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DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO BIOTECNOLGICO

PARA A PRODUO DE CIDO SUCCNICO POR Actinobacillus


succinogenes

ELCIO RIBEIRO BORGES

Tese de Doutorado, apresentada ao Programa


de

Ps-graduao

Processos

Qumicos

em
e

Tecnologia
Bioqumicos

de
para

Obteno do Grau de Doutor em Cincias


(DSc)

ORIENTADOR:
Prof. Nei Pereira Jr, PhD

Universidade Federal do Rio de Janeiro


Escola de Qumica
2011

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DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO PARA PRODUO DE CIDO


SUCCNICO POR Actinobacillus Succinogenes

E LCIO R IBEIRO B ORGES

Tese de Doutorado apresentada ao Curso de Ps-Graduao em Tecnologia


de Processos Qumicos e Bioqumicos para a Obteno do Grau de Doutor
em Cincias (DSc)

Universidade Federal do Rio de Janeiro


Escola de Qumica
2011

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Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ

Elcio Ribeiro Borges, 2011

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DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA PRODUO DE


CIDO SUCCNICO POR Actinobacillus Succinogenes
Elcio Ribeiro Borges
Tese submetida ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos
Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como parte dos requisitos necessrios obteno do grau de Doutor em
Cincias, sob orientao do Prof. Nei Pereira Jr.
Banca examinadora:

Prof. Nei Pereira Junior, PhD (EQ/UFRJ)


(Orientador-Presidente)

Profa. Gisella Maria Zanin, DSc (DEQ/UEM)

Prof. Paulo Luiz de Andrade Coutinho, DSc (BRASKEN)

Profa. Ins Conceio Roberto, DSc (EEL/USP)

Prof. Donato Alexandre Gomes, DSc (EQ/UFRJ)

Profa. Ldia Maria Melo Santa Anna, DSc (PETROBRAS)

EQ/UFRJ 2011

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Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ

Elcio Ribeiro Borges, 2011

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F ICHA

C ATALO GRFICA

Borges, Elcio Ribeiro.

DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA


PRODUO DE CIDO SUCCNICO POR Actinobacillus Succinogenes /
Elcio Ribeiro Borges Rio de Janeiro, 2011.

Tese (Doutorado em Cincias) Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ, Escola de Qumica, Programa de Ps-Graduao em Tecnologia de
Processos Qumicos e Bioqumicos, 2011.
Orientador: Nei Pereira Jr., PhD.
1.
2.
3.
4.

cido succnico
Fermentao
Bagao de cana-de-aucar
Gs carbnico

I. Pereira Jr., Nei (Orient.)


II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Escola de Qumica. PsGraduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos.
III. Ttulo.

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Elcio Ribeiro Borges, 2011

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memria de minha me, Lucia Helena Ribeiro Borges,


memria do meu irmo, Erick Anderson Ribeiro Borges,
Famlia e entes queridos,
Saudosamente,
Dedico
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"A cada dia que vivo, mais me conveno de que o desperdcio da vida
est no amor que no damos, nas foras que no usamos, na prudncia
egosta que nada arrisca."
Carlos Drummond de Andrade

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AGRADECIMENTOS
 Ao meu querido orientador, Professor Nei Pereira Jr, pelo presente concedido atravs da
possibilidade de fazer parte de uma jornada de conhecimentos e vivenciar experincias,
bastante sustentadoras, no mbito profissional e pessoal. Saber enxergar, sem ressalvas, a
potencialidade de cada aluno e acrescent-los em sua rotina de trabalho, de forma
enriquecedora, um privilgio daqueles que possuem uma racionalidade intuitiva, contribuindo
imensamente para elevar o potencial de nossa Universidade. Diante de tanto talento e
contribuio, palavras a mais se tornam mera redundncia. No obstante, qualquer tentativa de
registrar minha gratido, em algumas linhas, no suficiente para estimar a imensido de
minha admirao, respeito e inspirao. Porm, cada pgina traz consigo a presena sensvel
de uma felicidade invisvel, silenciosa, sempre motivada e direcionada por uma orientao de
notvel qualidade, excelncia e singularidade;
 Ao Departamento de Engenharia Bioqumica e seus funcionrios, especialmente ao tcnico Luiz
Cludio, pelo fundamental apoio no ambiente de trabalho e pela indispensvel atuao
administrativa. Alm do convvio, amizade e confiana conquistados ao longo dos ltimos anos,
de forma incisiva e verdadeira;
 minha famlia, pela gratificante oportunidade de solidificar diversos valores pessoais de
carter, envolvendo acertos e erros no educantrio terrestre, contribuindo para o meu
crescimento e amadurecimento;
 minha querida e saudosa me, Lucia Helena Ribeiro Borges, pela constncia de seus
ensinamentos repletos de amor, carinho e incentivos. Mesmo ausente, fisicamente neste plano,
conforta e emana a vibrao que alimenta a minha f e esperana, ajudando a superar de forma
obstinada toda e qualquer provao;
 Aos companheiros de trabalho, Patrcia, Flvia, Vernica, Eleandro, Liliana, Mariana, Ludmylla,
Fabio, Diogo, Carolina, Paulo, Vanessa, Roberto, Gabriel, Jorge, Graziela e a todos aqueles
que fizeram parte de gratas recordaes;
 Danielle Silveira dos Santos, particularmente, pela presena inevitavelmente sustentadora em
todos os momentos aparentemente difceis, contribuindo efetivamente para formulao e
definio do real significado das palavras amizade e confiana;
 Ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos da
Escola de Qumica da UFRJ, pela agradvel recepo e convivncia diria;
 Ao CNPq, FAPERJ e PETROBRAS pelo apoio financeiro.

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RESUMO
BORGES, Elcio Ribeiro. Desenvolvimento de um processo para produo de cido
succnico por Actinobacillus succinogenes. Orientador: Nei Pereira Jr. Escola de Qumica Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2011.

Atualmente, a maioria do cido succnico produzido comercialmente feito por sntese


qumica. Entretanto, recentemente a ateno tem sido focalizada na produo microbiana de
cido succnico por microrganismos como uma alternativa para a sntese qumica. Neste
trabalho objetivou-se definir uma estratgia de produo de cido succnico, por Actinobacillus
succinogenes CIP 106512, em fermentaes com hidrolisado hemicelullsico de bagao de
cana-de-acar. Inicialmente, trs estratgias de planejamentos experimentais sequenciais
foram adotadas para a otimizao do processo. Adicionalmente, o processo de Sacarificao e
Fermentao Simultneas (SSF), tambm foi realizado. Em uma primeira etapa, foi
desenvolvido um Planejamento Fatorial Fracionado PFF 241, seguido de um Delineamento
Composto Central Rotacional (DCCR), para se estimar o efeito de cada varivel. As melhores
concentraes de nutrientes para formulao do meio de cultivo, segundo o resultado predito
pelo modelo foram: NaHCO3, 10,0 g/L; MgSO4, 3,0 g/L; Extrato de levedura, 2,0 g/L e KH2PO4,
5,0 g/L. Posteriormente, um Planejamento Fatorial Fracionado PFF 2

5-1

foi delineado para a

avaliao das seguintes condies: concentrao de substrato, extrato de levedura,


temperatura, agitao e pH. A validao das condies timas, em biorreator instrumentado,
para produo de cido succnico a partir da frao hemicelulsica do bagao de cana-deacar, resultou em uma concentrao final de produto igual a 40,3 g/L, com 80,0 g/L de
concentrao inicial de xilose, sob agitao de 150 rpm a 37C. Finalmente, um modelo
cintico simples para a produo de cido succnico a partir de glicose, incluindo os termos de
inibio pelo substrato e pelo produto, foi proposto baseando-se em modelos encontrados na
literatura. O perfil de crescimento celular da bactria A. succinogenes pode ser expresso por
um modelo de Monod expandido, incorporando a inibio causada pela concentrao de
glicose e pelos cidos orgnicos (metablitos secundrios) acumulados durante a fermentao.
Com outros modelos elaborados, como o de Andrews, Levenspiel e Luedeking-Piret foi obter
condies para descrever a formao do produto e o perfil de subprodutos. Em todos os casos,
as simulaes do modelo mostraram-se satisfatrias e de acordo com os dados experimentais,
sendo possvel facilitar a compreenso do aspecto cintico da fermentao durante a
converso em cido succnico. O modelo proposto pode ser til para o desenvolvimento e o
aperfeioamento dos processos para a produo de cido succnico a partir de fontes
renovveis.

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ABSTRACT
BORGES, Elcio Ribeiro. Development of a process for succinic acid production by
Actinobacillus succinogenes. Supervisor: Nei Pereira Jr. High School of Federal
University of Rio de Janeiro Brazil , 2011.

Nowadays the majority of succinic acid produced commercially is made by chemical


synthesis. However, attention has been focused on microbial succinic acid production as an
alternative to chemical synthesis. This work aims at defining a strategy for succinic acid
production by Actinobacillus succinogenes from the hemicellulose hydrolysate of sugarcane
bagasse. Additionally, the Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) has been
processed. In a first approach, three sequencial experimental designs were performed for
optimizing the succinic acid production. The first experiment consisted of a 241 fractional
factorial design, and the second entailed a Central Composite Rotational Design so as to
achieve optimal conditions. The optimal concentrations of nutrients predicted by the model
were: NaHCO3, 10,0 g/L; MgSO4, 3,0 g/L; yeast extract, 2,0 g/L; KH2PO4. 5,0 g/L; wich
these were experimentally validated. In the third experiment, the fermentation was carried
out using a two-level fractional factorial design 25-1. The variables analyzed and their levels
were: concentration of substrate; yeast extract, temperature, pH and agitation. Under the
best conversion conditions, as determined by statistical analysis, the production of succinic
acid was carried out bachwise in an instrumented bioreactor using sugarcane bagasse
hemicellulose hydrolysate, yielding a concentration of 40,3 g/L, with 80,0 g/L of initial
concentration, at temperature 37C and orbital agitation at 150rpm. Finally, the kinetic
model was performed for succinic acid production by Actinobacillus succinogenes, based
on models told in the researches, that use conditions for

substrate

and

product

inhibitions. The growth of Actinobacillus succinogenes strain could be showed by a modified


Monod model incorporating inhibitions effects of substrate and products in the fermentation.
In agreement with the literature, several models were able to describe the formation of
organic acids presents during fermentation process. In all analyse, the kinetic model
simulation showed a great adjustment with the experimental observations. The proposed
model can be useful for the development and optimization of succinic acid production
process, contributing to the subsequent studies.

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SMARIO
AGRADECIMENTOS ........................................................................................................ VII
RESUMO ......................................................................................................................... VIII
ABSTRACT........................................................................................................................ IX
SMARIO ........................................................................................................................... X
CAPTULO 1 .......................................................................................................................1
APRESENTAO DO TEMA DA TESE..............................................................................1
CAPTULO 2 .......................................................................................................................6
REVISO BIBLIOGRFICA ................................................................................................6
2.1. cidos orgnicos......................................................................................................7
2.1.1. Aspectos histricos ...........................................................................................8
2.1.2. Comercializao................................................................................................8
2.1.3. cidos orgnicos como blocos de construo.................................................12
2.2. cido succnico ......................................................................................................15
2.2.1. Aplicaes do cido succnico.........................................................................16
2.2.2. Biopolmeros, bioplsticos e plsticos biodegradveis ....................................20
2.2.2.1. O Potencial das inovaes de base biotecnolgica em biopolmeros...........23
2.3. Aspectos mercadolgicos da produo mundial de cido succnico ......................24
2.4. Processos de produo de cido succnico ...........................................................26
2.4.1. Rota qumica ...................................................................................................26
2.4.2. Rota fermentativa ...........................................................................................27
2.4.2.1. Matrias-primas utilizadas na produo de cido succnico .........................28
2.4.3. Materiais lignocelulsicos................................................................................30
2.4.3.1. Celulose .......................................................................................................32
2.4.3.2. A Lignina ......................................................................................................33
2.4.3.3. A Frao Hemicelulsica..............................................................................33
2.4.4. Materiais lignocelulsicos e o contexto de biorrefinaria...................................34
2.4.5. Bagao de cana-de-acar .............................................................................35
2.4.6. Tipos de Pr-Tratamento.................................................................................36
2.4.6.1. Pr-tratamento cido ....................................................................................38
2.4.6.1.1. Inibidores do processo de fermentao.....................................................39
2.4.6.1.2. Processos de Destoxificao.....................................................................40
2.4.6.1.3. Pr-tratamento alcalino .............................................................................41
2.4.6.1.4. Hidrlise enzimtica da celulose ...............................................................41
2.4.7. Sacarificao e fermentao simultneas (SSF) .............................................44
2.4.8. Sacarificao com co-fermentao simultneas (SSCF).................................45
2.4.9. Microrganismos produtores de cido succnico ..............................................46
2.4.9.1. Metabolismo na produo de cido succnico ..............................................49
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2.5. Processos de recuperao e purificao de cidos orgnicos ...............................52


2.5.1. Processos de separao e recuperao de cido succnico ...........................53
2.6. Modelagem e Simulao de Processos .................................................................56
2.6.1. Modelagem de Processos Biotecnolgicos .....................................................57
2.6.2. Modelos cinticos de crescimento microbiano ................................................61
2.6.3. Mtodos matemticos utilizados para a resoluo dos modelos ....................65
2.6.3.1. Mtodo dos resduos ponderados ...............................................................65
2.6.3.2. Mtodo de Colocao Ortogonal .................................................................65
2.6.3.3. Mtodo das Linhas .......................................................................................65
2.6.3.4. Mtodo de Runge-Kutta ...............................................................................65
2.6.3.5. Planejamento Experimental..........................................................................66
2.7. Estratgias de fermentao para a produo de cido succnico ..........................67
2.8. Consideraes gerais.............................................................................................72
CAPTULO 3 .....................................................................................................................74
JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS......................................................................................74
3.1. Justificativa.............................................................................................................74
3.2. Objetivo geral .........................................................................................................75
3.2.1. Objetivos especficos.......................................................................................76
CAPTULO 4 .....................................................................................................................77
MATERIAIS E MTODOS.................................................................................................77
4.1. Esterilizao das vidrarias e do meio de cultivo .....................................................78
4.2. Material microbiolgico...........................................................................................78
4.2.1. Microrganismo utilizado...................................................................................78
4.2.2. Manuteno do microrganismo .......................................................................78
4.2.3. Observao microscpica ...............................................................................79
4.3. Meios empregados para ativao, propagao e fermentao ..............................79
4.3.1. Meio de ativao para obteno do pr-inculo .............................................79
4.3.2. Inculo.............................................................................................................80
4.3.3. Meios de Fermentao....................................................................................82
4.3.4. Processo de propagao mediante aclimatao celular..................................83
4.4. Processos de fermentao em frascos agitados ....................................................84
4.4.1. Fermentao em presena de CO2 na fase gasosa ........................................86
4.5. Avaliao da influncia da relao C:N no crescimento celular .............................87
4.5.1 Anlise estatstica ............................................................................................88
4.6. Planejamentos experimentais sequenciais para a otimizao................................88
4.6.1 Avaliao da influncia dos componentes do meio de fermentao (PFF) ......88
4.6.2. Delineamento Composto Central Rotacional...................................................89
4.6.3. Otimizao das condies de cultivo do processo atravs de PFF .................90

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4.6.4. Anlise estatstica ...........................................................................................90


4.7. Fermentao em biorreator instrumentado a partir de meio sinttico....................91
4.8. Fermentao em biorreator a partir da frao hemicelulsica................................92
4.8.1. Pr-tratamento cido .......................................................................................92
4.8.2. Fermentao em biorreator instrumentado......................................................92
4.9. Experimentos empregando a estratgia SSF ........................................................93
4.9.1. Pr-tratamento alcalino ...................................................................................93
4.9.2. Pr-hidrlise enzimtica ..................................................................................94
4.9.3. Processo SSF em biorreator ...........................................................................95
4.10. Desenvolvimento de um modelo para produo de cido succnico ....................95
4.10.1. Avaliao e estimao dos parmetros cinticos ..........................................96
4.10.2. Modelo para estimao dos parmetros........................................................98
4.11. Amostragem.........................................................................................................98
4.12. Mtodos Analticos ...............................................................................................99
4.12.1. Determinao de biomassa...........................................................................99
4.12.2. Determinaes quantitativas ....................................................................... 100
4.12.3. Medida do pH .............................................................................................. 101
4.13. Avaliao de resultados ..................................................................................... 101
4.13.1. Clculo de eficincia do processo ............................................................... 101
4.13.2. Taxa instantnea especfica de crescimento microbiano ............................ 101
4.13.3. Tempo de duplicao .................................................................................. 102
4.13.4. Variveis de Resposta................................................................................ 103
CAPTULO 5 ...................................................................................................................... 104
RESULTADOS E DISCUSSO .............................................................................................. 104
5.1. Levantamento de informaes e panorama geral das pesquisas sobre AS ......... 105
5.2. Morfologia da linhagem Actinobacillus succinogenes........................................... 107
5.3. Padronizao da metodologia para ativao celular e preparo de inculo ........... 108
5.3.1. Cultivo de ativao em meio sinttico ........................................................... 108
5.3.2. Cultivo de crescimento para obteno de inculo ......................................... 109
5.4. Processo de fermentao mediante estratgias de aclimatao celular .............. 112
5.5. Avaliao do efeito da fonte de carbono e influncia da relao C:N .................. 115
5.6. Planejamentos experimentais seqenciais para otimizao do processo ............ 119
5.6.1. Planejamento Experimental Fatorial Fracionado PFF 24-1 ............................. 119
5.6.2. Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) ................................... 125
5.7. Planejamento Experimental Fatorial Fracionado PFF25-1 ..................................... 134
5.8. Ensaios experimentais em biorreator ................................................................... 142
5.8.1. Formao de Subprodutos ............................................................................ 158
5.9. Avaliao da produo de cido succnico pelo processo SSF ........................... 160

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5.10. Evoluo dos experimentos desenvolvidos na produo de cido succnico ..... 166
5.11. Comparao entre os processos a partir do hidrolisado hemicelulsico e SSF . 168
5.12. Desenvolvimento de um modelo para produo de cido succnico .................. 170
5.12.1. Classificao do perfil para o crescimento celular ....................................... 170
5.12.2. Classificao para o perfil de formao de produto e subprodutos ............. 175
5.12.3. Classificao do perfil de consumo de substrato......................................... 175
5.13. Consideraes finais .......................................................................................... 176
CAPTULO 6 ...................................................................................................................... 178
CONCLUSES ................................................................................................................... 178
6.1. Concluses .......................................................................................................... 178
6.2. Sugestes ............................................................................................................ 181
CAPTULO 7 ...................................................................................................................... 182
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ......................................................................................... 182

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LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1. Estrutura qumica do cido succnico............................................................................... 16


Figura 2.2. Produtos obtidos a partir do cido succnico ................................................................... 19
Figura 2.3. Polisteres alifticos e aromticos. .................................................................................. 21
Figura 2.4. Estruturas possveis para os copolmeros PET-co-PES.................................................. 23
Figura 2.6. Principais matrias-primas glicdicas e seus substratos correspondentes...................... 30
Figura 2.7. Polmeros constituintes do material lignoceulsico.......................................................... 30
Figura 2.8. Disposio das molculas de glicose......................................................................... 32
Figura 2.9. lcoois precursores da lignina ......................................................................................... 33
Figura 2.11. Esquema simplificado das rotas tecnolgicas (Biorrefinarias)....................................... 35
Figura 2.12. Enzimas envolvidas na hidrlise da celulose. ................................................................ 42
Figura 2.13. Diagrama de blocos do processo SSF........................................................................... 44
Figura 2.14. Diagrama de blocos do processo SSCF. ....................................................................... 45
Figura 2.15. Via bioqumica para sntese de succinato, por E. coli.................................................... 50
Figura 2.16. Metabolismo de A. succiniciproducens e A. succinogenes............................................ 51
Figura 2.17. Transporte de diferentes espcies atravs de uma membrana..................................... 53
Figura 2.18. Processo de separao e purificao de cido succnico ............................................. 54
Figura 2.19. Esquema de funcionamento de membranas bipolares de eletrodilise .......................... 55
Figura 2.20. Diagrama de blocos da produo de cidos orgnicos por fermentao...................... 55
Figura 2.21. Resumo de alguns parmetros, fenmenos e interaes dos estudos cinticos .......... 58
Figura 2.22. Classificao dos modelos matemticos ....................................................................... 59
Figura 2.23. Padres cinticos de crescimento celular e formao de produtos............................... 64
Figura 4.1. Esquema representativo das estratgias para a padronizao do inculo ..................... 81
Figura 4.2. Metodologia para propagao celular.. ............................................................................ 83
Figura 4.3. Esquema ilustrativo geral para crescimento celular e produo de cido succnico....... 85
Figura 4.4. Esquema ilustrativo do sistema de adio de CO2 .......................................................... 86
Figura 4.5. Biorreator BIOFLO III (New .Brunswick) utilizado na produo de cido succnico ........ 91
Figura 4.6. Etapas do pr-tratamento cido do bagao de cana-de-acar ...................................... 92
Figura 4.7. Etapas do pr-tratamento alcalino ................................................................................... 93
Figura 4.8. Aspecto da celulignina aps a pr-hidrlise enzimtica, em frascos agitados ............... 94
Figura 4.9. Celulignina aps a pr-hidrlise enzimtica, em biorreator ............................................ 94
Figura 4.10. Diagrama de blocos para o tratamento das amostras. .................................................. 99
Figura 4.11. Cromatograma tpico com identificao dos cidos orgnicos .................................... 101
Figura 5.1. Nmero de patentes e trabalhos publicados, at 2010..........................................

105

Figura 5.2. Peridicos com maior nmero de publicaes e os temas mais estudados, at 2010 . 106
Figura 5.3. Observao microscpica das linhagens Actinobacillus succinogenes ....................... 107
Figura 5.4. Cintica de crescimento do cultivo de ativao da bactria A. succinogenes .............. 109
Figura 5.5. Cintica de crescimento do inculo em meio sinttico (xilose)...................................... 110
Figura 5.6. Cintica de crescimento do inculo em meio sinttico (glicose).................................... 110

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Figura 5.7. Cintica de crescimento do inculo contendo hidrolisado hemicelulsico diludo......... 111
Figura 5.8. Cintica de fermentao de em meio sinttico .............................................................. 112
Figura 5.9. Perfil de crescimento celular a partir das estratgias de propagao celular................ 113
Figura 5.10. Efeitos de diferentes fontes de carbono na produo de biomassa ........................... 115
Figura 5.11. Produo de biomassa em meio, com xilose, em diferentes razes C:N.................... 116
Figura 5.12. Produo de biomassa em meio, com glicose, em diferentes razes C:N.................. 116
Figura 5.13. Efeitos de diferentes fontes de carbono na concentrao de AS ................................ 118
Figura 5.14. Efeitos de diferentes fontes de carbono na concentrao de AS (histograma)........... 118
Figura 5.15. Histograma de influncia das variveis e suas interaes, do PFF 24-1 ..................... 123
Figura 5.16. Diagrama de Pareto para o efeito estimado das variveis ......................................... 124
Figura 5.17. Superfcie de resposta mostrando o efeito da interao entre as variveis. ............... 125
Figura 5.18. Histograma de influncia das variveis e suas interaes, para o DCCR................... 131
Figura.5.19.Superfcie de resposta dos efeitos combinados (DCCR) para xilose ........................... 132
Figura.5.20.Superfcie de resposta dos efeitos combinados (DCCR) para glicose.. ....................... 133
Figura 5.21. Diagrama de Pareto para os efeitos estimados pelo PFF 2 5-1 (24h) .......................... 139
Figura 5.22. Diagrama de Pareto para os efeitos estimados pelo PFF 2 5-1 (48h) .......................... 140
Figura 5.23. Superfcie de resposta da concentrao de cido succnico a partir de glicose ......... 141
Figura 5.24. Superfcie de resposta da concentrao de cido succnico a partir de xilose ........... 141
Figura 5.25. Fermentao em meio sinttico, com 22,0 g.L-1 de xilose ........................................... 143
Figura 5.26. Fermentao em meio sinttico de composio definida aps otimizao. ................ 145
Figura 5.27. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com 22,0 g.L-1 de xilose........................ 146
Figura 5.28. Fermentao em meio sinttico, com 52,0 g.L-1 de xilose ........................................... 148
Figura 5.29. Fermentao em meio sinttico de composio definida aps otimizao ................. 149
Figura 5.30. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com 52,0 g.L-1 de xilose........................ 151
Figura 5.31. Fermentao em meio sinttico, com 80,0 g.L-1 de xilose ........................................... 152
Figura 5.32. Fermentao em meio sinttico de composio definida aps otimizao ................. 154
Figura 5.33. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com 80,0 g.L-1 de xilose ........................ 155
Figura 5.34. Concentrao final de produto e subprodutos do processo SSF ................................ 161
Figura 5.35. Perfil cintico do processo SSF, em frascos agitados. ................................................ 162
Figura 5.36. Perfil cintico do processo de fermentao, em biorreator.......................................... 163
Figura 5.37. Perfil cintico do processo SSF com concentrao de glicose igual a 81,0 g.L-1 ........ 164
Figura 5.38. Evoluo da produo de cido succnico com o decorrer do trabalho ...................... 168
Figura 5.39. Avaliao dos efeitos da concentrao inicial de glicose sob a tx de cresc ................ 172
Figura 5.40. Perfil cintico de formao de cido succnico, crescimento celular e consumo de
substrato (glicose). ........................................................................................................................... 173
Figura 5.41. Perfil cintico da formao dos cidos actico, frmico e ltico .................................. 174

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LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1. Pontos de ebulio, frmulas moleculares e constantes (Ka) . ..............................................7
Tabela 2.2. Ano de descoberta e/ou isolamento de alguns cidos orgnicos ..........................................8
Tabela 2.3. Blocos primrios produzidos por rota fermentativa ou qumica ............................................13
Tabela 2.4. Candidatos em potencial como blocos de construo ..........................................................13
Tabela 2.5. Valores de produtividade e rendimento de alguns cidos orgnicos ...................................14
Tabela 2.6 . Caractersticas do cido succnico .......................................................................................16
Tabela 2.7. Composio de resduos agro-industriais .............................................................................31
Tabela 2.8. Constituintes bsicos de alguns materiais lignocelulsicos ..................................................31
Tabela 2.9. Parmetros para aplicao de processos de separao ......................................................53
Tabela 2.10. Tipos de modelos usados em processos microbianos........................................................59
Tabela 2.11. Modelos cinticos no estruturados . ..................................................................................62
Tabela 2.12. Modelos para formao de produto metablico inibitrio....................................................64
Tabela 2.13. Valores encontrados e calculados para diferentes estratgias de fermentao.................68
Tabela 4.1. Meio de manuteno (TSA)...................................................................................................79
Tabela 4.2. Composio do meio utilizado para pr-inculo....................................................................79
Tabela 4 3. Composio do meio de crescimento utilizado para inculo ................................................82
Tabela 4.4. Composio do meio sinttico para fermentao .................................................................82
Tabela 4.5. Composio qumica do meio lquido com diferentes razes C:N........................................87
Tabela 4.6. Parmetros e nveis usados no PFF 24-1 ...............................................................................89
Tabela 4.7. Parmetros e nveis usados no DCCR..................................................................................90
Tabela 4.8. Variveis analisadas no PFF e nveis codificados e reais. ...................................................90
Tabela 4.9. Composio do meio de fermentao, aps estudos de otimizao ....................................91
Tabela 4.10. Condies operacionais do cromatgrafo .........................................................................100
Tabela 4.11. Condies operacionais do cromatgrafo (cidos orgnicos) ..........................................101
Tabela 5.1. Parmetros relevantes nos processos de propagao de clulas de A. succinogenes. ...111
Tabela 5. 2. Variveis de Resposta na Avaliao do Efeito da Aclimatao ........................................114
Tabela 5.3. Influncia da concentrao inicial de substrato e da razo C:N no crescimento celular. ..117
Tabela 5.4. Matriz experimental do PFF 24-1 e concentrao final de cido succnico, para xilose......119
Tabela 5.5. Matriz experimental do PFF 24-1 e concentrao final de cido succnico, para glicose....120
Tabela 5.6. Anlise de varincia (ANOVA), no PFF 241 para xilose como fonte de carbono..............122
Tabela 5.7. Anlise de varincia (ANOVA), no PFF 241 para glicose como fonte de carbono............122
Tabela 5.8. Matriz experimental do DCCR investigando os efeitos dos nutrientes do meio (xilose) ....127
Tabela 5.9. Matriz experimental do DCCR investigando os efeitos dos nutrientes do meio (glicose) ..128
Tabela 5.10. Anlise de varincia (ANOVA) para xilose como fonte de carbono.................................129
Tabela 5.11. Anlise de varincia (ANOVA) para glicose como fonte de carbono...............................130
Tabela 5.12. Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado PFF 25-1 para glicose ..............135
Tabela 5.13. Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado PFF 25-1 para xilose ................135
Tabela 5.14. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 glicose (24h)................136
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Tabela 5.15. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 xilose(24h)...................137
Tabela 5.16. Efeitos estimados do p lanejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 para glicose (48h) ......138
Tabela 5.17. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 para xilose (48h)..........138
Tabela 5.18. Variveis de resposta obtidos para meio sinttico e hidrolisado hemicelulsico..............157
Tabela 5.19. Concentrao final de produto e subprodutos dos processos de fermentao ..............159
Tabela 5.20. Variveis de resposta e concentrao de produto e subprodutos pelo processo SSF. ..165
Tabela 5.21. Resultados finais e evoluo do processo para a produo de cido succnico ............167
Tabela 5.22. Produo de cido succnico a partir dos hidrolisados hemicelulsico e celulsico .......169
Tabela 5.23. Valores obtidos dos parmetros cinticos de fermentao..............................................171

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

SIGLAS
ABS: Absorvncia;
AIE: Agncia Internacional de Energia;
ANOVA: Anlise de varincia;
ARD: Agro-industrie Recherches e Dveloppements;
AS: cido succnico;
AA: cido actico;
AS: cido frmico;
AL: cido ltico;
ATP: Adenosina trifosfato;
ATP: Adenosina trifosfato;
ATP: Adenosina trifosfato;
BHT: Butirolactona;
CBH: Celobiohidrolases;
CIP: Institut Pasteur Collection;
CM: Concentrao mxima;
CTA: Triacetato de celulose;
DCCCF: Delineamento composto Central de Faces-centradas;
DCCR: Delineamento Composto Central Rotacional;
DNP: Diversified Natural Products;
DOE: Departamento de Energias do EUA;
DSP: Processo de Separao e Purificao;
EBMP: Membranas bipolares de eletrodilise;
ED: Eletrodilise;
EDO: Equaes diferenciais ordinrias;
EDP: Equaes diferenciais parciais;
EL: Extrato de levedura;
ELL: Extrao lquido-lquido;
EMP: Embden-Meyerhof Pathway;
EVOH: Copolmero de etileno e lcool vinlico;
GL: Graus de Liberdade;
GT: Grupo de trabalho;
GT-6: Grupo de trabalho;

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CLAE: Cromatografia lquida de alta eficincia;


