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UNIVERS]DAD DE EL SALVADOR
FACULTAD DE CIENCTAS AGRONOMCAS
DEPARTAMENTO DE PROTECCION VEGETAL
MICROBIOLOGA ANIMAL

..clcLo

I- 2014

INTERPRETACIN Y FUNDAMENTO DE TAS PRUEBAS PARA

IDENTIFICACIN DE BACTERTAS
Licda: , Rosmerv Erroa

En esquema, la realizacin de una prueba boqumca implca:

1) Cultvar el mcroorgansmo que se investiga en un medio que contiene un

determinado sustrato o inhlbdor y luego de la incubacin vlsullzar el crecimlento y la
degradacin de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agrgado de.un
reactivo revelador de la pfesencia del sustrator o de algtin producto de su degradacin.

lactosa ni de sacarosa. la cantidad de cido Producda por fermentacin ser baja

(porque la cantdad de glucosa inicial es baja). En las primeras horas (10 a 16 hs) de
ncubacn se producir viraje del indcador al amarillo en todo el tubo (Bisel y fondo),
pero al contlnuar la incubacin, el Bsel del tubo retornar al rojo por la produccin de
minas dbida a la degradacin aerobia de las peptonas antes descrF.
Si el microorganismo, fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentracones de
estos azcares son 10 veces mayores a Ia glucosa, se produqir gran cantidad de cido
(que no puede ser neutralizado por la produccin de aminas en la superficie), por lo
tanto todo el tubo (Bisel y fondo) virar al cofor amarillo (cido)'

La produccin d"-!d.3-Pg!i!.f|gjiQglruje pone en-evidenca por precpitacn del

sulfuro ferroso (nE6JT mri iI reaciise da preferencialmente en medo cido,
un ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede.cubrlr todo el fondo dll tubo y
enmascarar el color amarillo) se lee como fermentacin de algunos de los azcares del
iledio. Adems puede observarse la pfoduccin de gas (Hz y COr), ya sea como
burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o desplazamiento del mismo hacia
la superficie.

2) cultivaf el microorganismo en un medio de propagacin gue contenga el sustrato

de una enzima induclble y luego de la incubacin demostrar la activldad enzlmuca.

TSI

empleadas con fines de

Existen una gran
-se variedad deapruebas bioqumicas las
que se utilizan ms
continuacn solo
identficcin,
enumeran

C_.!C

sodio

*}

\;

"
J

Peptona

Ej

E,

coli

I )-*
l// I
t I
| |
(-J+

cido (A): Bisel color amarillo

Ut

fermenta

glucosa, lactosa y/o

scarosa

cido (A); fondo amarllo

TRES AZUCARES Y IIIERRO (TSI)

Fundamento,
El agar se prepara en forma de Bsel de flauta o bisel. Esto determina que existan dos
cmaras de reaccin dentro del mismo tubo. La porcin nclinada (Bisel) expuest en
toda su superficie al oxgeno es aerobia y la porcin inferior (fondo) est protegida del
are v es relatlvamente anaeroba.

Al crecer un m;croorganismo en el TSI, el Bsel tlende a virar al pH alcalino (color rojo

por el rojo fenol) por la produccin de aminas, debido a la utilizacin aerobla de las
peptonas. En el fondo del tubo -donde no hay oxgeno- la degradacin de peptonas es
menor y no se generan aminas, de manela que se pueden detectar la produccin de
pequeas catidades de cido (color amarllo por el rojo fenol). S se inocrlan
microoorqanismo no feimentadores no se formarn cdos, pero por la produccln de
aminas en el Blsel, todo el medio quedar rojo,

La glucosa en el TSI est en una proporcn 10 veces menor que la lactosa y la

scarosa. s el TSI es inoculad-o'con una bactera fermentadora de glucosa pero no de

Eii Poteus

<:

l //r' I
I t'-

Alcalino (N): bisel rosado

N/A: solo fermenta glucosa

Acido (A): fondo amaillo

LJ
Eji Pseudot ronas

Alcalino (N): bisel rosado

NIN: no fermenta
nngn carbohidrato
Alcalno (N): fondo rosado

,CI+*".0q

Ar C-(%"e't*

Rojo fenol (indcador)

POS]BLES LECIUMS

frecuentemente, agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre

corriente.

