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1. ESPIROQUETAS
Las espiroquetas tienen una morfologa en espiral que las asemeja a un resorte metlico;
algunas presentan un enrollamiento ms apretado que otras. Sin embrago, la
caracterstica ms distintiva de este orden es el modo en que se mueven, que se basa en
el uso de dos o ms filamentos axiales (o endoflagelos) encerrados en el espacio
existente entre una vaina externa y el cuerpo de la clula. Un extremo de cada filamento
axial se adhiere cerca de un polo de la clula (vanse fig.).
Mediante la rotacin de su filamento axial, la clula rota en direccin opuesta, como un
tirabuzn, lo que le permite moverse con mucha eficiencia a travs de los lquidos. Para
las bacterias esto es ms difcil de lo que parece. En la escala de una bacteria el agua es
tan viscosa como la melaza para los seres humanos. Sin embargo, una bacteria
tpicamente puede moverse cerca de 100 veces la longitud de su cuerpo en un segundo
(o cerca de 50 pm/segundo), mientras que un pez grande, como un atn, slo puede
moverse 10 veces la longitud de su cuerpo en ese tiempo.
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SEMINARIO N02
excretadas en la orina de Ciertos animales (p. ej.. perros. ratas y cerdos) de modo que
los perros y los patos domsticos por lo general estn inmunizados contra la
leptospirosis.1
2. MICOPLASMAS
Los micoplasmas son muy pleomorfos porque carecen de pared celular y pueden
producir filamentos que se asemejan a los hongos, de all su nombre (mykes hongo y
plasma = (ormado). Las clulas del gnero Mycoplasma son muy pequeas, con un
tamao que vara de 0,1 a 0,25 pm y un volumen celular dcl 5% del de un bacilo tpico.
Corno su tamao y plasticidad les permita atravesar los filtros que retenan a las
bacterias en un comienzo fueron considerados virus. Los micoplasmas representan los
microorganismos autorreplicantes ms pequeos capaces de llevar una existencia
celular independiente. Los estudios de su DNA sugieren que estn estricamente
relacionados con el grupo de bacte-rias gramposirivas que abarca los gneros Bacilus.
Estreptococos y Lactobacilus pero gradualmente han perdido material gentico. Para
describir este proceso se ha utilizado el trmino evolucin degenerativa.
Entre los micoplasmas el patgeno humano ms importante es M. pneumoniae, que es
la causa de una forma comn de neumona leve. Otros gneros del orden
ANALISIS CLNICO
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Mycoplasmatales son Spiroplasma, clulas con una morfologa en tirabuzn rgido que
causan enfermedades graves en las plantas y son parsitos frecuentes de los insectos que
se alimentan de plantas, y Ureaplasma, denominados as porque pueden degradar la urea
de laorina de modo enzimaticoy en ocasiones se asocian con infecciones urinarias.
Los micoplasmas pueden crecer en medios artificiales que les proporcionen esteroles, si
es necesario, y satisfagan otros requerimientos nutricionales fsicos especiales. Las
colonias miden menos de 1 mm de dimetro y tienen un apecto caracterstico en "huevo
frito" cuando se las observa con aumento. Para muchos propsitos a menudo resultan
ms satisfactorios los mtodos de cultivos celulares. De hecho, los micoplasmas crecen
tan bien con estos mtodos que constituyen un problema de contaminacin frecuente en
los laboratorios de cultivos celulares.1
3. RICKETSIAS
Se trata de microorganismos procariotas que se comportan como parsitos intracelulares
estrictos. Pertenecen al dominio Bacteria phylum: Proteobacteria, orden: Rickettsiales.
Tienen forma bacilar, cocobacilas o son pleomorficas y su tamao es de alrededor de
0.3 por 1.2 um. Son grmenes gramnegativos aerobios.
No se colorean bien con la coloracin de Gram, pero si con las de Giemsa o de
Gimnez, que permite visualizarlas con el microscopio ptico.
ANALISIS CLNICO
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Tienen dos cidos nucleicos, DNA y RNA, y ribosomas para la sntesis de protenas. El
general no pueden metabolizar la glucosa como sustrato: pueden sintetizar ADP, pero
no ATP, el cual obtienen de la clula hospedadora.
Se cree que este parasitismo energtico obligado se debe a un sistema inusual de
transporte a nivel de sus membranas, mediado por una enzima, la translocasa que
intercambia el ADP bacteriano por ATP celular, adems de otros metabolitos esenciales
(aminocidos y nucletidos) presentes en el citoplasma de la clula eucariota.
ESTRUCTURA CELULAR
CULTIVO Y REPRODUCCION
ANALISIS CLNICO
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SEMINARIO N02
4. CLAMIDIAS
Las clamidias son bacterias muy semejantes a las rickettsias, pero tienen un ciclo
intracelular de reproduccin ms complejo. Comparten con ellas y los virus la condicin
de ser parsitos intracelulares estrictos.
Son formas cocoideas, inmviles, con membrana citoplasmtica y ribosomas; no poseen
peptidoglucano en su pared gramnegativa, con aspecto de bicapa separadas por un
espacio periplsmico. No poseen capsulas ni flagelos. Pueden tener proyecciones en su
superficie, y un complejo grupo de protenas en la membrana externa responsables de la
gran variabilidad antignica, del tropismo y la infectividad. Poseen dos cidos
nucleicos, pero no producen su propio ATP, por lo cual las ATP/ADP transferasas estn
presentes en todas las especies de clamidias.
