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Requerimientos
Actividad
transcriptasas
Plantilla de ARN
RT
Principales
aplicacin/notas
Sntesis de ADNc
inversas
cebador
AMV / MAV
RT
RT MuLV
Plantilla de ARN
cebador
RNasa H
a partir de ARN
(RT-PCR)
RT
RNasa H
RT-PCR
para
transcripciones
largas
transcriptasas plantilla
Tth
Inversa
termoestable
RT
en
presencia
de Mn2 +
Pol ADN en
presencia
de Mg2 +
PCR o RT-PCR,
dependiendo de
la
composicin
del tampn
MonsterScript
RT
cebador
Mn2 +
plantilla
Terma
de plantilla
Fragmento
Klenow de C.
cebador
RT-PCR
cebador
Mg2 +
plantas, mientras que representa alrededor del 45% del genoma humano. La
clasificacin de Finnegan (Finnegan 1989) distingue los transposones ARN (Clase
I o retrotransposones), que amplifican a travs de un tipo de "copiar y pegar" de
transposicin, y transposones de ADN (clase II), que utilizan una Tipo de
transposicin "cortar y pegar". Sin embargo, la ms reciente clasificacin de
Wicker tiene en cuenta el reciente descubrimiento de las bacterias y eucariotas ET
que copian y pegan sin intermediarios de ARN, y de nuevo en elementos
transponibles miniatura de repeticin invertida (MITEs) (Wicker et al. 2007).
AMV / MAV RT
Los RT ms utilizados en biologa molecular es la que permite la replicacin del
aviar Myeoloblastosis Virus (AMV), un retrovirus alfa que induce myeoloblastosis
en el pollo (Baluda et al. 1983). Curiosamente, la clonacin de la AMV genoma
identific el oncogn v-myb como responsable de intensa proliferacin de
mieloblastos transformadas. La insercin de secuencias oncognicas-V myb en el
genoma AMV interrumpe la secuencia codificante de la RT, con la AMV RTdeficiente. Como todos los virus deficientes, AMV depende de un virus auxiliar
para su replicacin. El ayudante AMV, la Myeoloblastosis virus asociado (MAV), es
de hecho la Fuente "real" de la RT en el ciclo de vida de AMV, y para la biologa
molecular (Perbal 2008).
El AMV / MAV RT se compone de dos subunidades estructuralmente relacionados
y designados (65 kDa y 95 kDa, respectivamente). La subunidad de la
enzima RT y ofrece actividades de RNasa H. La actividad RT requiere la presencia
de un cebador y una plantilla (Leis et al 1983;. Verma 1977). AMV / MAV RT es
ampliamente utilizado para copiar mensajes totales
RT MuLV
El gen pol del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV) codifica una
endonucleasa de ADN que carece de actividad RT, y que presenta una actividad
RNAsa H menor de AMV / MAV RT (Moelling 1974). M-MuLV RT es 4 veces
menos eficiente, y Por lo menos 4 veces menos estables que los de AMV / MAV
RT. Por lo tanto, los rendimientos comparables de la sntesis de ADNc requieren
de seis a ocho veces ms M-MuLV RT de AMV / MAV RT. Sin embargo, MMuLV
RT es capaz de generar transcritos ms largos que los que hace AMV / MAV RT
cuando se usa en exceso (Houts et al. 1979).
Transcriptasas inversas termoestables
Varios
RTs
identificados
en
organismos
termfilos
estn
disponibles
Ligasas
Las principales caractersticas de las ligasas discutidass en este seccin se
resumen en la Tabla 3.
Las ADN ligasas (EC 6.5.1.1 y 6.5.1.2 para ATP y + NAD ADN ligasas, repectively)
las ADN ligasas conectan fragmentos de ADN para catalizar la formacin de un
enlace fosfodister entre un 3'-OH y un grupo fosfato 5 'en un descanso de una
sola hebra de cadena doble ADN (Lehman 1974).