IBGE: Instituto brasileiro de geografia e estatstica;
IUPAC: Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada;
IV: Infravermelho;
KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes;
LADEBIO: Laboratrio de Desenvolvimento de Bioprocessos-Departamento de Engenharia
Qumica-Escola de Qumica/UFRJ;
MAPA: Ministrio de Agricultura, Pecuria e Abastecimento;
MBI: International, Myriant Technologies;
MCG: Meio de Crescimento Guetler;
MCL: Meio de Crescimento LADEBIO;
MCT: Meio de Crescimento Triptona;
MF: Microfiltrao;
MQ: Mdia Quadrtica;
NF: Nanofiltrao;
OI: Osmose Inversa;
P.E: Ponto de ebulio;
P.F: Ponto de fuso;
PA: Poliamida;
PB: Plackett-Burman;
PBS: Polibutilenosuccinato;
PBT: Polibutilenotereftalado;
PC: Pontos centrais;
PCCell: Modelo e marca de membrana de eletrodilise(Electrodialysis Cell);
PEP: Fosfoenolpiruvato;
PES:Polisuccinato de etileno;
PET: Polietileno tereftalato;
PFF: Planejamento Experimental Fatorial Fracionrio;
PFF: Planejamento Experimental Fatorial;
PFF: Planejamento Fatorial Fracionrio;
PHA: Polihidroxialcanoato;
PIM: Polymer inclusion membranes;
PROALCOOL: Programa Nacional do lcool;
PST: Polisuccinato tereftalato;
PVC: Poli (cloreto) de vinila;
PVDC: Copolmero de cloreto de vinilideno;
RSM: Superfcie de Resposta;
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SES: Succinato etileno succinato;


SQ: Soma Quadrtica;
TCA: Ciclo dos cidos tricarboxlicos;
TCA: Ciclo dos cidos tricarboxlicos;
TES: Tereftalato etileno succinato;
TET: Tereftalato etileno tereftalato;
THF: Tetrahidrofurano;
TSA: Agar Triptona de Soja 500gr M/Difco
TSA: Agar Triptona de Soja 500gr M/Difco;
TSB: Caldo de Triptona de Soja - 500gr M/Difco;
TSB: Caldo de Triptona de Soja - 500gr M/Difco;
UF: Ultrafiltrao;
UNICA: Unio de Agroindstria Canavieira de So Paulo

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NOMENCLATURA MATEMTICA

Ef: eficincia, expressa em porcentagem;


fd: fator de diluio empregado na soluo;
g: gramas;
h: hora;
Ka: constantes de dissociao cida;
Kd: taxa de mortalidade especfica (h-1);
Ki : constante de inibio do substrato (g/L);
KS: constante de saturao do substrato (g/L);
L: litro;
mg: miligrama;
MMAS: massa molecular do cido succnico;
MMGl: massa molecular da glicose;
mmol/L: milimol por litro;
ms: coeficiente de manuteno energtic (g/g.h);
P: concentrao de produto (g/L);
P: concentrao final de cido succnico, g/L;
PCRIT: concentrao crtica de produto (g/L);
pH: potencial hidrogeninico;
Po: concentrao inicial de cido succnico, g/L;
QP: produtividade volumtrica em cido succnico, g/L.h;
r X : taxa de formao de biomassa (g/L.h);
rSA : taxas de formao dos cidos succnico (g/L.h);
S: concentrao final de substrato, g/L;
So: concentrao inicial de substrato, g/L;
T: temperatura, oC;
td: tempo de duplicao, horas;
tf: tempo de fermentao, horas;
v/v: relao volume/volume;
vvm: vazo de ar por volume de meio por minuto, min-1;
X: concentrao final de biomassa, g/L;
Xo: concentrao inicial de biomassa, g/L;
YAA: fator de rendimento estequiomtrico para cido actico g/g;
YAF: fator de rendimento estequiomtrico para cido frmico g/g;
YAL: fator de rendimento estequiomtrico para cido ltico g/g;
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YP/S: fator de rendimento em produto por substrato consumido, g/g;


YX/S: fator de rendimento em biomassa por substrato consumido, g/g;
Z: Discrepncias quadrticas entre os dados experimentais e simulados

Letras gregas
-1
max: taxa especfica mxima de crescimento (h );

:: taxa de crescimento especfico (h-1);


AA: parmetro de formao de cido actico associado ao crescimento (g/g);
FA: parmetro de formao de cido frmico associado ao crescimento (g/g);
LA: parmetro de formao de cido ltico associado ao crescimento (g/g);
SA: parmetro de formao de cido succnico associado ao crescimento (g/g);
AA: parmetro de formao de cido actico no associado ao crescimento (g/g);
FA: parmetro de formao de cido frmico no associado ao crescimento (g/g);
LA: parmetro de formao de cido ltico no associado ao crescimento (g/g);
AS: parmetro de formao de cido succnico no associado ao crescimento (g/g)

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CAPTULO 1
APRESENTAO DO TEMA DA TESE

Uma etapa fundamental para o desenvolvimento sustentvel de uma Sociedade a


mudana da realidade dependente do petrleo para o uso abundante de recursos
renovveis. Os impactos ambientais, decorrentes da queima de combustveis fsseis,
representam uma realidade com a qual a Sociedade tem que conviver, controlar e se
adaptar, necessitando de uma tomada de conscincia da importncia da questo e
exigindo mudanas em muitos hbitos de consumo e comportamento (PEREIRA JR,
2010).
Grande parte dos especialistas sugere que, nos prximos anos, o petrleo se
tornar mais escasso e consideravelmente mais caro do que nos dias atuais. Segundo o
anurio Perspectiva de Energia Mundial (2010), as observaes descritas pela Agncia
Internacional de Energia (AIE) indicam que sem a alterao da matriz energtica, os
combustveis fsseis responderiam por 90% do aumento projetado na demanda mundial,
at 2035. O crescimento da populao associado demanda por combustveis e produtos
qumicos, tem aumentado a busca e o desenvolvimento para o uso mais diversificado de
matria-prima renovvel (EMBREE et al., 2001; WILLKE & VORLOPO, 2004).
Neste contexto, a indstria qumica do sculo XXI ser obrigada a passar por uma
completa reestruturao, recorrendo ao uso de recursos renovveis como matria-prima
bsica e Biotecnologia para realizao de muitas transformaes qumicas (BRDTAC,
2002; NRC, 2000; WILKE, 2000).
A maior parte dos esquemas relacionados a uma indstria qumica a base de
biomassa

envolve

um

pequeno

nmero

de

molculas

intermedirias

versteis,

normalmente de baixa massa molar. Cada um destes intermedirios-base d origem a uma

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famlia de substncias qumicas derivadas, obtidas por meio de converses biolgicas ou,
mais freqentemente, por reaes qumicas tradicionais, em um esquema muito similar ao
que ocorre na indstria petroqumica atual (LYND et al., 1999). Nestes termos, um exemplo
de intermedirio-base que tem sido bastante reportado na literatura o cido butanodiico,
conhecido como cido succnico (WERPY & PETERSON, 2004). Sendo passvel de
obteno por rota fermentativa, este cido tem o potencial para se tornar uma comoditie,
produzido em larga escala, podendo se constituir na base para o fornecimento de uma
srie de substncias intermedirias e produtos finais importantes na indstria qumica,
principalmente de biopolmeros a partir de succinato, alm de ser um componente chave
na produo de mais de 30 produtos comercialmete importantes, na indstria de alimentos,
farmacutica e de cosmticos (MCKINLAY et al., 2007; ZEIKUS & JAIN, 1999; SONG &
LEE, 2005).
Cabe ressaltar que o cido succnico pode substituir mais de 250 produtos qumicos
derivados do benzeno, que conhecidamente carcinognico por todas as rotas de
exposio (KERMANSHAHI et al., 2005). Somado a sua importncia como bloco de
construo para o segmento industrial, uma vantagem adicional desta substncia qumica
reside na sua produo por fermentao, a qual ocorre com consumo de CO2, fornecendo
uma alternativa interessante para o problema de seqestro do carbono (VAN DER WERF
& GUETLER, 1997).
A maioria dos cidos orgnicos existentes no mercado produzida via sntese
qumica, gerando altos nveis de poluio. A evoluo do mercado mundial dos produtos
derivados de matrias-primas agro-industriais est obrigando as empresas do Setor
Qumico a incorporar novas tecnologias para alcanar maiores ndices de qualidade e
eficincia. Na busca por produtos finais mais competitivos e rentveis, como por exemplo,
cidos orgnicos e plsticos biodegradveis, o setor industrial vem sendo compelido a
incorporar inovaes tecnolgicas, desenvolvimentos de novos sistemas produtivos e de
equipamentos para processos que protejem o meio ambiente e gerem menor quantidade
de poluentes (CORDOBA, 2001).
O Frum de Competitividade em Biotecnologia foi constitudo para definir as aes
necessrias inscrio da rea de Biotecnologia entre as vrias opes estratgicas da
Poltica Industrial, Tecnolgica e de Comrcio Exterior. O GT-6 vem avaliando o segmento
da Biotecnologia Industrial e Outras Aplicaes, que tem como referncia a classificao
de Biotecnologia Branca (White Biotechnology), como o setor que aplica recursos naturais
para a produo industrial de bioprodutos de interesse comercial. As profundas alteraes
ocorridas no setor agroindustrial com apropriao de novas tecnologias e a formao de
grandes clusters de cadeia produtiva das culturas extensivas de soja, cana-de-acar e
milho (produo de sementes ou mudas, plantio, colheita e beneficiamento) tm
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impulsionado a discusso sobre um novo modelo de indstria de transformao destas


matrias-primas renovveis em produtos qumicos intermedirios e finais, atravs de
modificaes fsicas, qumicas e biolgicas (PRADELLA, 2006).
Esse modelo pressupe integrao de processos e de fluxos de insumos,
otimizao das utilidades industriais e da logstica de transporte, alto rendimento de
converso, alta produtividade e ampla escala de produo, com a finalidade de reduzir
custos, diversificar e flexibilizar a produo, para responder s demandas de mercado,
modelo similar ao praticado pela indstria petroqumica. Por fazerem uso de matriasprimas de origem biolgica e possurem um forte componente de transformao
bioqumica, prope-se o termo Biorrefinaria para designar os processos ou os arranjos
industriais dessa natureza (PEREIRA JR, 2006).
As

Biorrefinarias pertencem

categoria

dos

agronegcios,

devendo

ser

consideradas uma extenso da cadeia produtiva agrcola e, portanto, integradas


fisicamente no processo de plantio, colheita, beneficiamento e transformao desses
plantios. Dentro desta perspectiva, vrias categorias de produtos devem ser destacadas
como candidatas potenciais para desenvolvimento do chamado comoditie de larga
utilizao (RODRIGUEZ, 2006).
Do ponto de vista do balano energtico, as Biorrefinarias podem ser extremamente
eficientes, uma vez que os resduos lignocelulsicos podem ser aproveitados para
produo de energia, que ser consumida na unidade industrial, gerando tambm crditos
de carbono, passveis de comercializao (PRADELLA et al., 2006). A cana-de-acar e
seus residuos constituem-se em fontes de carbono de baixo custo que podem minimizar os
custos de produo em relao aos seus sucedneos advindos de petrleo.
O bagao de cana-de-acar apresenta-se como um dos materiais lignocelulsicos
com maior potencial para a obteno de diversos produtos de interesse comercial. A
separao seletiva das fraes do material lignocelulsico de acordo com suas
caractersticas qumicas e/ou dos produtos a serem obtidos, representa uma das
estratgias a serem adotadas no campo da Biotecnologia.
Sendo a hemicelulose e a celulose, as principais fraes estruturais do bagao de
cana, representando uma fonte potencial de xilose e glicose, respectivamente, o presente
trabalho investiga o desenvolvimento de um processo para a produo de cido succnico,
por uma linhagem de Actinobacillus succinogenes. Porm, a obteno desses acares
requer a aplicao de tcnicas que permitam a sua extrao seletiva. No caso da extrao
de xilose, so utilizadas diferentes metodologias de solubilizao e hidrlise, dentre as
quais o pr-tratamento cido normalmente empregado (BETANCUR & PEREIRA JR,
2010).

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Este trabalho faz parte de uma das linhas de pesquisas desenvolvidas nos
Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos Escola de Qumica/ UFRJ, sob a
coordenao do Prof. Dr. Nei Pereira Jr., intitulada Valorizao de Resduos
Lignocelulsicos para o Aproveitamento Integral de Biomassas Residuais por Via
Biotecnolgica.
No que se refere produo internacional, o nmero de pesquisas vm se
destacando, de forma gradativa, ao longo dos ltimos anos, com diferentes tipos de
microrganismos. Em relao ao cenrio nacional, possvel constatar alguns trabalhos em
andamento acerca da produo de cido succnico nas universidades de grande potencial.

Organizao do trabalho
O presente trabalho encontra-se estruturado em 7 captulos e uma seo final,
intitulada Anexos, incluindo os artigos publicados em peridicos internacionais. O captulo
dois apresenta a Reviso Bibliogrfica dos aspectos relevantes ao assunto tratado,
ressaltando a importncia da produo de cido succnico e suas potenciais utilizaes,
alm de abordar aspectos cientficos, tecnolgicos e econmicos. Neste captulo, tambm
so descritos, de forma sucinta, alguns fundamentos da modelagem matemtica de
processos biotecnolgicos, incluindo mtodos matemticos freqentemente utilizados para
resoluo destes modelos, alm de tcnicas para otimizao e controle de processos.
No captulo trs, intitulado Justificativas e Objetivos, so apresentados os motivos
que levaram ao desenvolvimento desta tese, bem como os objetivos especficos
desenvolvidos.
O captulo quatro refere-se descrio dos Materiais e Mtodos utilizados para a
execuo deste trabalho, como por exemplo, detalhamento das metodologias experimental
e analtica adotadas, bem como das tcnicas de planejamento experimental para a anlise
dos resultados.
Os Resultados e Discusso relativos s principais anlises conduzidas encontramse no quinto captulo. Para a otimizao dos parmetros e condies de processo, foram
desenvolvidos planejamentos seqenciais para a realizao dos experimentos com maior
grau de confiabilidade. Foi avaliada a hierarquia de efeitos estimados sobre a varivel de
resposta do processo, bem como apresentados os estudos iniciais dos parmetros
cinticos para a modelagem do processo visando produo de cido succnico, mediante
o estudo do comportamento microbiano durante a fermentao. No captulo seis so
registradas as Concluses e Sugestes do presente trabalho.

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Por fim, as Referncias Bibliogrficas so apresentadas no stimo captulo,


atravs das quais todas as informaes contidas nesse texto podero ser localizadas e,
obtidos mais detalhes sobre seus registros.
Com o desenvolvimento da presente pesquisa, foram publicados (ANEXO) os
seguintes trabalhos:

Lista de trabalhos publicados em perdicos indexados:


1.

Borges, E.R. & Pereira Jr., N. Succinic acid production from sugarcane bagasse
hemicellulose hydrolysate by Actinobacillus succinogenes. Journal of Industrial
Microbiology & Biotechnology, v. 13, p. 1-11, 2010.

2.

Borges, E.R.; Souza, L.B.R & Pereira Jr, N. Study of succinic acid production by
Actinobacillus succinogenes. Jornal of Life Sciences, v. 4, p. 5-12, 2010.
Trabalhos completos em congressos nacionais:

1.

Borges, E.R.; Souza, L.B.R & Pereira Jr., N. Uso de biomassas para produo de
cio succnico por Actinobacillus succinogenes. IX SHEB - Seminrio de Hidrlise
Enzimtica e Biomassas, Maring-PR, 23 -27/11/2009.

2.

Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Recuperao e purificao de cido
succnico obtido por um processo biotecnolgico. XXXIV ENEMP - Congresso
Brasileiro de Sistemas Particulados, Campinas SP, 18 a 21/10/09.

3.

Borges, E.R.; Souza, L.B.R & Pereira Jr, N. Estudo das variveis de processo na
produo de cido succnico por Actinobacillus succinogenes. XVII SINAFERM
Simpsio Nacional de Bioprocessos, Natal RN.

4.

Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Produo de cido succnico por
Actinobacillus succinogenes a partir do hidrolisado da frao hemicelulsica do
bagao de cana-de-acar. XVIII SINAFERM Simpsio Nacional de
Bioprocessos, Caxias do Sul RS. 24 a 27/07/2011. Situao: Aceito
Participao em eventos

1.

Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Influncias das Variveis de
Processo na Produo de cido Succnico por Actinobacillus succinogenes. XXXI
Jornada Giulio Massarani de Iniciao Cientfica, Artstica e Cultural da UFRJ, Rio
de Janeiro.

2.

Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Influncia da Razo C:N no
Crescimento Celular e Biossntese de Metablitos Durante a Produo de cido
Orgnico. XXX Jornada Giulio Massarani de Iniciao Cientfica, Artstica e
Cultural da UFRJ, Rio de Janeiro.

3.

Borges, E.R. & Pereira Jr, N. Succinic Acid Production from Sugarcane Bagasse
by Actinobacilus succinogene. 32nd Symposium on Biotechnology for Fuels and
Chemicals. 2010. Orlando/Flrida.

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CAPTULO 2
REVISO BIBLIOGRFICA

Neste captulo so apresentados os diferentes aspectos tericos referentes


temtica abordada: cidos orgnicos de interesse industrial; o cido succnico e suas
aplicaes no mercado; microrganismos produtores e aspectos de metabolismo; o bagao
de cana como matria-prima para a produo do cido succnico; algumas caractersticas
relevantes ao processo de aproveitamento do material lignocelulsico e consideraes
importantes sobre o uso dos cidos orgnicos como intermedirios na produo de
plsticos biodegradveis e como blocos de construo para a produo de substncias
qumicas de interesse comercial.

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2.1. cidos orgnicos


Os cidos orgnicos so importantes para a indstria de transformao,
principalmente a qumica, farmacutica e de alimentos. Podem ser comercializados, tanto
como cidos (com relativo grau de pureza), ou na forma de sais deles derivados.
Ao contrrio das principais fermentaes de alimentos e de bebidas cujas origens
remontam antiguidade, os processos de produo desses cidos s comearam a ser
desenvolvidos nos ltimos cem anos. A primeira fbrica, para produo em larga escala de
uma substncia qumica por fermentao, comeou a operar em 1881 em Massachusetts
(EUA) para produo de lactato de clcio, empregando bactrias.
Com exceo do cido clordrico presente no suco gstrico, os cidos mais comuns
com os quais convivemos so orgnicos, ou seja, queles contendo tomos de carbono.
Destes, o maior grupo o dos cidos carboxlicos, que so os cidos caracterizados pela
presena do grupo funcional (COOH), a carboxila (SNYDER, 1995). As propriedades, para
alguns cidos carboxlicos, classificados como mono e dicarboxlicos, de acordo com o
nmero de carboxila presente em sua estrutura qumicas, so apresentadas na Tabela 2.1
(SOLOMONS, 1996; HARRIS, 1999).

Tabela 2.1. Pontos de ebulio, frmulas moleculares e constantes de dissociao cida

(Ka) de alguns cidos carboxlicos.


cidos monocarboxlicos
Nome do cido (IUPAC/nome usual)

Frmula molecular

P.E/C

Ka

HCOOH

100,5

1,80X10-4

CH3COOH

118

1,75x10-5

CH3CH2COOH

141

1,34 x10-5

CH3CH2CH2COOH

164

1,52 x10-5

Pentanico (valrico)

CH3(CH2)3COOH

187

1,44 x10-5

Hexanico (caprico)

CH3(CH2)4COOH

205

Octanico (caprlico)

CH3(CH2)6COOH

239

Decanico (cprico, P.F. 31)

CH3(CH2)8COOH

269

Metanico (frmico)
Etanico (actico)
Propanco (propinico)
Butanico (butrico)

cidos dicarboxlicos
Butanodiico (succnico,P.F.187C)

HOOC(CH2)2COOH

235

K = 6,2 x 10-5
K = 2,3 x 10-6

Pentanodiico (glutrico, P.F. 98 C)

HOOC(CH 2)3COOH

303

K = 4,6 x 10-5
K = 3,7 x 10-6

Hexanodiico (adpico, P.F. 153 C)

HOOC(CH 2)4COOH

340

K = 3,8 x 10-5
K = 3,8 x 10-6

Fonte: (SOLOMONS, 1996; HARRIS, 1999).

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A presena do grupo COOH confere aos cidos carboxlicos, entre outras


propriedades, a de serem cidos fracos em meio aquoso e de apresentarem elevados
pontos de ebulio devido facilidade com que formam interaes intermoleculares do tipo
ligaes de hidrognio (LINTOMEN et al., 1990).
2.1.1. Aspectos histricos
A

descoberta

dos

cidos

orgnicos

est

intimamente

relacionada

ao

desenvolvimento da qumica experimental. Neste contexto, Carl Wilhelm Scheele (17421786), um notvel qumico experimental sueco, desempenhou um papel primordial. Dentre
os 15 a 20 mil experimentos atribudos a ele, esto as descobertas de compostos
orgnicos de natureza cida (cidos carboxlicos e fenis), como os cidos tartrico (2,3
dihidroxibutanodiico), mlico (2-hidroxibutanodiico), lctico (2-hidroxipropanico), oxlico
(etanodiico), rico, glico (3,4,5-trihidroxibenzico) e ctrico (2-hidroxipropan-1,2,3tricarboxlico) (FIORUCCI et al., 2002). Scheele fez uso de reaes e tcnicas que at
ento estavam intimamente relacionadas com a Qumica Inorgnica (extraes por
solventes, formaes de sais, diferenas de solubilidade). Uma atribuio destas
descobertas e seus respectivos autores esto descritas na Tabela 2.2.
Tabela 2.2. Ano de descoberta e/ou isolamento de alguns cidos orgnicos e seus
respectivo descobridores.
cido

Data

Pesquisador

Frmico

1500

H. Brunschwigk

Benzico

1556

M. Nostredame

Succnico 1600 Oswald Croll


Tartrico 1770 C.W. Scheele
Pcrico
1771 Peter Woulfe
Oxlico
1760 J.C. Wiegleb
Oxlico
1776 C.W. Scheele
Ltico
1780 C.W. Scheele
rico
1780 C.W. Scheele
Ctrico
1784 C.W. Scheele
Mlico
1785 C.W. Scheele
Glico
1786 C.W. Scheele
Fonte: (FIORUCCI et al., 2002)

Fonte descoberta
Destilao por arraste de vapor de solues
contendo formigas
Sublimao da goma do benjoim (resina extrada
do benjoeiro)
Sublimao do mbar (resina vegetal fssil)
Do resduo de fermentao do vinho
Do tratamento do ndigo com cido ntrico
Isolado do trevo azedo (oxalis)
Oxidao do acar com cido ntrico
Fermentao do leite azedo
Dos resduos da urina
Dos sucos de frutas ctricas
Extrado do suco de ma
Das nozes da Gala

2.1.2. Comercializao

Os cidos orgnicos apresentam muitas aplicaes nas indstrias qumica,


farmacutica e alimentcia, com propriedades organolpticas importantes, tanto que o
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sabor azedo caracterstico foi o primeiro critrio para classificao destes compostos. Na
indstria alimentcia, os cidos so adicionados por diferentes propsitos, aos alimentos.
As funes mais importantes dessa adio so: conservantes devido participao em
sistemas tampo, a habilidade de produzir um sabor azedo (onde o gerador o on
hidrognio ou hidrnio - H3O+) e tambm, como acidulante, devido capacidade de
modificar e intensificar o sabor de outros condimentos.
Como conservantes, atuam como sequestrantes de ons metlicos atravs do on
carboxila, evitando a catlise de reaes de oxidao nos alimentos (GITIRANA, 2007). A
adio de acidulantes comumente destinada s bebidas gasosas, principalmente aquelas
s quais se procura dar sabor parecido ao das frutas; estas bebidas j apresentam leve
teor cido, pelo CO2 que encerram em forma de cido carbnico (H2CO3). O pequeno grau
de acidez dado pelos acidulantes faz com que estes sejam empregados como recursos de
melhoria de sabores. Entre outros produtos em que os acidulantes so empregados, podese destacar: gelias artificiais, sorvetes, balas, ps para coberturas, produtos de
confeitaria, etc. Os cidos orgnicos comumente usados na indstria de alimentos so os
cidos: actico, ltico, ctrico, mlico, fumrico, succnico e tartrico (FENNEMA, 1985). Os
cidos, frmico e actico tm cheiro intenso, irritante e paladar azedo. O cido fosfrico
(H3PO4) o nico cido inorgnico empregado extensivamente como acidulante alimentar.
Os cidos de quatro a oito tomos de carbono tm odores desagradveis, como os
cidos caprico (hexanico), caprlico (octanico) e cprico (decanico). Entretanto, em
pequenas concentraes, os cidos carboxlicos so responsveis por muitas fragrncias.
Os cidos, benzico, cinmico (3-fenil-2-propenico), mirstico (tetradecanico) e
isovalrico (3-metilbutanico) esto presentes em leos essenciais, que so leos volteis,
odorferos, de origem vegetal (SHREVE & BRINK, 1980).
Uma grande parte dos cidos orgnicos, oriundos de microrganismos, ou como
intermedirios naturais em caminhos metablicos principais podem contribuir para o
avano nas produes biotecnolgicas a partir de fontes renovveis. Por causa dos grupos
funcionais dos cidos orgnicos, estas molculas so extremamente teis para a indstria
qumica. Por exemplo, cido succinico poderia susbtituir o anidrido maleico, que possui um
mercado bastante amplo na petroqumica (WERPY & PETERSEN, 2004).
Os cidos orgnicos so amplamente usados na indstria de alimentos como
aditivos. Como agentes de processamento, so adicionados para controlar a alcalinidade
de muitos produtos podendo agir como tampes ou simplesmente como agentes
neutralizantes. Como conservantes, podem atuar desde agentes antimicrobianos at
antioxidantes. Algumas caractersticas desses cidos orgnicos so abordadas a seguir:

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cido Metanico (frmico): causa do ardor das picadas de formiga, o mais


simples dos cidos carboxlicos. Seu nome origina-se da palavra em Latim para formiga,
formica.
cido Etanico (actico): o principal ingrediente do vinagre. Seu nome deriva do
Latim acetum, que significa azedo. Conhecido e usado h tempos pela humanidade,
usado como condimento e conservante de alimentos. A oxidao aerbica, por bactrias
do gnero Acetobacter, do lcool a cido actico diludo (8%) um processo antigo, que
produz o vinagre, uma soluo de cido actico aromatizada, obtida pela fermentao do
vinho, da cidra, do malte ou do lcool diludo (SHREVE & BRINK, 1980). O cido actico
para uso industrial e em laboratrios comercializado na forma de cido actico glacial
(~99,5%), assim chamado porque em dias frios se solidifica com aspecto de gelo (P.F. 17
C). O cido actico o cido orgnico mais abunda nte, freqentemente utilizado como
matria prima para se preparar outros produtos como steres acticos. Outra importante
aplicao do cido actico como solvente para muitos processos industriais, como na
fabricao de acetato de celulose e de produtos farmacuticos (SHI et al., 2005).
Recentemente, muitos pesquisadores tm se esforado para determinar por que cidos
orgnicos, como o cido actico funcionam como inibidores de crescimento de
microrganismos patognicos e deteriorantes (JENSEN et al., 2003).
cido 2-acetoxibenzico (acetilsaliclico): conhecido como aspirina e empregado
como antipirtico e analgsico, produzido pela reao de esterificao do cido saliclico
(2-hidrxibenzico) com o anidrido actico (SHREVE e BRINK, 1980). O nome cido
saliclico deriva do Latim e designa a rvore do salgueiro, salix. Os mdicos da Grcia
Antiga conheciam as propriedades antipirticas e redutoras da febre, da casca desta
rvore. Em 1829, o qumico francs Henri Leroux isolou da casca do salgueiro, o composto
ativo na forma pura, a salicina, que uma molcula estruturalmente semelhante aspirina
(SNYDER, 1995).
cido 2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxlico (ctrico): o responsvel pela acidez
de frutas ctricas. Para emprego industrial, o cido ctrico fabricado pela fermentao
aerbica do acar bruto (sacarose) ou acar de milho (dextrose) por uma linhagens
especiais de Aspergillus niger. Seu maior emprego como acidulante em bebidas
carbonatadas e alimentos. No campo mdico, empregado na fabricao de citratos e de
sais efervescentes (SHREVE & BRINK, 1980).
cido etanodiico (oxlico): um cido dicarboxlico txico e presente em plantas,
como espinafre e azedinhas. Embora a ingesto de cido oxlico puro seja fatal, seu teor
na maioria das plantas comestveis muito baixo para apresentar um risco srio
(SNYDER, 1995). um bom removedor de manchas e ferrugem, sendo usado em vrias
preparaes comerciais de limpeza. Alm disso, a grande maioria dos clculos renais
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constituda pelo oxalato de clcio monohidratado, um sal de baixa solubilidade derivado


deste cido. Seu nome (do Latimoxalis) resulta do seu primeiro isolamento do trevo azedo
(Oxalis acetosella).
cido propanico (propinico): um cido monocarboxlico, saturado, de cadeia
aberta, que apresenta um odor pungente, aroma e sabor suave, podendo ser usado como
aromatizante (HEATH, 1978). O cido propanico o responsvel pelo cheiro
caracterstico do queijo suo (SNYDER, 1995). Durante o perodo principal de maturao
deste tipo de queijo, Propionibacterium shermanii e microrganismos similares, convertem
cido ltico e lactatos aos cidos propinico e actico e a dixido de carbono. O gs CO2
gerado responsvel pela formao dos buracos caractersticos do queijo suo. Suas
molculas se atraem por pontes de hidrognio e, solvel em gua, em qualquer
proporo. O cido propinico e seus sais so amplamente usados como matria-prima
em diferentes indstrias. Os steres do cido propinico so usados na indstria de
perfumes e propionato de celulose utilizado na indstria de plsticos (GOSWAMI &
SRIVASTAVA, 2000).
cido butanico (butrico): seu nome deriva do Latim butyrum, que significa
manteiga; fornece um odor peculiar rancidez da manteiga. usado na sntese de
aromas, em frmacos e em agentes emulsificantes (PARKER, 1997).
cido 2-hidroxipropanico (ltico): um hidrxicido carboxlico que contribui
para o sabor de manteiga, e sua estrutura altamente polar com limitada volatilidade
(FORSS & SUGISAWA, 1981). largamente distribudo na natureza, e comercialmente
disponvel, sob a forma de soluo aquosa que incolor, inodora, viscosa e no voltil.
usado na indstria de alimentos para inibir a deteriorao de azeitonas curadas e para
ajustar acidez na produo de queijos (ANTUNES & CANHOS, 1983). Pode ser produzido
por meio da fermentao bacteriana da lactose, acar do leite, por Streptococcus lactis.
Fabricado industrialmente pela fermentao controlada de hexoses de melao, milho e
leite, empregado no curtimento de couros, e na indstria alimentcia, como acidulante. O
cido ltico tambm produzido pelo corpo humano. Quando a glicose metabolizada
pela atividade muscular anaerbica, o cido ltico gerado nos msculos e, ento,
decomposto (oxidado totalmente) a CO2 e H2O (LEHNINGER et al., 1995). Com o exerccio
intenso, o cido ltico formado mais rapidamente do que pode ser eliminado. Esta
acumulao transiente do cido ltico responsvel pela sensao de cansao e de dor
muscular.
cido 2,4-hexadienico (srbico): encontrado em muitas plantas, e empregado
como fungicida, conservante em alimentos e na manufatura de plsticos e lubrificantes
(PARKER, 1997).