REPRODUCCION
ANALISIS CLNICO
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DIAGNSTICO POR EL LABORATORIO DE LAS INFECCIONES
MICTICAS2
CUADRO 1 Signos Sntomas y agentes etiolgicos de las micosis extrapulmonares1
TIPO
DE
INFECCIN
SIGNOS Y SNTOMAS
Cutnea
SNC
Urinaria
Ocular
Endocarditis
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la
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Sinusitis
I.
RECOGIDA DE LA MUESTRA2
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SEMINARIO N02
embargo, algunas muestras (conducto auditivo, faringe, vagina, crvix) no
pueden ser recogidas de otra forma.
6. Las muestras de lesiones cerradas y abscesos suelen presentar un gran
rendimiento. Deben aspirarse con jeringa y transferirse a un contenedor estril
con solucin salina, prestando atencin a la recogida de grnulos, si los hubiese.
7. El raspado de lesiones de piel y faneras puede realizarse con distintos materiales;
los ms utilizados son bistur, moqueta o cepillo.
8. En situaciones que requieran un estudio epidemiolgico, debe establecerse la
necesidad de una recogida de muestras ambientales, familiares o animales.
9. El recipiente de recogida se identificar con los datos del enfermo (nombre y
localizacin), y debe protegerse para que no se rompa en su transporte al
laboratorio.
10. Las muestras deben ir acompaadas obligatoriamente del volante de peticin
para Microbiologa. En el cual, al menos, debe hacerse constar la siguiente
informacin: datos del paciente (nombre y apellidos, nmero de historia clnica,
fecha de nacimiento y sexo); datos clnicos (orientacin diagnstica, tratamiento
antimicrobiano, enfermedad de base y antecedentes de inters); datos del mdico
solicitante.
11. Al laboratorio se le debe informar de la sospecha de presencia de hongos
peligrosos. Tambin si se sospecha la presencia de hongos con requerimientos
especiales, as como de viajes u origen de paciente.
Los envases para la recogida de las muestras pueden variar segn el tipo de muestra a
recoger y transportar:
Tubos estriles con tapn de rosca: LCR y otros lquidos biolgicos.
Frascos estriles de boca ancha con tapn de rosca: orinas, esputos, heces,
fragmentos de tejidos, etc.
Torundas o hisopos de algodn estriles: Se usan para tomar muestras de
superficies y orificios corporales (exudados, secreciones).
Jeringas estriles: slo se admiten cuando su volumen no permita transferir la
muestra a un medio de transporte adecuado.
Frascos de hemocultivo para lquidos biolgicos.
Placas de Petri estriles.
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II.
TRANSPORTE2,4
Todas las muestras deben enviarse al laboratorio rpidamente, sin conservantes. Las
muestras deben transportarse en un recipiente estril, humidificado y a prueba de
vertidos; sin embargo, las muestras dermatolgicas pueden transportarse en un
recipiente seco (placa de Petri, papel de fotografa negro, entre dos portas). En general,
no deben introducirse en medios de transporte, a no ser que sea fcil retirar la muestra
del medio. Las muestras en que se sospeche la presencia de dermatofitos u hongos
dimrficos se conservarn a temperatura ambiente, nunca refrigerados. Los raspados
corneales y hemocultivos deben sembrase directamente en el medio de cultivo
adecuado. Si esto no fuera posible, se usarn medios de transporte adecuados o se
conservaran a 4 C. Las condiciones de transporte y almacenamiento vienen reflejadas
en la tabla 1, considerando ciertas variaciones segn el agente probable.
III.
MANEJO2,3
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA2
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(muestras de piel, aspirados transtraqueales, aspirados de odo interno, muestras de
conjuntiva) deben enviarse a temperatura ambiente.
En trminos generales, los procedimientos utilizados en el laboratorio de bacteriologa
son adecuados para el cultivo de hongos, pero hay que tener en cuenta que,
habitualmente, la carga microbiana es inferior en el caso de los hongos con respecto a
las bacterias. Esto obliga a recoger mayor cantidad de muestra para obtener un
rendimiento ptimo. Las muestras inaceptables no deben procesarse y el facultativo
debe ser informado inmediatamente. Todo laboratorio debe distribuir por escrito las
normas de rechazo de muestras.
Consejos generales para optimizar el procesamiento de muestras2,4
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Atendiendo a su composicin, los medios de cultivo pueden ser generales, enriquecidos,
selectivos, diferenciales y especializados:
i.
ii.
iii.
son
antibacterianos
(cloranfenicol,
gentamicina,
penicilina,
v.
B. PREPARACIN3
La buena calidad de los medios es indispensable para conseguir el aislamiento y la
identificacin de los hongos; por lo tanto, cuando se utilicen medios comerciales es
necesario tener en cuenta la garanta que aporta el proveedor y la calidad de la
distribucin. Cuando se prepara un medio deshidratado deben seguirse rigurosamente
las instrucciones del fabricante, evitando errores en la forma de disolverlos o
suspenderlos, en la temperatura y duracin de la esterilizacin para que no se afecte la
calidad del producto final. Algunos antibiticos deben aadirse al medio una vez
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esterilizado y a la temperatura adecuada, para que no se inactiven por las altas
temperaturas de la esterilizacin.