En las clulas, las ADN ligasas son esenciales para la unin de los fragmentos de
Okazaki durante la replicacin, y en el ltimo paso del proceso de reparacin del
ADN. Las ligasas de ADN se utilizan en la biologa molecular para unirse a
fragmentos de ADN con extremos romos o pegajosos tales como los generados
por la digestin con enzimas de restriccin, aaden enlazadores o adaptadores al
ADN, o mellas de reparacin.
Las ADN ligasas operan en una reaccin de tres pasos. El primer paso implica la
creacin de una ciclasa-ligasa intermedia, en el que se crea un enlace fosfoamida
entre un residuo de lisina y una molcula de AMP de la enzima cofactor (ATP o
NAD +). En segundo lugar, el AMP se transfiere al extremo 5'-fosfato de la mella
Requerimiento
s
Mg2+
ATP
Mg2+
NAD+
ADN termoestable
Ligasas (varias
fuentes )
ligasas de ARN
T4 ARN ligasa 1
ATP
T4 ARN ligasa 2
(T4 Rnl - 2 )
T4 truncado
Actividad
Mas aplicaciones
Ms frecuentemente
utilizado para la
clonacin.
Ligadura de un
contundente final o
ligadura de ARN /
ADN debe ser evitado
ATP
RNL2
No es un sustituto de
la T4 o E. Coli
ligasas , sino que se
utiliza para especficas
tcnicas como la LCR
Etiquetado ARN, la
extensin del cebador
Nicks de reparacin
en dsRNA
Ligadura enlazador
optimizado para la
clonacin de
microRNAs
Las observaciones originales sugirieron que las ADN ligasas bacterianas usan
NAD + como cofactor donde como las ligasas de ADN de los eucariotas, virus y
bacterifagos utilizan ATP (Doherty y Wigley 1999; Timson y Wigley 1999). Sin
embargo, se sabe ahora que algunos ligasas pueden aceptar ya sea un cofactor, a
pesar de que ambos cofactores no son igualmente eficientes (Nakatani et al 2000;
Rolland et al., 2004).
ADN ligasas no termoestable
Los ms pequeos de ADN ligasas conocidos son la ADN ligasa dependiente de
ATP provenientes del virus Chlorella y bacterifago T7 (34 y 41 kDa,
respectivamente). Son mucho ms pequeos que ligasas de ADN eucariotas, que
pueden alcanzar 100 kDa de tamao. Mientras T7 y chlorella-codificado ATPdependiente ligasas ambos contienen slo un nucleotidyl -transferasa dominio y
dplex de
Tabla 4
Enzima
Requerimiento
s
Zn2+, Mg2+
Actividad
Principal aplicacin
Para evitar la
recircularizacin de
vectores de ADN en
experimentos de
clonacin
T4 polinucleotido
cinasa
ATP, Mg2+,
Agentes
reductores
Transfiere un grupo
fosfato desde el ATP
a 5'- OH terminal de
un cido nucleico
(pH neutro) 3'fosfatasa (pH cido)
El cido nucleico
etiquetado
Mutante T4
Polinucleotido cinasa
ATP, Mg2+,
Agentes
reductores
Transfiere un grupo
fosfato desde el ATP
a 5'- OH terminal de
un cido nucleico
(pH neutro)
Igual que el
polinucletido cinasa
T4 , pero sin actividad
de 3'- fosfatasa
Hidroliza enlaces
pirofosfato en
puentes tapas
trifosfato
La eliminacin de
fosfato y la
transferencia alcalina.
Fosfatasa
Tabaco acido
Pirofosfatasa
endonucleasas
de
rompen
cidos
nucleicos
internamente.
Las
Weiss 1980); iv) la actividad endonucleasa: exonucleasa III escinde bases purnas
y pirimidinicas del esqueleto de fosfato de azcar en el ADN (Keller y Crouch
1972).