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cido pentanico (valrico): o responsvel pelo aroma do queijo Roquefort. Foi


isolado pela primeira vez da raiz de uma valeriana (do Latim valere).
cido hexanodiico (adpico): um cido dicarboxlico. Seu nome vem do Latim
adipem, que significa uma gordura, e reflete a observao de que o cido adpico uma
das substncias formadas quando gorduras so oxidadas com cido ntrico. Sua
importncia industrial est relacionada com a descoberta do nylon, um polmero de
condensao, por Wallace H. Carothers e seus colaboradores, pesquisadores da empresa
americana Du Pont. Eles descobriram que pela reao de polimerizao de uma mistura
do cido adpico e 1,6-diaminohexano poderiam produzir o nylon (SNYDER, 1995;
SHREVE & BRINK, 1980).
cido 3-oxo-L-gulofuranolactona (ascrbico): conhecido como vitamina C, tem
seu nome qumico representando duas de suas propriedades: uma qumica e outra
biolgica. Em relao primeira, um cido, embora este no pertena claramente
classe dos cidos carboxlicos. Sua natureza cida em soluo aquosa deriva da ionizao
de uma hidroxila de um dos grupos enlicos (pKa = 4,25) (DAVIES et al., 1991).
Adicionalmente, o termo ascrbico representa seu valor biolgico na proteo contra a
doena escorbuto, do Latim scorbutus (LEHNINGER et al., 1995).
2.1.3. cidos orgnicos como blocos de construo
Segundo o Departamento de Energia dos EUA (DOE) e a Comisso Europia, o
cido succnico tm sido apontado como o cido orgnico de maior potencialidade acerca
de uma variedade de aplicaes industriais. O mercado para este cido de
aproximadamente 20.000 30.000 toneladas por ano, considerando a sua produo por
rota qumica, a partir do anidrido maleico (KIDWELL, 2008). Compostos que apresentam
uma ampla aplicao industrial, a partir dos quais se obtm uma srie de subprodutos,
esto inseridos no conceito de blocos de construo, os quais constituem a base para o
fornecimento de uma srie de substncias intermedirias e produtos finais, importantes na
indstria qumica. (DELHOMME et al., 2009; WERPY et al., 2004).
As Tabelas 2.3 e 2.4, mostram a posio de destaque do cido succnico, em
comparao com outros onze blocos de construo, obtidos por rota qumica ou
biotecnolgica e os trinta candidatos que podem ser classificados e apresentados, de
acordo com o nmero de carbono em sua estrutura e interesse industrial (PATEL et al.,
2006). O interesse em processos de produo biotecnolgica vem sendo considerado uma
alternativa vivel do ponto de vista ambiental, dentro do contexto de biorrefinaria. Com o
crescente avano de processos acerca de produtos derivados de matrias-primas agroindustriais, vrios setores industriais se propem a alcanar maiores ndices de qualidade,

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com produtos finais mais competitivos e rentveis, como o cido succnico (DELHOMME et
al., 2009) A produo de cidos orgnicos amplamente utilizada em escala industrial,
sendo limitada a produo de cidos de origem microbiana, a qual vem apresentando
vantagens econmicas sobre a sntese qumica destes compostos (MATTEY, 1992).
Tabela 2.3. Blocos primrios produzidos por rota fermentativa ou qumica
Blocos de construo
cido succnico, fumrico e mlico
cido 2,5 furanodicarboxlico
cido 3 hidrxipropinico
cido asprtico
cido glucrico
cido glutmico
cido itacnico
cido levulnico
3-hidrxibutirolactona
glicerol
sorbitol
Xilitol/ arabinitol
Fonte: Top Value Added Chemicals from Biomass (DOE/GO-2006). U.S. Department of Energy

Tabela 2.4. Candidatos em potencial como blocos de construo


N
de Carbono
1
2
3
4
5

Candidatos em potencial
Monxido de carbono & Hidrognio
(gs de sntese)
nenhum
Glicerol, cido 3-hidrxipropinico, cido
propinico, cido ltico
Acetona, cido asprtico, cido fumrico,
3-hidroxibutirolactona, cido malnico,
cido succnico, treonina
Arabinotil, furfural, cido glutmico, cido itacnico,
cido levulnico, prolina, xilitol,cido xilnico

cido 2,5 furanodicarboxlico, cido glucrico,


lisina, sorbitol
Fonte: Top Value Added Chemicals from Biomass (DOE/GO-2006). U.S. Department of Energy
6

.
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O campo que investiga produo microbiana de cidos orgnicos atualmente, um


dos setores de pesquisas que mais vm avanando, na rea biotecnolgica. O processo
de fermentao aerbica o principal processo industrial para a formao de cidos
orgnicos. A gliclise (EMP Embden-Meyerhof Pathway) o caminho mais comum para
a converso fermentativa da glicose, no qual o cido pirvico o intermedirio metablicochave. Esse cido oxidado de uma maneira cclica, em um ciclo conhecido como TCA
(tricarboxylic acid cycle). Algumas modificaes no ciclo metablico podem fornecer os
cidos de interesse com um rendimento maior (THAYSEN, 2005).
Na ltima dcada, diversos processos contnuos de fermentao foram descritos e
revisados; entretanto, ainda mencionam-se diversos requisitos para que os processos de
fermentao sejam atraentes economicamente. Na Tabela 2.5 esto reunidos resultados
obtidos com trs produtos: cido ctrico, o qual j se encontra no mercado h algum tempo,
cido lctico, de comercializao ampla e, cido succnico, com grande potencial para uma
variedade de aplicaes.

Tabela 2.5. Valores de produtividade e rendimento na produo de cidos orgnicos em


destaque no mercado, por rota fermentativa ou qumica
P
(g/L)

Qp
(g/L.h)

Yp/s
(g/g)

Fonte de
Carbono

Microrganismo

Estratgias
de conduo

Referncias

cido ctrico
150

----

----

Glicose

Aspergillus niger

(REHM et al., 2001)

113.5

----

0,71

Beterraba,
melao

Aspergillus niger

(LOTFY et al.,
2007)

114

0,61

0,76

Melao de
cana

Aspergillus niger

40

0,1

0,99

n-Parafina

Yarrowia lipolytica

(CROLLA, 2004)

42,9

----

0,56

Glicose

Yarrowia lipolytica

(PAPANIKOLAOU,
2006)

140

0,73

0,82

Sacarose

Yarrowia lipolytica

(FORSTER, 2007)

----

----

Lactobacillus
rhamnosus

Extrao em
processo
contnuo

Frascos
agitados

(IKRAM et al.,
2004)

cido ltico
5,4
67,1
52/144

----

----

Lactobacillus spp.

Batelada e
Reciclo de
clulas

----

3,1

Protena

Lactobacillus spp.

Eletrodilise

(HOFVENDAHL &
HAN, 2000)

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P
(g/L)

Qp
(g/L.h)

Yp/s
(g/g)

Fonte de
Carbono

Microrganismo

Estratgias
de conduo

Referncias

29

----

0,78

Farinha de
lentilha

Lactobacillus
amylophilus

-----

(ALTAF et al., 2007)

40

0,63

0,95

Bagao de
mandioca

Lactobacillus
delbrueckii

Imobilizao

JHON et al., 2007)

58

0,6

0,58

Xilose

Pichia stipitis

Hemicelulose
de bagao de
cana

(ILMEN et al., 2007)

51.7

----

0,68

Aveia

Rhizopus oryzae

Estratgia de
biorrefinaria

(KOUTINAS et al.,
2007)

95

2,2

0,80

Glicose

Rhizopus spp.

Airlift (escala
industrial)

(LIU et al., 2006)

122

----

0,61

Caldo de
cana

Saccharomyces
cerevisiae

Cultura
neutralizada

(SAITOH et al.,
2005)

70

----

0,93

Glicose

Saccharomyces
cerevisiae

pH baixo

(VALLI et al., 2006)

cido succnico
35.6

1,01

0,82

Trigo

Actinobacillus
succinogenes

Hidrlise/
Batelada

(DU et al., 2007)

52

1,8

0,76

Glicose

Mannheimia
succiniciproducens

----

(LEE et al., 2006)

43

0,72

0,53

Glicose

Escherichia coli

Batelada

(LIN et al., 2005)

58.3

1,08

0,62

Glicose

Escherichia coli

Batelada
alimentada

(LIN et al., 2005)

55.2

1,15

----

Melao de
cana

Actinobacillus
succinogenes

Batelada

(LIU et al., 2007)

83

10,4

0,89

Glicose

Anaerobiospirillum
succiniciproducens

Batelada
Eletrodilise

(MEYNIAL, 2008)

P: produto final, Qp: Produtividade volumrica, Yp/s: Fator de rendimento em produto

2.2. cido succnico


O cido butanodiico, conhecido como cido succnico, um cido dicarboxlico
produzido como um intermedirio do ciclo dos cidos tricarboxlicos (TCA), ou como
produto principal da fermentao anaerbica por alguns microrganismos (LEE, et al.,
2000), constituindo-se em um metablito comum produzido por plantas, animais e
microrganismos (ZEIKUS et al., 1999).
Sua estrutura qumica, apresentada na Figura 2.1, representada por C4H6O4, e
suas caractersticas esto apresentadas na Tabela 2.6.

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Figura 2.1. Estrutura qumica do cido succnico

Basicamente, um composto slido em temperatura ambiente, incolor e inodoro.


Possui ponto de fuso de 185 0C e ponto de ebulio de 235 0C. Sua forma aninica o
succinato, que constitui um componente do ciclo do cido tricarboxlico, capaz de doar
eltrons para a cadeia transportadora de eltrons.

Tabela 2.6 . Caractersticas do cido succnico

Nomes comuns

cido butanodiico, cido


1,2-etanodicarboxlico,

Massa molecular
Aparncia
Gravidade especfica
Ponto de fuso
Ponto de ebulio
Volatilidade
Outras informaes

118,09 u
Cristal inodoro/incolor
1,572 (200C /40C)
184-1880C
2350C
0 (210C)
Combustvel e corrosivo

Fonte: www.gadiv.com

2.2.1. Aplicaes do cido succnico

Considerado um componente chave na obteno de uma srie de produtos


comercialmente importantes, serve de matria-prima para fabricao de muitos comodities
qumicos, tais como cido adpico, surfactantes, solventes verdes, ingredientes
estimulantes para crescimento de plantas, antibiticos e vitaminas (MCKINLAY et al., 2007;
ZEIKUS & JAIN, 1999). O cido succnico e seus derivados so largamente utilizados
como especialidade qumica para aplicaes na indstria de alimentos, farmacutica e de
cosmticos (SONG & LEE, 2006).

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Destaca-se por permitir a realizao de transformaes na sua estrutura qumica de


maneira facilitada. Dentre as suas aplicaes principais, podem ser destacados trs
derivados do succinato, obtidos por hidrogenao, que so o 1,4 butanodiol (BDO),
tetrahidrofurano (THF), e gamma-butirolactona (GBL), alm de molculas de pirrolidonas
(CUKALOVIC & STEVENS, 2008; DELHOMME et al., 2009).
De acordo com a potencialidade do cido succnico, seu uso est voltado para
produo de numerosas substncias qumicas com diferentes aplicaes industriais,
classificadas em trs grandes grupos:
I. Indstria qumica: Setor que constitui o maior mercado de aplicao deste cido,
podendo ser usado na fabricao de resinas sintticas, biopolmeros (PBS, PES),
detergentes, solventes biodegradveis e intermedirios para snteses qumicas (WILKE et
al., 2004). Tambm pode ser utilizado na produo de fibra de vidro e resinas de troca
inica (LEE et al., 2003 (a); KIM et al., 2004).

Segundo RUDNER et al. (2005), as

substncias qumicas mais importantes, produzidas a partir do cido succnico, so:

n-metilpirrolidona: recomendado como substituto do cloreto de metileno como

solvente para diminuir poluies txicas. Este composto conhecido como solvente
verde;

1,4-butanodiol: matria-prima para a produo de resinas, plsticos e

polmeros de alta resistncia, sendo tambm utilizado como solvente;

Tetrahidrofurano (THF): ingrediente de solventes, colas e tintas;

-butirolactona: ingrediente de solventes de tintas e produtos txteis;

cido adpico: precursor do nylon 6.6 e matria-prima na fabricao de

espumas e produtos industriais;

Dietil-succinato: qumico verde utilizado na limpeza de superfcies metlicas

e tambm como removedor de tintas;

steres lineares alifticos: utilizados na fabricao de resinas, plsticos e

outros produtos de consumo industrial;

Succimidas: utilizadas como combustveis e em materiais absorventes.

Conforme j mencionado, anteriormente, o cido succnico pode substituir uma


quantidade acima de 250 produtos qumicos que so derivados do benzeno, minimizando a
poluio gerada na produo dos mesmos (KERMANSHAHI et al., 2005). Alm disso, o
etileno-diaminodisuccinato, derivado do cido succnico, pode substituir o EDTA em muitos
processos em que utilizado atualmente (ZEIKUS, 1999).
II. Indstria de alimentos: usado como modificador de pH e como agente
antimicrobiano. O succinato de sdio tem a caracterstica de acentuar o sabor dos
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alimentos, podendo ser utilizado no lugar do glutamato de sdio (CAROLE et al., 2004).
Outros sais do cido podem ser utilizados como aditivos no cultivo de plantas e na
alimentao animal, atuando como precursor de protenas, fontes de energia e
estimulantes de crescimento. Em alguns aminocidos usado para produzir substncias
com qualidades de protenas de soja.
III. Indstria farmacutica: O cido succnico utilizado na produo de frmacos,
antibiticos, aminocidos, vitaminas, sedativos, medicamentos anticoncepcionais e
medicinais combatendo inflamaes, espasmos, artrites e at mesmo o cncer. O mercado
destas substncias est acima de 400 milhes de dlares ao ano (ZEIKUS, 1999).
O esquema de blocos, ilustrado na Figura 2.2, apresenta essas e outras aplicaes
do cido succinico, consideradas importantes.

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Hidrlise
Especialidades

Substncias Qumicas

cido adpico

Substitutos de Sal
Solventes

Estimuladores para
crescimento de plantas

1,4-Butanodiol

Acidulantes

4,4 steres

Polisteres

Solventes Verdes

Tetrahidrofurano
Dimetil/Dietil
Succinato
cido

-Butirolactona

Detergentes e
surfactantes

Succnico
2-Pirrolidiona
cido

Produtos
farmacutico

Succinimida

4-Aminobutanico

Anidrido maleico

Maleimida

Hidroxisuccinimida

Inibidores de
corroso

cido maleico

cido itacnico
cido mlico

cido fumrico
cido Asprtico

Figura 2.2. Produtos obtidos a partir do cido succnico, como uma comoditie em potencial. (JOERI et al., 2010; CUKALOVIC &
STEVENS, 2008 e DELHOMME et al., 2009)
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2.2.2. Biopolmeros, bioplsticos e plsticos biodegradveis


Alm da demanda crescente de aplicaes utilizando cido succnico, seu uso
estendido sntese de copolmeros biodegradveis (RUDNER, 2005), tais como os
polisteres: PES (polisuccinato de etileno), PBS (polibutilenosuccinato), PBSA (polibutileno
succinato adipato) e PBT (polibutilenotereftalado) (PRADELLA et al., 2006).
Polmeros verdes so polmeros semelhantes aos polmeros sintticos de origem
petroqumica, mas que empregam matrias-primas renovveis (BASTOS, 2007). Nesse
sentido, so exatamente iguais aos polmeros derivados do petrleo, polimerizados da
mesma maneira e com as mesmas propriedades. Os biopolmeros so polmeros naturais
sintetizados por organismos vivos, sob as mais diversas condies ambientais, com
diferentes

composies

de

monmeros,

estrutura

macromolecular

diferentes

propriedades fsicas. Constituem exemplos de biopolmeros o amido, as protenas e os


peptdeos, alm dos cidos nuclicos (DNA e RNA), cujos respectivos monmeros so os
acares, os aminocidos e os cidos nuclicos (PRADELLA et al., 2006)
Os principais tipos de biopolmero so os bioplsticos, como o polipropileno e o
polietileno, entre outros, que podem ser usados no segmento de embalagens. Seu
consumo ainda inexpressivo, mas as perspectivas de crescimento so promissoras,
particularmente, devido a aspectos ambientais e econmicos. Em 2005, o consumo desses
materiais na Europa foi de 40 mil toneladas, o dobro em relao a 2001 (EPOBIO, 2006).
Especialistas vislumbram perspectivas promissoras e estimam que, nos prximos dez
anos, os bioplsticos representaro cerca de 1% a 2% do mercado mundial (COUTINHO et
al., 2004).
A maioria dos biopolmeros biocompatvel (no produz efeito txico) e
biodegradvel,

decompondo-se

em

curto

espao

de

tempo,

em

ambientes

microbiologicamente ativos. No entanto, plsticos sintticos tambm podem ser


biodegradveis e a maioria dos que so assim definidos tm como base o petrleo. Os
primeiros produtos, originados h mais de vinte anos, eram baseados nas resinas plsticas
tradicionais derivadas do petrleo, misturadas com pequenas quantidades de amido. Em
presena de gua, as resinas se desintegravam em pequenos pedaos e o amido se
biodegradava. Posteriormente, novos polmeros biodegradveis foram desenvolvidos com
base em amido e outros produtos naturais (modificados quimicamente ou em reatores
biolgicos) ou utilizando o prprio petrleo. H estruturas mais recentes, como os plsticos
oxibiodegradveis, que so baseados em poliolefinas tradicionais, s quais se adiciona um
catalisador, aditivo de origem orgnica, como carbono ou hidrognio, contendo sais de
metais de transio que aceleram a oxidao do polmero. Este processo resulta em

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molculas menores, passveis de serem umedecidas por gua, e disponveis para os


microrganismos sob a forma de uma fonte de energia. A taxa de degradao est
relacionada temperatura ambiente (DOTY, 2005).
Portanto, plsticos biodegradveis podem ser obtidos de polmeros naturais ou
sintticos e podem ser produzidos por fontes renovveis ou no-renovveis. Alguns dos
principais plsticos biodegradveis so polisteres que podem ser naturais ou sintetizados
por meio de fontes renovveis ou no-renovveis (Figura 2.3).

Figura 2.3. Polisteres alifticos e aromticos.


Fonte: NOLAN (2002).
PBS: Polibutileno succinato, PHA: Polihidroxialcanoato, PLA: Polilactato, PBSA: Polibutileno succinato
adipato, PHB: Polihidroxibutirato, PHH: Polihidroxialcanaoato, PET: Polietileno tereftalato, ACC:
Copolister aliftico aromtico, PMAT: Polimetileno adipato tereftalato

Cabe ressaltar que, apesar das caractersticas interessantes dos biopolmeros, tais
como biodegradabilidade e o uso de recursos renovveis, muitos ainda no apresentam
propriedades fsicas idnticas aos polmeros petroqumicos (por exemplo, maior fragilidade
e decomposio muito rpida) e, em especial, tm custos de produo elevados, ainda que
em queda nos ltimos anos (COUTINHO et al., 2004). A questo do preo , de fato, a
principal desvantagem. Biopolmeros como o PLA encontram-se na faixa de 3,00-4,00/kg,
o PHA em 3,50-5,00/kg e os compostos do amido em 2,00-4,00/kg, enquanto o preo
dos plsticos sintticos est atualmente em 1,00/kg.
O PBS um polister aliftico sinttico obtido atravs da copolimerizao do 1,4
butanodiol (BDO) com cido succnico, ambos produzidos por fermentao. Munoz-Guerra
et al. (2005) publicaram a sntese de copolisteres aliftico-aromticos obtidos pela reao

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em massa do PET com o poli (succinato de 1,4 butileno) (PBS) em diferentes propores
de cada homopolmero (KINT et al., 2003). A reao do PET ps-consumo com polisteres
alifticos destaca-se por ser um meio simples e de baixo custo para a produo de novos
termoplsticos com propriedades intermedirias entre os polisteres aromticos e
alifticos, aliado vantagem destes copolmeros serem biodegradveis.
O PET um material que possui excelentes propriedades trmicas e mecnicas, o
que o torna um dos polmeros mais utilizados atualmente, sendo amplamente empregado
na fabricao de embalagens de alimentos e bebidas. A elevada produo mundial,
estimada em 26 milhes de toneladas no ano de 2000 com previso de alcanar um total
de 55 milhes de toneladas em 2010 (FRADET & TESSIER, 2003), aliada estabilidade
qumica responsvel, juntamente com outros fatores, pelo acmulo crescente deste
polmero nos aterros sanitrios. Apesar de o PET ser incuo ao corpo humano, devido
sua excelente resistncia a agentes biolgicos e atmosfricos, ele torna-se nocivo ao meio
ambiente (KINT & MUNOZ, 1999).
Fatores econmicos e ambientais advogam em favor da reciclagem em grande
escala do PET, de maneira similar ao que j acontece atualmente com materiais
convencionais como vidro, papel e metal (LOUP et al., 2003). Muitos trabalhos vm sendo
realizados

visando

obter

copolmeros

com

propriedades

trmicas

mecnicas

interessantes, porm com caractersticas de biodegradabilidade superiores quando


comparadas ao PET.
Copolmeros de PET obtidos atravs da insero de molculas sulfonadas na sua
cadeia possuem biodegradabilidade bastante alta quando comparada com o PET (GAONA
& ILARDYA, 2003). WITT et al. (1997) sintetizaram diferentes copolmeros alifticoaromticos e observaram que em uma faixa em torno de 35 a 55% em mols de cido
tereftlico obtm-se copolmeros com uma boa relao entre propriedades mecnicas e
trmicas e biodegradabilidade.
O PES sintetizado atravs da reao de policondensao entre os monmeros
etilenoglicol (EG) e cido succnico (AS) com uma proporo inicial de EG/AS=3/1, com a
eliminao da gua formada e do etilenoglicol em excesso (FRADET, 2003).

copolister, obtido da reao do PET e PES, pode apresentar na sua estrutura as


seqncias TET (tereftalato etileno tereftalato), SES (succinato etileno succinato) e TES
(tereftalato etileno succinato), conforme mostra a Figura 2.4.
O desenvolvimento dessas rotas alternativas possibilitar reduo de custos de
produo, de modo a tornar o PBS uma alternativa futura aos polmeros convencionais
(PET) e mesmo a outros biopolmeros (PLA). Hoje, seu custo s permite o uso como
blenda com amido ou copolmeros adipatos, produzidos pela japonesa Showa Highpolymer

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e a coreana SK Polymers (NOLAN, 2002). A DuPont, a Eastar e a Basf produzem o


polibutileno succinato tereftalato (PBST), com base no BDO e no cido succnico
(BASTOS, 2007)

Figura 2.4. Estruturas possveis para os copolmeros PET-co-PES. Fonte: (PIRES et al., 2005)

2.2.2.1. O Potencial das inovaes de base biotecnolgica em biopolmeros

importante destacar os diversos mecanismos de apoio governamental mobilizados


para biopolmeros e biotecnologia industrial, por meio da concesso de recursos para
pesquisa, desenvolvimento e inovao, alm de modificaes na legislao com vistas a
estimular o uso de biopolmeros e polmeros verdes.
No Brasil, j possvel identificar iniciativas orientadas para a produo de alguns
biopolmeros, como bioplsticos com base no acar, o PHB e o PHB-HV, pela empresa
PHB Industrial, a partir de tecnologia desenvolvida em parceria com universidades e
instituies de pesquisa. H ainda, a produo de quitosana pela Polymar com a Padetec
(UFCE), alm de projetos para produo de goma xantana, pelas empresas Policam e
Quantas, por meio de tecnologias desenvolvidas em universidades brasileiras e, diversos
outros casos em que os resultados de pesquisas cientfico-acadmicas no pas podero
originar, futuramente, produo local de biopolmeros. Um desses exemplos corresponde
ao desenvolvimento de bioplstico base de amido de milho (ou outros cereais, razes e
tubrculos) e de gelatina, por pesquisadores da Unicamp. Outro exemplo o
desenvolvimento do PHB e do PHB-HV pelo Laboratrio de Engenharia Bioqumica/UFSC,

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com base na frutose do bagao de ma. Como regra geral, essas iniciativas resultam de
projetos cooperativos de pesquisa de empresas de menor porte com universidades.
Na rea de polmeros fabricados com base em matrias-primas renovveis (os
polmeros verdes), por outro lado, as iniciativas so de grandes grupos, tradicionais
empresas qumicas como a multinacional Dow Qumica ou a maior empresa petroqumica
brasileira, a Braskem (grupo Odebrecht), por meio da busca de alternativas ao petrleo,
com projetos para produo de polietileno verde, ou seja, o polietileno convencional
polimerizado a partir do etileno obtido do etanol da cana-de-acar e no da nafta
petroqumica (VALOR, 2007). A primeira est buscando parceria com o fabricante da
matria-prima da cana-de-acar (Crystalsev), para produo de 350 mil t/a de polietileno
verde, enquanto a Braskem objetiva produzir de 100 mil a 200 mil t/a de polietileno do
etanol da cana adquirido do mercado (DCI, 2007). Os dois investimentos so tpicos
projetos da alcoolqumica, que, embora sem envolver inovaes tecnolgicas radicais
como os biopolmeros, esto em consonncia com a tendncia mundial de valorizao de
matrias-primas renovveis.

2.3. Aspectos mercadolgicos da produo mundial de cido succnico

O cultivo da cana-de-acar privilgio de poucos pases, estando o Brasil em uma


posio muito favorvel, em relao a esta biomassa. Dessa forma, natural que o avano
da biorrefinaria no Brasil se d, inicialmente, com a cana-de-acar, em vez da madeira.
Um estudo recente indica que, considerando os preos atuais de mercado da madeira, do
petrleo e do bioetanol, a utilizao mais lucrativa da madeira em grande escala ainda
para a produo de polpa Kraft branqueada. Neste estudo, foi determinada a seguinte
relao relativa de lucratividade, para o uso da madeira: 100% para a produo de polpa
Kraft branqueada, 7% para a queima em caldeira de biomassa, para produo de
vapor/energia e 46% para a produo de bioetanol (COLODETTE, 2008). Porm, a
produo de cido succnico, a partir da madeira, apresentaria lucratividade de 800%, isto
, 8 vezes maior que a produo de polpa branqueada.
Deve ser ressaltado que o mercado mundial de cido succnico no excede a US$ 2
milhes anualmente. Naturalmente, todos esses clculos econmicos so baseados no
preo de US$ 110/barril de petrleo. Em suma, com os crescentes aumentos no preo do
petrleo e a potencial exausto desse recurso natural no renovvel, a biorrefinaria tornarse- uma realidade cada vez menos contestada.

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O mercado global para cido succnico, incluindo rota biotecnolgica e qumica, foi
projetado para crescer a uma taxa anual de 23.5% entre 2006 e 2015, estimando-se
alcanar em torno 144.7 mil toneladas nos prximos cinco anos. Este crescimento pode ser
justificado pelos interesses acerca da sua posio de destaque como bloco de construo.
Em um relatrio publicado, atravs do Mercado Global, foi descrito um total de 27 grandes
empresas que esto empenhadas em consolidar a produo em larga escala de cido
succnico, como a ARD (Agro-Industrie Recherches et Dveloppements, Frana), Anhui
Sanxin Chemical Co., Ltd.(China), Anqing Hexing Chemical Co., Ltd. (China), BASF SE
(Alemanha), Bio-amber S.A.S (Frana), DNP Green Technology, Inc.(EUA), Kawasaki
Kasei Chemicals Ltd.(Japo), e a MBI International, Myriant Technologies, LLC (EUA),
Roquette Frres S.A. (Frana) e a Royal DSM N.V.
A Royal DSM N.V e a Roquette criaram uma aliana estratgica para comercializar
cido succnico em escala industrial, at o final de 2011, a partir de um processo de
fermentao com fontes renovveis (glicose) e suprimento de CO2. Desde 2009, uma
planta piloto para demonstrao foi inaugurada em Pomacle (Frana) (KIDWELL et al.,
2008 e SCOTT et al., 2009). Uma integrao com a DNP Tecnologia Verde e a ARD
(BioAmber), anunciou uma capacidade de produo anual de 2.000 toneladas.
No incio de 2011, a BioAmber entrou em acordo exclusivo de licenciamento de
tecnologia com a CELEXION para produzir cido succnico e cido adpico, a partir de
fontes renovveis, aumentando sua infra-estrutura. A empresa tambm criou uma unidade
de P&D em Plymouth (Minnesota) com uma considervel eficincia em seus processos
fermentativos, em qumica analtica e biologia molecular (BIOAMBER, 2011).
No mesmo perodo, a Myriant Technologies (Myriant) e a Davy Process Technology
(Davy), uma empresa Johnson Matthey, assinaram um memorando de entendimento,
sobre a utilizao de cido succnico como matria-prima para a obteno de 1,4butanodiol e gama-butirolactona (GBL), visando minimizar os custos de recuperao e
purificao do cido succnico, na etapa de Downstream. Nos ultimos quinze anos, as
empresas Davy desenvolveram uma tecnologia baseada em butanodiol obtido pelo
anidrido maleico e, licenciou mais de meio milho de toneladas de capacidade anual sobre
a produo das diferentes misturas de tetraidrofurano (THF), butanodiol (BDO) e gamabutirolactona (GBL) (MYRIANT, 2011).
No obstante, mais uma aliana, almejando licenciamento no perodo entre 2010 e
2011, foi criada entre a Myriant Technologies LLC e a Uhde, para estudos de engenharia,
de obteno e construo de uma planta industrial. As empresas comearam, inclusive, a

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disponibilizar amostras para a verificao das especificaes e da qualidade do produto


para os seus clientes. A companhia espera com este ritmo, comear uma produo
comercial at 2012 (MCCONNELL et al., 2009). Outras empresas, como a BASF AG e a
Purac Ltd, tambm anunciaram parcerias para produzir cido succnico em escala
industrial.

Enquanto isso, a Mitsubishi Chemical Corp. Ltd, e a PTT PLC esto em

andamento com os estudos para fabricao do polmero biodegradvel, PBS, derivado de


cido succnico (MM et al., 2009).
O valor monetrio do cido succnico, produzido por sntese qumica, est na faixa de US$
5,90 8,80/kg dependendo do seu grau de pureza (SONG & LEE, 2005). De acordo com .
Koutinas et al. (2007), a produo de cido succnico via fermentativa, a partir de glicose,
poderia reduzir o preo de mercado em relao rota petroqumica, de US$ 7,0/kg para
US$ 0.6/kg.
O comrcio de substncias qumicas, derivadas do cido succnico, estaria em torno
de aproximadamente 16.000 toneladas por ano (PATEL, 2006). Entretanto, o mercado em
potencial estimado para aproximadamente 270.000 toneladas ao ano, caso o cido
succnico realmente venha a substituir o anidrido maleico como precursor de uma srie de
produtos qumicos de interesse industrial (DELHOMME, 2009; WILLKE &VORLOP, 2004).
Ainda, de acordo com OTERO (2009), a produo de cido succnico apresenta
uma demanda mundial anual que excede US$ 2 bilhes, acima dos 160 milhes/kg
produzidos atualmente pela rota petroqumica, mediante a converso do anidrido maleico
(OTERO et al., 2009).
Pode se concluir, que o interesse na produo de cido succnico por fermentao
est, claramente, associado s aplicaes para a obteno de plsticos biodegradveis.
Alm disso, o uso de recursos renovveis resultam em uma reduo de energia em torno
de 30-40% em relao a um processo qumico atual, diminuindo as emisses de CO2, j
que se trata do primeiro processo onde o CO2 usado ativamente durante a produo
(WILLKE & VORLOP, 2004; ZHANG, 2008).

2.4. Processos de produo de cido succnico


2.4.1. Rota qumica
Atualmente, a maioria do cido succnico produzido comercialmente resultado da
sntese qumica envolvendo a hidrlise de produtos derivados do petrleo, o qual est
associado a processos ambientalmente no favorveis, gerando nveis de poluio. Esse
processo se d com a oxidao do butano at anidrido maleico, que hidrolisado at

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obteno do cido maleico (CORNIL & LAPPE, 2002). Em seguida, atravs de sua
hidrogenao obtido o cido succnico (ZEIKUS et al., 1999), conforme mostra a Figura
2.5.