Agar

0.17o

Glucosa
Sacarosa 1%

Lactosa 1%
oe
{iosulfato
Suffato amnico ferroso

I
t-

En todos los casos se debe tener un cultlvo fresco (18-24 hrs. de ncubacin) en un
medio en que el microorganismo se desanolla en forma ptima, a pH, atmsfera y

temperatura adecuados

a
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A partir de un cutvo puro, serbrar en TSI, picando el fondo y extendendo sobre la

superficie de medio.

Incubacin
A 35-37oC durante 24 horas, en aerobiosis,

Vogs-Proskauer: A la otra porcn de cultivo se fe aade;

0,6m1 del Reactivo A de Voges-proskauer (alfa-naftol 5olo en etlico absoluto). Fl
medo adquiee un aspecto lechoso.

0,2m del Reactvo B de Voges-proskauer (KOH 400/0). Desaparece el aspecto

lechoso y se agta fuertemente,
Prueba positva: antes de cinco minutos apaiece un color rosado-violceo o
anaranjado rojzo, ms o menos ntenso, que se inicia qn la parte superior del
tubo, 6 la prueba es negatva no aparece ninguna coloracln.

Resultados
1-Bisel alcalno/fondo

(Bsel rojo/fondo amarlllo): el microorgansmo sotamente

cido
f"T-gB+4ll!oa*-:*

Srve para detectar s los mcroorgansmos son capaces de fermentar

el mantol
gue srn detectadgs sra.gias at ndicadio-i@iqG
para esta pruba et medio mantol incluye 7,5 g/l de D_
Manita. Bacterias manitol (-) son. dentro de las enterobacteria,, proteus-mrdblA
Proteus wlgans y Shlgella dysenterae. Entre las bacterias de mportancla clnica, la
prueba del manitof srve para dferencar Staphylococcus aureus(+) de Staphytococcus
epdernds (),

2-Bisel cido/fodo cdo (Bisel amarillofondo amarillo): el micoorganismo fermenta

glucosa, lactosa v/o sacarosa

3-Bisel alcalno/fondo alcalino (Bisel rojo/fondo rojo):

fermentador de azcares.

4-La presencia de burbujas,

mcroorgansmo produce gas.

el

microorgansmo

es

s-El ennegrecmiento del medo ndica que

sulfhdrico.

el

!9f:.t{: ei$$g:cidos
camorara a coror amailo.

no

ruptum del medo de cultvo, indca oue

el

microorganismo produce cido

Estas dos. pruebas forman parte del IMVIC de las colimetras y permiten la
diferenclacin dentro de las entefobacterias de grupo coli
ergenes, Las
enterobacteras son anaerobios facurtatvos que utrizarn ra qrucose ef dos fq:91
consumrenoo
raproamente et oxfgeno del med,, para, en;qgr$gJt$gr, cAllnu.Ff metabolizndola

*e%

Piueba negativa: No hy cambio de color

PRUEBA DE LA MOVILIDAD

f"{r,:,"'q...

Olqgl. 13 letahol?d0--ggr!iaeDte-tfe5ru.cin*ffi.UA,

Prueba postiva: cambo de color de rosado a amarillo

.1,* ,.rrrkn,,'.
' ',.' *r-r trcnry'r
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ROJO DE METTLO/VOGEs-PROSKAUER

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DfL MANITOI.

PRUEBA

+lliq.rl;ri

pri

Sirve para determinar s n mfcrootgansmo es mvl o inmvil. Las bacters tienen

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movlidad por medo de $us flagelos que se encuentmn princpalmente entre los bacilos
aunque exsten algunas formas de cocos mviles.