Otra caracterstica significativa de la exonucleasa III es su especificidad relativa
para el ADN de doble cadena. Cuando esta enzima acta como una
endonucleasa, se genera un vaco en las mellas en el ADN de doble cadena,
mientras que cuando acta como una exonucleasa, se
genera un extremo 5'-protuberante (que es resistente a la digestin adicional
desde exonucleasa III no est activo en el ADN de una sola hebra). Exonucleasa
III es nica entre las exonucleasas en su accin fosfo-monoesterase en un
extremo 3'-fosfato (Demple y Harrison 1994;. Mol et al 1995).
Al igual que la enzima de tipo salvaje, la mutante polinucletido quinasa est
hecho de cuatro subunidades de 33 kDa cada una, transfiere efectivamente el
fosfato gamma de ATP al extremo 5'-OH de ADN y ARN. Adems, los
polinucletidos quinasas mutantes y el tipo salvaje requieren concentraciones de
iones de magnesio similares, tienen el mismo pH optima y se inhibe por tanto
fosfato inorgnico. El polinucletido mutante quinasa es muy til cuando la
actividad de la 3'- exonucleasa debe evitarse (por ejemplo, el terminal 5'-32P
etiquetado de 3'-CMP en vista de extremo etiquetado 3 'del ARN especies antes
de la toma de huellas dactilares o secuenciacin).
PIROFOSFATASA CIDA DE TABACO
Pirofosfatasa cida de tabaco se utiliza como un primer paso para el etiquetado de
mRNAs en sus de extremos 5', que generalmente tienen un lmite, a fin de generar
sondas para radiomarcados de secuenciacin de ARN: in vitro, 32P-etiquetado de
ARNm 5' terminal, exige la eliminacin de los 7-metilguanosina y 5'-fosfato restos
del extremo de tope final. Pirofosfatasa cida del tabaco hidroliza el enlace
pirofosfato en el capuchn del puente de trifosfato, la generacin la terminacin de
un 5'-fosfato en la molcula de ARN (que conduce a p7MeG, pp7MeG y ppN- PN-
endonucleasas
de
rompen
cidos
nucleicos
internamente.
Las
Dos especies moleculares diferentes que se describen como rpido (F) y lenta (S)
Bal 31 nucleasas han sido purificadas a partir del medio de cultivo de Alteromonas
espejiana Bal 31. Ambas especies
acortar dplex de ADN (en tanto 3 'y 5') y sin utilizar mellas internas, y muestran
una muy especfica actividad endonucleasa de ADN de cadena sencilla (escinde
en mellas,las lagunas y las regiones de cadena simple de ADN dplex y ARN).
La Nucleasa F-Bal 31 purificada se utiliza para la restriccin, mapeo, eliminacin
de largos tramos (hasta miles de base pares) o cortos tramos (decenas a cientos
de pares de bases)
del DNA dplex, mapeo de las ensambladuras B-Z ADN, rompiendo el ADN en
sitios de lesiones covalentes (tales como UV-inducida), y acortamiento de las
molculas de ARN. El S-Bal 31 es una enzima de accin lenta utilizada slo para
el mapeo de restriccin y eliminacin de tramos cortos de ADN dplex. Desde que
Ca+2 es un cofactor esencial, EGTA es necesaria para inactivar ambas enzimas.
Ms Bal 31 genera fragmentos de DNA con extremos de bases pareadas, que
adems se puede ligar a cualquier fragmento de ADN de extremos romos como
enlazador molecular. Una pequea fraccin de Bal 31 genera frangmentos de DNA
que albergan 5-sobresalliente.
trenzado simple, sin actividad aparente en hbridos ARN o ADN ARN (Chase y Richardson
1974a). Puesto que es capaz de atacar a cualquiera de los extremos de las molculas de
ADN, es a menudo utilizado para degradar mucho tiempo a los filamentos de la DNA
dplex que sobresalen (como los generados por la restriccin Endonucleasas) y generar
ADN final. Exonucleasa VII difiere situados I y III en eso i) puede degradar el ADN del
extremo 5 o su 3, ii) puede generar oligonucletidos y iii) sigue plenamente activa en 8
mM EDTA. Exonucleasa VII es particularmente til para la rpida eliminacin de las
cartillas del oligonucletido trenzado simple de una reaccin de polimerizacin en cadena
terminada, cuando diferentes cartillas se requieren para posteriores reacciones de PCR
(Li et al., 1991).
