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Cromatografia lquida

de alta eficincia

O que cromatografia lquida?

cromatografia

fundamenta-se

na

migrao

diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido


a diferentes interaes entre duas fases imiscveis, sendo uma

fase fixa que tem uma grande rea superficial chamada fase
estacionria, e a outra um fluido que se move atravs da fase
estacionria sendo chamada de fase mvel. Na cromatografia
lquida a fase mvel lquida! (LANAS, 1993; DEGANI; CASS;
VIEIRA, 1998).

Principio da cromatografia lquida


AMOSTRA

Coluna
contendo fase
estacionria.

SOLVENTE

Ao da
gravidade!

Tempo

Tipos de cromatografia lquida:


CROMATOGRAFIA LQUIDA

PLANAR

CCD

COLUNA

HPLC

CP

ADOSRO

PARTIO

INICA

CONVENCIONAL

EXCLUSO

Primeiro, o que HPLC?


HPLC uma abreviao do nome em ingls : High Performance (Pressure)
Liquid Cromatography.
Historia da HPLC:

- Dcada de 60 : O comeo da HPLC como High pressure LC!


- Dcada de 70 : Com a melhora do material da coluna e da
instrumentao, HPLC passa a ser High Performance LC!

- Dcada de 80: A partir dessa dcada houve um boom do HPLC


- 2006- Evoluo da tcnica: UPLC, RRLC, UFLC...

Vantagens da HPLC

FE utilizada inmeras vezes.

Versatilidade: nico requisito a solubilidade na FM.

Tempo reduzido de anlise.

Alta resoluo.

Anlise qualitativa: tR , espectro de absoro no UV (DAD), MS.

Anlise quantitativa: desvios menores do que 5%.

Boa detectabilidade:
Absoro de UV-Vis de comprimento de onda varivel 10-10 g;
Fluorescncia: 10-12 g;

Automatizao

Limitaes da HPLC

Alto custo do instrumento

Alto custo de manuteno

Alto custo de operao

Falta de detector universal sensvel


ndice de refrao: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco estvel.
Espectrmetro de massas: ~US$ 150.000,00

Necessidade de experincia no seu manuseio

Como um HPLC comercial?


Reservatrios dos
solventes e
sistema de
degaseificao.

Bomba.
Injetor.
Coluna.

Detector.

Instrumentao para HPLC

Instrumentao para HPLC

Reservatrio para a fase mvel


Filtro do reservatrio :
Captar a fase mvel e evitar que partculas suspensas na FM obstruam
os capilares ou contaminem a bomba.

Filtros de 10 a 40 um

Limpeza peridica!!

Caractersticas da fase mvel

Ser de alto grau de pureza ou fcil purificao

Dissolver a amostra sem decompor seus componentes

No decompor ou dissolver a fase estacionria

Ter baixa viscosidade

Compatvel com o tipo de detector

Polaridade adequada para permitir a separao dos componentes da amostra.

Degaseificao da FM:
Garanti a reprodutibilidade da vazo
Estabilidade da linha base.

Mtodos de degaseificao

Ultrassom:

Vcuo + ultrassom: Rpido, eficiente, refazer a cada 12 hrs.

Purga com Hlio:

Muito lento, pouco eficiente, requer agitao, em geral o


pior mtodo quando usado sozinho

Contnuo, hlio razoavelmente caro, leva a

aumento de vazamentos, maior custo operacional

Degaseificador on-line: Contnuo, remove o ar logo antes de entrar


na bomba, investimento alto inicial (melhor opo a longo prazo)

Instrumentao para HPLC

Sistema de bombeamento
Tm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutvel de FM para o
sistema cromatogrfico

REQUISITOS:

Ser de material inerte

Presses de at 6000 psi (~400 atm)

Vazo contnua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)

Vazes de 0,1 a 10 ml/min (aplicaes analticas)

Controle de vazo e reprodutibilidade melhor que 1 %

Sistema de bombeamento
Tipos de bombas:
Pneumtica
Deslocamento

Recproca

Bomba pneumtica

Vantagens:
Baixo custo
Livre de pulsaes

Desvantagens:
Baixa presso (at 2000 psi)
Baixo volume
No permite gradiente
Vazo depende da presso de retorno e viscosidade da fase mvel