El medio movilidad permte la reatizacin de esta prueba gracas a ser semistido ya

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que presenta solamente 3,5 9/l de agar. En estas condicibnes, las bacterias mvilLs
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un enturbiamiento-homogdneo del medio debido a la distribucin aleatoria
f r,. producirn
. Fermentacin e&-$*EtL$) La reatizan.tas bacteras det grupo de E
'l; , 'f.- .,..
los microorganismos, Por el contraro, las bacterias inmviles permanecern en la
' iJ L- \--' de
coil y ros productos frnates son acidos orgnicos (cidos frmico, acflco, lctico
r.::,,. .;:.lri lti r-'... ,
msma linea de la pcadura en que se sembraron.
p
.
y succnico) que provocan un fueite descenbo del pH inaial Ael medio. peae
l(:r{ir"r .?' 1"." r, /ri :' l
detectarse por el vlraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo
Entrelasenterobacterias,lamovildadnospermitediferenciarelgnero
Klebsrella(-)
por encima de pH 5,1 y rojo por debajo
4,4.
",. -*3 f-,-,,fr,"l
: : Fr ' " de las restantes que.guelen ser movlidad (+).
ri'' :"rrr ,.!i"{r-dr'
. Fermentaci uilni'Ugirtm CVDde L
ieatzan tas bacterias cel qrupo J df,*, ".
Klebsella-Enterobader, Los productos finales son compuestos neutros iomo I
-?'.;:Jt]'
Dentro.del gnero Baciltus, nos perrnte diferencar B,anthracis (-) de otras espectes
1,'r.' t1i*.
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el butanodot y
e.?!g9q!qe"4!!dig!toJna goTojJrme;*ard"ffi ,
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..id generalmente (+).
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ser detectada Onadreglfpg{io KOH (ieactioA-le Voges-proskauer) y alfq:l
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maer.qhhJfffmenta#I).

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sta pueA'se-i J?-i

tipos:

el
hfl6u

a telloffiF3iiui)
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paoducendo un color rojo caracterstco.

.
.
.

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qe reaccionarn- con este.coGlo}

Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le aade unas gotas (4-5) de solucin
ndicadora de Rojo de Metlo. Se agta para homogeneizar y s observa

f '* r;r'r

ta . lr{f
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cororacin.

positiva: si vira al rojo

Negatlva: s permanece amarillo.

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;c' ,
1' {.

Algunas bacteras pueden usar nitratos como aceptor fnal de e- en la respiracin. El

puede ser reducjdo a ntrito o en un paso ms a gases (xdos de ntrgeno),. . ,- P
La..F litrato.
: Las enterobacterias y Pseudomonas son usualmente positvos

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pRUEBA DE LA REDUCCTN DE NTTRATOS

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Las bacterias se inoculan en medos conteniendo nitrato sdco. E ntrto procedente

cido
sulfanlico producindose un color rojo.

de la reduccin de clulas puede detectarse aadiendo alfanaftilamna y

el ntratq puede habeBe reducido ms que nltritos

producindose gas. Si al aadir zinc en polvo no hay color rojo es que no hay nitrato
porque se ha reducido a gas (desnitrifcacn)
Se puede saber s

.
.
.

Un cambo de color (rojo) dentro de los 30 seg. indica prueba completa con

resutado positivo,
Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg)

de polvo de cinc pursimo, totalmente exento de nitratos o ntrtos, y

observa el cambo de color drante otros 30 seg, al cabo de los cuales
realza la interpretacin final,
Las enterobactetias son generalmente nitratos

se
se

(+)

PRUEBA DEL INDOL

Mediante esta prueba se detecta la llbe:acin dq indol en un cultivo bacteriano. Dicha
lberacn se debe a l" O"gfig*j9n-?-q_-ffi:q!.ff:tr-'glane mediante el grtAnra'

-Flegativol el medo permanece de color verde debdo

bacteriano y no hay cambo de color.

a que no hay desarrollo

PRUEAA DE LA UREASA (Urea)

formando dos
Determina la caDacdad de un microoroanismo de desdoblar la urea *ejii''
es
molculas da
caracterstic de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar
este gnero de otras enterobacteras que dan negativo o postvo retafdado.

