UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

PLO UNIVERSITRIO DE VOLTA REDONDA

INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA

APOSTILA DE BIOQUMICA
EXPERIMENTAL

Prof. Ricardo de Freitas Branco

Volta Redonda RJ - 2013

APRESENTAO

Essa apostila foi montada visando o ensino de bioqumica

experimental para acadmicos do curso de Qumica. Por este motivo
alguns experimentos so mais direcionados em anlises do que nos
fenmenos bioqumicos, sendo que o enfoque entender a qumica
das anlises e dos fenmenos.
Deve-se ressaltar que alm das normas de segurana de laboratrios de
qumica, as quais os alunos j esto acostumados, os mesmos devem
considerar que em alguns experimentos na bioqumica experimental sero
realizados com material biolgico neste caso, de baixo risco. Por esta razo
necessrio que os alunos sejam introduzidos a algumas normas de segurana
de laboratrios biolgicos. O professor ser responsvel por ministrar na aula
de segurana de laboratrio sobre esse tpico. Demais materiais sobre
segurana em laboratrios podem ser encontrados em outras apostilas vistas
anteriormente e para segurana biolgica h inmeras fontes na rede,
recomenda-se os manuais da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
(ANVISA).

Sumrio
Prtica 1 AMINOCIDOS E SOLUES TAMPES......................................3
Prtica 2 PROTENAS.................................................................................. 11
Prtica 3 ENZIMAS...................................................................................... 15
Prtica 4 CARBOIDRATOS..........................................................................23
Prtica 5 LIPDEOS...................................................................................... 25
Prtica 6 METABOLISMO - VIA GLICOLTICA............................................27
Prtica 7 METABOLISMO - FERMENTAO..............................................30
Prtica 8 ISOLAMENTO DE DNA................................................................31

Prtica 1 AMINOCIDOS E SOLUES TAMPES

Prtica 2 PROTENAS

10

11

12

13

Prtica 3 ENZIMAS

14

15

16

AO DA INVERTASE (B-FRUTOFURANOSIDADE) DE LEVEDO

A invertase ou sacarose uma hidrolase que atua sobre a sacarose
produzindo glicose e frutose. Como ambas as hexoses esto combinadas
pelos seus grupos redutores respectivos, a sacarose no possui
propriedades redutoras. Por este motivo, possvel medir a ao da
invertase, determinando-se a formao de acar redutor.
1.1

Obteno da preparao enzimtica

Colocar um tablete de levedura prensada em um almofariz. Adicionar

5g de slica e 10 ml de ter etlico.
Triturar bem e adicionar pores de 5 ml de gua destilada, ainda
triturando, at completar 30 ml. Ento, deixar em repouso por 30
minutos e a seguir centrifugar por 10 minutos, a alta velocidade. A
soluo sobrenadante resultante dever conter a invertase. Dividir em 2
pores e armazenar uma delas em congelador.
1.2

Curva padro de glicose-frutose,

Ser usada uma soluo padro contendo glicose 0,01 M e frutose

0,01 M. Pipetar alquotas desta soluo e colocar em tubos de ensaio,
conforme a tabela abaixo. Completar o volume a 1,5 ml com gua
destilada.
Adicionar 1 ml do reagente do cido 3,5 dinitrossaliclico (3,5 DNS) e
colocar em banho de gua fervente por 5 minutos. Resfriar em gua fria
e completar o volume a 10 ml com gua destilada. Homogeneizar e ler a
absorvncia a 540 nm.
TUBO N

SOLUO
PADRO (ml)

GUA

ABS. 540 NM

1
2
3
4
5
6
7
Traar curva padro:
Umol de glicdios redutores contra Abs. 540 nm.
Calcular o coeficiente de inclinao da reta.
1.3

Diluio da enzima
Preparar uma srie de tubos conforme indicado abaixo:

17

TUBO
S
0,02
M
1
2
3
4

SACARO
SE

0,5
0,5
0,5
0,5

ACETAT
O

ml
ml
ml
ml

TAMP
O

DILUD INVERTA
A
SE

0,8
0,8
0,8
0,8

0
2
5

ml
ml
ml
ml

ABS. 540
nm

Pipetar 0,2 ml de soluo de invertase previamente diluda.