Ribonucleasas
Ribonucleasa pancretica (RNasa A, EC 3.1.27.5)
Ribonucleasa pancretica (tambin llamado RNasa A) es una endonucleasa que hiende
solo RNA varado en nuclesidos 3-fosfatos y 3-fosfo oligonucletidos terminando en Cp o
hacia arriba. RNasa A se utiliza para reducir la contaminacin del RNA en preparaciones
de ADN plsmido, y para las mutaciones de mapeo en DNA o RNA por clivaje de
desajuste, puesto que hiende el RNA en hbridos de RNADNA en los sitios de sola
incompatibilidad de nucletidos. RNasa A degrada el RNA en mono nucletidos 3fosforilados y oligonucletidos, generando un 2, 3 fosfato cclico intermedio durante la
reaccin (Anfinsen y blanco 1961).
RNasa A es difcil de desactivar y activo bajo condiciones muy diferentes. Por lo tanto,
mucho cuidado debe ser tomado para evitar la contaminacin con RNasa A y mayor
degradacin de las muestras de RNA. RNasa-inhibidor de placenta humana podra
utilizarse para inhibir la actividad RNasa. Sin embargo, recomendamos utilizar dietil
Pirocarbonato (DEPC), sales de guanidinio, beta-mercaptoetanol, metales pesados o
vanadyl-ribonuclesido complejos para la eficaz inhibicin de RNasa A. RNasa A est
disponible de muchas fuentes comerciales. Como se mencion anteriormente para otras
enzimas, muy pocos proveedores proporcionan informacin til sobre el origen o la
pureza de su preparacin enzimtica.
Ribonucleasa H (3.1.26.4)
Ribonucleasa H (RNasa H) degrada especficamente RNA en hbridos ARN ADN. Permite
la extraccin de ARN de hibridaciones previas, o la destitucin de colas de poli-A en el
extremo 3 de mRNAs. Se consigue una ptima actividad de RNasa H a un pH
comprendido entre 7,5 y 9.1 (Berkower et al., 1973) en la presencia de reduccin de
reactivos. Actividad RNasa H es inhibida en presencia de N-etilmaleimida (una sustancia
qumica que reaccionan con los grupos SH) y no es afectada notablemente por alta fuerza
inica (actividad 50 % se retiene en presencia de 0,3 M de NaCl). ARNasa H requiere
Mg2 iones, que pueden ser reemplazados parcialmente por los iones Mn2.
Otras ribonucleasas
Muchas otras ribonucleasas han sido utilizadas para la secuencia de RNA. Cada uno de
ellas tiene especificidad y requisito especfico. Abajo se encuentra una lista de estas
ribonucleasas. Ribonucleasa Phy que pueda utilizarse para rpida secuencia de ARN.
Est aislado de cultivos de Physarum polycephalum. Ribonucleasa Phy hiende la
molcula de ARN en G, A y U, pero no en residuos de C. Los productos son mono
nucletidos 3 con 5 C terminal. CL3 RNasa se utiliza para la secuencia ARN. Se la asla
de hgado de pollo (Gallus gallus). RNasa CL3 digiere RNA adyacente al cido citidlico en
una proporcin de 60% de residuos de C digeridos para cada residuo U digerido. La
actividad enzimtica es inhibida por tractos de poli-A, a menos que se agrega la
espermidina. Utilizado principalmente para RNA secuenciacin (Lockard et al.1978),
ribonucleasa cereus es una endorribonucleasa que hiende preferentemente al RNA y a
residuos de C. Ribonucleasa Phy M, purificado de Physarum polycephalum, tambin se
ha utilizado para la secuencia de ARN (Donis-Keller 1980). Ribonucleasa Phy M
preferencial segmenta el RNA en residuos de C y A. Ocasionalmente, puede producirse
G. Esta reaccin indeseada puede minimizarse en presencia de 7 M de urea.
sobre posicin puede ser usada para crear nuevas especificaciones para
endonucleasas de restriccin en la cadena duplex de ADN (Nelson et al 1984).