Oxidao

Especi

Hidrogenao

Figura 2.5. Sntese qumica para obteno do cido succnico (ZEIKUS et al.,1999)

O custo elevado para a converso de anidrido maleico para cido succnico,


representa uma limitao para as diversas aplicaes deste produto. Entretanto, devido a
questes de impacto econmico e ambiental, ateno tem sido focalizada na produo
fermentativa de cido succnico por microrganismos anaerbios ou anaerbios facultativos,
como uma alternativa para a sntese qumica (ISAR et al., 2006; SONG et al., 2007; LIU et
al., 2008 e SAUER et al., 2008).

2.4.2. Rota fermentativa


Existem vrios processos fermentativos para a produo de cidos orgnicos, que
diferem principalmente no tipo de fermentao e no microrganismo utilizado. Os processos
podem ser em superfcies (lquidas ou slidas) ou em meios lquidos, podendo ainda
utilizar leveduras, bactrias ou fungos (GOLDBERG et al., 1991). A sobrevivncia das
companhias produtoras de cido depende muito do baixo custo de produo, por se tratar
de um mercado de preos bastante suscetveis, com uma ligeira margem de lucro,
aumento constante do nmero de companhias produtoras e o constante aumento de
produtos sintetizados quimicamente. A estratgia de conduo do processo fermentativo,
requer estudos prvios de otimizao, visando maiores rendimentos, contribuindo para
diminuir os custos do processo (MCKINLAY et al., 2007).
O processo fermentativo pode ser operado por trs formas: batelada simples,
batelada alimentada ou contnuo. Na batelada simples, ao meio de fermentao
adicionada uma suspenso celular e o processo transcorrido, sem adies de meio novo,
nem retiradas de meio reacional durante o seu curso. A batelada simples caracterizada
por alterao nas condies ambientais a todo instante do processo (as concentraes de

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nutrientes so reduzidas e de clulas, produtos e sub-produtos aumentadas) (PEREIRA


JR., 2005). O principal problema desta forma de se operar o processo fermentativo
decorrente de fenmenos de inibio pelo substrato, produto, ou outros metablitos. Para
se contornar esses problemas associados inibio, outras formas de conduo podem
ser utilizadas, como a batelada alimentada, que possibilita a manuteno da concentrao
desses inibidores/repressores em nveis sub-inibitrios/sub-repressores, com implicaes
diretas no desempenho da clula. A tcnica de batelada alimentada definida como um
modo de operao onde um ou mais nutrientes necessrios ao crescimento celular so
adicionados ao fermentador, intermitentemente ou continuamente, sem que ocorra retirada
de material durante a operao (PEREIRA JR., 2005). A conduo contnua outra
modalidade de se operar fermentadores. Como o prprio nome sugere tanto a alimentao
de meio nutriente, quanto retirada de produto (meio fermentado) so realizadas de forma
contnua. Sua principal vantagem, quando comparada com outras formas de conduo,
est ligada possibilidade de se operar o sistema por extensos perodos de tempo,
resultando em aumento de produtividade (PEREIRA JR., 1991).
A

fermentao

est

se

tornando

cada

vez

mais,

parte

integrante

do

desenvolvimento de novos produtos de alto valor agregado e est substituindo rotas


convencionais para produo de importantes produtos qumicos (HOEK et al., 2003). O
etanol, o butanol e o cido lctico so os produtos mais tradicionais de processos
fermentativos, e so formados como resultado do metabolismo anaerbio de acares.
Porm, h uma srie de vantagens ligadas obteno biotecnolgica do cido succnico,
destacando-se a possibilidade de planejamento de produes alternativas, seqenciais ou
conjuntas com outros produtos de interesse no mercado como: cido ctrico, cido lctico,
cido actico, propinico e/ou etanol, cujas produes se do com o emprego de matriaprima renovvel, particularmente, os resduos agrcolas e agro-industriais, decorrentes do
processamento da cana-de-acar; (ZEIKUS et al., 1999).

2.4.2.1. Matrias-primas utilizadas na produo de cido succnico


Uma grande variedade de matrias-primas para a produo de cido succnico,
utilizadas como fonte de substrato/carbono/energia, pode ser encontrada descrita na
literatura. Diferentes estratgias para fermentao tambm tem sido reportadas a partir de
soro do queijo (SAMUELOV et al., 1999;LEE et al., 2000,2003a; WAN et al., 2008), melao
de cana de acar (AGARWAL et al., 2006; LIU et al., 2008), hidrolisado de madeira (LEE
et al., 2003b e OKUDA et al., 2007), hidrolisado da madeira destoxificado (HODEG et al.,
2009), hidrolisado da palha de arroz (DONNELLY, 2004), fibra de milho (CHEN et al.,

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2010), resduos de talo de milho (corn stover) (LI et al., 2010), alcachofra e topinambo de
Jerusalm (REN et al., 2008); trigo (DORADO et al., 2009), milhocina (AGARWAL et al.,
2006); palha de trigo (DU et al., 2008) e hidrolisado do sake (CHEN et al., 2010).
A viabilidade tcnica, os balanos mssicos e energticos e a economicidade so
aspectos relevantes que devem ser considerados na escolha da matria-prima. Dessa
forma, as matrias-primas para bioprocessos podem ser agrupadas em funo da estrutura
e complexidade molecular dos substratos (reagentes primrios dos quais o produto
obtido). Em algumas, os substratos encontram-se na forma polimrica, e sua hidrlise
prvia ser necessria, caso o agente biolgico no seja capaz de sintetizar enzimas que
catalisam a despolimerizao desses substratos (PEREIRA, 1991). Assim, essas matriasprimas podem conter:


Substratos solveis que podem ser facilmente extrados e convertidos prontamente a


produto(s), como por exemplo: sacarose, glicose, frutose e lactose, de cana de
acar, beterraba, melao, soro de leite etc.

Polissacardeos insolveis, que precisam de tratamento moderado para solubilizao


e hidrlise, antes da converso a produto(s), como por exemplo: amido de milho,
mandioca, trigo, cevada, batata, etc.

Polissacardeos insolveis altamente resistentes, que necessitam de pr-tratamento


fsico, seguido de hidrlise qumica ou enzimtica para produzir substratos na forma
monomrica, que sero convertidos a produto(s), como por exemplo: celulose e
hemicelulose de matrias primas lignocelulsicas.
A Figura 2.6 apresenta a classificao das matrias-primas em funo de seus

respectivos substratos. O desenvolvimento das novas tecnologias visa o aproveitamento


de resduos agroindustriais, materiais lignocelulsicos, no intuito de diminuir os custos
associados s matrias primas, que podem atingir 2/3 do custo total de produo, e
incrementar os nveis de produtividade. H que se ressaltar, que a matria-prima um dos
componentes mais relevantes nos custos de produo, havendo casos em que pode
representar at 75% dos custos totais, sendo esta uma das razes pelo crescente
interesse no aproveitamento de resduos agro-industriais e florestais como matrias-primas
para a produo no somente de cidos orgnicos, mas de uma grande gama de
substncias qumicas de forte interesse comercial (BETANCUR & PEREIRA JR, 2010).

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Figura 2.6. Principais matrias-primas glicdicas e seus substratos correspondentes.


Fonte: PEREIRA JR. (1991)

2.4.3. Materiais lignocelulsicos


Os materiais lignocelulsicos so os compostos orgnicos mais abundantes na
biosfera, participando com aproximadamente 50% da biomassa terrestre. O termo estrutura
lignocelulsica (Figura 2.7) refere-se parte do vegetal que forma a parede celular (meialamela, paredes primria e secundria), composta por estruturas fibrosas, constitudas
basicamente por polissacardeos [celulose (40-60%) e hemicelulose (20-40%)] (SANTOS &
PEREIRA

JR,

2009).

Estes

componentes

esto

associados

uma

estrutura

macromolecular contendo substncias aromticas, denominada lignina (15-25%). De uma


forma geral, pode-se afirmar que estes materiais possuem em sua composio,
aproximadamente, 65-75% de polissacardeos (em base seca), que contm em suas
unidades monomricas, valiosos glicdios (acares) (PEREIRA JR, 2010).

Figura 2.7. Polmeros constituintes do material lignoceulsico (SHLESER, 1994)

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Dentre os resduos agro-industriais de composio lignocelulsica de maior


importncia destacam-se: bagao e palha de cana; sabugo e palha de milho; palhas de
trigo e arroz, restos de madeira processada e resduos municipais baseados em papel
(Tabela 2.7). No contexto brasileiro, estima-se que somente o setor sucro-alcooleiro gere,
aproximadamente, 16 milhes de toneladas de bagao de cana excedente e 76 milhes de
toneladas de palha (DEDINI, 2007 e MAPA, 2008).
Tabela 2.7. Composio de resduos agro-industriais
Composio (%)
Fonte

Celulose

Hemicelulose

Lignina

Extrativos

Cinzas

Bagao de cana

33-36

28-30

18-20

4-6

2-4,8

Palha de arroz

32-37

19-24

9-13

4-5

12-18

Sabugo de milho

34-36

16-24

15-19

2-6

2-4

Palha de trigo

30-33

22-28

14-18

3-7

3-7

Palha de sorgo

34-36

25-26

25-26

Jornal impresso

40-55

25-40

18-30

Madeiras

~50

~20

15-20

At 10

At 5

Fonte: SUN & CHENG (2002), PANDEY et al. (2000), OLSSON & HAHN-HGERDAL (1996)

As composies em glicdeos da celulose e da hemicelulose so mostradas na


Tabela 2.8, apresentando variaes segundo o tipo de material lignocelulsico.
Tabela 2.8. Constituintes bsicos de alguns materiais lignocelulsicos
Sabugo
de
milho

Palha
de
trigo

Palha
Bagao
Semente
de
de
de
arroz
cana
algodo
Glicdeos (%)

Glicose

39,0

36,6

41,0

38,1

Manose

0,3

0,8

1,8

Galactose

0,8

4,4

Xilose

14,8

Arabinose

4,2

Jornal
impresso

Resduos
urbanos

20,0

64,4

40,0

n.d.

4,1

16,6

8,0

0,4

1,1

0,1

n.d.

n.d.

19,2

14,8

23,3

4,6

4,6

14,0

4,4

4,5

4,5

4,3

0,5

4,0

Outros (%)
Lignina

15,1

14,5

9,9

18,4

17,6

21,0

20,0

Cinzas

4,3

9,6

4,4

4,8

14,8

0,4

1,0

Protenas
4,0
4,0
n.d.
n.d. medidas no determinadas
Fonte: LEE (1998)

4,0

4,0

n.d.

n.d.

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2.4.3.1. Celulose

A celulose o polmero orgnico considerado como o maior constituinte da parede


celular das plantas e uma das estruturas que constantemente regenerada durante a
fotossntese. um homopolissacardeo linear composto por unidades de -D-glicose,
unidas por ligaes (1-4) carbono-carbono (Figura 2.8 (1)) (PANDLEY, 2000; LEE, 1997).
A molcula de celulose possui entre 8000 e 14000 unidades de glicose, dependendo do
tipo de planta, apresentando uma massa aproximada de 2,3 milhes de umas (unidades de
massa atmica) (SHLESER, 1994). As cadeias de celulose formam entre si ligaes de
hidrognio intramoleculares (O6-H-O2 e O6-H-O3) e intermoleculares (O3-H-O5) (Figura
2.8 (6)).
Estas ligaes conferem alta rigidez e elevado grau de ordenao estrutura,
criando as denominadas regies cristalinas, responsveis pela insolubilidade e pouca
reatividade da celulose (LEMOS, 2001).

Figura 2.8. Disposio das molculas de glicose, unidas por ligaes Glicosdicas (1)
(COUGHLAN, 1985 apud LEMOS, 2001); Estrutura simplificada da Celulose (2)
(PEREIRA Jr., 1991)

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2.4.3.2. A Lignina

A lignina, rica em compostos aromticos, presente em todas as plantas superiores,


a responsvel pela rigidez da parede celular em vegetais, da sua resistncia ao impacto,
compresso e dobra, sendo tambm um agente permanente de ligao entre as clulas
(LEMOS, 2001). Cabe destacar que a lignina quando liberada dificulta os processos
fermentativos. Estruturalmente, uma complexa macromolcula aromtica, hidrofbica e
opticamente inativa, com numerosas ligaes cruzadas (aproximadamente 10 tipos
diferentes). A macromolcula deriva da polimerizao desidrogenativa de trs lcoois:
lcool trans-coniferlico, trans-p-cumrico e lcool trans-sinaplico, conforme mostra a
Figura 2.9 (CARAMEZ, 1999).

Figura 2.9. lcoois precursores da lignina


Fonte: dALMEIDA (1988)

2.4.3.3. A Frao Hemicelulsica

Da estrutura complexa da hemicelulose participam dois tipos de unidades de


acar, formando macromolculas com 100 a 200 unidades, que, em conjunto,
atingem uma massa molecular bem menor do que a da celulose.
Entre as unidades de pentoses e hexoses que formam a estrutura da hemicelulose
destacam-se

-D-manose,

-D-glicose,

-L-arabinose,

-D-galactose

principalmente, -D-xilose, em propores que dependem da origem do meterial


lignocelulsico.

Adicionalmente,

podem

ser

encontrados

cidos

como

-D-

glucurnico, -D-galactournico e -D-4-O-metilglucurnico, e alguns grupos acetil


(CARAMEZ, 1999).
A macromolcula da hemicelulose (Figura 2.10), sem regies cristalinas devido ao
seu grau de ramificao, constituda por uma mistura de polissacardeos de baixa massa
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molecular, como xilanas, arabinanas, mananas, e ainda polissacardeos mais complexos


como arabinoxilanas, glucoarabinoxilanas, arabinogalactanas, arabinoglucoranoxilanas,
glucomananas, arabinogalactanas, galactoglucomanas e galactomanas (FOGEL, 2004).
A

xilana

componente

majoritrio

do

complexo

hemicelulsico,

constituindo entre 15% e 30% da massa seca de madeiras e resduos agroindustriais. Depois da celulose as xilanas constituem a mais abundante fonte de
carboidratos das plantas. As xilanas correspondem a 15-30% da massa seca total
nas madeiras duras, formadas, principalmente, por glucouranoxilanas, e a 7-12%
das madeiras macias, formadas, principalmente, por galactoglucomananas e
arabinoglucouranoxilana (CARAMEZ, 1999).
No caso do pr-tratamento cido do material lignocelulsico, visando solubilizao
da hemicelulose, gera-se uma mistura de glicdeos na qual a xilose majoritria,
alcanando os dois teros dos acares redutores (DELGENES et al., 1998).
-Arabinofuranose
Grupo Acetil

OH
H

H
OH
O

CH3
H

H
O

OH

H
OH

O
OH

H
OH

O
O

H
O

O OH

CH3

H
O

H
OH

OH

Xilobiose
OH

H
O
H
OH

O
OH

H
O

H
O

H
O

H
O

H
OH

H
OH

H
OH

H
OH

OH

OH

OH

OH

H
H
OH

H
O OH

O
CH3

Grupo Acetil

cido Glucurnico

H
CH3

H
OH

OH

cido Glucurnico

Figura 2.10. Estrutura Tpica da Hemicelulose


Fonte: MUSSATTO (2002)

2.4.4. Materiais lignocelulsicos e o contexto de biorrefinaria


O aproveitamento de materiais de composio lignocelulsica tem focalizado a
produo no convencional de etanol combustvel. No entanto, j podem ser observados
intensivos esforos e grandes investimentos no sentido de se diversificar o uso desses
abundantes resduos, dentro do conceito, do que vem sendo denominado, de Biorrefinaria.
Biorrefinaria um termo relativamente novo, que se refere ao uso de matriasprimas renovveis (biomassas) e de seus resduos, de maneira mais integral e
diversificada, para a produo, por rota qumica ou biotecnolgica de uma variedade de
valiosas substncias e energia, com mnima gerao de resduos e emisses (PEREIRA
JR, 2008).
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O conceito de Biorrefinaria construdo com base em duas plataformas diferentes.


Ambas visam fornecer blocos de construo para a obteno de diferentes produtos. A
plataforma bioqumica focaliza a fermentao dos glicdios (acares) extrados das
biomassas por processos hidrolticos. A plataforma termoqumica enfoca a gaseificao ou
a pirlise da biomassa e de subprodutos dos processos de converso (PEREIRA JR,
2008). A Figura 2.11 ilustra as duas correntes para o aproveitamento das biomassas,
sendo a plataforma bioqumica aquela sobre a qual o presente trabalho est,
fundamentalmente, baseado.

PLATAFORMA BIOQUMICA
Hidrlise (qumica/enzimtica)
Fermentao
Converso da lignina

intermedirios
glicdicos ou
derivados de lignina
PRODUTOS

BIOMASSAS
Cultivos energticos
Resduos agrcolas/agroindustriais

PLATAFORMA TERMOQUMICA
Pirlise (bio-leo)
Gaseificao (BTL; GTL)

combustveis
substncias qumicas
energia
Intermedirios
gasosos ou lquidos

Figura 2.11. Esquema simplificado das rotas tecnolgicas para o desenvolvimento de


Biorrefinarias (Fonte: PEREIRA JR. et al., 2008)

2.4.5. Bagao de cana-de-acar

O cultivo de cana de acar comeou no Brasil no sculo XVI com o intuito de


produzir acar e romper com o monoplio promovido pela Frana. No incio da dcada de
70 a produo atingia os 50 milhes de toneladas e, com a implantao do PROALCOOL,
este valor elevou-se consideravelmente no ano de 1985 (MOREIRA & GOLDEMBERG,
1999).

Segundo algumas estimativas, a safra de cana-de-acar aumentou de 318

milhes de toneladas em 2007 para 514 milhes de toneladas em 2008, chegando a


aproximadamente 730 milhes em 2010 (SANTOS, 2009). Atualmente, o bagao gerado
nas usinas consumido para produo de energia por meio da co-gerao, tornando as
usinas auto-sustentveis energeticamente.
Com a moagem da cana-de-acar para a extrao do caldo de cana, geram-se
grandes quantidades de bagao de cana, normalmente utilizadas para a produo de
vapor e eletricidade em processos de pouca eficincia, devido inexistncia de aplicaes

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mais atraentes para o material.. Atualmente, pretende-se desenvolver processos que


permitam um aproveitamento mais racional do bagao de cana, como a produo
biotecnolgica de diversas substncias como etanol, xilitol e cido succnico (ARIFEEN,
2007; KOUTINAS, 2007 e DU, 2008). Para este tipo de aproveitamento necessria a
liberao dos glicdeos constituintes das diferentes fraes hemicelulsica e celulsica,
utilizando pr-tratamentos economicamente viveis que permitam a extrao com pouca
degradao dos acares e baixas concentraes de inibidores (SUN & CHENG, 2002).
A existncia de processos eficientes para a extrao dos glicdeos, unida
integrao energtica das usinas que inclui o uso de caldeiras mais eficientes, e
substituio

de

parte

do

bagao

queimado

por

outros

materiais

como

palha,..permitiriam..uma disponibilidade de bagao prxima a 78% do obtido no processo


de moagem. Esse excedente de bagao poderia ser destinado a etapas de pr-tratamento
e posterior transformao em substncias de maior interesse comercial (BETANCUR,
2010).

2.4.6. Tipos de Pr-Tratamento


Um pr-tratamento considerado bom se a acessibilidade ao ataque biolgico, isto
, das enzimas, maximizada e a formao dos co-produtos inibidores minimizada. Os
diferentes tipos de pr-tratamento, aplicados a materiais lignocelulsicos para clivar as
ligaes das macroestruturas, podem ser classificados como fsicos, fsico-qumicos,
qumicos e biolgicos.
Os pr-tratamentos fsico-qumicos so utilizados para aumentar a susceptibilidade
do material lignocelulsico ao ataque enzimtico. Caracterizam-se pelo tratamento do
material em elevadas presses e temperaturas, e o posterior resfriamento rpido. So eles:
 Exploso a vapor ou auto-hidrlise: O material tratado em contato com vapor de
gua saturado, permitindo a solubilizao de alguns monmeros e variados
polissacardeos da frao hemicelulsica, a transformao da lignina e o aumento
da susceptibilidade da celulose a posterior hidrlise.
 Exploso por amnia: Neste caso o material impregnado ou embebido numa
soluo de amnia durante o processo com o intuito de aumentar taxa de
sacarificao.
 Exploso por CO2: Neste caso o material impregnado com CO2 que se transforma
no correspondente cido e incrementa o processo hidroltico.

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No caso dos pr-tratamentos qumicos, alguns desses processos so descritos a


seguir:
 Hidrlise cida: Neste processo so utilizados cidos como catalisadores do
rompimento entre as fraes, e/ou das prprias fraes, em condies que variam
desde as mais drsticas, com o objetivo de hidrolisar a celulose, at moderadas,
para a solubilizao seletiva da frao de hemicelulose.
 Ozonlise: O oznio utilizado neste processo para retirar a lignina do material
lignocelulsico deixando-o mais accessvel ao ataque enzimtico.
 Hidrlise alcalina: A presena de lcalis durante o processo de hidrlise permite a
saponificao de ligaes ster, ocorrentes entre xilanas e entre xilana e lignina,
permitindo a extrao de uma parte dessas fraes, ao mesmo tempo em que
reduzida a cristalinidade das fibras do complexo.
 Deslignificao oxidativa: Neste processo enzimas peroxidases so utilizadas para
biodegradar a lignina em presena de H2O2 aumentando a susceptibilidade das
fibras a posteriores processos de hidrlises.
 Processo organosolv: Uma mistura de cido e solvente orgnico, geralmente etanol,
utilizada neste processo para o rompimento das ligaes internas da lignina e a
hemicelulose.

Nos pr-tratamentos biolgicos so utilizados biocatalisadores (enzimas) para clivar


seletivamente as ligaes presentes no material lignocelulsico. Em outros casos so
utilizados microrganismos, principalmente, actinomicetos e fungos basidiomicetos, para a
degradao total do material (SUN & CHENG, 2002).
O processo mais comum utilizado como pr-tratamento de materiais lignocelulsicos
a exploso por vapor. Neste processo o material mantido por um determinado tempo
imerso em vapor de agua saturado, numa temperatura que oscila entre 160 e 260oC (0,69
a 4,83 MPa) e, posteriormente, submetido a uma descompresso rpida at alcanar a
presso atmosfrica. O procedimento permite que a hemicelulose seja separada da matriz
lignocelulsica e solubilizada. Algumas das limitaes da exploso por vapor, que podem
ser generalizadas para a maioria dos pr-tratamentos, tm sido citadas por diferentes
autores (SUN & CHENG, 2002; LAVARACK et al., 2002), como: destruio de parte da
frao hemicelulsica; rompimento incompleto da matriz lignina-carboidrato e a gerao de
inibidores. Os inibidores podem ser compostos por minerais contidos no material
lignocelulsico ou gerados pela corroso de equipamentos; o cido actico, proveniente
dos grupos acetil presente no material; Furfural e hidroximetilfurfural (HMF) formados da

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degradao de xilose e glicose, respectivamente; produtos derivados da degradao da


lignina (compostos fenlicos, cidos aromticos e aldedos) e compostos derivados do
eventual uso de catalisadores (cido vanlico, caprico, caprlico, pelargnico e palmtico).
A exploso de vapor, apesar de ser o pr-tratamento mais comum, no atinge os
valores de rendimento em recuperao de xilose, obtidos com a hidrlise cida, acima de
95% (FOGEL, 2005).

2.4.6.1. Pr-tratamento cido

Esta tcnica especialmente til para a separao e solubilizao da frao


hemicelulsica, quando realizada com cidos diludos, permitindo, o aumento da
susceptibilidade

da

celulose

futuros

processos

de

hidrlise

sem

afetar,

consideravelmente, sua estrutura base. Essa caracterstica do processo permite a


obteno de hidrolisados com alto contedo de xilose em relao a outros glicdeos.
Durante o pr-tratamento cido, os catalisadores liberam prtons que clivam as
ligaes heterocclicas de ter entre os monmeros das cadeias polimricas da
hemicelulose e, no caso de cidos concentrados, da celulose. Com a clivagem dos
polmeros so liberadas diversas substncias, sendo majoritria a presena de xilose,
glicose e arabinose. Entre os cidos utilizados para este tipo de pr-tratamento,
encontram-se: H2SO4, HCl, HF, CH3COOH e HNO3 (AGUILAR et al., 2002; SUN & CHENG,
2002; CUZENS & MILLER, 1997; RODRGUEZ-CHONG et al., 2004).
Apesar de ser uma reao relativamente complexa, principalmente, pela
caracterstica bifsica do processo, AGUILAR (2002) sugere que as etapas do mecanismo
de hidrlise incluem:
1. A difuso de prtons atravs da matriz lignocelulsica;
2. A protonao dos oxignios das ligaes heterocclicas de ter entre os
monmeros do glicdeo constituinte da cadeia;
3. Clivagem das ligaes ter;
4. Gerao de ctions de carbono como intermedirio;
5. Solvatao do ction de carbono com gua;
6. Regenerao do prton com co-gerao do monmero, oligmero ou polmero do
glicdeo, dependendo da posio da ligao ter;
7. Difuso dos produtos da reao pela fase lquida;
8. Recomeo da reao a partir do segundo passo.

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2.4.6.1.1. Inibidores do processo de fermentao


A desvantagem em relao ao processo de pr-tratamento cido, que resulta no
hidrolisado hemicelulsico, reside na formao de inibidores do crescimento celular e da
fermentao de xilose. A presena de hexoses como manose, galactose, glicose e/ou de
pentoses, pode promover uma diminuio na utilizao da xilose, devido preferncia
metablica por esses glicdeos ou a inibio das enzimas responsveis do metabolismo da
pentose. Apesar disso, o consumo de xilose restabelecido quando esgotados esses
glicdeos fermentveis (DU PREEZ, 1994).
Outros tipos de inibidores podem limitar, e at impedir, o consumo da fonte de
carbono e/ou reduzir a cintica de crescimento, prejudicando o desempenho da
fermentao. A inibio pode tambm ser resultado do sinergismo entre as vrias
substncias presentes no hidrolisado. Os inibidores mais comuns so:
cido actico: gerado a partir dos grupos acetil presentes nas xilanas. Tem-se
reportado concentraes de at 16,7 g/L em hidrolisado de bagao de cana, dependendo
das condies em realizada a hidrlise cida (PARAJ, 1998b). O cido, na forma no
dissociada, pode-se difundir ao citoplasma da clula e reduzir o pH intracelular, gerando
problemas para a produo de energia e transporte de diversos nutrientes, o que aumenta
o requerimento de energia da clula. Mecanismos semelhantes de inibio vm sendo
reportados para o acetaldedo.
Furfural: um aldedo com natureza aromtica formado pela hidrlise de materiais
lignocelulsicos que contm pentoses, como o bagao de cana (GUTIRREZ et al., 2002).
Este tipo de substncia reduz o crescimento celular, a formao de ATP e a produo de
etanol durante sua assimilao ou degradao (PALMQVIST & HAHN-HGERDAL, 1999).
Segundo o tipo de microrganismo, pode causar a morte celular, ao interferir no processo de
respirao e na fosforilao oxidativa. Em sua forma reduzida, lcool furfurlico, tambm
gera efeitos inibitrios de menor intensidade (PARAJO, 1998b).
Hidroxi-metil-furfural (HMF): com um mecanismo de ao similar ao descrito para
o furfural, o HMF assimilado em taxas menores tendo o efeito de aumentar a fase lag de
crescimento das clulas. Esta substncia gerada da degradao de hexoses durante o
processo da hidrlise (PALMQVIST & HAHN-HGERDAL, 1999).
Substncias Fenlicas: Estas substncias so geradas nos processos de
degradao da lignina, que ocorrem durante o pr-tratamento cido. As substncias
fenlicas atuam desestruturando as membranas celulares, o que diminui a capacidade de
proteo e produo enzimtica das clulas. Adicionalmente, a inibio do consumo de
xilose gerada por alguns compostos fenlicos de baixa massa molecular, tem sido
reportada pela literatura. Entre essas substncias fenlicas obtidas pela degradao da
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lignina, encontram-se: cido p-hidroxibenzico, cido m-hidroxibenzico, cido vanlico,


cido sirngico, p-hidroxibenzaldedo, vanilina, cido cinmico, siringaldedo, cinamaldedo,
p-hidroxicinamaldedo,

lcool

coniferilico

lcool

3,5-dimetoxi-4-hidroxinamlico

(PALMQVIST & HAHN-HGERDAL, 1999. PARAJO, 1998b).


Adicionalmente, deve-se ressaltar que o efeito inibitrio de algumas das substncias
citadas potencializado pela presena conjunta de outras, como no caso do cido actico
e do furfural (PALMQVIST et al., 1999), podendo ser minimizado com o uso de alta
concentrao de clulas no incio do processo mediante etapas suscessivas de
crescimento (LARSSON et al., 1998).
2.4.6.1.2. Processos de Destoxificao
Os mtodos para destoxificao do hidrolisado hemicelulsico, oriundo do prtratamento, a ser utilizado como meio de fermentao, variam de acordo com tipo de
inibidor presente. Entre os mtodos mais conhecidos encontram-se aqueles destinados a
mudanas de pH com CaO, Ca(OH)2, H2SO4 ou utilizao de carvo ativo, colunas de troca
inica, precipitao, extrao com solventes orgnicos, evaporao, peneiras moleculares,
polieletrlitos e at enzimas (OLSSON & HAHN-HGERDAL, 1996; POUTANEN et al.,
1990; HAHN HGERDAL et al., 1991 e 1998).
Informaes adicionais sobre alguns tratamentos investigados para a destoxificao
de hidrolisados hemicelulsicos e seus efeitos de resposta sobre os inibidores, podem ser
encontrados nos estudos de SANCHES et al. (2005); HAHN-HGERDAL et al. (1998);
BETANCUR & PEREIRA (2010). Entre esses processos, por exemplo, o aumento de pH
para 10, seguido de ajuste para pH 6, apresenta-se como um dos tratamentos mais
promissores, devido faixa de inibidores que so retirados e ao custo do tratamento. Notase que alguns tratamentos, apesar de se mostrarem eficientes na diminuio de inibidores,
podem criar condies que afetam as caractersticas do meio e geram uma maior condio
de stress ao microrganismo utilizado. Tratamentos com variaes de pH podem
desencadear aumentos excessivos na fora inica do meio. Adicionalmente, alguns
tratamentos podem diminuir a concentrao de acares fermentveis no hidrolisado.
O desenvolvimento de processos de hidrlises que minimizem a presena de
inibidores no hidrolisado, eliminando possveis etapas de destoxificao, concomitantes a
uma alta eficincia na recuperao de acares, so de suma importncia para reduzir os
custos do processo. Uma alternativa para minimizar estes efeitos inibitrios, ocasionado
por substncias indesejadas no hidrolisado, refere-se aclimatao do microrganismo ao
meio, utilizando uma metodologia de cultivos sucessivos em meios, com contedos

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gradativamente maiores da soluo que contem as substncias inibidoras (BETANCUR &


PEREIRA, 2010).

