas estructurales
y funcionales, conocido con el nombre de sndrome de exceso de
volumen fetal, que disminuyen el vigor de los animales en el momento
de su nacimiento y provocan una mayor mortalidad peri natal.

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