Bomba de deslocamento
Vantagens:
Vazo independe da presso de retorno e viscosidade da fase mvel
Livre de pulsaes
Desvantagens:
Baixo volume

No permite gradiente

Bomba recproca

Vantagens:
Presso elevada (at 10 000 psi)
Pequeno volume interno (35 a 400 L)
Permite gradiente

Desvantagem:
Fluxo pulsado

Alto custo

Sistema de bombeamento
Isocrtico :

+ A composio da fase mvel permanece constante ao longo da


anlise.
+ Capaz de separa um nmero limitado de analitos.
Gradiente
+ A composio da fase mvel varia durante a anlise.

+ Sistema aplicado com a polaridade dos compostos presentes


na amostra , muito diferente.
+ Separao de amostras complexas.

Separao isocrtica e por gradiente

A eluio isocrtica feita com um nico solvente (ou mistura de


solventes). Se um solvente no propiciar uma eluio suficientemente
rpida de todos os componentes, ento pode ser utilizada uma eluio
por gradiente.

Com base nas eluies isocrticas foi elaborado o gradiente a seguir.

Instrumentao para HPLC

Sistema de Injeo

INJEO MANUAL
- As amostras so introduzidas com seringas.
- Aps virar a ala, a amostra carregada pela fase mvel at o incio
da coluna.

AMOSTRADOR AUTOMTICO
- As amostras so postas em um frasco localizado
dentro do amostrador.
- O amostrador automtico :
1- Mede o volume correto para injeo.
2- Injeta a amostra.
3 Prepara o injetor para uma prxima amostra

Sistema de Injeo
LOAD

Injetor Rheodyne Diagrama de fluxo

Bomba

Coluna

Bomba

Coluna

Sobrecarga de Volume da amostra


Para aproveitar de todos os pratos que uma
colina possui, no se deve injetar um volume
maior que 1% do volume da coluna vazia.
(L)=(raio)2(comprimento)(0,01)

Instrumentao para HPLC

Coluna

Geralmente em ao inox ( mais popular, maior presso)


+ Coluna de vidro reforado (at 600 psi, utilizada para biomoleculas)
+ PEEK polmero ( biocompatvel e quimicamente inerte com a maioria
dos solventes)
+ Preo: > US$ 200.00
Tipos de colunas
+ Analticas : dimetro interno (i.d) 1,0-4,6 mm, comprimento 15 - 250
mm.
+ Preparativas: i.d 4,6 mm, comprimento 50 -250 mm.
A escolha de uma coluna apropriada o ponto crtico para o sucesso
da anlise.

Pr-coluna

Localizada entre o injetor e a coluna

Colunas de 2 a 5 cm, i.d igual ao da coluna.


Mesma FE da coluna de separao.

Protege a coluna
Custo reduzido

Pr-coluna!

Coluna

Fase estacionria.
+ As colunas so recheadas com partculas porosas com dimetro
de 1,8 5 m.

+ Estas partculas porosas na coluna tm geralmente uma fase ligada


quimicamente sobre a sua superfcie, que interage com os componentes da
amostra para separ-los um do outro.

Condicionamento da Coluna
Necessrio para que haja um perfeito equilbrio
da FM e da FE.

Coluna nova: 4- 8 horas


Coluna parada h alguns dias: 2 horas
Coluna de uso dirio: 15 minutos.
Lembre-se: a coluna deve ser
guardada em solvente orgnico.

LC com fase quimicamente ligada

Sntese da FE.

Modos de HPLC
HPLC

Adsoro

Partio

Inica

Excluso

Tipos de cromatografia lquida:

Adsoro:
O mecanismo de separao: competio entre molculas da
amostra e da fase mvel em ocupar os stios ativos da fase estacionria,
slido. (Slica)
Fase estacionria (polar) afetada com frequncia pela
reteno de molculas de alta polaridade como lcoois, gua.