2.4.6.1.3. Pr-tratamento alcalino


Quando comparado com o tratamento cido, a utilizao do pr-tratamento alcalino
requer temperaturas e presses moderadas e consiste na remoo de Iignina da
biomassa, aumentando a reatividade da fibra. Normalmente, utilizada a soda ou cal como
lcalis, seguido de recuperao dos mesmos, para garantir a economicidade do mtodo
(BAUDEL et al., 2006). O tratamento consiste em causar um desnovelamento da estrutura,
aumentando a rea de superfcie interna, diminuindo o grau de polimerizao e a
cristalinidade, promovendo a separao das ligaes estruturais entre a lignina e os
carboidratos (SUN & CHENG, 2002). Como resultado, a porosidade dos materiais
lignocelulsicos intensificada, aps a remoo da lignina.

2.4.6.1.4. Hidrlise enzimtica da celulose

A hidrlise enzimtica de materiais lignocelulsicos um processo muito estudado


por apresentar especificidade da reao, ausncia de reaes secundrias (que levariam
perda de rendimento), ausncia de formao de produtos secundrios (inibidores da
fermentao alcolica) e reao em condies suaves que no requerem altas presses e
temperaturas ou ambientes corrosivos para os equipamentos (BASTOS, 2007). A
cristalinidade da celulose, a proteo da lignina e as configuraes espaciais do complexo
celulose-hemicelulose-lignina tornam este tipo de hidrlise um processo lento e pouco
econmico. A estrutura capilar das fibras de celulose e a presena de metais diminuem a
eficincia da hidrlise enzimtica (ROBERTO et al, 2003; CANETTIERE, 2004).
Ao contrrio dos catalisadores qumicos, as enzimas apresentam uma elevada
especificidade em relao ao substrato e sua utilizao reduz a obteno de subprodutos
indesejveis na reao, diminuindo assim os custos de separao dos produtos, bem como
os problemas de tratamento de efluente (SEGEL, 1975). No caso da hidrlise enzimtica, a
especificidade da enzima evita ainda que ocorra degradao da glicose, o que pode
ocorrer na hidrlise cida (CONTEIRO, 1992).
As enzimas do complexo celuloltico, denominadas de forma geral de celulases, so
amplamente utilizadas para o desenvolvimento de diversos estudos e, podem ser
produzidas por bactrias e fungos filamentosos, principalmente o Trichoderma reesei

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(MARTINS, 2005). H ainda registros na literatura com Sclerotium rolfsii, Phanerochaete


chrysosporium gneros como Aspergillus, Penicillium e Schizophyllum.
As celulases so classificadas em trs grupos: (i) Endoglucanases, que clivam
ligaes internas da fibra celulsica; (ii) Exoglucanases, que atuam progressivamente nas
extremidades redutoras e no-redutoras da celulose libertando pequenos oligosacardeos
de celulose; e (iii) -glucosidases, que hidrolisam oligossacardeos solveis a glicose
(LYND et al., 2002). A Figura 2.12 esquematiza a atuao dessas enzimas sobre a
celulose.

Figura 2.12. Enzimas envolvidas na hidrlise da celulose.


Fonte: MALBURG et al. (1992).

As endoglucanases, ou 1,4--D-glucana-4-glucanohidrolases (E.C.3.2.1.4) so as


enzimas do complexo celulsico responsveis por iniciar a hidrlise. Tais enzimas
hidrolisam randomicamente regies internas de estrutura amorfa da fibra celulsica,
liberando como produtos oligossacardeos de diversos graus de polimerizao e,
conseqentemente, novos terminais redutores, sendo um redutor e um no redutor.
Durante a reao de hidrlise uma molcula de gua consumida (BEGUIN & AUBERT,
1993; MIYAMOTO, 1997).
O grupo das exoglucanases constitudo majoritariamente pelas enzimas
1,4--D-glucana-glucanohidrolases

(E.C.3.2.1.74),

tambm

conhecidas

como

celodextrinases e 1,4--D-glucana-celobiohidrolases (E.C.3.2.1.91), mais comumente


conhecidas como celobiohidrolases. Dentre os dois tipos, certamente o mais reportado na
literatura o das celobiohidrolases (CBH).
As celobiohidrolases so distinguidas em dois tipos: As enzimas do tipo I (CBH I)
hidrolisam terminais redutores, enquanto que as do tipo II (CBH II) hidrolisam terminais no

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redutores. Essas enzimas geralmente sofrem inibio pelo seu produto de hidrlise, a
celobiose (AWAFO et al., 1996). A estrutura das celobiohidrolases apresenta uma regio
na forma de gancho, cuja funo se ligar fibra celulsica, facilitando o seu acesso ao
stio cataltico. Adicionalmente, reportado que as celobiohidrolases (CBH I) possuem dez
substios ativos no domnio cataltico, cuja funo se ligar fisicamente celulose e iniciar
as reaes qumicas que hidrolisam as cadeias a celobiose.
O terceiro e ltimo grande grupo das enzimas do complexo celuloltico engloba as
enzimas

-glucosidsicas,

ou

-glicosdeo

glucohidrolases

(E.C.3.2.1.21).

As

glucosidases tm a propriedade de hidrolisar celobiose e oligossacardeos solveis (com


menos de sete unidades monomricas) a glicose. Assim como as celobiohidrolases,
tambm so reportadas por sofrerem inibio por seu produto de hidrlise (AWAFO et al.,
1996). Quando atuam conjuntamente, as celulases apresentam um rendimento melhor do
que a soma dos rendimentos individuais, ou seja, quando atuam isoladamente umas das
outras. Tal efeito conhecido como sinergia. So conhecidas pelo menos trs formas de
sinergia (LYND et al., 2002):
1. Sinergia endo-exo. As endoglucanases, atuando nas regies amorfas da fibra,
disponibilizam terminais redutores e no redutores para atuao das CBH I e CBH
II, respectivamente;
2. Sinergia exo-exo. As CBH I e CBH II atuam simultaneamente na hidrlise dos
terminais redutores e no redutores liberados por ao das endoglucanases;
3. Sinergia exo-BG. Como seu produto de hidrlise, as celobiohidrolases liberam
celobiose, que so substratos para as -glucosidases.
A hidrlise do polmero celulsico pelas celulases envolve basicamente duas etapas: A
adsoro das celulases superfcie do substrato celulsico e a hidrlise de celulose em
acares fermentveis. Para tal, os seguintes passos acontecem (AWAFO et al., 1996):
1. Difuso do complexo celulsico do seio do fluido para a regio de localizao do
substrato celulsico. No caso de substrato insolvel, a difuso acontece na direo
do filme imediatamente adjacente partcula do substrato;
2. Adsoro do complexo celulsico aos stios disponveis no substrato celulsico;
3. Formao de um complexo ativo celulases-substrato;
4. Hidrlise das ligaes glicosdicas do polmero celulsico;
5. Difuso dos produtos de hidrlise do stio ativo celulases-substrato para o seio do
fluido;
6. Dessoro do complexo celulsico do substrato hidrolisado.
O rendimento da hidrlise governado por muitos fatores, tais como: tipo de prtratamento do substrato, inibio da atividade enzimtica pelos produtos finais da

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biodegradao, concentrao e adsoro do substrato, tempo de durao da hidrlise, pH


do meio, e taxa de agitao. Conseqentemente necessrio otimizar as condies de
hidrlise para conseguir o funcionamento satisfatrio dos processos de sacarificao
(KNAUF & MONIRUZZAMAN, 2004.) A transformao dos materiais lignocelulsicos, para
a produo de diversos produtos qumicos, vem sendo estudada sob diferentes estratgias
de processamento. Devido presena de diferentes acares, muitas vezes se faz
necessrio o multiprocessamento, ou seja, o emprego de enzimas simultaneamente ao
de microorganismos (PEREIRA JR, 2010). Neste sentido e trazendo estas estratgias para
a temtica do presente trabalho de pesquisa, 2 concepes tecnolgicas se destacam e
so descritas a seguir:

2.4.7. Sacarificao e fermentao simultneas


(Simultaneous Saccharification and Fermentation - SSF)
Como o prprio nome diz, a hidrlise enzimtica de celulose e a fermentao
ocorrem em uma mesma etapa, conforme mostra a Figura 2.13.
MATRIA-PRIMA
LIGNOCELULSICA

SLIDOS
(CELULIGNINA)

PR-TRATAMENTO
HIDRLISE
HEMICELULOSE

PRODUO DE
ENZIMAS

HIDRLISE ENZIMTICA DE CELULOSE


&
FERMENTAO C6

PSP

ACARES
SOLVEIS

FERMENTAO
C5

Succinato
cido
Succnico

Figura 2.13. Diagrama de blocos do processo SSF.


Fonte: Adaptado de PEREIRA JR (2010). PSP: Processo de Separao e Purificao

A frao hemicelulsica hidrolisada e fermentada em etapa separada, segundo


mtodos descritos anteriormente. Ao contrrio do que ocorre com a frao hemicelulsica,
da qual acares podem ser obtidos mediante a sua hidrlise, quando se objetiva realizar a
hidrlise enzimtica da celulose, esta dever estar associada a um processo de
transformao. Isto decorre do fato de que, ainda que apresentem altas atividades
catalticas, as enzimas do complexo celuloltico so inibidas pelos produtos gerados na
hidrlise (glicose e celobiose) (PEREIRA JR, 2010).

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Dessa forma, a alternativa encontrada para solucionar os problemas de inibio


consiste em deslocar o equilbrio da reao de hidrlise, mediante a retirada da glicose
do meio reacional. Para se alcanar esse tento, a estratgia adotada a de se acoplar ao
processo hidroltico um processo fermentativo que ocorra simultaneamente, medida que
a glicose seja formada. Esse processo chamado, na literatura, de Simultaneous
Saccharification and Fermentation (SSF). Por um lado, esse processo oferece a vantagem
de se minimizar os problemas inibitrios, por outro, as condies operacionais ideais para
a hidrlise enzimtica no necessariamente sero as mesmas da fermentao (PEREIRA
JR, 2010).

2.4.8. Sacarificao com co-fermentao simultneas


(Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation-SSCF)

Este processo envolve 3 etapas, das quais a hidrlise da frao hemicelulsica e a


produo de celulases ocorrem separadamente, conforme ilustrado na Figura 2.14.
MATRIA-PRIMA
LIGNOCELULSICA

PR-TRATAMENTO
HIDRLISE
HEMICELULOSE

SLIDOS
(CELULIGNINA)

PRODUO DE
ENZIMAS

HIDRLISE ENZIMTICA DE CELULOSE


&
FERMENTAO C6
&
FERMENTAO C5
ACARES
SOLVEIS

PSP

Succinato

cido
Succnico

Figura 2.14. Diagrama de blocos do processo SSCF.


Fonte: Adaptado de PEREIRA JR (2010). PSP: Processo de Separao e Purificao

De acordo com esta concepo, a corrente lquida rica em pentoses, obtida aps o
pr-tratamento permanece no reator, ao qual so adicionadas as celulases e,
posteriormente, inoculado com uma linhagem recombinante (capaz de fermentar pentoses
e hexoses).

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2.4.9. Microrganismos produtores de cido succnico

O primeiro passo no desenvolvimento de processos microbianos para sntese de


cidos orgnicos identificar uma ou mais linhagens que produzam os metablitos
desejveis e em quantidades aceitveis. A variedade de linhagens que tem sido reportada
como produtores em potencial de cido succnico vm se tornando uma realidade cada vez
mais concreta, por se tratar de um intermedirio metablico comum de muitos
microrganismos.
Entre esses microrganismos, encontra-se a espcie Propionibacterium, que forma
succinato a partir de aminocidos; as bactrias tpicas do trato gastrointestinal como
Esterechia coli, Pectinatus sp, Bacterides sp; as bactrias obtidas do rumem como
Ruminococcus

flavefaciens,

Actinobacillus

succinogenes,

Bacterides

amylophilus,

Prevotella ruminicola, Succinimonas amylolytica, Succinivibrio dextrinisolvens, Wolinella


succinogenes e Cytophaga succinicans (ISAR et al., 2007; OKINO et al., 2008 e KARNRA
et al., 2005). Alm de algumas linhagens de bactrias lticas, a bactria Mannheiimia
succiniciprocens, isolada do rumem bovino, tambm representa a classe produtora de
cido succnico (LEE, et al., 2003 (a) e KIM et al., 2004).
Alm dos microrganismos naturalmente ocorrentes, como M. succiniciproducens
(HUH et al., 2006 e LEE et al., 2003) e A. succiniciproducens (LEE et al., 1999a e
MEYNIAL et al., 2008), j esto disponveis estudos que envolvem algumas linhagens
geneticamente modificadas, como E.Coli AFP184 ou E.Coli KJ122 (LIN et al., 2005 e
OKUDA et al., 2007).
Grande parte dos microrganismos produtores de cido succnico foi isolada do
rumem bovino, porque nesse ecossistema o succinato usado como um importante
precursor para o propionato, que absorvido atravs da parede do rumem e oxidado
fornecendo energia e precursores biossntticos para esses animais (ZEIKUS et al., 1999).
Dentre os microrganismos com grande habilidade para produzir cido succnico, a
Anaerobiospirillum succiniproducen sps; Mannheimia succiniciproducens; Actinobacillus
succinogenes e a Escherichia coli, so os trs mais indicados, de acordo com
concentrao final de produto e valores de rendimentos alcanados de acordo com as
estratgias adotadas para cada caso. A bactria Anaerobiospirillum succiniproducens
estritamente anaerbica e gram negativa (ZEIKUS et al., 1999), podendo ser considerada
uma das mais eficientes, possuindo rendimento e produtividade de 88% e 1,8.g/L.h,
respectivamente, quando a concentrao inicial de glicose utilizada foi de 40.g/L (LEE et
al.,2003 (b)).

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A bactria Mannheimia succiniciproducens, mesoflica, capnoflica, gram negativa e


anaerbica facultativa, foi isolada recentemente do rumem bovino, podendo utilizar glicose
e xilose como fontes de carbono, geralmente de hidrolisados (LEE et al., 2002). Em
processos fermentativos, estudos usando hidrolisado de madeira como substrato,
resultaram em um fator de rendimento e produtividade igual a 63% e 1,19.g/L.h,
respectivamente (KIM et al., 2004).
Entretanto, muitos estudiosos sugerem que a linhagem Actinobacillus succinogenes,
bactria obtida do rumem bovino, osmotolerante e anaerbica facultativa, pode produzir
succinato com uma concentrao em torno de 100 g/L, assim como acetato, formato,
lactato e etanol, dependendo dos nveis de nutrientes adotados para a conduo do
processo. Uma caracterstica interessante desse microrganismo ser osmoflica moderada
e possuir alta tolerncia ao sal succinato, que crucial para o processo de recuperao do
produto (GUETLER et al., 1996; MCKINLAY et al., 2007).
Assim como a M. succiniciproducens, a A. succinogenes membro da famlia dos
Pasteurellaceae, e um total de 2115 genes foram identificados, dos quais 1768 possuem
uma funo predita. Desse total, somente 404 genes foram mapeados pelo banco de
dados KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), o que significa que muitos
estudos ainda precisam ser realizados para a compreenso bioqumica deste
microrganismo, de forma integral (MARKOWITZ et al., 2008). Por serem capnoflicos,
precisam incorporar gs carbnico como fonte auxiliar de carbonos, para um crescimento
celular adequado e atingir melhores rendimentos em cido succnico (VAN DER WERF et
al., 1997).
Por possuir um tempo pequeno para a duplicao celular e estar presente em
abundncia na natureza, a E. coli a bactria mais usada como referncia, em biologia
molecular. Porm, as linhagens selvagens de E. coli no produzem cido succnico como
produto principal, sendo necessrio desenvolver algumas manipulaes genticas
(JANTAMA et al., 2008; NEIDHARDT et al., 1996 e VEMURI et al., 2002).
Muitos esforos tm sido desenvolvidos na tentativa de obter altas concentraes
de cido succnico, a partir de E. coli (CHATTERJEE et al., 2001; GOKARN et al., 1997 e
GOKARN et al., 2001; HONG & LEE, 2001; VEMURI et al., 2002). Para aumentar a
produo, alcanando valores como 58.3 g/L de cido succnico, vrias estratgias j
foram executadas, como a incorporao de betana (aminocido N-metilado) no meio,
criando uma proteo natural para a clula. Valores elevados de concentrao, rendimento
e de produtividades iguais a 86.5 g/l, 0.83 g/g, e 0.9 g/L.h (JANTAMA et al., 2008),
respectivamente, j foram registrados na literatura e, mesmo assim ainda est distante do
valor timo para esta clula. Como subprodutos principais foram detectados a presena de

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piruvato, malato e acetato, sinalizando para uma possvel deficincia no potencial redox
desta linhagem.
Tcnicas de modificao gentica tm sido empregadas de forma recorrente para a
transformao de vrias linhagens, com a formao de vetores entre espcies prximas,
como Actinobacillus, Haemophilus, e Pasteurella visando elevar os valores de eficincia do
processo (BROGAN et al., 1996; FREY, 1992).
Raros estudos envolvendo o uso de fungos na produo de cido succnico foram
descritos, at a presente data. No entando, Fusarium spp., Aspergillus spp., e Penicillium
simplicissimum so fungos filamentosos conhecidos por produzirem cido succnico sob
condies aerbicas e anaerbicas (MAGNUSON et al., 2004).
Estudos envolvendo Saccharomyces cerevisiae vm apresentando um avano no
processo de produo de cido succnico, com o objetivo de minimizar os custos de
purificao e acidificao, etapas posteriores fermentao. No entanto, esta linhagem
no acumula succinato naturalmente, necessitando de alteraes genticas sobre seu
metabolismo, para utilizao de diversas fontes de substratos (OTERO, 2009).
CAMARASA & GRIVET (2003) investigaram o uso do vinho de arroz na produo
de cido succnico, em fermentao sob condies anaerbicas, por Saccharomyces
cerevisiae aps modificaes genticas, elevando os valores de rendimento em produto.
Um efeito combinado entre fungo e bactria (Rhizophus sp. Enterococcus faecalis)
atravs de um processo desenvolvido em duas etapas, apresentou um alto valor de
produtividade e rendimento (2.2 g/l/h e 0.95 g/g), durante estudos descritos por MOON et
al. (2003). Na primeira etapa, o fungo produz fumarato, que transferido para um segundo
reator, onde E. faecalis sintetiza o cido succnico.
Os substratos que podem ser utilizados para produo de cido succnico por esses
microrganismos so variados. A principal fonte de carbono geralmente a glicose, no
entanto, outros acares como celobiose, frutose, lactose, maltose, manitol, manose,
sacarose, D-xilose e salicina podem ser utilizadas por alguns microrganismos especficos,
como a A. succinogenes (GARRITY et al., 2004; GUETTLER, et al., 1999), permitindo a
fermentao de muitas fontes de carbono baratas, como melao de cana, soro e
hidrolisado de trigo (DU et al, 2008; WAN et al., 2008 e LIU et al., 2008).

J A.

succiniciproducens pode produzir succinato, acetato, formato, etanol e lactato a partir de


glicose e lactose (ZEIKUS et al., 1999).
As fontes de nitrognio mais utilizadas so o extrato de levedura e polipeptona.
Porm, resultados considerveis foram obtidos com milhocina, que constitui uma fonte de
nitrognio mais econmica em comparao com aos anteriores (LEE et al., 2003b).
Fatores fisiolgicos e nutricionais como concentrao inicial de acar, fontes de

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nitrognio, tamanho do inculo, concentrao dos ons carbonatos, pH e temperatura do


meio de crescimento so reportados como os fatores mais crticos que afetam tanto o
crescimento celular como a produo de cido succnico (AGARWAL, et al., 2007; LEE et
al., 1999 a, b).

2.4.9.1. Metabolismo na produo de cido succnico


Toda bactria produtora de cido succnico, durante a fermentao, forma uma
mistura de cidos, produzindo quantidades variadas do produto de interesse e de outros
sub-produtos (MCKINLAY et al., 2007). A fisiologia das bactrias que possuem habilidade
para produzir cido succnico varia de forma significativa. DATTA et al. (1992), reportam
que a bactria A. succiniciproducens apresenta mudanas morfolgicas durante seu
crescimento, afetando o rendimento de produo de cido succnico, dependendo da
concentrao inicial de glicose (NGHIEM et al., 1999; DATTA & GLASSNER, 1992)
A fermentao para obteno de cido succnico com E. coli pode ser atravs de
processo anaerbico ou de fase dupla, que consiste no crescimento aerbio seguido por
uma fase de produo anaerbica. Na fase anaerbica o fosfoenolpiruvato (PEP) e o
piruvato so convertidos at formato, lactato e etanol, conforme mostra a Figura 2.15
(VEMURI et al., 2002). As enzimas PEP carboxiquinase e PEP carboxilase atuam na
carboxilao do PEP para produzir oxaloacetato (MILARD et al., 1996). J as bactrias A.
succinogenes e A. succiniciproducens utilizam exclusivamente a via PEP carboxiquinase,
onde a A..succinogenes utiliza quatro enzimas-chaves (PEP carboxiquinase, malato
desidrogenase, fumarase e fumarato desidrogenase). A via PEP carboxiquinase regulada
pelo nvel de CO2. Nas bactrias que utilizam esta via (A. succiniciproducens e A.
succinogenes) a PEP carboxiquinase atua catabolicamente para fixar CO2, juntamente com
ADP, e sintetizar oxaloacetato e ATP a partir do PEP. A concentrao de CO2 regula os
nveis das principais enzimas da via PEP carboxiquinase, atuando como um aceptor de
eltrons e alterando o fluxo do PEP, metabolizando piruvato e lactato/etanol em baixos
nveis de CO2, produzindo succinato em altos nveis de CO2, conforme mostra a Figura
2.16 (KIM et al., 2004; GUETLER et al., 1996).

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Figura 2.15. Via bioqumica para sntese de succinato, por E. coli, em presena de glicose
como fonte de carbono (VEMURI et al., 2002)

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Figura 2.16. Metabolismo de A. succiniciproducens e A. succinogenes. (ZEIKUS et al., 1999).

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2.5. Processos de recuperao e purificao de cidos orgnicos


O impacto econmico dos produtos provenientes da fermentao ainda limitado,
em grande parte devido dificuldade de recuperao do produto. Para que os cidos
provenientes da fermentao sejam utilizados na indstria, melhoras substanciais nas
tecnologias de separao so necessrias. Alguns processos industriais requerem o cido
succnico livre, dessa forma torna-se necessrio remover todas as impurezas geradas na
produo (clulas, protenas, sais e subprodutos).
Existe na literatura uma srie de rotas para o processo de separao e
purificao de cidos orgnicos, sendo necessria uma avaliao minuciosa, mediante a
anlise de diversos fatores, como custo-benefcio e nveis de toxidez, durante a escolha do
processo que melhor se adequaria na etapa de dowstream, respeitando as condies do
processo. O mtodo tradicional de separao de cidos orgnicos obtidos por fermentao
a precipitao com hidrxido de clcio, a qual apresenta um grande consumo de
reagente e gera uma significativa quantidade de resduo slido, respondendo por cerca de
60-70% do custo do produto final (BANIEL & EYAL, 1995).
Portanto, a tcnica alternativa mais estudada a extrao lquido-lquido (ELL)
reativa, onde utilizada normalmente uma amina como extrato (HESTEKIN et al., 2002). O
sucesso de um processo de extrao lquido-lquido depende muito da escolha do
extratante mais conveniente, como por exemplo, alguns organofosforados, aminas
alifticas, solventes compostos e solventes simples com a adio de sais.

(LINTOMEN,

1999). Os dados apresentados e avaliados no trabalho de LINTOMEN (1999) demonstram


a utilizao de extratantes simples, como alcois, com a adio de sais, os quais abrem
novas possibilidades na recuperao de cidos orgnicos provenientes de diferentes
solues, incluindo caldos de fermentao, efluentes lquidos, etc.
Ainda que a extrao, lquido-lquido, seja uma tcnica de eficcia comprovada para
a separao de metais, com inmeras aplicaes industriais, os processos baseados
nessa tcnica normalmente consomem grandes quantidades de reagentes. Alm disto no
caso especfico da recuperao de compostos oriundos de fermentao, a toxidez dos
componentes da fase orgnica (diluente e extratante) para as bactrias constitui um
problema crtico (PAYNE & SMITH, 1983).
H ainda, os processos de separao por membranas (Figura 2.17), que agem
como uma barreira seletiva para separao, total ou parcial de espcies qumicas
presentes em uma mistura, lquida ou gasosa, da qual se pretende obter um produto isento
ou deficiente em determinados componentes e outro concentrado em tais componentes,
utilizando para este fim uma fora motriz ou diferena de potencial eltrico (eletrodilise)
apropriada (HABERT et al., 1997)
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Figura 2.17. Transporte de diferentes espcies atravs de uma membrana (HABERT et al.,
1997).

Em funo da natureza da fora motriz os processos so divididos em trs


categorias: Processos cuja fora motriz o gradiente de presso (Microfiltrao-MF,
Ultrafiltrao-UF, Nanofiltrao-NF e Osmose Inversa - OI); Processos cuja fora motriz o
gradiente de concentrao (Pervaporao, Permeao de gases, Dilise); Processos cuja
fora motriz o gradiente de potencial eltrico (Eletrodilise) (MULDER, 1991).
2.5.1. Processos de separao e recuperao de cido succnico
O processo de separao permanece como um dos assuntos mais discutidos,
quando a produo microbiana de cido succnico avaliada. Para uma efetiva aplicao
industrial, conforme mostra a Tabela 2.8, a escolha do processo depende da escalabilidade
(limites fsicos questo do desempenho), robustez, rendimento de separao global e
principalmente dos custos envolvidos (KURZROCK et al., 2010 e SONG & LEE, 2007).

Tabela 2.9. Parmetros para aplicao de processos de separao

Mtodos

Escalabilidade Robustez

Rendimento
(separao)

Custo

Ultrafiltrao

Precipitao

Eletrodilise

+/

Extrao lquido-lquido

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Entre os cidos orgnicos, o cido succnico um dos mais facilmente extrados


para a fase orgnica, devido a sua baixa polaridade, pois dicarboxlico, enquanto outros
cidos so, por exemplo, monocarboxlicos. Quanto menor a polaridade, menores so as
interaes com a gua e mais livre se encontra o cido para ser extrado pela fase
orgnica. cidos, em geral, mais polares apresentam uma forte ligao com a gua,
tornando-se ento menos extraveis pela fase orgnica. As interaes com a gua so do
tipo ligaes de hidrognio que ocorrem entre grupos carboxilas e hidroxilas do cido com
as molculas de gua (LINTOMEN et al., 1990).
Para reduzir o efeito inibitrio sobre o crescimento celular e incrementar os
parmetros produtivos, vrios sistemas de extrao de cidos, integrados ao processo
fermentativo, tm sido propostos (HATANAKA et al., 1988; ZHONG et al., 1993;
QUESADA-CHANTO et al., 1994; NAKANO et al., 1995; OZADALI et al., 1996; DA COSTA
et al., 1999; GU et al., 1998; WDZKI et al., 2000; MIYANO et al., 2000). Segundo
Kurzrock & Botz (2009), novas tecnologias incluem a participao simultnea de processos
de microfiltrao, eletrodilise, precipitao, acidificao, destilao e cristalizao (Figura
2.18) ou acidificao, troca inica e cristalizao, processos menos poluentes e de mais
altos rendimentos na recuperao do produto.

Figura 2.18. Processo de separao e purificao de cido succnico. MF/EBM: integrao


entre Microfiltrao e Membranas bipolares de eletrodilise.

Porm, este processo feito com a adio de Ca.(OH)2 no caldo de fermentao,


que alm de apresentar custo elevado hostil ao meio ambiente (INCI & USLU, 2005). O
slido filtrado e tratado com H2SO4, para a precipitao preferencial do CaSO4 (gesso). O
cido orgnico livre tambm pode ser purificado (carbono ativado, troca inica, etc.) e
concentrado por evaporao.

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DA COSTA et al. (1999) empregaram um mdulo de eletrodilise desenvolvido pela


GKSS Forschungezentrum Geesthacht GmbH, Institut fr Chemie, de Geesthacht,
Alemanha, integrado ao processo fermentativo, e observaram um incremento na
produtividade em cido orgnico e de produtividade em clulas. A tcnica da eletrodilise
(ED), Figura 2.19, um processo de separao de ons pelo efeito de um campo eltrico
utilizando membranas ons-seletivas, as quais so permeveis a determinados ons e
impermeveis a outros. So capazes de separar ctions ou nions presentes em uma
soluo aquosa.

Figura 2.19. Esquema de funcionamento de membranas bipolares de eletrodilise, PCCell

O processo de separao e purificao do cido succnico, durante a etapa de


Downstream, no fazem parte do foco de estudo no presente trabalho (Figura 2.20).
Maiores detalhes a respeito podem ser encontrados nos estudos de Davison et al. 2004;
HUH et al. (2006), LIN et al. (2009) e KURZROCK & WEUSTER (2010).

Preparo do meio

Esterilizao

Inculo

Objetivo Geral
Separao

Purificao

Fermentao

Cristalizao

Produto

Figura 2.20. Diagrama de blocos da produo de cidos orgnicos por fermentao.

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Pode-se concluir que, apesar das vantagens que os processos biotecnolgicos


apresentam, um dos principais problemas deste tipo de processo est relacionado alta
diluio do produto em soluo aquosa, aumentando o custo do processo de purificao e
separao, tornando-o o fator economicamente limitante do processo.
Neste contexto, a principal tarefa da bioengenharia em cooperao com a biologia
molecular superar este problema, no atravs da construo de novos biorreatores, mas
atravs do desenvolvimento de processos economicamente sustentveis (GERBSH &
BUCHHOLZ, 1995). Estudos visando otimizao do processo e a reduo de custos,
vm sendo cada vez mais recorrentes entre a comunidade cientfica. Por exemplo, vrios
modelos cinticos no estruturados foram propostos para descrever o processo
fermentativo para sntese de outros cidos actico, ltico e glutmico (AKERBERG et al.,
1998; KHAN et al., 2005).
Porm, ainda no h registros de estudos visando desenvolver modelos que
representem a sntese de cido succnico a partir da fermentao da cana-de acar,
mediante a converso direta de glicose em produto com formao de intermedirios.

2.6. Modelagem e Simulao de Processos


Uma importante aplicao dos modelos matemticos para testar ou validar
hipteses. Pela anlise de discrepncia entre os modelos e pelo sistema que eles
representam possvel estend-los para outras aplicaes ou desenvolver um novo
modelo, seguido de validao atravs do uso de dados do sistema, obtidos por
planejamento de experimentos ou a partir de medidas prvias do comportamento do
sistema (THAYSEN, 2005).
Segundo Secchi (1995) para o desenvolvimento da modelagem de um processo
deve-se considerar:
- Descrio do processo e definio do problema: talvez a parte mais importante
para anlise de um processo, seja o conhecimento dos fenmenos que o envolvem e o que
se deseja conhecer de suas causas e efeitos, ainda que no seja possvel estabelecer
regras para a definio do problema;
- Teoria e aplicao das leis fundamentais: definio da teoria que governa os seus
fenmenos. Esta teoria est geralmente disponvel em uma variedade de fontes publicadas
ou no. Para casos isolados, onde no existe teoria disponvel, interessante postular uma
ou vrias e posteriormente testar sua validade atravs da comparao da soluo do
modelo matemtico com resultados experimentais;

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- Equacionamento: escrever a teoria em simbologia matemtica; Consideraes do


modelo;
- Consistncia: verificar se o nmero de equaes igual ao nmero de variveis a
determinar (graus de liberdade igual a zero), isto muito importante em sistemas
complexos e grandes;
- Soluo desejada: uma considerao das solues requeridas do modelo um
processo necessrio antes de suas obtenes propriamente ditas;
- Matemtica e computao: a natureza das equaes do modelo que determina o
mtodo para a obteno da soluo a ser selecionada, seja ele analtico, numrico ou por
inspeo;
- Soluo e validao: verificar as solues obtidas do modelo matemtico, atravs
de comparaes com dados experimentais ou julgamentos de engenharia.
Segundo SCHMIDELL & BONOMI (2001), para a modelagem de um processo
microbiano, deve-se analisar, tambm, os principais fenmenos que caracterizam as
interaes: populao microbiana meio ambiente tipo de processo fermentativo, de
acordo com os fatores: influncia da histria da populao microbiana no processo (fase
lag e de adaptao, mutaes, perda de viabilidade entre outros); influncia da composio
do meio de cultivo nas velocidades de crescimento ou de produo da populao
microbiana; consumo de substrato para crescimento e tambm, na maioria dos casos, para
manuteno da viabilidade celular; gerao de produtos associados ou no ao crescimento
celular; transferncia de substrato do meio para o interior das clulas e de produtos da
clula para o meio; velocidade de respirao em processos aerbios; tipo de processo;
influncia das variveis fisico-qumicas no processo; influncia das variaes na sntese
dos componentes celulares; homogeneidade ou heterogeneidade do processo; influncia
das condies operacionais na morfologia da populao microbiana.