ATENO: Marcar o tempo zero a partir da adio da enzima no tubo
2. Agitar bem e incubar a temperatura ambiente por 5 minutos.
Interromper a reao pela adio de 1 ml do reagente 3,5 DNS. Ao
tubo 1 adicione a enzima aps a adio do reagente. Agitar bem os
tubos e colocar em banho de gua fervente durante 5 minutos.
Resfriar e completar o volume a 10 ml com gua destilada.
Homogeneizar e ler a absorvncia a 540 nm.
OBS.: Para realizar os outros testes, escolher a melhor diluio da
preparao enzimtica.
1.4. Cintica da ao da invertase
Preparar 7 tubos de ensaio contendo 0,8 ml de tampo acetato
0,05M a pH 4,7. Acrescentar 0,2 ml de soluo de enzima.
Acrescentar 0,5 ml de soluo de sacarose 0,02 M em cada tubo e
interromper a reao pela a adio de 1 ml do reagente 3,5 DNS em
intervalos de tempo conforme a tabela abaixo. Agitar bem os tubos e
colocar em banho gua fervente por 5 minutos. Resfriar e adicionar
7,5 ml de gua, homogeneizar e ler a absorbncia a 540 nm.

TUBOS

TEMPO

1
2
3
4
5
6
7

0
1
2
3
5
8
10

A540nm

Umoles
glic.formados

18

OBS.: No tubo 1, acrescentar primeiro o reagente de 3,5 DNS e

depois a soluo de sacarose 0,02 M
Traar o grfico que relaciona umoles de acares redutores formado
e o tempo. Calcular a velocidade inicial, ou seja umoles de produto
formado/min.
1.5.

Influncia da concentrao da enzima

Pipetar alquotas de soluo diluda de invertase em 5 tubos de ensaio
(vide tabela). Completar o volume a 1 ml com tampo acetato 0,05 M a ph
4,7. Escolher uma diluio de invertase que d Absorbncia prxima de 0,2
540 nm.
Acrescentar 0,5 ml de soluo de sacarose 0,2 M a cada tubo e incubar
temperatura ambiente por 5 minutos.
Interromper a reao pela adio de 1 ml do reagente 3,5 DNS e
proceder como descrito anteriormente.
TUBOS

SOL. ENZIMA
(ml)

TAMPO
ACETATO (ml)

A540

uMOLES
GLICDIOS
FORMADOS

1
0,0
1,0
2
0,1
0,9
3
0,2
0,8
4
0,4
0,6
5
0,6
0,4
Construir um grfico de volume de enzima contra umoles de glicdios
redutores formados.
1.6

Influncia da concentrao do substrato

Sero usadas solues de sacarose nas concentraes da 0,01M, 0,02M,

0,03M, 0,04M, 0,05M a pH 4,7 a cada tubo.
Acrescentar 0,2 ml de soluo de invertase diluda.
ATENO: marcar o tempo a partir da adio da enzima no primeiro
tubo. Agitar bem e incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. Parar a
reao pela adio de 1 ml do reagente 3,5 DNS. Agitar bem os tubos e
colocar em banho de gua fervente por 5 minutos. Resfriar e completar o
volume a 10 ml em gua destilada. Homogeneizar e ler a absorbncia a 540
nm.
TUBO

CONCENTRAO
DE SACAROSE
(M)

ABS 540 nm

uMOLES DE
GLICDIOS
REDUTORES/
MIN
19

1
2
3
4
5
6
7
8

0,00
0,01
0,02
0,03
0,05
0,10
0,20
0,30

OBS.: No tubo 1, acrescentar 0,5 ml de gua ao invs de substrato.

Calcular a quantidade de glicdios redutores/ min (v) para cada
concentrao do substrato. Traar um grfico de concentrao do substrato
(S) contra a velocidade (V).
A reao segue a equao de Michaelis-Menten?
Colocar os dados de 1/S x 1/V em grfico e determinar Km e Vmax pelo
mtodo de Lineweaver-Burk.

1.7

Preparo de solues

-Reagentes do cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS): 1,0 g de DNS, 40ml de NaOH

1N e 30 ml de gua. Dissolver a quente e completar o volume a 100ml.
-Soluo de sacarose com diferentes concentraes: preparar 50 ml da
soluo mais concentrada (0,3M) e diluir para obter as demais (0,01M,
0,02M, 0,03M, 0,05M, 0,10M, 0,20M). Conservar em geladeira.

20

Prtica 4 CARBOIDRATOS

21

22

23

Prtica 5 LIPDEOS

24

25

Prtica 6 METABOLISMO - VIA GLICOLTICA

1. VIA GLICOLTICA
1.1.

Inibidores da via glicoltica

MATERIAIS:
100 ml de soluo tampo fosfato de potssio 0,1M pH 5,7
30g de leveduras prensadas
25 ml de glicose 0,25M
5 ml de bissulfito de sdio 0,25M
5 ml de fluoreto de potssio 0,5M
5 ml de iodetoacetato 0,1M
1 almofariz com pistilo
1 cilindro graduado de 100 ml
5 pipetas de 5 ml
4 tubos de ensaio grandes acompanhados de 4 tubos pequenos de dimetro
menor para o teste de Durham
1 banho a 30C