Partio: (CLL ou CFL)


CLL:
O mecanismo de separao: baseia-se nas diferentes
solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase
mvel e na fase estacionria.(slica purificada)
O maior inconveniente desta tcnica a solubilidade da fase
estacionria na fase mvel.
CFL: A fase estacionria est imobilizada por meio de ligaes
qumicas. (Normal ou Reversa)

Fase normal x Fase reversa

Fase normal:
fase estacionria polar;
fase mvel apolar (n-alcanos, clorofrmio, acetato de etila);
solutos neutros;
polaridade soluto t. reteno;
mecanismo reteno: adsoro

Fase reversa:
fase estacionria apolar;
fase mvel polar (tampes, gua, metanol, acetonitrila, THF);
solutos apolares, no-inicos;
polaridade f. mvel t. reteno;
mecanismo reteno: interaes apolares com radicais da coluna.

Fase Normal
Si-OH + R3SiCl

Si-O-Si-(CH3)2R + HCl

OH
Si

Ciano (-C2H4CN)
R=

Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)

silanol livre

Amina (C3H6NH2)

Polaridade da fase mvel

CROMATOGRAFIA DE FASE
NORMAL
Polaridade do soluto:
a > b > c
c

tempo

Nos trabalhos pioneiros usou-se


fases altamente polares, como
gua
e
trietilenoglicol
adsorvidos sobre slica ou
alumina e solventes apolares,
como
hexano
ou
ter
isoproplico, eram usados como
fase mvel; por razes histricas,
este tipo de cromatografia
chamado de fase normal

tempo
Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua
maior solubilidade na fase mvel; aumentando a polaridade da fase mvel tem
o efeito de diminuir o tempo de eluio

Fase reversa

CROMATOGRAFIA DE FASE
REVERSA
Polaridade da fase mvel

Polaridade do soluto: a > b > c

Na cromatografia de fase reversa, a


fase estacionria apolar, um
hidrocarboneto por exemplo (C18), e a
fase mvel relativamente polar
(gua, metanol, acetonitrila, etc)

tempo

c
tempo

Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior
solubilidade na fase mvel; aumentando-se a polaridade da fase mvel aumenta-se
o tempo de eluio

Efeito do comprimento da cadeia na


reteno.

Tipos de cromatografia lquida:


Inica:
A fase estacionria , normalmente, uma resina de poliestireno e
divinilbenzeno, a qual so ligados grupos inicos, como por exemplo,
-SO-3
trocadores fortes de ction
-CO-2
trocadores fracos de ction
-NR+3 trocadores fortes de nions
-NH2R+ trocadores fracos de nions
Os grupos inicos tm um contra-on (com carga oposta) que pode
ser deslocado pelos ons da fase mvel de carga similar a ele.

Excluso:
A separao efetuada de acordo com o tamanho efetivo das
molculas.
A coluna recheada com matria inerte cujos poros tm tamanho
controlado. Onde, as molculas menores penetram a maioria dos poros.

Instrumentao para HPLC

Caractersticas de um detector
Sensibilidade e seletividade adequada
Ampla faixa linear
Baixo volume interno
Resposta Rpida
Boa estabilidade e reprodutibilidade

No destruir a amostra

Caractersticas de um detector

Baixo volume interno


O volume do detector a regio do fluxo cromatogrfico ao qual o detector
responde.
Grande volume alargamento dos picos registrados.

Resposta Rpida
O sistema de deteco deve idealmente apresentar um sinal que represente
um exato instante de uma poro do caminho (volume do detector).
Detector lento picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.

Caractersticas de um detector

Boa estabilidade e reprodutibilidade


Alta confiabilidade e facilidade de uso

No destruir a amostra para:


Permite coletar o eluato
Utilizar um segundo tipo de detector

Detector por espectrofotometria UVvisvel


Um feixe de luz ultravioleta dirigido atravs de uma clula de fluxo e um sensor
mede a luz que passa atravs da clula.

Quando um composto que absorve a energia da luz elui da coluna, ocorrer uma
alterao na quantidade de energia que incide sobre o sensor.
Essa alterao da quantidade de energia amplificada
sistema de registro de dados.

e dirigida para um

Como resposta, um espectro de UV obtido, o que pode ajudar na identificao


de alguns compostos.