C. CONTROL DE CALIDAD3
Para asegurar la correcta utilizacin de los medios, deben controlarse peridicamente
sus caractersticas ms importantes: apariencia, esterilidad, pH y funcionamiento. El
funcionamiento se puede evaluar utilizando las cepas de control adecuadas para cada
medio.
D. SOPORTE3
El soporte habitual para los medios de cultivo en Micologa suelen ser tubos de cristal o
placas de Petri (90 mm). Los tubos tienen la ventaja de soportar incubaciones
prolongadas y aumentan la seguridad en el caso de sospecha de micosis endmicas. Si
se utilizan tubos, deben incubarse en posicin horizontal las primeras 24 horas para que
el inculo no se concentre en el fondo. Los tubos deben de ser de boca ms ancha que
los habituales en bacteriologa, porque en ellos, las colonias no son fciles de aislar. Si
los tubos utilizados son de tapn de rosca, el cierre debe mantenerse parcialmente
abierto para garantizar las mejores condiciones atmosfricas. Cuando se eligen placas,
es conveniente que contengan 40 ml de medio para evitar que se sequen, y deben
cerrarse con cinta adhesiva para que no se abran involuntariamente, protegiendo al
personal de los hongos patgenos y evitando la contaminacin con hongos externos. El
precintado debe ser permeable al aire, ya que cuando el aire circula libremente se
favorece la produccin de pigmento y la superficie del agar se seca, permitiendo el
desarrollo de micelio areo y esporas.
E. ALMACENAMIENTO3
Los medios se deben guardar refrigerados a 2-8C. Para mejorar su conservacin y
prevenir la desecacin, es aconsejable invertir las placas e introducirlas en bolsas de
plstico. Las placas de Petri suelen conservarse en buen estado unos tres meses,
mientras que los medios semislidos o lquidos en tubo de tapn de rosca se conservan
bien hasta 6 meses. Sin embargo, ciertos medios, al contener sustancias inestables
(antibiticos, vitaminas, sangre, etc.), no se conservan en buen estado tanto tiempo.
Tambin hay que tener presente que algunos componentes de ciertos medios pueden
verse afectados por la luz, por lo que estos medios deben almacenarse en contenedores
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opacos. Como norma general, todos los medios deben utilizarse antes de la fecha de
caducidad indicada por el fabricante y, antes de su utilizacin, deben atemperarse,
durante unos minutos, a temperatura ambiente.
F. ELECCIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO3,4
Los medios ms utilizados en el cultivo de hongos son: agar Sabouraud glucosa (AGS),
habitualmente con la modificacin de Emmons, con cloranfenicol y con/sin actidiona;
agar infusin cerebro corazn (BHI) con o sin sangre de cordero al 5%, con o sin
antibacterianos; agar inhibidor para mohos (MIA); y agar patata glucosa (APG). Sin
embargo, los hongos tambin pueden crecer en medios no selectivos, incluidos la
mayora de los medios bacteriolgicos, si se incuban el tiempo suficiente. La eleccin y
el nmero de medios a utilizar estn condicionados por el coste, la disponibilidad y las
preferencias personales, pero siempre se deben incluir medios con antibacterianos y sin
ellos. La incorporacin de cicloheximida (actidiona), inhibidor de muchos hongos
considerados contaminantes, ayuda especialmente en las micosis de la piel, aunque
pueda inhibir algunos patgenos fngicos importantes; por ello, debe utilizarse siempre
en combinacin con otro medio sin cicloheximida. Los medios de cultivo ms
empleados en micologa pueden agruparse en dos categoras en funcin de su utilidad:
aislamiento e identificacin.
Para el aislamiento, la utilizacin de 3-4 medios prcticamente cubre todas las
necesidades: AGS con/sin antimicrobianos; un medio con cicloheximida y agar infusin
cerebro corazn, para las micosis sistmicas endmicas. Para la identificacin, puede ser
necesario un nmero mayor de medios que depender del nmero de muestras, las
etiologas ms probables en la zona geogrfica, las posibilidades del laboratorio y el
nivel diagnstico esperable segn el tipo de centro.
i.
ii.
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iii.
iv.
v.
vi.
Agar infusin de cerebro corazn: puede utilizarse como medio enriquecido para
facilitar el crecimiento de C. neoformans a partir de muestras estriles como el
LCR y el mantenimiento de la fase levaduriforme de algunas micosis sistmicas,
ya sea con sangre o sin ella. En general, est indicado para el aislamiento de una
gran variedad de patgenos, incluyendo levaduras, mohos y bacterias como
Nocardia. Enriquecido con sangre de carnero al 10%, se utiliza para el
aislamiento de todos los hongos, incluyendo los hongos dimrficos. Pueden
aadirse antibacterianos (cloranfenicol y/o gentamicina) para convertirlo en
selectivo. En algunas ocasiones tambin puede completarse con cicloheximida
(facilita el aislamiento de Histoplasma capsulatum y Blastomyces dermatitidis).
vii.
viii.
modificarse
aadiendo
cloranfenicol
bien
cloranfenicol
cicloheximida.
ix.
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hongos de inters mdico (Candida no albicans, Aspergillus, zigomicetos, C.
neoformans, etc.).
x.
xi.
xii.
xiii.
xiv.
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dimrficos o algn hongo que se desarrolle mejor a esta temperatura. No obstante,
tambin es necesaria una estufa a 37C para verificar la tolerancia a esta temperatura.