@sE"Tiudad

5e cultiva el microorganismo en agar urea de Christensen, Este medio se complementa

despus del autoclavado con 50 ml/l de urea estril. Esta ser degradada por aquellos
microofganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradacn produce
amonaco oue har variar el color del indicador de amarllo a rojo,*ponindose as de

"

matriesroliffiffrteeg:**

'

-;d

Para revelar el resultado de esta prueba es mportante tener en cuenfa el tiempo de

incubacin ya que especles de Proteus welven alcalino el medio poco despus de la
inoculacn y sus resultados deben ser ledos en las primeras 2-6 horas, mentras que
Cltrobacter freundy Klebslella pneumoniae tienen actvldad ureasa dentTo de las 2+
48 horas de lcubacn.

'gi$gfe$e*
Para la relizacin de esta prueba la bacteria se cultiva durante 2448 horas en un
caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante trptfano), Para la
posterior deteccin del indol se usa el reactivo de Kovacs (Erlich)
Si la bacteria posee la enzima trptofanasa, al aadr

al

cultvo 5 gotas del reactivo de

Kovacs (Erlich) por la pared del tubo, se producir un anillo de color rojo en la
superficie del caldo y la prueba ser consderada positiva.

FERMENTACION DE AZUCARES
LACTOSA/DEXTROSA/SUCRO5A

Esta prueb se usa para diferenclar entre las enterobacterias en general y el grupo de
las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importanc debido a que los
coliformes se utilizan como organismos indicadores de coltaminacn fecal en anlsis,
sobre todo, de aguas, En bacteriologa se define el grupo de organismos coliformes

Si esto ocurre despus de 24 horas, la prueba se consdera completa, pero si es

negativo deber ncubarse otras 24 hors y repetirse la prueba. Por ello es convenente
hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sno en una porcin de unos 2 mf que

como los "bacilos Gram negatvos, aerobios y anaerobos facultatvos, no

formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formacn d gas a
35oc n 48 horas", Se incluye una gran varedad de bacterias, la mayora de ellas de

se retira de l aspticamente.

origen intestinal.

PRUEBA DEL CITRATO

Una manera sencilla de realzar las pruebas de la fermentacn de la Lactosa, Dextrosa,

Sucrosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo g rnedios con la azcar
especfica conteniendo un indcador de pH (rojo neutro o rojo fenol)

{r-,

F_.

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q..

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En las enterobacteras, entre ellas, las que fermenten la lactosa (colformes) lberarn
productos cidos-que producrn u! cambioq pll,qutile-clelectar gracas algp
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medlo contiene ctrato
de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de ntrgeno respectivamente
y azul de bromotimol como indicador de pH. Slo las bacterias capaces de metabolizar
el ctrato (citrato per:reasa) podrn multpticarse en este medo y liberarn ones
amonio lo q; junto con la elmnacn del ctrato (cdo), generar una fuerte
basificacin del medlo que ser aparente por un camblo de color del indcador de pH,
de verde a azul.

-Postivo: creclmiento y color azul en el

H*l}p

iif

Bsel, alcalinidad,

nrf,r , :.;

fenol.

HIDRLISIS DE GELATINA
La mayora de los polmeros son demasado grandes para ser transportados dentro de
las clulas. Las bacterias excreban.enzmas exiracelularqg 4ue hidroll4A.esos polimeros
transportando af-itioi?i-id-itla en monmeros que les sirven para crecer,
La produccin de prolq?Eas-es evaluada por incorporacn de una protena (gelatina o

l.

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casena) en un medio semi slido en tubo. El tubo inoculado se coloca

refrigerador o una base de hielo por 30 min

en

el

La movlidad se demuestra por un enturbamiento del medio

difunde ms all de la lnea de inoculacin.

o por

crecimento cue

Medo licuado: prueba postva

La reaccn postiva a la ornitina est dada por un color prpura del medo.

Medio slido: prueba negativa

Debido a la fermentacn de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin

cda y orlginando que el indicadorde pH prpura de bromocresol vre al amarllo,

La presencia de aidez, otorga condciones ptmas para la actvidad de la enzima

ornitina decqo.Xilasa, la cual decarboxila la ornitina presente.