2.6.1. Modelagem de Processos Biotecnolgicos

Para se realizar o design de um processo biotecnolgico necessrio saber a taxa


com que ocorrem mudanas nas concentraes, por exemplo, de clulas, substrato e
produto. Os dados da cintica microbiana de crescimento, distribuio da populao de
clulas, sntese de produto e consumo de substrato so de grande importncia na
produo, controle e otimizao do processo (ASENJO & MERCHUK, 1994). importante
saber tambm como o ambiente reacional afeta a cintica. Em alguns casos o uso de

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modelos simplificados suficiente para o design do sistema. Contudo, em outros pode ser
vantajoso o uso de modelos mais sofisticados (LUNELLI & MACIEL, 2007)..
Dependendo do uso, da aplicao e da complexidade da situao fsica, os modelos
que representam o crescimento celular podem variar bastante. Esta variao engloba os
modelos bem simples e os mais sofisticados. A Figura 2.21 mostra alguns parmetros,
fenmenos e interaes que influenciam o comportamento cintico da populao de
clulas.
Meio
Multicomponentes

Populao microbiana
Nutrientes

Componentes mltiplos

Substrato
Reaes em soluo

Heterogeneidade entre individuos


Produtos

Equlibrio cido base,

Reaes mtiplas

pH, T, ...variveis

Controle interno

Propriedades reolgicas

Calor

Fases multiplas

Adaptabilidade
Probabilidade

(G-L, S-L, G-S...)

Interaes

Heterogeneidade espacial

Mecnicas

Degenerecncia

Figura 2.21. Resumo de alguns parmetros, fenmenos e interaes que determinam a


cintica da populao de clulas (BAYLEY & OLLIS, 1986).

A utilizao de modelos cinticos simplificados necessria para tornar prtica uma


representao matemtica da cintica. quase impossvel tentar formular um modelo que
inclua todos os detalhes mostrados na Figura 2.21. Assim, algumas simplificaes so
realizadas. Uma das mais utilizadas a que considera um nico substrato limitante sendo
o restante em excesso de modo que seja considerada somente a concentrao deste
substrato. Se necessrio pode-se incluir outro componente do meio como um inibidor.
Tambm o uso de controles externos no biorreator pode regular e manter constantes
algumas variveis do meio como pH, temperatura e concentrao de O2 dissolvido
(BAYLEY e OLLIS, 1986). Por outro lado, pode se tornar necessria, em alguns casos, a
incluso de variveis mltiplas no modelo de modo a se obter uma melhor
representatividade do comportamento cintico(LUNELLI & MACIEL, 2007)..
ROELS & KOSSEN (1978) apresentam uma perspectiva sobre os vrios tipos de
modelos usados em processos microbianos, os quais esto relacionados na Tabela 2.12.
Pode-se perceber a variedade de modelos que podem ser usados para a representao
matemtica de processos fermentativos (biotecnolgicos).

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Tabela 2.10. Tipos de modelos usados em processos microbianos


MODELOS
Determinstico
Estocstico
Estruturado
No estruturado
Distribudo
Segregado
Descritivo
Preditivo
Caixa preta
Caixa cinzenta
Contnuo
Discreto
Parmetros concentrados
Parmetros distribudos

Em relao aos modelos estruturados e no estruturados FREDRICKSON (1970


apud BAILEY, 1998), introduziu uma classificao para representar matematicamente a
populao celular, utilizando estes dois termos (estruturado e no estruturado), alm da
introduo dos termos, segregado e no segregado. Esta classificao proposta por
Fredrickson pode ser visualizada na Figura 2.22, que mostra a introduo do termo
segregado para indicar de forma explcita a presena de indivduos heterogneos em uma
populao celular, e o termo estruturado para designar a formulao, onde o material
celular composto de mltiplos componentes qumicos.

Figura 2.22. Classificao dos modelos matemticos para representao da cintica da


populao celular ..(FREDRICKSON, 1970 apud BAILEY, 1998).

Em estudos tradicionais de processos fermentativos, metablitos extracelulares


(como substrato e produto) tm sido quantificados, bem como a concentrao de
biomassa. Os modelos que podem ser formulados baseados nestes tipos de medidas so
altamente no estruturados e sua aplicao para a interpretao da fisiologia celular e
predio do comportamento celular de diferentes condies de cultivo completamente
limitada. Os modelos no estruturados constituem uma classe de modelos sem

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preocupao da descrio da estrutura da populao a ser modelada. No caso de uma


populao microbiana, a composio ou qualidade da biomassa no levada em
considerao. Estes modelos incluem as observaes mais fundamentais dos processos
de crescimento microbiano: 1) a taxa de produo de massa celular proporcional
concentrao de biomassa; 2) existe um limite de saturao para a taxa de crescimento ,
para cada substrato; 3) as clulas necessitam de substrato e podem sintetizar produtos,
mesmo quando cessam o crescimento (MONTESINOS et al., 1995). Este tipo de modelo
no reconhece nenhuma estrutura interna da clula, tambm no difere entre as formas
celulares, as quais so evidentes em culturas celulares, animal e vegetal.
Modelos no estruturados so geralmente mais tratveis do ponto de vista
matemtico e mais facilmente verificveis experimentalmente. De certa forma, estes
modelos so mais preferveis onde sua preciso e descrio do sistema sejam adequadas
a uma determinada aplicao. A equao de Monod, para o crescimento de microrganismo
limitado pelo substrato, um exemplo de um modelo no estruturado bem sucedido. Em
geral, modelos no estruturados podem ser considerados como uma boa preciso em dois
casos: quando a composio dos organismos no relevante ao aspecto do sistema, ou
quando

ela

independente

do

tempo,

isto

em

crescimento

balanceado

(FREDRICKSON, 1970 apud BAILEY, 1998). Quando a composio celular e/ou a


morfologia da cultura celular so importantes e as variveis fortemente dependentes do
tempo, a soluo o uso de modelos estruturados que incluem os principais aspectos da
estrutura e da fisiologia microbiana para a descrio matemtica do metabolismo dos
microrganismos (NIELSEN & VILLADSEN, 1992).
Seguindo os avanos das tcnicas analticas, medidas das concentraes de
metablitos intracelulares e as atividades de enzimas intracelulares tm possibilitado a
formulao de modelos mais estruturados, que tem aumentado a possibilidade para
interpretao e predio da fisiologia celular (GOMBERT & NIELSEN, 2000).
De acordo com Harder & Roels (1982) a importncia de se construir modelos
estruturados, reside no fato de que estes se tornam mais significantes, exatamente onde
os modelos no estruturados apresentam falhas, como por exemplo, Monod. Isto se aplica,
particularmente, para culturas em batelada, batelada alimentada ou contnua.
Apesar da complexidade dos fenmenos envolvidos, o mais importante que o
modelo estruturado seja to simples quanto possvel. Os modelos estruturados contm
uma grande quantidade de parmetros que tornam complicada sua manipulao com
vistas aplicao na biotecnologia (FREDRICKSON, 1976).

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2.6.2. Modelos cinticos de crescimento microbiano


O modelo cintico de crescimento microbiano mais utilizado apresentado na
Equao 2.3, denominado Monod. muito semelhante ao modelo de cintica enzimtica
Michaelis-Menten. Este modelo vlido se somente um substrato limitante estando os
outros em excesso.
(Equao 2.1)

(Equao 2.2)

onde,

SCHMIDELL et al. (2001) mostram um resumo de modelos no estruturados com


crescimento balanceado que so apresentados na Tabela 2.11. Estes modelos no
estruturados

no

devem

ser

utilizados

quando

composio

celular

mudar

significativamente no processo, afetando assim a cintica. Para estes casos devem ser
utilizados modelos estruturados disponveis em literatura especializada.
BAILEY & OLIS (1986) descreveram alguns estudos de casos onde o modelo de
Monod sofreu algumas modificaes, devido necessidade de se ampliar ou incluir
modificaes nos termos cinticos, para levar em conta o metabolismo endgeno,
manuteno celular, ou sugerir taxas especficas de crescimento que levam em conta
diferentes dependncias da cintica de crescimento, como os modelos de Tessier, Moser e
Contois. As duas primeiras equaes resultam equaes algbricas com solues mais
complicadas que a forma de Monod.
A equao de Contois, por exemplo, contm uma constante aparente proporcional
concentrao de biomassa X. Outros modelos para a taxa especfica de crescimento foram
propostos de acordo com casos particulares que forneceram bom ajuste a dados
experimentais. Segundo o modelo proposto por Andrews, a taxa especfica de crescimento
pode ser inibida pelos constituintes do meio tal como substrato e produto.
Existem tambm os modelos de formao de produto. A formao de produto pode
ser classificada em diferentes grupos (ASENJO & MERCHUK, 1994):
a. Produto principal resultado direto do metabolismo energtico.
b. Produto principal resultado indireto do metabolismo energtico.
c. Produto principal um metablico secundrio.
d. Produto principal uma protena intra ou extracelular.

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Tabela 2.11. Modelos cinticos no estruturados descritos para a representao de


diversos fenmenos identificados em processo fermentativos.
Referncia

Modelo cintico

Crescimento com um nico substrato limitante


MONOD

MOISER

CONTOIS
SINCLAIR; KRISTIANSEN
Crescimento com um nico substrato limitante e inibidor

ANDREWS

WU

DUNNET

MEGEE

TSAO; HANSON

PIRT

ZENG; DECKWER
Onde:
X: taxa especfica de crescimento.
d: taxa especfica de morte celular.
s: taxa especfica de consumo de substrato (pode ser representado por qs)
S, S1, S2 e S3: concentraes de substratos limitantes.
S*:concentrao de S para manter X.
X:concentrao celular.
Yx/s:fator de converso de substrato em clulas.
ms:coeficiente de manuteno energtica.Os demais so parmetros cinticos.

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Metablito primrio: produzido durante a fase de crescimento exponencial do


microrganismo. Um exemplo tpico deste tipo de metablito a produo de lcool. O
etanol um produto do metabolismo anaerbico de leveduras e algumas bactrias, sendo
formado como parte do metabolismo energtico. Uma vez que o crescimento s pode
ocorrer se houver produo de energia, a produo de etanol est associada ao
crescimento. Outros exemplos englobam a produo de aminocidos, nucleotdeos, cidos
orgnicos e enzimas.
Metablito secundrio: produzido durante a fase estacionria de crescimento ou
idiofase, ou seja, com produo no associada ao crescimento celular. Constituem o
grupo mais comum e importante dos metablitos de interesse industrial. Como exemplo
clssico, podemos citar a produo de antibiticos.
Segundo BAYLEY & OLLIS (1986), Gaden simplificou os grupos acima e classificou a
relao entre produo e crescimento celular em:
Tipo 1. Modelo de produo associada ao crescimento: o substrato convertido a um

produto nico, que se forma concomitantemente com o crescimento celular. Logo, a


formao de produto proporcional ao crescimento. A fermentao alcolica um
exemplo desta classe.
(Equao 2.3)
Tipo 2. Modelo de produo parcialmente associada ao crescimento: a taxa de
formao de produto depende tanto da taxa de crescimento como da concentrao celular.
Portanto, esta expresso, envolvendo dois termos cinticos, freqentemente chamados de
cintica Leudeking-Piret, bastante til no ajuste de dados para a formao de produtos de
diferentes fermentaes, como por exemplo, na produo de cido actico por
Lactobacillus delbrueckii.
(Equao 2.4)
Tipo 3. Modelo de produo no associada ao crescimento: a taxa de formao de
produto s dependente da concentrao celular. Como exemplo, a fermentao da

penicilina exibe tal comportamento.


(Equao 2.5)

A Figura 2.23 apresenta o comportamento de cada modelo descrito. Outros modelos,


que associam a formao de produto ao crescimento celular, podem ser visto na Tabela
2.12.

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Figura 2.23. Padres cinticos de crescimento celular e formao de produtos.

Tabela 2.12. Modelos com a formao de produto metablico inibitrio

Referncia

Modelo cintico

AIBA; SHODA

AIBA

GHOSE; TYAGI

LEVENSPEIL

LEE

TOSETTO

Onde:
X: taxa especfica de crescimento.
p: taxa especfica de produo (tambm pode ser representado por qp).
S: concentrao de substrato limitante.
P: concentrao de produto.
Os demais so parmetros cinticos.
Fonte: Adaptado de SCHMIDELL et al. (2001)

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65

2.6.3. Mtodos matemticos utilizados para a resoluo dos modelos


2.6.3.1. Mtodo dos resduos ponderados
Este mtodo pode ser aplicado para resolver equaes integrais diferenciais. Nesse
mtodo, a funo de densidade de populao aproximada por uma combinao linear de
funes de base. Os pesos do mtodo so determinados pela substituio da equao
total do mtodo no balano de populao para definir um resduo (RAWLINGS et al.,
1993).

2.6.3.2. Mtodo de Colocao Ortogonal


As variveis envolvidas so expandidas em termos de uma funo tentativa
polinomial e as equaes diferenciais parciais (EDP) so satisfeitas nos pontos discretos
ou pontos de colocao, os quais resultaro num conjunto de equaes diferenciais
ordinrias (EDO). Estas EDOs so expressas, normalmente, em termos do valor da
soluo nos pontos de colocao e, a colocao ortogonal pode ser feita em uma das duas
ou em ambas as direes espaciais do modelo matemtico (VASCO DE TOLEDO, 1999)

2.6.3.3. Mtodo das Linhas


O mtodo das linhas consiste na discretizao parcial de uma equao diferencial
parcial, na qual todas as coordenadas menos uma so discretizadas. A coordenada que
no discretizada deve aparecer apenas como uma derivada primeira, isto , a equao
diferencial parcial de primeira ordem em relao a esta coordenada. Assim, um sistema
de equaes diferenciais ordinrias o resultado da discretizao parcial (PINTO & LAGE,
1997).
2.6.3.4. Mtodo de Runge-Kutta

O mtodo de Runge-Kutta um mtodo clssico de fcil resoluo e


suficientemente preciso para resoluo de problemas que envolvem equaes diferenciais
ordinrias. Um dos mtodos de Runge-Kutta mais usado o mtodo de quarta ordem
(LUNELLI & MACIEL, 2007). Esse mtodo envolve uma mdia ponderada dos valores de
f(t,y) tomados em diferentes pontos de intervalo de intervalo (tn t tn+1), e dado por:

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66

h
yn.1 = yn + (kn.1 +2kn.2 +2kn.3 +kn.4 )
6
yn.1 = hf (tn , yn )
1
1
yn.2 = hf (tn + h, yn + + hkn.1)
2
2
1
1
yn.3 = hf (tn + h, yn + + hkn.2 )
2
2

(Equao 2.6)

yn.4 = hf (tn + h, yn + +hkn.3 )


Devido natureza no linear da velocidade de reao, a soluo numrica
facilmente implementada em computador, podendo-se incorporar diferentes modelos
cinticos para levar em conta fenmenos de inibio pelo substrato, produto ou pela
prpria clula, ou ainda manuteno celular e morte (LUNELLI & MACIEL, 2007)..

2.6.3.5. Planejamento Experimental


O planejamento experimental vem sendo muito usado para avaliar e otimizar
processos industriais, pois uma ferramenta que busca facilitar o estudo de um sistema,
diminuindo a quantidade de experimentos necessrios para obteno de informaes
sobre o comportamento do mesmo. Segundo BOX & HUNTER (1987), o planejamento
experimental fatorial facilita a elaborao de modelos, interagindo os dados; fazendo
comparaes, buscando similaridades, diferenas e tendncias. Quando h a necessidade
de investigar um grande nmero de fatores para estabelecer aqueles mais importantes,
emprega-se um projeto que permite verificar os efeitos principais do maior nmero possvel
de fatores, com um menor nmero de observaes (RODRIGUES, 2010). Tais projetos so
chamados projetos saturados, porque toda a informao usada para estimar os efeitos
principais, no restando graus de liberdade para estimar os efeitos de interao e s
vezes, nem o erro experimental (BARROS NETO et al., 1996). Um exemplo deste tipo de
planejamento saturado o planejamento de Plackett-Burman (PB).
Os planejamentos de PB so planejamentos fatoriais fracionrios atravs dos quais
se podem estudar muitos fatores com poucos ensaios. Neste caso, os fatores
considerados so os parmetros cinticos do modelo e as respostas so as concentraes
de clulas, substrato e produto. Tais planejamentos so de dois nveis e estudam k = N-1
fatores em N ensaios (RODIGUES, 2010). Maiores detalhes sobre os planejamentos de PB
podem ser obtidos em PLACKETT & BURMAN (1946).

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67

2.7. Estratgias de fermentao para a produo de cido succnico

Na Tabela 2.13 foi elaborada uma avaliao para a produo de cido succnico,
mediante uma ampla reviso da literatura, at a presente data. Foram selecionados para a
anlise os seguintes aspectos: as linhagens mais recorrentes (A.succinogenes, A.
succiniciproducens, M.succiniciproducens, E.coli, C.glutamicum e Bacteroides fragalis), as
estratgias de fermentao (aerao, operao do processo, componentes do meio e fonte
de CO2), alm dos valores de rendimento, taxa de formao de produto, concentrao final
de produto, produtividade volumtrica e subprodutos formados (BEAUPREZ et al., 2010).
Entre os trabalhos pesquisados, h um total de 11 patentes, que foram depositadas entre
1992 e 2005. Cabe ressaltar que os resultados encontrados para a linhagem A.
succinogenes CIP 106512 foram os mais proeminentes do presente trabalho.
Nota-se que a maioria dos grupos conduziram o processo em batelada, com
resultados relativamente satisfatrios, embora os maiores valores de produtividades e
taxas de formao de produto tenham sido obtidos com os ensaios conduzidos em
batelada alimentada e processo contnuo. Todos as operaes descritas foram conduzidas
em pH neutro e apresentaram formao de outros metablitos, alm do cido succnico,
comportamento tpico de heterofermentao. A maioria dos estudos utilizou para o preparo
do meio de cultivo as seguintes matrias-primas: milhocina, hidrolisado da madeira,
hidrolisado de resduos do milho, soro e melao. Quase a tolalidade dos ensaios foram
conduzidos com glicose como fonte de carbono. No entanto, ISAR et al. (2006)
depositaram uma patente onde foi utilizada a sacarose como fonte de carbono, com E.coli
W3110 e o processo foi conduzido com batelada em duas fases (aerbica e anaerbica),
resultando em um elevado rendimento, de 1.2 g/g, uma concentrao final de cido
succnico de 24 g/L e uma produtividade volumtrica de 0,81g/L.h.
Uma produtividade volumtrica elevada, igual a 10.4 g/L.h, e uma concentrao
igual 83 g/L de cido succnico, foram obtidos durante um processo contnuo com A.
succiniciproducens, a partir de um sistema de integrao com membranas para o reciclo de
clulas, a uma taxa de diluio igual a 0,98 h1 (MEYNIAL & DOROTNY, 2008)
Em um processo conduzido com batelada alimentada e reciclo de clulas, por C.
glutamicum (OKINO et al., 2008), uma concentrao de 146 g/L de cido succnico foi
obtida. Cabe ressaltar que os autores fizeram uso de engenharia metablica para atingir os
objetivos almejados. Utilizando a bactria A succinogenes CGMCC1593, ZHENG et al.
(2009) conseguiram um rendimento de 80% em cido succnico, a partir do hidrolisado da
palha, aps destoxificao para reduo da concentrao de inibidores do crescimento
celular, alm de conduzirem o processo em batelada alimentada.

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68

Tabela 2.13. Valores encontrados e calculados para rendimento (Yp/s), produtividade volumtrica (Qp) e taxa especfica de formao de
produto (qp), a partir dos dados obtidos pela literatura, para diferentes linhagens e estratgias de fermentao.
Linhagens

Estratgia de fermentao

A. succinogenes
CIP106512
an; B; Xi, E.L, CO2, NaHCO3
CIP106512
an; B; Hbc, E.L, CO2, NaHCO3
CIP106512
an; B; Glc, E.L, CO2, NaHCO3
CIP106512
an; B; Bc(SSF), E.L, CO2, NaHCO3
FZ6
an; B; Mic, E.L, Na2CO3
130Z
an; B; Mic, E.L, Na2CO3
FZ53
an; B; Glc, Mic, E.L, MgCO3
130Z
an; B; Glc, Mic, E.L, Ac, MgCO3
an; Bs; Glc, Mic, E.L, Ac,
130Z*
130Z
an; B; Glc, Def, NaHCO3
130Z
an; B; Glc, Def, NaHCO3
130Z
an; B; Glc, E.L, CO2, NaHCO3
CGMCC1593
an; B; HM, E.L, CO2, Na2CO3
an; BA; HM, E.L, CO2, Na2CO3
CGMCC1593*
an; BA; Glc, E.L CO2, Na2CO3
CGMCC1593*
130Z
an; B; Sor, E.L, CO2
130Z
an; B; HTr, CO2, MgCO3
CGMCC1593
an; B; HMil, CO2, MgCO3
an; BA; HMil, CO2, MgCO3
CGMCC1593*
A. succiniciproducens
ATCC 29305a
an; B; Glc, Mic, CO2, Na2CO3
ATCC 53488
an; B; Glc, Mic, CO2, Na2CO3
ATCC 53488
an; B; Glc, P, E.L, CO2, Na2CO3
an; C2e; Glc, Mic , CO2, Na2CO3
ATCC 53488*
FA-10
an; B; Glc, Mi, CO2, Na2CO3

Yp/s
(g/g)

qAS
(g/g . h)d

Qp
(g/L.h)

P
(g/L)c

0.66
0.53
0.52
0.45
0.94
0.79
0.82
0.87
0.86
0.46
0.5
0.62
0.79
0.94
0.75
0.57
0.81
0.81
0.82

0.34
0.31
0.27
0.25
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
0.47
0.19
0.3
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.

1.88
1.50
1.77
1.42
1.01
1.56
1.36
0.18
0.88
0.28
0.3
1.35
0.97
1.15
1.3
0.58
1.19
0.95
1.21

42.5
40.3
41.6
38.4
63.7
2939
105.8
17.4
33.9
4.2
4.1
33.8
46.4
55.2
60.2
50
64.2
45.5
53.2

Fo,Ac
Fo,Ac
Fo,Ac
Fo,Ac
Fo, Pi, Pr, Ac
Fo, Pi, Ac
Fo, Pi, Pr, Ac
Fo, Pi, Ac
Fo, Pi, Ac
Fo, Ac, Et
Fo, Ac, Et
Fo, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac

Este trabalho
Este trabalho
Este trabalho
Este trabalho
GLASSNER et al., 1996
GLASSHER et al., 1998
GUETLER et al., 1996
URBANCE et al., 2003
URBANCE et al., 2004
MCKINLAY et al., 2005
MCKINLAY et al., 2007
CORONA et al., 2008
LIU et al., 2008
LIU et al., 2008
LIU& ZHENG,2008
WAN et al., 2009
DU et al., 2008
ZHENG et al., 2009
ZHENG et al., 2009

15.9
43.5
33.2
39.1
34.1

Fo, Ac, Et, La


Fo, Ac
Fo, La, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac, Pi

SAMUELOV et al., 1991


SONG & LEE, 2006
DATTA et al., 1992
DATTA & JAIN, 1992
GUETLER & JAIN, 1994

0.79
0.91
0.88
0.85
0.66

N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.

0.79
1.93
0.87
2.03
0.77

___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________

Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ

Elcio Ribeiro Borges, 2011

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Subprodutosb

Referncias

69

Linhagens

Estratgia de fermentao

FA-10
an; B; Glc, E.L, P, CO2, Na2CO3
ATCC 53488
an; B; Glc, E.L, P, CO2, Na2CO3
ATCC 53488
an; B; Glc, E.L, P, CO2/H2,
ATCC 53488
an; B; Sor, Mic, CO2, Na2CO3
an; BA; Sor, Mic, CO2, Na2CO3
ATCC 53488*
an; C; Sor, Mic, CO2, Na2CO3
ATCC 53488
ATCC 53488
an; B; Glc/Gl, P, E.L, CO2,
ATCC 53488
an; B; HM, Mic, CO2, Na2CO3
an; Cm; Glc, P, E.L, CO2,
ATCC 53488*
an; Cm; Glc, P, E.L, CO2,
ATCC 53488*
ATCC 53488
an; B; Gal, P, E.L, CO2, Na2CO3
ATCC 53488
an; B; Gal/Glc, P, E.L, CO2,
M. succiniciproducens
MBEL55E
an; B; Glc, P, E.L, CO2
MBEL55E
an; B; HM, Mic, E.L, CO2
MBEL55E
an; C; HM, Mic, E.L, CO2
MBEL55E
an; C; HM, Mic, E.L, CO2
MBEL55E
an; B; HM, E.L, CO2
MBEL55E
an; C; HM, E.L, CO2
MBEL55E
an; C; HM, E.L, CO2
an; BA; Glc, E.L, CO2
LPK7*
MBEL55E
an; B; Glc, E.L, CO2, NaHCO3
LPK7
an; C; Glc (9 g/l), E.L, CO2
LPK7
an; C; Glc (9 g/l), EL, CO2
LPK7
an; C; Glc (18 g/l), EL, CO2
LPK7
an; C; Glc (18 g/l), EL, CO2
LPK7
an; B; Glc, Def, CO2
E. coli
JCL1208pPC201
an; B; Glc, E.L, T, MgCO3

Yp/s
(g/g)

qAS
(g/g . h)d

Qp
(g/L.h)

P
(g/L)c

Referncias

0.7
0.99
0.86
0.84
0.91
0.64
0.97
0.88
0.88
0.71
0.87
0.87

N.D.
1.5
0.45
N.D.
N.D.
N.D.
0.29
0.37
1.1
0.51
1.32
3

0.78
1.2
1.8
N.D.
0.96
3
1.35
0.74
10.4
3.3
1.46
0.97

31.6
32.2
34.4
34.3
34.7
19.8
29.6
23.8
83
14.3
15.3
14.7

Fo, Ac
Fo, Ac
Ac
Fo, La, Ac
Fo, La, Ac
Fo, La, Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac

0.70
0.72
0.69
0.60
0.56
0.60
0.55
0.76
0.59
0.71
0.29
0.28
0.10
0.54

0.54
0.37
0.45
1.77
0.58
1.80
6.38
0.72
0.52
0.64
0.78
0.53
0.52
0.53

1.87
1.22
1.00
3.90
1.17
1.40
3.19
1.80
1.75
1.29
1.56
1.07
1.05
1.67

14
13.5
12
5
11.7
9.5
8
52.4
10.5
12.9
5.2
10.7
3.5
10.1

Fo, La, Ac
Fo, La, Ac
Fo, Ac
Fo, La, Ac
Fo, La, Ac
Fo, La, Ac
Fo, La, Ac
Pi, Ma, Ac, La
Fo, La, Ac
Pi, Ac, La
Pi, Ac, La
PI, Ac, La
PI, Ac, La
Fo, La, Ac

LEE & HONG, 2002


LEE & CHANG, 2003
LEE & CHANG, 2003
LEE & CHANG, 2003
LEE et al., 2003
LEE et al., 2003
LEE et al., 2003
LEE & SONG, 2006
LEE et al., 2007
OH & LEE, 2008
OH & LEE, 2008
OH & LEE, 2008
OH & LEE, 2008
SONG & JANG, 2008

0.29

N.D.

0.59

10.7

Fo, Ac, Et, La

MILLARD et al., 1996

___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________

Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ

Subprodutosb

Elcio Ribeiro Borges, 2011

----

GUETLER & JAIN, 1994


NGHIEM et al., 1997
LEE et al., 1999
SAMUELOV et al., 1999
SAMUELOV et al., 1999
SAMUELOV et al., 1999
LEE et al., 2001
LEE et al., 2003
MEYNIAL et al, 2008
LEE et al., 2008
LEE & CHANG, 2008
LEE & CHANG, 2008

70

Linhagens

NZN111pMEE1
MG1655/pUC18
AFP111
JCL1242-pyc
NZN111pTrcML*
AFP400
AFP111-pyc
NZN111pTrcML
SS373
NZN111pTrcMLFu
HL27615k
HL27659k-pepc*
HL51276k-pepc
HL27659k*
SBS550MG*
E. coli
W3110GFA*
SBS110MG-pyc
TUQ19/pQZ6
TUQ2/pQZ6/pQZ5
W3110
SBS550 pHL314*
AFP184
AFP184
AFP184
NZN111*
W3110
KJ060
KJ073

Estratgia de fermentao

Yp/s
(g/g)

qAS
(g/g . h)d

Qp
(g/L.h)

P
(g/L)c

Subprodutosb

Referncias

d; B; Glc, E.L, T, CO2/H2, MgCO3


an; B; Glc, E.L T, CO2
d; B; Glc, Mi, CO2, Na2CO3
an; B; Glc, E.L, T, Na2CO3, CO2
d; BA; Glc, E.L, T, CO2/H2
an; B; Glc, EL, T, CO2, MgCO3
d; B; Glc, EL, T, CO2, Na2CO3
d; B; So, EL, T, CO2
d; B; Glc, EL, CO2, Na2CO3
d; B; Glc, EL, T, CO2/H2
ae; B; Glc, EL, T, Na2CO3
ae; BA; Glc, EL, T, NaHCO3
ae; B; Glc, EL , T, NaHCO3
ae; C; Glc, EL, T, NaHCO3
an; BA; Glc, EL,T, NaHCO3

0.64
0.42
0.54
0.15
0.47
0.61
1.10
1.10
0.73
0.35
0.45
0.62
0.71
0.59
1.06

N.D.
0.48
N.D.
0.17
N.D.
N.D.
0.13
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
0.09
0.05
0.20
0.21

0.32
0.43
0.52
0.14
0.08
0.61
1.30
0.13
0.32
0.06
0.16
0.72
0.14
0.70
0.42

12.8
4.2
51
1.5
9.4
6.1
99.2
10
11
7
5
58.3
8.3
7
40

Ac, Et
Fo, La
Ac
Fo, Ac, Et, La
Ma, Ac, Fo, La,
Fo, Ac, Et, La
Ac, Et
Ma, Ac, Et
PI
Ac, Et
PI, Ac
PI, Ac
PI, Ac
PI, Ac
Fo, Ac

STOLS & DONNELLY,1997


GOKARN et al., 1998
NGHIEM et al., 1999
GOKARN & ALTMAN, 2000
HONG &LEE, 2001
CHATTERJEE et al., 2001
VEMURI et al., 2002
HONG & LEE, 2002
CHANG & KIM, 2002
HONG & LEE, 2004
LIN & BENNETT, 2005
LIN & SAN, 2005
LIN & BENNETT, 2005
LIN et al., 2005
SANCHEZ et al., 2005

an; BA; Glc, EL, NaHCO3, CO2


an; B; Glc, EL, T, NaHCO3, CO2
d; B; Glc, EL, T, MgCO3, CO2
d; B; Glc, EL, T, MgCO3, CO2
d; B; Sac, EL, T, CO2, MgCO3
an; BA; Glc, EL, T, NaHCO3, CO2
d; B; Glc, Mic, CO2
d; B; Fru, Mic, CO2
d; B; Xi, Mic, CO2
d; BA; Glc, Ac, NaHCO3, CO2
d; B; Me, Mic, CO2, MgCO3
an; B; Glc, def, NaHCO3, CO2
an; B; Glc, def, NaHCO3, CO2

0.2
0.9
0.8
0.8
1.2
1.1
0.8
0.7
0.5
0.7
0.52
0.9
0.8

N.D.
N.D.
N.D.
1.2
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
0.2
N.D.
N.D.
N.D.