Sin embargo, utilizar 37C para el aislamiento del estadio levaduriforme de
Histoplasma o Blastomyces no aporta ventajas y, adems, son morfolgicamente
indistinguibles de otras levaduras. Los cultivos de hongos deben incubarse durante 3-4
semanas antes de ser desechados, y no deben desecharse cuando se asla un hongo, sino
que debe completarse el periodo de incubacin. Sin embargo, hay muestras que se
pueden eliminar antes (por ejemplo, exudado vaginal), a los 7 das, cuando se realizan
cultivos habituales.
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Para obviar este hecho y poder observar sin distorsin el micelio y las estructuras de
reproduccin asexual, es preferible recurrir al microcultivo. La tcnica del microcultivo
consiste en cortar de una Placa Petri con agar Saboraud un dado de 1 cm sobre y
depositarlo sobre un portaobjetos estril situado en otra placa de Petri vaca. A cada
lado del cubo de agar se inocula el hongo filamentoso. Se coloca sobre el agar un
cubreobjetos y se coloca la tapa de la placa Petri incubndose en ambiente hmedo.
Cuando el micelio crece, al cabo de unos das, se expande como una planta trepadora
por la cara inferior del cubreobjetos, el cual puede tomarse con cuidado y ponerse sobre
un portaobjetos en el que previamente se haya depositado una gota de colorante de
contraste, como el azul de actofenol. as, pueden observarse las estruturas fngicas sin
distorsin. Se han comercializaado sistemas que facilitan el desarrollo de esta tcnica. 6
velocidad
del
crecimiento
Las caractersticas
morfolgicas de las colonias
Las caractersticas
morfolgicas microscpicas
En la mayora de los casos el ltimo item proporciona los datos ms concluyentes para
la identificacin. La determinacin de la velocidad de crecimiento puede ser la medida
ms util cuando se examina el cultivo de un hongo filamentoso pero es posible que
tenga un valor limitado porque la velocidad de crecimiento de ciertos hongos vara en
funcin de la cantidad de inculo presente en la muestra clnica. En general la velocidad
de crecimiento de los hongosdimorfos como B. dermatidis; h. capsulatum y P.
brasiliensis es baja y se requieren de 1 a 4 semanas para que las colonias se tornen
visibles. El crecimiento de C. imunitis suele ser rpido y riesgoso para los
bacterilogos. Sin embargo, en algunos casos los cultivos de B. dermatidis e H.
capsulatum pueden observarse en el curso de 3 a 5 das, una circunstancia poco
frecuente que se presenta solo cuando hay grandes cantidades de la muestra. Las
colonias de los cigotos pueden aparecer dentro de las 24 horas mientras que los otros
hongos hialinos y dematiceos a menudo crecen en 1 a 5 das. En consecuencia, la
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velocidad de crecimiento de un hongo es importante pero debe utilizarse jutno con otras
caractersticas antes de realizar una identificacin definitiva.
Las caractersticas morfolgicas de las colonias pueden tener un valor limitado en la
identificacin de los hongos filamentosos debido a la variacin natural entre los
aislamientos y las colonias desarrolladas en medios de cultivo diferentes. SI bien es
posible reconocer hongos comunes aislados en formarepetida en el laboratorio , la
morfologa de la colonia es un criterio no fiable y debe utilizarse solo como
complemento de las caractersticas morfolgicas microscpicas. Deben considerarse las
condiciones de incubacin y los medios de cultivo. Por ejemplo H. capsulatum, que en
agar infusin de cerebro y corazn aparece como un hongo filamentoso algodonoso de
color blanco a ocre, puede aparecer levaduriforme cuando se desarrolla en el mismo
medio enriquecido con sangre.
En general las caractersticas morfolgicas, microscpicas de los hongos filamentosos
son estables y su variacin es mnima. l identificacin definitiva se basa en la forma
caracterstica, en el modo de reproduccin y en la dispocisin de las esporas; sin
embargo el tamao de las hifas tambin proporcionainformacin til. La hifas grandes
similares a cintas y con pocos tabiques de los cigomicetos, se reconocen con facilidad
mientras que las hifas pequeas (de alrededor de 2 um de dimetro) pueden sugerir la
presencia de un hongo dimrfico o de un dermatofito.
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En el medio SDA las colonias de levaduras suelen ser completas, ligeramente
abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisas (Figura 11.1) o rugosas (Figura
11.2), con olor dulzn agradable, volvindose ms pastosas a medida que envejecen.
Por lo general las colonias de levaduras no desarrollan micelio areo, aunque en
ocasiones pueden aparecer prolongaciones aracneiformes en la periferia de las colonias.
Si se observa un micelio areo definido, debe considerarse la posibilidad de que se trate
de un hongo dimrfico o de ciertas especies de levaduras que pueden formar micelio
verdadero como Geotrichum (Figura 11.3), Galactomyces, Trichosporon (Figura 11.4)
o Blastoschizomyces (su teleomorfo Dipodascus).
Una colonia de aspecto y consistencia mucoide sugiere la formacin de cpsulas y
puede ser el paso inicial para la identificacin de Cryptococcus neoformans (Figura
11.5).