Detector por espectrofotometria UVvisvel

Detector por espectrofotometria


UV-visvel

Detector por arranjo de diodos

Detector por arranjo de diodos

Detector por espectrofotometria UVvisvel


Princpio de operao

Absorvncia de luz na faixa UV-visvel

tipo

Seletivo, depende de propriedades do


composto

Min. quanti. detectvel


(g/mL)

10-9

Sensib. a temperatura

Baixa

Sensib. a vazo da f. mvel

No

til com gradientes

Sim

Aplicabilidade

Compostos que absorvem no selecionado

Detector por fluorescncia


Em comparao com detectores de UV-Vis, os detectores de

fluorescncia oferecem uma maior sensibilidade e seletividade, que


permite quantificar e identificar compostos e impurezas em matrizes
complexas em nveis extremamente baixos.

Os detectores de fluorescncia detectam apenas substncias que


apresentam fluorescncia.

Detector por fluorescncia

Detector por fluorescncia


Princpio de operao
tipo
Min. quanti. detetvel (g/mL)
Sensib. a temperatura

Excitao com luz produz emisso


fluorescente
Altamente seletivo
10-9 (excitao a laser: 10-12)
Baixa

Sensib. a vazo da f. mvel

No

til com gradientes

Sim

Aplicabilidade

Compostos ou derivados que fluorescem

Detector por ndice de refrao


A capacidade de um composto ou solvente para desviar a luz, fornece uma
maneira de detect-lo.
O IR uma medida da capacidade de uma molcula em desviar a luz em
uma fase lquida.
A quantidade de deflexo proporcional concentrao.
O detector IR considerado universal porm, pouco sensvel e sofre com a
variao da temperatura.

Detector por ndice de refrao

Detector por ndice de refrao


Princpio de operao
tipo

Mudana no ndice de refrao da fase mvel


Universal, depende de propriedade da f.
mvel

Min. quanti. detetvel (g/mL)

10-7

Sensib. a temperatura

alta

Sensib. a vazo da f. mvel

No

til com gradientes

No

Aplicabilidade

Geral

Detector eletroqumico
Princpio de operao

Oxidao ou reduo em potencial fixo

tipo

Seletivo, depende de propriedades do


composto

Min. quanti. detetvel (g/mL)


Sensib. a temperatura

10-12
Mdia

Sensib. a vazo da f. mvel

Sim

til com gradientes

No

Aplicabilidade

Espcies que oxidam ou reduzem

Detector por condutividade eltrica

Detector por condutividade eltrica


Princpio de operao
tipo
Min. quanti. detetvel (g/mL)
Sensib. a temperatura

Condutividade eltrica devida a presena de


ons
Seletivo, depende de propriedades do
composto
10-8
Mdia

Sensib. a vazo da f. mvel

Sim

til com gradientes

No

Aplicabilidade

Solues aquosas com compostos inicos

E aqui termina a aula,


!!!!!

Referncias bibliogrficas

http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html

SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A.


Princpios de anlise instrumental. 5. Ed., 2002.

COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S.


Introduo a mtodos cromatogrficos.
WESTON, A., BROWN, P. R. HPLC and CE - principles
and practice. 1997.

POLARIDADE DO SOLUTO

ESCOPO DA
CROMATOGRAFIA A
LQUIDO

insolvel em gua
no-polar

espcies MM>104: cromatografia


por excluso
espcies inicas de baixa MM:
cromatografia por troca inica

espcies no-polares:
cromatografia por adsoro
(ismeros estruturais,
hidrocarbonetos alifticos)

inico

polar no-inico

102

103
massa molecular

espcies pequenas e polares,


mas no-inicas: mtodos de
partio (srie homloga)

solvel em gua

104
105
106

ADSORO

PARTIO
fase
reversa

fase
normal

TROCA
INICA

permeao
em gel
EXCLUSO
filtrao
em gel
aplicaes

Figura 28-1 Skoog p642 vp

HPLC x GC
Comparao entre as caractersticas de GC e HPLC
Fator

GC

HPLC

Requisito p/ amostra

voltil e termicamente
estvel

solvel na fase mvel

Tipos de amostra

gases, lquido e slidos

lquidos e slidos

Quantidade mnima
detectvel

10-12 g (ECD)

10-9 g (UV)

Tempo de anlise

minutos at poucas
horas

minutos at muitas
horas

Pratos tericos por


coluna

2.000-300.000

500-25.000

Capacidade analtica

at 200 componentes

at 50 componentes

Tempo de treinamento
do operador

cerca de 3 meses

pelo menos 6 meses

(a)

(c)

(b)

(d)