0.03
0.65
0.79
0.59
0.81
0.42
1.27
1.01
0.78
0.70
0.87
0.90
0.82

2.1
16
13
12
24
40
38
30
23
28
26
87
79

Fo, Ac, Et, La


Fo, Ac
Ac, Et, La
Ac, Et, La
N.D.
Fo, Ac
PI
PI
PI
PI, Ac
N.D.
Ma, Ac, La
Ma, Ac, PI

LEE & KIM, 2005


SANCHEZ et al., 2005
WANG & CHEN, 2006
WANG & WU, 2006
ISAR et al., 2006
KA-YIU et al., 2005
ANDERSSON et al., 2007
ANDERSSON et al., 2007
ANDERSSON et al., 2007
WU & ZHOU, 2007
AGARWAL et al., 2007
JANTAMA et al., 2008
JANTAMA & HAUPT, 2008

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Linhagens

Estratgia de fermentao

Yp/s
(g/g)

qAS
(g/g . h)d

Qp
(g/L.h)

P
(g/L)c

Subprodutosb

Referncias

KJ060
an; B; Glc, def, NaHCO3, CO2
1.1
N.D.
0.61
73
Ma, Ac, La, PI
JANTAMA & HAUPT, 2008
KJ122
an; B; Glc, def, NaHCO3, CO2
0.9
0.4
0.88
83
Ma, Ac, PI
JANTAMA & ZHANG, 2008
C. glutamicum*
ae; BArc; Glc, EL, Cas, NaHCO3 0.19 0.13
R*
3.8
23
Ac, La
OKINO et al., 2005
R ldhA-pCRA717* ae; BArc; Glc, EL, Cas, NaHCO3 0.92 0.06
3.17
146
Ac, Ma, La, PI
OKINO et al., 2008
Bacteroides fragalis
MTCC1045
an; B; Glc, EL, P, Na2CO3, CO2
0.62 N.D.
0.42
12.5 N.D.
ISAR & AGARWAL, 2006
MTCC1045
an; B; Glc, EL, P, Na2CO3, CO2
0.57 N.D.
0.83
20
N.D.
ISAR & AGARWAL, 2007
Estratgia de fermentao: an: anaerbico, ae: aerbico, d: duas fases; ae: microaerbico; B: batelada, Bs: batelada sequencial
(repetida); BA: batelada alimentada, BArc: batelada alimentada com reciclo de clulas, C: cultivo contnuo, C2e: sistema contnuo em dois
estgios (2 taxas de diluio diferentes), Cm: cultivo contnuo integrado com sitema de membranas para reciclo de clulas.
Meio de cultivo: Xi: xilose, Glc: glicose, Gl: glicerol, Sac: sacarose, Fru: frutose Gal: galactose, So: sorbitol, P: peptona, T: triptona, E.L:
extrato de levedura, Cas: casaminocidos, Mic: milhocina, Sor: soro, HM: Hidrolisado de madeira pr-tratado, Me: melao de cana, HTr:
Hidrolisado do trigo, HMil: Hidrolisado de resduos de milho (corn stover), Bc: bagao de cana-de-aucar, Hbc: Hidrolisado do bagao de
cana-de-aucar; Ac: acetato, Def: meio definido.
Smbolos: Qp: produtividade volumtrica, qAS: taxa especfica de formao de cido succnico, Yp/s: rendimento em produto por substrato
consumido, N.D: Nenhum dado foi mencionado
Subprodutos: Fo: cido frmico, La: cido ltico, Ac: cido actico, PI: piruvato, Ma: malato, Pr: propionato, Et: etanol.
ndices: a: ATCC 29305 foi depositado novamente, como ATCC 53488, em 1992. b: Em muitos casos, no houve a formao de todos os
subprodutos. c: Alguns casos apresentaram valores baixos na concentrao de cido succnico, devido ao uso de pequenas concentraes
iniciais de fonte de carbono ou adotaram uma estratgia de fermentao pouco eficiente. d: Muitos estudos no apresentaram dados
suficientes para que fossem realizados todos os clculos referentes s taxas especficas de formao de produto.
* Processos que utilizaram estratgias diferentes da conduo em Batelada simples.
Dados em vermelho representam as referncias de trabalhos que foram depositados como patente.
Fonte: Adaptado de BEAUPREZ et al. (2010)

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Uma alternativa para a reduo desses metablitos indesejados para processos


com A. succinogenes, envolve o uso de engenharia gentica, retirando os genes que
codificam para formao de formato, lactato e etanol (desidrogenase) e acetato (quinase).
Um estudo com uma bactria modificada, A. succinogenes FZ6, mostrou que a produo
de piruvato foi aumentada ao invs de succinato, devido ao da desidrogenase (PARK
et al., 1999), indicando que a formao de subproduto o resultante na rota
fosfoenolpiruvato para piruvato ou oxaloacetato. Logo o fluxo para piruvato precisa ser
controlado (SAUER et al., 2005). Porm, toda estratgia de engenharia exige ferramentas
genticas essenciais para uma modificao adequada do microrganismo e, ainda no
foram desenvolvidas muitas tecnologias para Pasteurellaceae. Recentemente, um vetor de
transporte foi construdo para A. succinogenes, que permitiu a superexpresso de genes
exgenos (KIM & LAIVENIEKS et al., 2004). A divulgao dessa informao gentica
atendeu as expectativas de alguns estudos, utilizando E.coli (deMEY et al.,

2007),

melhorando o rendimento em cido succnico, mas acarretou em um grande nmero de


subprodutos.

2.8. Consideraes gerais


O crescimento populacional e a associada demanda por combustveis e bens de
consumo tm intensificado Pesquisa e Desenvolvimento para a utilizao, de forma mais
diversificada, de matrias-primas renovveis, em substituio s fontes fsseis. Isso tem
estimulado pesquisadores e empresas de diversos pases, que contam com amplos
mecanismos de apoio governamental, a buscar o desenvolvimento de novas tecnologias,
visando instalao de biorrefinarias anlogas s refinarias de petrleo.
A utilizao de biomassas residuais de grande interesse e importncia na medida
em que no h demanda de aumento da extenso de reas agricultveis. O que se
tenciona transferi-las da posio de resduos slidos para a posio de matrias-primas
valiosas visando produo de combustveis e de outras substncias qumicas. Os
avanos nesta rea sinalizam que, seguramente, o aproveitamento de matrias-primas
renovveis, incluindo os seus resduos, reverter dependncia mundial por fontes
fsseis. Assim, matrias-primas no tradicionais devero ter seu potencial avaliado e os
processos de produo de biocombustveis e de outras substncias qumicas, como cido
succnico, no contexto de biorrefinaria devero ser desenvolvidos.
Como pode ser observado pela Tabela 2.13, a otimizao de um processo para a
obteno de cido succnico vem sendo tpico constante de vrias pesquisas nos ltimos
anos. Embora alguns dos desempenhos do processo sejam de fato promissores, muitos
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problemas foram descobertos. Existe uma expressiva quantidade de microrganismos


produtores de cido succnico, conforme foi descrito antriormente, com destaque para as
espcies A. succinogenes, A. succiniciproducens, M. succiniciproducens, E. coli,
Corynebacterium. glutamicum e Bacteroides. fragalis. As linhagens naturalmente
ocorrentes, vm apresentando uma srie de auxotrofias, aumentando as exigncias pelo
substrato e, consequentemente encarecendo o processo.

Alm disso, a maioria dos

rendimentos eficientes, foi alcanada mediante a utilizao de um meio de cultivo


complexo.
Para evitar o principal problema de auxotrofia, a E.coli foi escolhida como alternativa
para alguns processos, devido a sua facilidade de crescimento em meio de composio
mnima e alterao gentica do metabolismo. Embora muitos processos tenham utilizado
de forma recorrente esses mtodos de mutao, nenhuma linhagem foi desenvolvida sem
a necessidade de uma suplementao que compensasse a auxotrofia. Portanto, deveriam
ser desenvolvidos modelos mais aprimorados para aumentar a taxa de produo. Cabe
ressaltar a importncia do uso de ferramentas computacionais para uma correta
otimizao, mediante simulaes do processo, seguidas de uma coerente anlise dos
parmetros do modelo e sua hierarquia de influncia sobre a varivel de resposta.
Sumariamente, a estratgia concebida para a elaborao do presente trabalho foi
realizar o pr-tratamento qumico em condies moderadas, que resulta na hidrlise da
hemicelulose, seguido de pr-hidrlise enzimtica da celulose, que foi na sequencia
associada (integrada) a um processo de bioconverso, denominado de processo SSF
(Simultaneous Saccharification and Fermentation). Foi com o intuito de inserir a produo
de cido succnico de 2 gerao no contexto de biorrefinaria que este trabalho foi
concebido, no tendo sido identificados grupos nacionais ou poucos grupos internacionais
que estejam trabalhando nesta temtica. Acreditamos que a lacuna existente nos estudos
relacionados produo deste importante cido orgnico corrobora a importncia desta
temtica, dando o devido suporte a realizao da presente tese de doutorado. Concluindo
este captulo, transcreve-se citao de uma declarao do orientador do presente trabalho
de pesquisa.

O Pas rene condies para ser o principal receptor de recursos de investimento,


provenientes do mercado de carbono, por ter no meio ambiente sua maior riqueza e
possuir enorme capacidade de absoro e regenerao atmosfrica. A produo de cido
succnico de 2 gerao est inserida no contexto de biorrefinaria, avanando para as
tecnologias emergentes e portadoras de futuro.

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CAPTULO 3
JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS

3.1. Justificativa
A dependncia por petrleo permanece como o fator mais importante que afeta a
distribuio mundial de riqueza, os conflitos globais e a qualidade do meio ambiente.
Existem diversas possibilidades para substituir processos qumicos convencionais por
processos biotecnolgicos baseados em fontes renovveis, dentro do contexto de
biorrefinaria. Porm, isso se torna vivel somente quando a matria-prima barata, como
o caso do bagao de cana-de-acar no Brasil. Adicionalmente, necessrio o
desenvolvimento de processos que trabalham de forma adequada para fazer o melhor
uso possvel de matria-prima, com procedimentos que evitam o mximo possvel
agresso ao meio ambiente, onde a utilizao de fontes alternativas feita de forma
equilibrada entre a cadeia alimentar e a obteno de produtos qumicos (HATTI et al.,
2007).
Paralelamente, questes de segurana, poltica e sade esto se tornando cada vez
mais importantes, fazendo-se necessria a reavaliao de muitos processos qumicos. As
autoridades reguladoras tm dado maior ateno aos problemas de carter ambiental, seja
por presso da opinio pblica mundial ou por segmentos da sociedade civil organizada. O
processamento de hidrocarbonetos ocorre, via de regras, em solventes orgnicos. Muitas
rotas so baseadas em catalisadores que requerem altas temperaturas e presses para
sua atividade. Em geral, reagentes, subprodutos ou intermedirios so nocivos sade
humana ou ao meio-ambiente. Alm disto, o consumo de energia e a emisso de efluentes
(lquidos, gasosos e resduos slidos) so significativos (DECHEMA, 2004).
Por outro lado, os bioprocessos ocorrem geralmente em meio aquoso e produzem
efluentes com um grau de toxidez muito inferior em relao aqueles oriundos do
processamento do petrleo. Alm disto, os produtos do processamento de biomassa so
normalmente biodegradveis e no-txicos (LYND et al., 1999; WILLKE & VORLOPO,
2004). incontestvel que, particularmente na rea de produo bsica e na qumica fina,
o uso de processos biotecnolgicos significativo, uma vez que:

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So usualmente distintos pela sua alta especificidade (converso de substrato) e


seletividade (espectro do produto);

Usam

fontes

renovveis

como

matria-prima,

contribuindo

para

sustentabilidade de processos e produtos;

As reaes dos processos biotecnolgicos podem ocorrer em condies


brandas em relao aos valores de pH, temperatura e presso.
Sob esta panormica, bagao de cana-de-acar pode ser utilizado, a exemplo

do que ocorre com a produo de etanol de 2 gerao, nos Laboratrios de


Desenvolvimento de Bioprocessos (LADEBIO/EQ/UFRJ), para obteno de cido
succnico, desde que sejam utilizados os processos que permitam a extrao dos
acares constituintes. Em suma, so vrias as justificativas que impulsionaram a
realizao do presente trabalho:

O cido succnico pode ser considerado um produto commodity de ampla


aplicao industrial, tornando-se alvo de interesse por grandes empresas nos
ltimos anos;

Possui alta reatividade, devido a sua quiralidade natural, pela presena de dois
grupamentos carboxila;

Permite o uso de matria-prima renovvel no processo fermentativo;

economicamente vivel em relao rota qumica;

Est inserido no contexto de tecnologia de captao de CO2;

Dessa forma, faz-se evidente a importncia do desenvolvimento de um projeto


sobre esta temtica, envolvendo baixos custos e altas produtividades. A seguir, o objetivo
geral e objetivos especficos foram traados:

3.2. Objetivo geral


Dentro do contexto apresentado acima, o objetivo geral do presente trabalho
consiste no desenvolvimento de um processo microbiano, economicamente vivel, para a
sntese de cido succnico por Actinobacillus succinogenes CIP 106152, a partir da
fermentao do bagao de cana-de-acar, atravs da converso de xilose (hemicelulose)
e glicose (celulose), respectivamente.

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3.2.1. Objetivos especficos

Padronizar o tempo de propagao atravs de estudos dos perfis cinticos de


crescimento da bactria Actinobacillus Succinogenes CIP 106152;

Elaborar um meio de crescimento menos complexo, em relao ao recomendado pela


literatura, para normalizar a atividade metablica da linhagem;

Estudar a melhor relao carbono e nitrognio (C:N) na produo de cido succnico,


usando glicose e xilose como fontes de carbono;

Avaliar da influncia dos componentes do meio de fermentao na produo de cido


succnico atravs de planejamento experimental;

Otimizar das condies de processo (pH, agitao, temperatura), utilizando


metodologia de planejamento experimental como ferramenta de trabalho, com a
produo cida como varivel de resposta;

Estudar a fermentabilidade a partir do hidrolisado hemicelulsico de bagao de canade-acar, obtido em condies otimizadas por Betancur (2005), para produo de
cido succnico;

Estudar uma estratgia para propagao celular em meio contendo hidrolisado com
alto teor de xilose (aclimatao celular);

Otimizar a produo de cido succnico em biorreator, na ausncia e presena de


suprimento externo de CO2 durante o processo fermentativo, avaliando efetivamente
sua influncia no metabolismo celular;

Validar os resultados obtidos no planejamento experimental fatorial, em biorreator


instrumentado, com as variveis significativamente mais favorveis produo de
cido succnico, segundo os experimentos conduzidos em frascos agitados;

Investigar a viabilidade da realizao de um processo simultneo de hidrlise


enzimtica de celulose e fermentao (SSF), abordando o desempenho da linhagem
face utilizao de celulignina, com preparados comerciais, em condies otimizadas
por Santos (2009);

Desenvolver um modelo determinstico simples, de acordo com os modelos existentes


na literatura, para uma maior compreenso do comportamento cintico do processo
estudado;

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CAPTULO 4
MATERIAIS E MTODOS

Neste captulo so apresentados os materiais e as metodologias utilizadas para o


desenvolvimento do presente trabalho. Os experimentos tiveram incio aps a ativao das
clulas, armazenadas em ampolas de liofilizao, mtodo utilizado para preservao de
clulas a longo prazo. Foram estabelecidos: manuteno e manipulao do microrganismo
utilizado; padronizao do tempo para preparo de inculo e a elaborao dos ensaios
conduzidos em meio de composio simplificada. A metodologia experimental utilizada
para obteno de cido succnico foi desenvolvida, inicialmente, atravs de frascos
agitados com posterior validao das condies timas em biorreator instrumentado. Para
a otimizao do processo, foram utilizados planejamentos experimentais e anlises de
respostas mediante ferramentas computacionais de trabalho, garantindo um controle mais
seguro das condies operacionais do processo.

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4.1. Esterilizao das vidrarias e do meio de cultivo


Toda vidraria utilizada nos experimentos de cultivo foi esterilizada em autoclave
durante 20 minutos, sob presso de 1 kgf/cm2 e temperatura de 120C, seguido de
secagem em estufa de esterilizao Mod. FIC. 05. FAMO (50 a 60 C). Os meios de cultura
foram autoclavados por 15 min., sob presso de 0.5 kgf/cm2 e temperatura de 120C.

4.2. Material microbiolgico

4.2.1. Microrganismo utilizado


A linhagem de Actinobacillus succinogenes CIP 106512 foi obtida do banco de
cepas francs Institut Pasteur Collection - CIP, mantida em liofilizao, armazenada em
ampola devidamente lacrada, sob abrigo de luz. Esta bactria foi previamente reportada
como sendo o microrganismo mais adequado para converso de acares a cido
succnico (ZEIKUS et al., 1999).
A linhagem foi ativada mediante a suspenso de clulas em um meio lquido TSB
(Caldo de Triptona de Soja - 500gr M/Difco), para obteno de inculo, com a seguinte
composio, em g/L de gua deionizada: Peptona de casena: 3,0; Peptona de soja 2,0;
Cloreto de sdio 4,0; Fosfato de potssio 2,5 e glicose 2,5 (VAN DER WERF et al., 1997).
Inicialmente, preparou-se o meio contendo a soluo de TSB 40,0 g/L que foi, em seguida,
esterilizado. Seguindo a recomendao do CIP, tubos de ensaios contendo alquotas de 2
mL deste meio foram utilizados para promover a ativao das clulas contidas nas
ampolas de liofilizao, que foram em seguida, transferidas assepticamente para o meio de
manuteno. Com o auxlio de uma ala de Drigalski, previamente esterilizada, as clulas
foram espalhadas sob a superfcie do meio agarizado em placas de PETRI estreis, as
quais foram levadas para incubao a 370C por 24h.
4.2.2. Manuteno do microrganismo
O microrganismo foi mantido em gar inclinado TSA (Triptona Agar Triptona de Soja
500gr M/Difco) e armazenado a 4C, aps ser incubado em estufa com temperatura
controlada de 370C durante aproximadamente 24h. A composio do meio agarizado est
descrita na Tabela 4.1. Com a finalidade de manter as clulas ativas para a realizao dos
diferentes experimentos, repiques peridicos a partir do cultivo original foram realizados a
cada trs meses em cmara assptica.

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Tabela 4.1. Meio de manuteno (TSA)


Concentrao
(g/L)
5.0
2.0
4.0
2.5
2.5
30.0

Componente
Peptona de casena
Peptona de soja
Cloreto de sdio
Fosfato dipotsico
Glicose
gar-gar
Fonte: (FREY, 1992).

4.2.3. Observao microscpica


Aps o crescimento bacteriano nos meios de cultura, foram retiradas amostras
assepticamente com auxlio de uma ala de platina e, preparados esfregaos em lminas
para posterior colorao, segundo o mtodo Gram. As lminas com material microbiano
foram analisadas em microscpio binocular com aumento de 1000x.

4.3. Meios empregados para ativao, propagao e fermentao


Em todos os experimentos, as clulas foram inicialmente ativadas em meio lquido
e, posteriormente propagadas.
4.3.1. Meio de ativao para obteno do pr-inculo
Foram utilizados tubos Falcon ou frascos Erlenmeyer de 100 mL contendo 20mL de
meio esterilizado (Tabela 4.2), mantidos em agitao de 150 rpm, temperatura de 37oC,
durante 12 horas (tempo necessrio para que as clulas atingissem uma concentrao
apropriada ao final da fase exponencial de crescimento).

Tabela 4.2. Composio do meio utilizado para pr-inculo


Componente
Glicose
Extrato de Levedura
MgSO4
NaHCO3
K2HPO4

Concentrao (g/L)
20.0
2.0
1.0
12.0
1.5

Fonte: VAN DER WERF et al., (1997)

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4.3.2. Inculo
Para atingir o crescimento celular, o meio para o preparo de inculo possui mesma
composio descrita na Tabela 4.2, com exceo da fonte de carbono, que anteriormente
fora realizada apenas com glicose. Cabe ressaltar, nesta etapa, que todos os experimentos
foram realizados paralelamente para glicose e xilose como fontes de carbono, mantendose os mesmos valores de concentrao inicial para os outros componentes presentes no
meio.
Frascos Erlenmeyer de 500 mL, contendo 200 mL de meio (previamente
esterilizado), foram inoculados com o volume total de pr-inculo (20mL), para a obteno
do cultivo de inculo. As condies de cultivo, em incubadora refrigerada orbital, foram s
mesmas citadas anteriormente. Adicionalmente, foi realizado um cultivo em meio sinttico
para a obteno de inculo, contendo hidrolisado diludo, visando avaliar o comportamento
celular diante de inibidores presentes no hidrolisado hemicelulsico (BETANCUR, 2005),
que foi esterilizado separadamente, a 0,5 atm durante 10 min.
A Figura 4.1 apresenta um esquema representativo dos ensaios, conduzidos
inicialmente em frascos agitados. Foram realizados quantificao de clulas e posterior
clculo do volume a ser centrifugado, obtendo-se a quantidade de clulas requeridas para
alcanar as concentraes desejadas, de acordo com os planejamentos experimentais
para cada fermentao desenvolvida. A concentrao celular foi determinada pela medida
de densidade ptica a 600 nm (SPECTRUMLAB 22 PC), utilizando-se uma curva de
calibrao para absorvncia.
Resumidamente, as estratgias adotadas para os ensaios em frascos agitados,
correspondem s seguintes etapas:
a) Todos os ensaios tiveram incio com o cultivo de meio de ativao, em frascos cnicos
de 100 mL contendo 20 mL de meio (Tabela 4.2), sob agitao de 150 rpm e 37C.
Cabe ressaltar que no foram realizadas etapas de pr-inculo a partir de xilose,
usando-se portanto apenas a glicose para esta finalidade;

b) Para o preparo de inculo, a composio dos nutrientes, foi fundamentada segundo as


exigncias do meio de crescimento preconizado por GUETLER (1996), cuja composio
encontra-se na Tabela 4.3. Alguns nutrientes foram retirados por serem considerados
excessivos

ou

de

presena

redundante,

caracterizando

uma

complexidade

desnecessria na formulao do meio. Dentre os nutrientes retirados, esto alguns sais


minerais e algumas vitaminas, como tiamina (B1), riboflavina (B2), cianocobalamina
(B12), biotina (B7) e niacina (B3);

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Frascos 100 mL
Meio de ativao:
20 mL
a) Padronizao de tempo

Frascos 500 mL
Meio de Crescimento:
200 mL
b) Padronizao de tempo

Frascos 500 mL
Meio de Fermentao:
200 mL
c.1 ) Planejamentos
........experimentais
com Xilose

10 % (v/v)
Volume
total

Cmara
assptica

c.2) Planejamentos
........experimentais
com Glicose

Pr-inculo
10 % (v/v)

a) Pr-Inculo

b) Preparo de Inculo

c) Fermentao

Figura 4.1. Esquema representativo das estratgias para a padronizao do tempo de preparo
de pr-inculo (a), inculo (b) e fermentao (c), dos experimentos iniciais, em frascos
agitados. Todos os ensaios foram realizados para xilose e glicose, como fonte de carbono, sob
as mesmas condies.

c) Em seguida, foram realizados estudos sobre a influncia de cada nutriente presente no


meio de fermentao e as condies de processo (pH, agitao e temperatura), visando
a hierarquizao das variveis para alcanar melhores rendimentos sobre a produo
de cido succnico, de acordo com Gonzales et al. (2008). Para a anlise do impacto
dessas variveis sobre a resposta de cada experimento, foi utilizado o Software Statistic
5.0 (Statsoft Inc. 2335, Easth 13th Street Tusla, OK, 74104, USA) e Design-Expert ver.
6.0 (Stat-Easem Minneapolis, MN), para ambas as fontes de carbono utilizadas (glicose
e xilose). Os resultados obtidos nesta etapa foram posteriormente validados em
biorreator, segundo as melhores condies determinadas com a execuo do modelo,
garantindo maior controle sob os parmetros operacionais do processo.

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Tabela 4 3. Composio do meio de crescimento preconizado por Guetler (1996).


Componentes
Glicose
Extrato de levedura
NaH2PO4 . H2O
Na2HPO4
NaCl
MgCl2 . 6 H2O
Vitamina B12
Biotina
cido Flico
Tiamina
Riboflavina
Niacina
Pantotenato
P-aminobenzoato
cido lipico
Vitamina B6
MgCO3
Acetato de sdio
Dextrose

Concentrao
20 g
5g
1,16 g
0,31
1,0 g
0,2 g
10 mg
200 mg
200 mg
500 mg
500 mg
500 mg
500 mg
500 mg
500 mg
1 mg
80 g
1,5 3,5 g
100 135 g

Fonte: GUETLER et al. (1996).

4.3.3. Meios de Fermentao


Para o preparo do meio sinttico utilizado para os ensaios de fermentao, que
antecederam a etapa de otimizao mediante planejamento experimental (hierarquizao
dos efeitos das variveis de processo), foi adotada a mesma sistemtica descrita para o
meio de crescimento celular (inculo), alterando-se a concentrao das fontes de carbono
(xilose ou glicose), de acordo com os planejamentos sequenciais desenvolvidos, no
decorrer do presente trabalho (Tabela 4.4).
Tabela 4.4. Composio do meio sinttico para fermentao
Componente
Glicose ou Xilose
Extrato de Levedura
MgSO4
NaHCO3
K2HPO4

Concentrao
(g/L)
Variaes*
2.0
1.0
12.0
1.5

* As concentraes de glicose ou xilose foram variadas de acordo com


os planejamentos experimenatis sequenciais realizados

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4.3.4. Processo de propagao mediante diferentes estratgias de aclimatao


celular

Conforme mostra a Figura 4.2, com o objetivo de investigar o efeito da aclimatao


celular, durante a converso de xilose em cido succnico, foram utilizadas trs estratgias
diferentes para a propagao celular para a obteno do inoculo, a ser adicionado no
biorreator contendo o hidrolisado hemicelulsico para fermentao. Estas estratgias esto
descritas a seguir:

Glicose

Xilose

10 %

a) Uma etapa (sinttico)

b) Uma etapa (25%)


Frascos
100mL
Meio sinttico
20 ml

1.Ativao

10 % (v/v)

c) Duas etapas (25% e 50%)


2.Propagao
celular

Fermentao
(meio com
hidrolisado)

Figura 4.2. Metodologia para Propagao Celular. (a) crescimento em uma nica etapa em
meio sinttico; (b) crescimento em uma nica etapa em meio contendo 25% de hidrolisado e,
(c) crescimento em duas etapas em meios contendo 25% e 50% de hidrolisado,
respectivamente.

a) Para obteno do inculo, o processo de propagao celular em meio sinttico em


uma nica etapa (propagao celular sem aclimatao) foi realizado, com a
composio apresentada na Tabela 4.3, sendo esterilizado seguindo as mesmas
condies anteriores. As duas etapas seguintes referem-se ao procedimento de
aclimatao celular em meio contendo hidrolisado;

b) Aclimatao em uma nica etapa: a composio do meio utilizado contm a mesma


proporo de nutrientes descritos para o crescimento. Porm, a soluo de xilose
comercial foi substituda pelo hidrolisado, esterilizado durante 10 minutos a 0,5 atm,
numa proporo de 25% do volume total, correspondentes a uma concentrao de
aproximadamente 20 g/L de xilose presente no meio;

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c) Aclimatao em duas etapas: a metodologia a mesma utilizada anteriormente,


onde propagao celular ocorre em um frasco cnico com 200 mL de meio
contendo 25% de hidrolisado. Porm, em seguida, fracos cnicos contendo 200 mL
com 50% de hidrolisado, foram inoculados com 10% (v/v) do meio obtido
anteriormente. As clulas centrifugadas (3000 rpm/10 min) foram posteriormente
ressuspensas

no

meio

de

fermentao

contendo

hidrolisado,

com

uma

concentrao de aproximadamente 3,0 g/L, mediante rigor estril;

4.4. Processos de fermentao em frascos agitados

As fermentaes foram realizadas em frascos cnicos de 500 mL contendo 200 mL


do meio correspondente, com as concentraes de nutrientes definidas pelo planejamento
experimental. O meio de fermentao foi inoculado, depois de esterilizado, com 10% (v/v)
do inculo e incubado em Shaker, sob agitao de 150 rpm, a 37C por aproximadamente
24h. O pH do meio foi ajustado para 7,0 com uma soluo de NaOH (2M) ou HCl (2M).
Com a finalidade de evitar reaes indesejadas entre os componentes do meio em altas
temperaturas, uma soluo contendo a fonte de carbono e outra com os demais nutrientes
foram preparadas e esterilizadas separadamente, em todos os experimentos realizados no
decorrer da pesquisa.
O crescimento celular, o consumo de substrato e a formao de produto foram
acompanhados durante o tempo necessrio, para verificar a estabilidade na concentrao
celular e/ou esgotamento da fonte de carbono.
A Figura 4.3 apresenta um esquema geral, visando facilitar a compreenso das
etapas definidas para frascos agitados, onde podem ser vistos os pontos em que foram
realizadas observaes microscpicas para o monitoramento sob a pureza do cultivo.

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3-Cmara assptica

4 - Incubadora

2-Autoclave 121C
1-Preparo de meios
37C
24 h

.Meios ( 15 min, 0,5 atm)


.Vidrarias (20 min, 1 atm)
Ativao de cultura
Repiques peridicos (3 meses)
Frascos 100 mL
20 mL Meio
Pontos de
Observao
Microscpica
(GRAM)

Peso seco em balana IV

Filtrao a vcuo

37C
5 - Preparo de inculo

12 h
150 rpm

7.b) Curva padro


(Biomassa)

CO2
Shaker
Frascos
500 mL

amostras

200 mL
meio

9.a) -Leitura de biomassa


9.b) HPLC
- Aucares
- Produtos

Sobrenadante

8 Centrifugao
12000 rpm/15 min

7.a) - Condies de cultivo


(37C, 150 rpm)

6 - Inoculao em cmara assptica


10 % (v/v) inculo

Figura 4.3. Esquema ilustrativo geral para crescimento celular e produo de cido succnico, em frascos agitados. 1-preparo de meio, 2- esterilizao de meios
e vidrarias, 3- ativao de clulas e repiques peridicos, 4- condies de cultivo, 5- preparo de inculo, 6- inoculao em meio de fermentao, 7. a) Shaker e
condies de cultivo, com ou sem presena de CO2, 7.b) filtrao a vcuo de clulas para obteno de curva padro, correlacionando peso seco de clulas com
absorvncia, 8- separao de biomassa e sobrenadante, 9 a) quantificao de biomassa, 9.b) quantificao de produtos e aucares em HPLC.
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4.4.1. Fermentao em presena de CO2 na fase gasosa


Os estudos de fermentao visando otimizao do processo de obteno de cido
succnico, foram realizados em frascos cnicos de 500 mL, contendo 200 mL do meio de
crescimento, com suprimento externo de CO2 na fase gasosa a 0,05 vvm (LEE et al., 1999),
para garantir condies anaerbicas, conforme mostra a Figura 4.4. Inicialmente, todo o
material foi autoclavado e enviado para confeco do sistema de adio de CO2, em cmara
assptica, para evitar contaminao. Dessa forma, aps o desenvolvimento desta etapa,
fundamental para se atingir a fase de crescimento celular exponencial, amostras foram
coletadas para serem transferidas em novas placas, a partir das quais repiques peridicos
foram realizados.