HIDRLISIS oEL ALMIDN

-..d.s.-

Los polisacarjdot como el almidn son demasiados largos para ser transportados al
interior de la clula, Los mcroorgansmos xcretan amilasas que hdrolzn esos
polmeros hasta oligo o monosacridos que pueden usarse como sustratos para crecer.
La hidrlisis de almldn es analzada en medio lqudo conteniendo almldn. Despus
de ncubar se agrega de 3-4 gotas de lugol que al unirse con el almidn Intacto forma
un complejo prpura

No hay cambo de color: Positvo si el almdn es degradado, no se une el odooduro de' Lugol y no se observa color en el medio. La prueba es-pOStTIVA, sin
color., la bacteria posee la enzima amlasa para degradar el almidn presente
en el medo de cultivo, para convertirlo en azcaes simples. El iodo-loduro del
lugol adconado NO se une por que el almidn no est presente en el medo de
cultvo.

Color azul o prpura: Negativo prueba de amilasa NEGATIVA, color azul

oscuro, La bactera no posee la enzma amilasa paa degradar el almidn
present en el medio de cultivo. por eso el iodo-ioduro del luool adiclonado se
une al almidn presente en el medio de cultivo,

5e ncluyen en este 3 pruebas boqumicas debido a que se pueden realizar cultivando

el microorganismo en un nico medio, Movilidad Indol y Ornltna, que se prepara en
tubo con agar recto y se siembra en pcadura, incubndose a 37oC durante 24 horas..

en base a su

movildad,

Medo de cultivo semislido, altamente nutritivo debdo a la presenca de extracto de

levadura, peptona y triptefna, La triptena aporta grandes cantidades de triptofano,
sustrato de la enzima triptofanasa, para la realizacin de la p"ueba del indsl. La

hacia el color prpura,

El indol, es producdo a partr del trptofanqpor los microorganismos que contienen la
enzma triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de
reactivo de Kovac's o de Erlich, Indica un resultado positvo.

l-Movilldad:
El agaf es el agente soldificante, el cual se encuentra en una concentracin que le da
la caracterlsticas de medio semislido util para evidenciar la rnotilidad bacterana.

-Resultado postivo: presencia de turbidez o crecmiento ms all de la lnea de

siembra.
-Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de sembra.

2-Ornitina decarboxlasa:
-Resultado positivo: color prpura.
-Resultado negativo: color amarillo, A veces se puede desarollar un color violceo en
la suDercie del medio.

MIO (Movilida4 ltldol, Ornitina)

f Medio usado para la identifcacln de Enterobacteriaceae

) actvdad de ornitna decarboxilasa y produccin de indot.
U

Po decarboxllacin, se alcalinz el medo, con el consecuente viraje del indicador

dextrosa es el hdrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la

deteccin de la enzima orntina decarlloxilasa, el prpura de bromocresol es el
indcador de pH, que en medio alcalino es de color prpura y en medlo cido es

amarillo.
j,Por su composicin, es posble detectar 3 reaccones en un msmo tubo: movilidad,
y'presencia de orntna decarboxilasa e indol.

3-Pruba del indol:

La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movildad y la prueba
de orntna.
-Resultado postvo: color rojo al agregar el reactivo revelador.
-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarllento.

SIM : (Movilidad, produccin de indol y de eulfuro de hidrgeno)

Es un medo semisldo destinado a veriflcar la movilidad, produccn de indol y de
sulfuro de hidrgeno en un msmo tubo al igual que el MIO
Es til para diferenciar membros de la famila Enterobacteriaceae.

Fundamento
El triptfano es un aminocdo constituyente de muchas peptonas, y particularmente
de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. Fn el

proceso intervene un conjunto de enzmas llamadas triptofanasa, El lndol producido se

combina con el aldehido del reactivo de Kovac's o de Erlich, para originar un

compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medo, por la
turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras qoe aquellas

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