La segunda clase de sobre posicin ocurre en los lmites de la secuencia de
reconocimiento por endonucleasas y metilasas de restriccin. Por ejemplo, cuando
la secuencia GGATCC de un sitio de restriccin Bam HI es seguido por GG, el
sitio Bam HI parcialmente se sobrepone con el sitio de metilacin CCGG del M.
Mspl. Desde que M. Mspl transfiere un grupo metil al residuo de citosina 5 en la
secuencia CCGG, ste metila al sitio Bam HI en su citosina interna. Haciendo
resistente la secuencia de la endonucleasa Bam HI.
modificado por la Hae III, Alu I, Hha I y Msp I metilasas. La deficiencia del sitema
mcrB en cepas de E. coli estn disponibles en New England Biolabs.
Las metilasas de ADN en sistemas del tipo II RM realizan la reaccin de metilacin
bajo condiciones similares as como la restriccin de endonucleasas, excepto que
las metilasas requieren SAM como donador de grupos metilo. Adems, es
generalmente aceptable llevar a cabo la reaccin de metilacin usando buffers
endonucleasas de restriccin estndar donde SAM se ha unido. Tambin, las
metilasas no requieren cationes divalentes para ser activadas, mientras que
muchas endonucleasas de restriccin si.
Otras enzimas
Polyadenilato polimerasa de E. coli
El poliadenilato (polyA) polimerasa de E.coli es un polipptido de 58 kDa que
polimeriza residuos de adenilato en el final 3 de varios polirribonucleotids, en una
manera independiente de la plantilla. In vitro, es usada para extensin 3 de ARN
para preparar un sitio cebador para sintesis cADN usando oligo-dT, o para
purificaciones basadas en poly-dT. Dependiendo de las condiciones
experimentales, polyA polimerasa puede polimerizar un tramo desde 20 a 2000
nucleotidos de largo.
La polyA polimerasa en E. coli cataliza la adicin de monofosfatos de adenina
(AMPs) usando ATP como sustrato, ADP, dATP, y GTP no son considerados
sustratos de polyA polimerasa, pero CTP y UTP si lo son. Poly A polimerasa es
inhibida por iones fosfato y pirofosfato, y cido aurin tricarboxilico es un inhibidor
de ambos ARN polimerasa y de la unin de mRNA a los ribosomas. PolyA
polimerasa es ms bien una enzima inusual en que su ptima actividad requiere la
presencia de altas concentraciones de cationes monovalentes. Es estmulado por
Mn2+ y es insensible a antibiticos como fifampicina y streptoligdina (inhibidores
transcripcionales de inciacion y elongacin, respectivamente. En contraste a la
polinucleotido fosforilasa, otro templete polinucleotido independiente de la plantilla
que sintetiza enzimas, polyA polimeraza no degrada su propio producto polyA.
La polyA polimerasa usa una amplia variedad de especies de RNA monocatenario
como primers. ARN bicatenario y algunos polinucleotidos son primers muy pobres.
El ADN no funciona como primer. sta ltima propiedad es comn a prcticamente
todas las otras polimerasas, excepto por las enzimas aisladas de plantas como
maz que muestra actividad considerable con oligo y poli-dNTPs sintticos.
Topoisomerasas
extremos 5 de ARN
compleja
no
acepta
monofosfato
RNA
como
sustrato.
En
de
incubacin,
condiciones
de
desnaturalizacin,
contaminacin