Las colonias de color rojo-anaranjado o naranja, de aspecto cremoso o rugoso, son
caractersticas de las especies del gnero Rhodotorula (del gr. rhodo, rojo) (Figura 11.6)
y Sporobolomyces (anaranjado), color que manifiestan estas levaduras por su riqueza en
carotenoides. Pero no todas las colonias blancas y cremosas son levaduras; las especies
de algas acloroflicas del gnero Prototheca, tras incubacin a 28 C durante 3-4 das,
desarrollan unas colonias blancas cremosas muy parecidas a las producidas por el
gnero Candida (Figura 11.7).
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Slo C. albicans es capaz de producir verdaderos tubos germinales; sin embargo, otras
especies como C. tropicalis pueden producir pseudohifas precoces de aspecto similar a
los tubos germinales pero con una zona de constriccin caracterstica adyacente a la
clula madre, por lo que esta prueba es til para diferenciar C. albicans del resto de las
especies de Candida, aunque no est exenta de falsos negativos.
Metodologa
1. Emulsionar una porcin de la colonia aislada en 0,5 ml de suero humano o de conejo.
2. Incubar a 35 C durante 2 h.
3. Depositar una gota de la emulsin sobre un portaobjetos limpio y desengrasado,
colocar un cubreobjetos y visualizar a x100, x400 x1.000. Interpretacin: La prueba
es positiva si se visualizan tubos germinales (Figura 11.8). Variante: Adems de la
tcnica con suero, el test de filamentacin puede realizarse utilizando otros medios de
cultivo:
a) Plasma de conejo: Berardinelli y Opheim, describieron un medio de induccin de
tubos germinales constituido por tres partes de coagulasa plasmtica de conejo con
EDTA (BBL Microbiology Systems) y dos partes de caldo Try-Soy (Scott Laboratories,
Inc). La inoculacin, incubacin e interpretacin son similares a la tcnica con suero.
b) Medio de cultivo slido Oxgall-Tween-cido cafeico (TOC): [Oxgall 10 g, agar
20 g, Tween 80 (solucin al 10%) 10 ml, cido cafeico 0,3 g, agua destilada 1.000 ml].
La utilizacin de este medio permite la visualizacin del tubo germinal y tambin de
clamidosporas [2]. Para su realizacin se estra una pequea porcin de la colonia sobre
al agar TOC y a continuacin se coloca con suavidad un cubre-objetos estril
(flamendolo suavemente) sobre la superficie inoculada (para evitar la acumulacin de
humedad es preciso no presionar el cubre-objeto sobre a superficie del agar). Se incuba
a 35 C, en 10% de CO2, durante 2 h, manteniendo la tapa de la placa ligeramente
abierta para que todo el cultivo sea alcanzado por el CO2. La prueba es positiva si se
visualizan los tubos germinales en la zona de inoculacin a bajo aumento (x100- x400).
Formacin de hifas, blastoconidias, clamidosporas y artrosporas.- La
formacin de hifas, blastoconidias, clamidosporas o artrosporas por parte de las
levaduras constituye una caracterstica morfolgica de gran importancia para la
identificacin de algunas especies de levaduras.
Ante la presencia de estructuras con aspecto de hifas, lo primero que hay que
determinar es si se trata de pseudohifas (resultantes del proceso de formacin de
blastoconidias y, por tanto, con puntos regulares de estrechamiento) o, por el contrario,
son verdaderas hifas que se fragmentan en artroconidias. Si el desarrollo en medios
especiales (ver ms adelante) revela la presencia de seudohifas y blastoco-nidias, la
levadura a identificar pertenece a alguna especie del gnero Candida. Si por el
contrario, revela verdaderas hifas y artroconidias, lo ms probable es que se trate de
especies de Trichosporon, Geotrichum, Galactomyces o Blastoschizomyces.
Trichosporon y Blastoschizomyces producen tanto artroconidias como blastoconidias;
estas ltimas nacen en brotes de los ngulos de las artroconidias adquiriendo la forma
caracterstica de oreja de conejo (Figura 11.9). Las especies
Galactomyces geotrichum (Geotrichum candidum) y Blastoschizomyces capitatus
(Geotrichum capitatus) tambin producen blastoconidias a partir del ngulo de la
artroconidia, pero, en este caso, forman una estructura denominada palo de hockey
(Figura 11.10). C. tropicalis produce pequeas cantidades de blastoconidias, muy
esparcidas o en pequeos grupos a lo largo de las hifas. Sin embargo, C. parapsilosis,
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C. kefyr y C. krusei se ordenan a lo largo de una corriente de blastoconidias, siendo esta
la caracterstica que permite su identificacin; adems, algunas cepas pueden producir
hifas gigantes.
Las clamidosporas son formas de resistencia, redondas u ovales, de 6-12 m de
dimetro y pared gruesa, con aspecto de esporas laterales o terminales. Su produccin es
caracterstica y diagnstica de C. albicans [3] (Figura 11.11). Tambin puede hacerse
una identificacin presuntiva de esta especie si se observa la formacin de grupos
compactos de blastoconidias, a intervalos regulares, a lo largo de la pseudohifa.
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2. Identificacin mediante criterios bioqumicos
2.1. Criterios bioqumicos enzimticos
Medios cromognicos
Estos medios estn diseados para el aislamiento e identificacin de algunas especies
del gnero Candida tras su incubacin a 30-37 C durante 24 a 48 h.