PROCEDIMENTO:
Preparar os seguintes tubos
TUBOS

GLICOSE
(ml)

H2O

1
2
3
4

4
4
4
4

NaHSO3

KF
(ml)

IODOACETATO

4
4
4

Suspender 15g de levedura em 50 ml de tampo fosfato no almofariz. Adicionar

em cada tubo 4 ml de suspenso de levedura. Introduzir em cada tubo de ensaio
grande, um tubo de ensaio pequeno e de dimetro menor invertido (teste de
Durham). Completar o pequeno tubo de ensaio com a soluo e observar com o
tempo (at uma hora) o que acontece.
Explicar o resultado em cada caso.
2.1. INTERMEDIRIOS DA VIA GLICOLTICA
26

MATERIAIS:
52 ml de hidrognio fosfato de potssio 0,5M
52 ml de dihidrognio fosfato de potssio 0,5M
25 ml de glicose 10%
2 ml de nitroprussiato de sdio 5% recm preparado
5 ml de amnia concentrada
5 g de sulfato de amnia slido
2 ml de NaOH 10% (p/v)
2 ml de soluo saturada de 2,4 dinitrofenilhidrazina
HCl (ver item preparo de solues)
Banho a 37C
Suspenso de leveduras (5g/50 ml de K2HPO4 recm preparada)
Suspenso de leveduras (5g/50 ml de KH2PO4 recm preparada)
10 ml de soluo de cido tricloroactico (100 g/L)

2.1.1. Ensaio para a formao de piruvato a partir da glicose

PROCEDIMENTO:
Pipetar 5 ml de soluo de glicose 10 % em 2 tubos A e B, e adicionar 5 ml da suspenso
de leveduras em soluo de K2HPO4 ao tubo A e 5 ml da suspenso KH2PO4 no tubo B.
Colocar os tubos num banho a 37C por 1 hora. Aps este tempo adicionar 2 ml de cido
tricloroactico em cada tubo, homogeneizar bem, e centrifugar por 10 minutos numa
centrfuga clnica. (Passar os sobrenadantes para 2 tubos novos A e B).
Ensaio com nitroprussiato: adicionar 2 ml de cada sobrenadante fervido em 2
tubos de ensaio que j contenham aproximadamente 1 cm de sulfato de amnio
slido. Adicionar 2 gotas de soluo recm preparada de nitroprussiato de sdio
(50 g/L), agitar vigorosamente, e adicionar cuidadosamente pelas paredes do tubo
amnia (1ml) concentrada para formar 2 camadas. Observar a colorao formada
na superfcie de separao das camadas (deixar em repouso).

Ensaio com 2,4 dinitrofenilhidrazina: adicionar 1 ml de soluo saturada de 2,4

dinitrofenilhidrazina em 2 ml de cada sobrenadanteem 2 tubos A e B e agitar
vigorasamente. Colocar 2 ou 3 gotas de cada mistura em tubos de ensaio A e B e
adicionar 1 ml de hidrxido de sdio 10%, e diluir com aproximadamente 5ml de
gua.
Explicar os resultados.
27

PREPARO DE SOLUO:

2,4 dinitrofenilhidrazina HCl: dissolver pequenas

dinitrofenilhidrazina em 20 ml de HCl 2N at saturao.

pores

de

2,4

28

Prtica 7 METABOLISMO FERMENTAO

Materiais/Equipamentos

Quantidade
Total

Opes

pHmetro (calibrado)

Basto de vidro

Barra magntica

pequena

Tubo de silicone

0,5-1,5 cm de
dimetro e 15-25
cm comprimento

Rolha para frasco Erlenmeyer de

125 mL

com entrada para o

tubo de silicone

Proveta

25 mL ou 50 mL

Proveta

10 mL

Frasco Erlenmeyer

125 ml

Bequer

100 ml

Agitador
magntico
aquecimento

com

Reagente
(evitar frmula)

C.L.

Quantidad Concentra
e
o

C.L.

(g ou mL)
S. cerevisiae

0,05 g

Glicose

1,5 g

Extrato de levedura

0,5 g

Peptona

0,5 g

100 mL

gua destilada

PREPARO DO MEIO DE CULTIVO

A glicose, extrato de levedura e peptona devero ser colocados em
Erlenmeyer de 125mL ento adiciona-se 50 mL de gua destilada. O meio deve
ser ento autoclavado 110 C (0,5 atm) por 15 min. Resfriado a temperatura

29

ambiente, se necessrio ajustar o pH para 5,00,2(faixa de 4,8 a 5,2) com

amnia ou cido sulfrico.

Prtica 8 ISOLAMENTO DE DNA

30

31

32

FONTES BIBLIOGRFICAS

APOSTILA UFF

LIVRO DE BIOQ

33