El fundamento de los mismos se basa en la deteccin de determinadas actividades
enzimticas por parte de las levaduras mediante la hidrlisis especfica de un sustrato
cromognico en presencia de un indicador de la enzima. Una de las principales ventajas
de estos medios es permitir diferenciar fcilmente los cultivos mixtos.
Estos medios pueden ser utilizados como medios de aislamientos primarios o con fines
de identificacin, despus del aislamiento de los organismos levaduriformes en los
medios convencionales. Aunque, segn nuestra experiencia, slo debera utilizarse
como medio de aislamiento primario en aquellas muestras con alta sospecha de micosis
por levaduras.
CHROMagar Candida
El medio CHROMagar Candida (CHROMagar) fue descrito por Odds y Bernaerts en
1994 para identificar las especies clnicamente importantes del gnero Candida [6].
CHROMagar Candida permite diferenciar C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, y C.
glabrata en funcin de los colores que desarrollan en este medio.
La siembra se realiza segn las tcnicas tradicionales y las placas se incuban a 30-37 C
durante 48 h para que las levaduras desarrollen completamente el color. Al cabo de este
tiempo, las colonias de C. albicans son lisas y de color verde esmeralda, a diferencia de
C. dubliniensis que desarrolla un color verde oscuro y que, adems, es incapaz de crecer
a 45 C [7]. C. tropicalis produce colonias azul oscuro con un halo prpura-marrn en
el agar que la rodea. C. krusei forma colonias rugosas con el centro rosado y el borde
blanco. C. glabrata manifiesta un color violeta morado. Las dems especies desarrollan
colores y tonalidades diversas que no permiten su identificacin por este medio (Figuras
11.16 y 11.17).
COLOREX Candida
Colorex Candida (Biomedics) es un nuevo medio cromgenico y diferencial que
facilita la identificacin presuntiva de algunas de la levaduras de mayor importancia en
clnica (C. albicans, C. tropicalis y C. krusei).
La siembra se realiza segn las tcnicas habituales y las placas se incuban a 30-37C,
segn el origen de la muestra, durante 24-48 h. En este medio, C. albicans desarrolla
colonias verdes, C. tropicalis azules-grisceas y C. krusei colonias rosas rizadas.
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Cromogen Albicans
Cromogen Albicans (Biomedics) es un medio diferencial y selectivo utilizado para el
aislamiento e identificacin de C. albicans en muestras vaginales, rectales, escamas,
orina, pus, escobillonados
bucales, etc. La siembra se realiza segn las tcnicas habituales y las placas se incuban a
30-37 C, segn el origen de las muestras, durante 24-48 h. Las colonias de C. albicans
adquieren un color azul verdoso caracterstico, dependiendo del periodo de incubacin y
la temperatura, con formas redondeadas, lisas y ligeramente elevadas. Las otras especies
de levaduras aparecen de color blanco cremoso y necesitan una identificacin
bioqumica posterior.
Candida ID
El medio Candida ID (bioMrieux) es un medio cromognico que permite el
aislamiento de organismos levaduriformes, la identificacin presuntiva de C. albicans y
cierta orientacin para la identificacin de otras especies no albicans. La inoculacin e
incubacin son similares a las descritas para otros medios cromognicos.
En Candida ID, las colonias de C. albicans son redondeadas, ligeramente convexas,
lisas, de bordes netos y de color azul (cuya intensidad vara en funcin del tiempo de
incubacin). Las colonias de C. tropicalis, C. lusitaniae, C. guilliermondii y C. kefyr
desarrollan un color rosa a las 48 h de incubacin.
Otras especies, como C. famata, C. humicola, y Cryptococcus neoformans, pueden
originar colonias rosas ms o menos intensas. El resto de las especies desarrolla un
color blanco-crema, requiriendo una identificacin bioqumica posterior (Figura 11.18).
Albicans ID2
El medio Albicans ID2 (bioMrieux) es muy parecido al anterior. Se ha enriquecido la
frmula para facilitar el aislamiento y la identificacin de las colonias de C. albicans
que desarrollan un color azul ms intenso. Adems, permite, la identificacin presuntiva
de C. tropicalis ya que presenta una tonalidad verdosa en este medio. Las colonias de
las dems especies son de color blanco. La inoculacin e incubacin son similares al
medio anterior.
Candida ID2 (CAN2)
El medio Candida ID 2 (bioMrieux) es un medio cromognico destinado al aislamiento
selectivo de levaduras, identificacin de la especie C. albicans y diferenciacin
presuntiva de un conjunto de especies como C. tropicalis, C. lusitaniae y C. kefyr. Este
medio se ha presentado como una modificacin de la formula anterior (medio
CandidaID-CA) . La inoculacin e incubacin se llevar a cabo igual que en los casos
anteriores, tras 24-48 h. a 30-37C, se observar el color de las colonias. Azul plido a
azul oscuro es propio de C. albicans; rosa es caracterstico de C. tropicalis, C.
lusitaniae y C. kefyr, la identificacin de estas especies debe continuarse por pruebas
bioqumica y/o inmunolgicas. Las colonias de color blanco crema no pueden
identificarse de forma presuntiva por lo que deben utilizarse tcnicas bioqumicas y/o
inmunolgicas
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SEMINARIO N02
CandiSelect
El medio CandiSelect (Bio-Rad) es un medio selectivo que permite la identificacin de
C. albicans mediante la hidrlisis del sustrato cromognico presente lo que origina el
desarrollo de un color azul por las colonias de esta especie. La inoculacin e incubacin
son similares a los otros medios romognicos. C. albicans se identifica por la presencia
de colonias lisas azules y el resto de las levaduras manifiesta un color blanco en sus
colonias. A las 48 h de incubacin, algunas cepas de C. tropicalis y Trichosporon spp.
Pueden tambin desarrollar colonias azules, pero morfolgicamente son diferentes a C.
albicans.
Fluoroplate Candida
El Agar Fluoroplate Candida (Merck) permite identificar macroscpicamente C.
albicans por su capacidad de hidrolizar el sustracto 4-metilumbeliferil- N-acetil--Dgalactosaminida, por la enzima
N-acetil-galactosaminidasa (NAGasa), originando una fluorescencia blanquecina al
iluminar la placa con luz ultravioleta. El resto de las especies no presenta fluorescencia.
La siembra en este medio se realiza de forma convencional y las placas se incuban a 3037 C durante 18-24 h. La lectura se realiza, en la oscuridad, colocando las placas sobre
un transiluminador de luz ultravioleta de 365 nm (Linus).
ANALISIS CLNICO
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SEMINARIO N02
Sistema Uni-Yeast-Tek
El sistema Uni-Yeast Tek (Remel) est constituido por una placa plstica con mltiples
compartimentos que contienen un medio con agar para la asimilacin diferencial de
siete hidratos de carbono.
Tambin incorpora una cubeta central con agar harina de maz-Tween 80 para
determinar el crecimiento micelial y la produccin de clamidosporas. Adems, est
provisto de agar urea, agar para la asimilacin y reduccin de nitratos y de un caldo con
extracto de carne al 2,6% (con 0,05% de glucosa) para realizar la prueba del tubo
germinal.
2.3. Sistemas semiautomticos
En la actualidad se han comercializado diversos mtodos de asimilacin de nutrientes
que simplifican tanto su uso como su interpretacin
API 20C AUX
La galera API 20 C AUX (bioMrieux) se compone de 20 cpulas con sustratos
deshidratados que permiten realizar 19 pruebas de asimilacin. Las cpulas se inoculan
con un medio mnimo semislido y las levaduras slo se reproducen si son capaces de
utilizar el sustrato correspondiente.
Permite identificar un total de 34 especies diferentes. La lectura de estas reacciones se
hace por comparacin con un control de crecimiento y la identificacin se obtiene, a
partir de un cdigo numrico, mediante un catlogo analtico o un programa
informtico.
Galera ID 32C
La galera ID 32 C (bioMrieux) est compuesta por diferentes pruebas de asimilacin y
por una base de datos especialmente adaptada. Permite identificar 63 especies diferentes
de organismos levaduriformes o relacionados y puede ser utilizada manualmente o bien
de forma automatizada mediante los sistemas ATB Expression o mini API.
La galera se compone de 32 cpulas: 29 contienen cada una un sustrato carbonado
deshidratado, una es el control negativo, otra detecta la sensibilidad a la cicloheximida y
la ltima es una prueba colorimtrica para la esculina. El procedimiento para la
inoculacin de la galera, incubacin e interpretacin es similar al descrito para el
sistema API 20 C AUX. La nica diferencia es la posibilidad de realizar la lectura de la
galera, de forma automtica, mediante el sistema ATB Expression o mini API.
Sistema Vitek
Las tarjetas Yeast Biochemical Card (YBC) del sistema Vitek (bioMrieux) permiten la
identificacin de organismos levaduriformes y afines de forma automatizada. Son unas
tarjetas plsticas desechables que incluyen 30 celdillas: 26 pruebas bioqumicas
convencionales y 4 controles. Por otra parte, el sistema Vitek consta de un mdulo con
cmara de vaco para inoculacin de las tarjetas, un lector/incubador, un sistema
automtico de manipulacin de tarjetas, un fotmetro para medir la densidad ptica, un
ordenador central y una impresora.
El sitema Vitek permite identificar 36 especies diferentes de levaduras: 16 especies del
gnero Candida, 6 Cryptococcus, 3 Rhodotorula, 2 Trichosporon, 3 Geotrichum, 2
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SEMINARIO N02
Prototheca, Hansenula anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia
lipolytica.
2.4. Sistemas automticos
Sistema Vitek 2
El sistema Vitek 2 (bioMrieux) es un sistema totalmente automtico para la deteccin
del metabolismo fngico que puede identificar levadu-ras y organismos afines en tan
slo 15 h. Est basado en ecnologa de fluorescencia y se compone de las tarjetas de
anlisis con 63 pocillos, una consola satlite para la recogida de informacin, un
mdulo incubador, un mdulo principal donde se procesa la informacin gracias a un
software de anlisis y un sistema experto avanzado.
2.5. Identificacin rpida de levaduras mediante pruebas bioqumicas y
enzimticas
RapID Yeast Plus System
El RapID Yeast Plus System (Remel) es un sistema compuesto por un panel de 18
pocillos; cada uno contiene un sustrato convencional o cromognico que detecta la
asimilacin de carbohidratos, cidos orgnicos o aminocidos, as como la hidrlisis de
la urea y de cidos grasos. Permite identificar hasta 43 especies de levaduras.
Fongiscreen 4H
Fongiscreen 4H (Bio-Rad) es un sistema basado en el estudio del perfil enzimtico de
algunas levaduras, permitiendo identificar en 4 h C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis
y C. neoformans. La utilizacin de sustratos deshidratados por las enzimas fngicas se
manifiesta por un cambio de color, ya sea espontneamente o despus de aadir un
reactivo revelador.
3. Identificacin mediante criterios inmunolgicos
3.1. Bichro-latex albicans
Bichro-latex albicans (Fumouze) es un mtodo para la identificacin rpida de
aislamientos C. albicans por aglutinacin de partculas ltex utilizando un anticuerpo
monoclonal especfico de C. albicans.
a) bolas de ltex recubiertas con anticuerpos monoclonales que reaccionan
especficamente con el antgeno de C. albicans localizado en su pared celular, y
b) un agente disociante que permite la exposicin al antgeno.
3.2. Krusei-color
Krusei-color (Fumouze) es un mtodo para la identificacin de aislamientos de C.
krusei por aglutinacin de partculas de ltex, mediante un anticuerpo monoclonal que
reacciona especficamente con el antgeno localizado en su pared.
ANALISIS CLNICO
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SEMINARIO N02
3.3. Bichro-Dubli
Bichro-Dubli (Fumouze) es un mtodo para la identificacin rpida de C.
dubliniensis, basado en la coaglutinacin de blastosporas de esta especie con partculas
de ltex recubiertas con anticuerpos monoclonales, el cual permite la deteccin
especifica de un antgeno de C. dubliniensis localizado en la superficie de la clula. La
emulsin de colonias de C. dubliniensis en el reactivo Bichro-Dubli revela una
coaglutinacin, visible a simple vista, entre las blastosporas que portan el antgeno y las
particulas de ltex sensibilizadas con anticuerpos monoclonales, aglutinados azules que
progresivamente se extienden hacia la periferia, formando un borde azul alrededor de un
rea central roja/rosa.
11.5. Identificacin de levaduras lipfilas
Debido a su requerimiento de cidos grasos, las levaduras lipfilas no pueden ser
identificadas con los sistemas y medios habituales para otras levaduras, por lo que su
identificacin merece un comentario diferenciado.
Durante mucho aos se ha venido utilizando el binomio Malassezia furfur para designar
la fase micelial de las levaduras lipfilas encontradas en la piel humana, en tanto se
reservaban los trminos Pityrosporum ovale y Pityrosporum orbiculare para los dos
tipos morfolgicos de la fase levaduriforme.
La taxonoma del gnero Malassezia ha sido recientemente revisada y comprende en la
actualidad siete especies: M. furfur, M. pachydermatis, M. sympodialis, M. globosa, M.
obtusa, M. restricta y M. slooffiae
Es factible recuperar estos microorganismos en cultivos en SDA o en agar sangre de
carnero al 5% si los cubrimos con cidos grasos de cadena larga, como los contenidos
en el aceite de oliva. Tras incubacin a 35 C durante 2 a 4 das se desarrollan unas
colonias de consistencia cremosa muy parecidas a las producidas por las otras
levaduras.
Adems de los medios suplementados, tambin se puede utilizar medios especficos
para el aislamiento de las especies de este gnero, como son el medio Agar de Dixon
modificado y el de Leeming. A partir de su crecimiento en estos medios, la
identificacin de las especies de Malassezia se lleva a cabo mediante criterios
microscpicos y bioqumicos [13]. Entre estos ltimos: produccin de catalasa;
crecimiento en SDA o suplementado con lpidos a 32 C; crecimiento en Agar Dixon
modificado a 32 C, 37 C y 40 C; utilizacin de Tween 80, Tween 40 y Tween 20. (8)
FUNGIGRAMA:
Las levaduras del gnero Cndida se encuentran ampliamente difundidas en la
naturaleza. maz, agar papa, caldo para ureasa y suero en la humano para filamentacin.
Son componentes naturales de la microbiota en las personas entrndose en piel, boca,
intestino y genitales.
Est reportado que un 75% de la poblacin femenina presentar por lo menos un
episodio de vulvovaginitis por Cndida en su vida.
ANALISIS CLNICO
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El gnero Candida es un grupo de levaduras muy difundidas en la naturaleza, que puede
causar patologas en el ser humano, siendo una de las ms habituales la vulvovaginitis.
Si bien, Candida albicans se asla con mayor frecuencia, en los ltimos aos ha habido
un incremento en los aislamientos de Candida glabrata, Candida guillermondii y
Candida krusei. Estos microorganismos presentan sensibilidad disminuida o nula al
Fluconazol. Es por eso que el objetivo es caracterizar las diferentes especies de candidas
halladas en muestras de exudado vaginal, y evaluar la sensibilidad a los antifngicos de
las especies de candida no albicans encontradas.
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REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
Microbiologa.
Editorial
Mdica
Panamericana.
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10. Floridia R, Ronchi G, Ampuero V. Caracterizacin de las especies de Cndida
halladas en muestras de exudado vaginal de mujeres sintomticas. 2011. Acceso:
20 Abril, 2014. Disponible en:
http://www.revistabioanalisis.com/arxius/notas/cr1A7WLV.pdf
11. Onicomicosis: agente causal, correlacin clnica y sensibilidad a alilamnicos e
imidazlicos. 2011. Acceso: 20/04/2014. Disponible en:
http://www.medigraphic.com/pdfs/patol/pt-2011/pt114f.pdf
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