2- Manmetro
5-Distribuidor de gs
4- Membrana
Milipore 0.45 m

3-Rotmetro

CO2

0,05 vvm

1-Cilindro
6-Shaker

CO2

Figura 4.4. Esquema ilustrativo do sistema de adio de CO2

O sistema projetado para disponibilizar o CO2 no meio de fermentao foi constitudo,


basicamente, dos seguintes materiais: 1- cilindro de CO2; 2- manmetro para controle de
presso; 3- rotmetro para controle e monitoramento da vazo de gs; 4- membrana milipore
para filtrao do gs carbnico de entrada; 5- divisores plsticos, comumente empregados
para distribuio de ar em aqurios domsticos, dotados de controladores individuais de
Vazo; 6 - mangueiras tygon para conexo entre os instrumentos utilizados e seringas
descartveis para permitir a passagem do gs carbnico para o interior dos frascos
Erlenmeyer mantidos sob agitao em Shaker. Cabe ressaltar, que os experimentos
desenvovidos ao longo do presente trabalho, foram realizados com clulas crescidas a partir
de amostras obtidas durante a fase exponencial do perfil cintico de ensaios conduzidos,
inicialmente, em presena de CO2 (Figura 4.4). Este procedimento foi realizado para garantir o

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bom desempenho em todos os ensaios posteriores, uma vez que tal exigncia nutricional deve
ser atendida de acordo com o que reportado pela literatura.

4.5. Avaliao da relao C:N sobre o crescimento celular


Nesta etapa, o objetivo foi avaliar a melhor razo carbono/nitrognio para o
crescimento celular. Foram avaliados diferentes concentraes de glicose e xilose, mantendose fixa a quantidade de extrato de levedura, segundo metodologia desenvolvida por Gonzales
et al. (2008), os quais estudaram tambm o uso de sacarose em seus experimentos. Porm,
no presente trabalho foram avaliados apenas a glicose e xilose como fontes de carbono de
interesse, alm de um meio economicamente mais vivel em relao literatura. em um meio
economicamente vivel. Para a conduo dos experimentos foram usados frascos cnicos de
500 mL contendo 200 mL de meio de crescimento com os seguintes componentes (em g/L de
gua deionizada): MgSO4, 1.0; NaHCO3, 12.0 e K2HPO4, 1.5 g. O pH do meio foi ajustado
para 7,0 com NaOH, aps a esterilizao. O meio de crescimento foi inoculado, depois de
esterilizado com 10% (v/v) de inculo e, em seguida, incubado a 150 rpm e 37C por 24h de
fermentao. A Tabela 4.5, apresenta as diferentes razes de C:N.
Cabe ressaltar, que as fontes de carboidratos foram autoclavadas separadamente e
adicionadas posteriormente no meio de cultiv, evitando possveis reaes de escurecimento,
as quais promovem inibio do crescimento celular, inviabilizando o processo de
fermentao..
Tabela 4.5. Composio qumica do meio lquido com diferentes razes C:N
Ensaio

Glicose e Xilose*
(g/L)

C
(g/L)

E.L
(g/L)

N
(g/L)

C:N

1
4,0
1,6
5
0,650
2,6:1
2
8,0
3,2
5
0,650
5,2:1
3
10,0
4,0
5
0,650
6,5:1
4
15,0
6,0
5
0,650
9,7:1
5
20,0
8,0
5
0,650
13:1
6
25,0
10,0
5
0,650
16,2:1
7
30,0
12,0
5
0,650
19,4:1
8
35,0
14,0
5
0,650
22,7:1
9
45,0
18,0
5
0,650
29,1:1
10
55,0
22,0
5
0,650
35,1:1
*Os valores encontram-se ligeiramente diferente daqueles usados por Gonzales et al.
(2008), devido a impreciso durante etapa de pesagem na quantidade de aucares, o que
no inviabiliza estudos de comparao entre os resultados.

Segundo Gonzales et al. (2008), o estudo da influncia da razo C:N pode ser
baseado na composio qumica do meio de cultivo. Nesta etapa foram feitos dez meios com
diferentes razes C:N, variando de 2.6 a 35.1, para cada carboidrato estudado (glicose,
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xilose). Inicialmente foi determinada a quantidade de carbono e nitrognio presentes nos


aucares e no extrato de levedura
As massas de carbono na glicose e xilose tiveram como base a frmula qumica dos
acares (C6H12O6, C5H10O5 e C12H22O11) sendo de 40% de C. Assim as quantidades de
carbono foram calculadas multiplicando-se a concentrao de carboidrato por 40%. A
quantidade de nitrognio foi calculada multiplicando-se a quantidade de extrato de levedura
por 13,0%, dado determinado segundo metodologia usando o Kit da Hack, de acordo com
Gonzles et al. (2008).
4.5.1 Anlise estatstica
Os valores obtidos com os ensaios foram interpretados de acordo com a anlise
varincia (ANOVA) e pelo teste de Tukey em p<0,05, disponvel no software Statistica 5.0,
permitindo visualizar as diferenas significativas entre as razes C:N estudadas, em termos de
capacidade de crescimento de biomassa em cada fonte de carbono (BOX & HUNTER, 1978).

4.6. Planejamentos experimentais sequenciais para a otimizao de parmetros e


condies de cultivo do processo de fermentao

Nesta etapa, os experimentos foram realizados de acordo com os princpios da


metodologia estatstica de superfcie de resposta. O modelo estatstico utilizado para o
estudo dos efeitos agregados de variveis com a finalidade de determinar as condies timas
para sistemas de mltiplas respostas (RODRIGUES, 2010). Na maioria das vezes mais
interessante comear um experimento com um planejamento fatorial fracionado (PFF) ou
Plackett-Burman (PB), analisar os efeitos principais das variveis sobre as respostas e realizar
outro planejamento, sequencialmente, reduzindo o nmero de variveis e alterando as faixas
de estudo em funo do impacto que elas tiveram sobre as respostas, desde que a ausncia
de um dos parmetros no comprometa a hierarquizao (ordem dos efeitos) individual ou de
interao entre eles. No final desta estratgia, pode-se realizar um planejamento do tipo
Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para elaborar o modelo preditivo
(RODRIGUES, 2010). Portanto, no presente trabalho, trs estratgias de planejamentos
experimentais seqenciais foram adotadas a seguir.
4.6.1 Avaliao da influncia dos componentes do meio de fermentao na obteno de
cido sucnico, atravs de Planejamento Experimental Fatorial Fracionado

Inicialmente, foi realizado um Planejamento Experimental Fatorial Fracionrio PFF 24-1


(8 experimentos com adio de dois pontos centrais) para verificar o efeito estimado dos
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seguintes componentes do meio de fermentao sob obteno de cido succnico: NaHCO3,


extrato de levedura, K2HPO4 e MgS04, conforme mostra a Tabela 4.6.
O meio de fermentao foi inoculado, depois de esterilizado, com 10% (v/v) de inculo
e incubado em Shaker, sob agitao de 150 rpm e temperatura de 37C, por
aproximadamente 24 horas. O pH foi ajustado para 7,0 mediante uso de soluo de NaOH 0,1
M e a concentrao da fonte de carbono foi igual a 20 g/L.

Tabela 4.6. Parmetros e nveis usados no Planejamento Experimental Fatorial Fracionrio


PFF 24-1, com concentrao inicial de 20 g/L para glicose e xilose respectivamente.
Parmetros
(g/L)
K2HPO4
MgSO4
Extrato de levedura
NaHCO3

Nveis
Inferior Superior
0.0
10.0
0.0
2.0
0.0
5.0
0.0
10.0

O planejamento fatorial fracionado geralmente escolhido por ser o mais apropriado na


determinao dos efeitos lineares das variveis, sendo os efeitos da curvatura e das possveis
interaes excludos da anlise estatstica. Porm, o fracionamento do planejamento
experimental e a reduo do nmero de experimentos realizados acarretam perdas quanto
anlise da influncia de interaes entre as variveis de estudo sobre a resposta de interesse
(BRUNS, 1995). Dessa forma, em uma segunda estratgia, o planejamento experimental
composto central (DCCR delineamento composto central rotacional) foi necessrio para
visualizao da curvatura com valor de mximo absoluto.
4.6.2. Planejamento Composto Central Rotacional
Nesta etapa, alm dos nveis inferiores e superiores apresentados na matriz usada no
Planejamento Experimental Fatorial Fracionrio PFF 24-1, foram feitos o acrscimo dos pontos
axiais (- e + ), conforme mostra a Tabela 4.7, para obteno da curvatura de mximo
absoluto. Em seguida, foi realizado um estudo de otimizao das condies de processo (pH,
agitao, temperatura), para posterior validao dos resultados obtidos nos planejamentos
experimentais, em biorreator instrumentado.

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Tabela 4.7. Parmetros e nveis usados no Planejamento Composto Central Rotacional e para
otimizao produo de cido succnico.
Nveis
Axial

Inferior

CP

Superior

Axial

2.5
1.0
0.0
1.5

5.0
2.0
1.0
5.0

7.0
3.0
3.0
10.0

10.0
4.0
5.0
15.0

12.5
5.0
7.0
20.0

Parmetros
(g/L)
K2HPO4
MgSO4
xtrato de levedura
NaHCO3

4.6.3. Otimizao das condies de cultivo do processo de fermentao atravs de um


Planejamento Fatorial Fracionrio
Nesta etapa do trabalho foram utilizadas condies semelhantes aquelas estudadas
por Gonzales et al. (2008), com acrscimo de experimentos envolvendo a xilose como fonte
de carbono, concomitante aos ensaios conduzidos a partir de glicose. Logo, para verificar a
influncia das variveis: concentraes de glicose e xilose; extrato de levedura, temperatura,
pH inicial e agitao, sob a concentrao final de cido succnico, foi utilizado um
Planejamento Fatorial Fracionrio 25-1 (com adio de trs rplicas no ponto central,
totalizando 19 ensaios). Na Tabela 4.8 so mostrados os nveis reais e codificados das vrias
estudadas nesta etapa da pesquisa.
Tabela 4.8. Variveis analisadas no planejamento fatorial fracionrio e seus respectivos nveis
codificados e reais.
Variveis
Extrato de Levedura (g/L)
Glicose e xilose (g/L)
Temperatura (C)
pH inicial
Agitao (rpm)

-1
5
20,0
32
6
100

Nveis
0
+1
8
11
30,0
40,0
37
42
7
8
200
300

4.6.4. Anlise estatstica


Os efeitos estimados das variveis e condies de processo sobre a concentrao final
de cido succnico (varivel de resposta) foram analisados em um intervalo de 90% de
confiana, mediante a Anlise de Varincia (ANOVA), Diagrama de Pareto e Metodologia de

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Superfcie de Resposta (MSR), atravs do Software Statistic 5.0 (Statsoft Inc. 2335, Easth 13th
Street Tusla, OK, 74104, USA), segundo BOX & HUNTER (1978).
4.7. Fermentao em biorreator instrumentado a partir de meio sinttico
Para a realizao das fermentaes sob condies controladas foi utilizado um
biorreator do modelo Biostat (B. Braun Biotech International - Alemanha), agitado
mecanicamente (Figura 4.5), empregando um vaso reacional de 2L, contendo 600 mL de meio
de

fermentao.

Os

experimentos

conduzidos

em

batelada

foram

controlados

automaticamente a uma temperatura de 37C, agitao de 150 rpm, e pH 7,0 monitorado


utilizando-se um eletrodo de pH esterilizado e controlado mediante a adio de NaOH (2M) ou
HCL (2M). Adicionalmente, um segundo processo de fermentao em biorreator

foi

conduzido, sob as mesmas condies, para avaliar a influncia do suprimento externo de CO2,
atravs de uma distribuio constante de fluxo a 0,05 vvm. A operao em batelada foi
conduzida com as variveis significativamente mais favorveis produo de cido succnico,
de acordo com os experimentos em frascos agitados. O meio de fermentao (Tabela 4.9), foi
preparado com 22, 52 e 80 g/L de xilose, simulando os valores de concentrao utilizadas
conduo dos experimentos de fermentao em meio contendo hidrolisado. Para o incio do
processo foram inoculadas aproximadamente 3,0 g/L de clulas concentradas, aps
centrifugao (6000 rpm/ 10 min) e separao do sobrenadante.

Figura 4.5. Biorreator BIOFLO III (New .Brunswick) utilizado na produo de cido succnico

Tabela 4.9. Composio do meio de fermentao, aps estudos de otimizao


Componentes
Extrato de Levedura
MgSO4

Concentrao
(g/L)
5.0
3.0

NaHCO3

10.0

K2HPO4

1.5

* As concentraes de xilose para cada ensaio foram: 22,0; 52.0 e 80,0 g/L.
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4.8. Fermentao em biorreator instrumentado a partir da frao hemicelulsica do


bagao de cana-de-acar
4.8.1. Pr-tratamento cido
O Bagao de cana-de-acar (Saccharum spp.) foi cedido pela Destilaria Costa Pinto
(SP-Brazil). Inicialmente, uma etapa de pr-tratamento cido foi realizada para desorganizar a
matriz lignocelulsica e remover a frao hemicelulsica. As condies para a realizao do
pr-tratamento cido foram s seguintes: H2SO4, 1,09% (v/v); relao slido-lquido 1:2.8 (g/ml)
e temperatura de exposio do bagao de 121oC, durante 27 minutos em autoclave
(BETANCUR, 2010). O hidrolisado, licor resultante deste processo (hemicelulose), foi
separado utilizando uma prensa hidrulica, e seu pH foi corrigido para 6,5 mediante a adio
de Ca(OH)2 (13,12 mg/mL) sob banho de gua e gelo para evitar o aquecimento gerado em
excesso, durante este procedimento. Em seguida, a soluo foi filtrada (vcuo) para retirar o
precipitado formado, resultando no material desejado para ser utilizado como base do meio de
fermentao (FOGEL, 2005). As etapas descritas para a obteno do hidrolisado
hemicelulsico pode ser visualizadas na Figura 4.6.

Figura 4.6. Etapas do pr-tratamento cido: Bagao in natura (a), Exposio do bagao ao cido
(b,c), Distribuio em frascos (d), Tratamento trmico em autoclave (e), Distribuio em prensa
hidrulica (f), Prensagem para separao do bagao acidificado (celulignina) (g) da frao
hemicelulsica (h).

4.8.2. Fermentao em biorreator instrumentado


As clulas foram crescidas em meio de ativao, seguindo a metodologia de
aclimatao em duas etapas, descrita anteriormente. O processo foi conduzido em um
biorreator do tipo BIOFLO III, com 600mL de meio de fermentao contendo os nutrientes
necessrios para fermentao, com exceo da xilose, que foi incorporada com a frao
hemicelulsica do bagao-de-cana, derivada da etapa de pr-tratamento cido. Os ensaios
foram desenvolvidos com 25%, 50% e 75% de hidrolisado, resultando em concentraes
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iniciais de xilose de aproximadamente 22, 52 e 80 g/L, respectivamente. As condies de


processo (agitao, temperatura, pH, composio de nutrientes e suprimento externo de CO2)
foram as mesmas descritas anteriormente (meio sinttico). O inculo foi obtido com uma
concentrao inicial de aproximadamente 3,0 g/L, aps metodologia de aclimatao de clulas
em duas etapas, em hidrolisado.

4.9. Experimentos empregando a estratgia SSF (Simultaneous Saccharification and


Fermentation)
A frao slida residual da hidrlise cida de bagao de cana possui um alto contedo
de celulose que pode ser utilizada para a obteno de cido succno por fermentao,
mediante tcnicas que possibilitem o aproveitamento de glicose contida no resduo. Entre as
tcnicas que poderiam ser avaliadas encontrem-se a hidrlise enzimtica e a aplicao do
processo SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation).
4.9.1. Pr-tratamento alcalino
A celulignina, resultante da metodologia para obteno de hemicelulose, foi submetida
deslignificao mediante tratamento alcalino, com 4% de NaOH e uma relao slido-lquido
1:20, seguido de tratamento trmico a 121oC, durante 30 minutos em autoclave, conforme
mostra a Figura 4.7 . Lavagens Seqncias de lavagens com gua destilada foram feitas,
garantindo a eliminao parcial da lignina, gerando a celulignina parcialmente deslignificada
(VSQUES, 2007).

Figura 4.7. Etapas do tratamento alcalino: Celulignina sendo pesada (a,b); Tratamento alcalino
com NaOH diludo (c); Tratamento trmico em autoclave (d); Celulignina obtida/licor alcalino (e);
Separao em prensa hidrulica(f), Sequncia de lavagens at clarificao da gua utilizada para
remoo da lignina (h).

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4.9.2. Pr-hidrlise enzimtica


A celulignina parcialmente deslignificada foi submetida hidrlise enzimtica atravs
de preparados comerciais (Multifect, Genencor, USA), para facilitar o acesso celulose. Com
este procedimento, foi possvel promover a lise da molcula da celulose para a gerao da
glicose. O experimento foi desenvolvido utilizando-se uma atividade enzimtica de 25 FPU/g,
sob temperatura constante de 50oC, relao slido-lquido 3:10 durante 12 horas (SANTOS,
2009). As Figuras 4.8 e 4.9 apresentam a celulignina seca obtida aps a deslignificao; aps
a adio da enzima e o meio obtido aps o perodo de pr-hidrlise enzimtica.

Figura 4.8. Aspecto da celulignina aps a deslignificao (a); aps a adio de enzimas e meio (b)
e aspecto aps a pr-hidrlise enzimtica em frascos agitados (c).

Figura 4.9. Celulignina aps deslignificao (a), aps a pr-hidrlise em frascos (b) e aps a prhidrlise enzimtica em biorreator (c).

Aps o tratamento qumico do bagao-de-cana e do pr-tratamento enzimtico, que


resultou em aproximadamente 75,0 g/L de glicose, a cintica do processo SSF foi avaliada em
frascos agitados, por 24-48 horas de fermentao, sob 150 rpm e 37C. Sem o nmero de
fatores suficientes (mnimo de 3) para gerar os pontos centrais de um planejamento, no h
como calcular o impacto das variveis sobre as respostas, obtido pela distribuio de
freqncia, necessria para obteno de uma superfcie de resposta (RODRIGUES, 2010).
Dessa forma, foram adotadas as condies otimizadas por SANTOS (2009), para obteno de
aproximadamente 75 g/L de glicose e, em seguida, os ensaios em frascos agitados foram

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operados com variao da concentrao (1,0; 2,0; 3,0 e 4,0 g/L), para avaliao da
concentrao final de cido succnico e, posterior validao em biorreator.
4.9.3. Processo SSF em biorreator
Os ensaios de fermentao foram realizados em biorreator (BIOFLO III, New
Brunswick), com volume nominal de 1,5 L. O processo foi operado com um volume de meio
para fermentao de 600 mL, sob as mesmas condies anteriores, aps inoculao de
aproximadamente 3,0 g/L de clulas.
Adicionalmente, foi realizada uma fermentao em meio sinttico visando padronizar
uma referncia de comparao com o processo SSF. Neste caso o meio de fermentao foi
preparado simulando a composio em glicose obtida aps a pr-hidrlise enzimtica, de
aproximadamente 81 g/L. A composio de meio utilizado, a exemplo da fermentao a partir
do hidrolisado, foi previamente otimizado por planejamento experimental DCCR para glicose
como fonte de carbono, resultando na mesma composio anterior: K2HPO4, 5.0 g/L; MgSO4,
2.0 g/L, extrato de levedura, 3.0 g/L e NaHCO3; 10 g/L. Cabe ressaltar que todos os
experimentos atravs do processo SSF foram conduzidos com fluxo contnuo de suprimento
externo de CO2 meio de fermentao, a 0,05 vvm.

4.10. Desenvolvimento de um modelo para produo de cido succnico

Os estudos preliminares desenvolvidos nesta etapa visaram o desenvolvimento de


modelos determinsticos para representar o processo biotecnolgico da sntese de cido
succnico, bem como elucidar os estudos do comportamento cintico do processo, identificar
os parmetros mais relevantes, com a finalidade de apresentar uma metodologia mais segura e
eficiente a partir da linhagem selecionada, em trabalhos futuros (SCHMIDELL et al., 2001)

Inicialmente, mediante pesquisa bibliogrfica, um modelo no estruturado do


processo de fermentao de cido succnico foi identificado para a linha M. succiniciproducens
(SONG et al., 2008). O modelo encontrado foi utilizado no presente trabalho, para a linhagem
A. succinogenes e os resultados foram comparados com a literatura.
Fermentaes em diferentes concentraes iniciais de glicose foram conduzidas e os
dados experimentais usados para estimar os parmetros cinticos preditos. Segundo Lunelli &
Maciel (2007), a partir do estudo do modelo simplificado possvel obter o perfil de
concentrao apenas dos principais componentes do processo, como o crescimento celular,
substrato consumido e produto(s) formado(s). Em seguida, os parmetros operacionais
obtidos com o modelo foram analisados e, comparados com os dados experimentais. Para a

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resoluo das equaes diferenciais ordinrias do modelo foi usado, a exemplo dos modelos
encontrados na literatura, o mtodo de Runge-Kutta de 4a ordem (LUNELLI & MACIEL, 2007).

4.10.1. Identificao dos parmetros cinticos


A sntese de cido succnico, a partir de glicose, via rota biotecnolgica se apresenta
como uma heterofermentao. Portanto, um modelo no estruturado simples pode ser
considerado para a obteno dos parmetros cinticos (HYOHA & SEE, 2007). Os
experimentos para o clculo da taxa de crescimento especfico mximo foram realizados
mediante variao na concentrao inicial de substrato, iguais a 2,0; 4,0; 6,0; 10,0; 20,0; 30,0;
40,0; 50,0 e 70,0. Os dados experimentais foram usados para o clculo de parmetros
cinticos e o comportamento desenvolvido pela linhagem A. succinogenes durante a
fermentao foi predito atravs do modelo proposto, e ento comparados com os dados
resultantes dos experimentos. De acordo com Bailey & Olis (1986), a cintica da fermentao
pode ser descrita atravs da taxa de crescimento celular (rX), taxa de formao de produto (rP),
e taxa de consumo de substrato (rS). Considerando o efeito de inibio sobre o crescimento da
bactria A. succinogenes em excesso de substrato, o modelo de Monod que geralmente
usado para representar o crescimento microbiano sob condies de substrato limitante, pode
ser modificado, a exemplo dos estudos de de Song et al. (2008), resultando na seguinte
expresso:

m S
( S + K S + ( S 2 / K I ))

(Equao 4.1)

Onde,
m : taxa de crescimento especfico mximo (h-1),
S : concentrao de substrato (g/L),
KS : constante de saturao do substrato (g/L),
KI : constante de inibio do substrato (g/L)

Em determinados sistemas, o microrganismo pode sofrer uma inibio de forma


gradual em seu crescimento devido a formao de produtos (HA et al., 2003; GE et al., 2006).
Sendo assim, a equao 4.1 no pode ser aplicada, pois a formao de cidos oriundos do
metabolismo celular, em concentraes crticas, pode promover o declnio e/ou morte celular
(KONG et al., 2006; vanNIEL et al., 2003). Uma equao no linear sugerida por
LEVENSPIEL (1980), pode representar matematicamente essa dependncia do crescimento
celular com o produto formado.

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Dessa forma, para valores de P< PCRIT, a equao anterior pode ser representada da
seguinte maneira:

m S

P
1
2
( S + K S + ( S / K I )) PCRIT

(Equao 4.2)

E para valores de P PCRIT, vlido a seguinte expresso:

= Kd ,

(Equao 4.3)

Onde,
m : taxa de crescimento especfico mximo (h-1),
S : concentrao de substrato (g/L),
P : soma das concentraes dos produtos (g/L),
PCRIT : soma das concentraes crticas dos produtos na qual o crescimento celular cessa
totalmente (g/L),
Kd : taxa especfica de morte (h-1), e
X : concentrao de biomassa (g/L).
A bactria A. succinogenes produz o cido succnico como produto principal na
fermentao e, simultaneamente, formam-se os cidos actico, frmico e ltico como
subprodutos (GUETLER et al., 1999). Considerando a soma dos produtos formados e valores
de P > PCRIT, de acordo com a equao anterior, o perfil cintico o crescimento pode ser
representado atravs das seguinte expresso:

m S
P

rX =

2
P X
S
K
S
K
(
+
+
(
/
))
S
I
CRIT

(Equao 4.4)

E considerando valores de P PCRIT, a expresso para o perfil cintico de crescimento


pode ser representado atravs da maneira:

rX = K d X

(Equao 4.5)

Onde, r X a taxa de formao de biomassa (g/L.h) e, X a concentrao de biomassa (g/L).


A formao dos cidos succnico, actico, frmico e ltico pode ser descrita pelo
modelo de Luedeking-Piret (KHAN et al., 2005), que mostra a relao dependente entre a taxa
de formao de produto com rX e X, a seguir:

rP = P rX + P X

(Equao 4.6)

Onde rP denota a taxa de formao do produo(s), dado em g/L.h; representa o


parmetro que est associados ao crescimento celular para formao de produto e o
parmetro de perfil no-associados ao crescimento.

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Sabe-se que o substrato utilizado (glicose) convertido para formao de biomassa,


produtos e tambm parte direcionada para a manuteno energtica da clula. Logo, a partir
de um balano de massa de carbono, a taxa de consume de substrato, pode ser obtida
atravs da seguinte expresso:

rS =

1
1
1
1
1
rX +
rAS +
rAA +
rAF +
rAL + mS X
YX
YAS
YAA
YAF
YAL

(Equao 4.7)

Sendo, rS a taxa de consumo de substrato (glicose), dado em g/L.h; YX, YSA, YAA,

YFA, e YLA so os coeficientes estequiomtricos de rendimento e substrato em biomassa e em


cidos succnico, actico, frmico e ltico, dados em g/g; mS o coeficiente de manuteno
energtica especfica, dado em g/g.h. vlido ressaltar que, quanto mais distante a clula
estiver do timo fisiolgico para execuo das funes metablicas, maior ser o
requerimento de energia necessria para a manuteno celular (PEREIRA JR., 2008).
4.10.2. Modelo proposto para obteno dos parmetros cinticos
Os parmetros cinticos dos modelos foram determinados atravs de uma expresso
chamada Funo Objetivo Z para garantir o minmo de erros possveis, a partir dos dados
experimentais obtidos atravs das fermentaes conduzidas com a linhagem A. succinogenes
(LUNELLI & MACIEL, 2007; SONG et al., 2008)

ZX = (X j.exp X j.sim) , ZP = (Pj.exp Pj.sim) , ZS = (S j.exp S j.sim) ,


n

j=1

j=1

(Eq. 4.8)

j=1

Cabe ressaltar que, os termos de Z representam as diferenciaes quadrticas entre os


dados experimentais (exp) e os simulados (sim) para os perfis cinticos de crescimento celular
(ZX), produto (Zp), e substrato (Zs), respectivamente. O ndice j quantifica o nmero de pontos
dos dados experimentais.
Para facilitar a integrao das equaes do modelo, foi utilizado o mtodo de Runge
Kutta de 4 ordem, contido na biblioteca IMSL, rotina DBCONF do software FORTRAN
(LUNELLI & MACIEL, 2007) .

4.11. Amostragem
Em todos os experimentos foram retiradas alquotas de 2 mL, em mdia, a cada trs
horas, com auxlio de pipetas estreis do mesmo volume. As amostras eram centrifugadas a

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12000 rpm durante 10 minutos, sendo o sobrenadante destinado para dosagens de acares
e produtos, aps de filtrao em membrana de celulose com uma porosidade de 0,22 m.
O sedimentado foi lavado e completado at 2 mL com gua destilada e homogeneizado
em agitador tipo vortex, para promover a ressuspenso das clulas antes da quantificao.
Todos os procedimentos de amostragem foram conduzidos com rigor assptico, em cabine de
fluxo laminar. A Figura 4.10 apresenta um diagrama de blocos com a metodologia utilizada
para o processamento das amostras.

Amostra

Sobrenadante
Filtrao em
membrana de 0,22 m

Centrifugao
12000 rpm/15

Sedimento

Lavagem
c/ gua destilada

Diluio
Diluio
Dosagem de acares e
produtos em HPLC

Quantificao de biomassa por


espectrofotometria

Figura 4.10. Diagrama de blocos para o tratamento das amostras.

4.12. Mtodos Analticos


4.12.1. Determinao de biomassa
A concentrao de massa celular foi acompanhada por espectrofotometria a 600 nm
(LEAL, 1998). Inicialmente, uma curva padro correlacionando o peso da massa seca das
clulas com a absorvncia foi construda. As clulas utilizadas na construo da curva padro
foram cultivadas em frascos cnicos de 100 mL contendo 20 mL de meio de ativao, a 37oC
em agitador rotatrio a 150 rpm. Aps 24 horas de incubao, as clulas foram colhidas,
lavadas e resuspensas em gua destilada. A determinao da concentrao das clulas foi
realizada filtrando 20 mL da suspenso, por filtrao a vcuo, cujo procedimento foi
desenvolvido em triplicata. A pesagem dos filtros, contendo a biomassa retida, foi realizada
at a obteno de peso constante durante secagem a 80oC, em balana de infravermelho.
A curva de calibrao para quantificao de biomassa forneceu a concentrao de
massa celular, atravs da correlao entre concentrao de clulas seca e absorvncia,
seguindo a seguinte equao:
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X=(0,331*Abs)*fd

(Equao 4.9)

Onde,
X = concentrao celular em peso seco (g/L) a 600 nm;
Abs = absorvncia em 600 nm;
fd = fator de diluio empregado na soluo.

4.12.2. Determinaes quantitativas


Inicialmente, a concentrao de glicose e sacarose residual foram medidas no
sobrenadante livre de clulas pelo mtodo oxidase-peroxidase utilizando um kit enzimtico
(Laborclin, Pinhais, Brazil), e uso de curva padro. A concentrao de xilose residual dos
experimentos foi determinada pelo mtodo colorimtrico de Somogyi-Nelson, SOMOGY
(1952). A quantificao das amostras, contendo glicose, xilose, arabinose, sacarose, celobiose
e etanol, foi realizada por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) em cromatgrafo
Waters (Sistema de bombeamento modelo 510, injetor Rheodyne, detector de ndice de
refrao modelo 410), acoplado a uma coluna de troca catinica Aminex HPX-87P, fabricada
pela Bio-Rad. As condies operacionais utilizadas para as anlises encontram-se
especificadas na tabela 4.10.

Tabela 4.10. Condies operacionais do cromatgrafo


Fase mvel:
Vazo de fase mvel:
Presso mxima:
Volume de amostra:
Texterna:
Tinterna:

gua MilliQ desgaseificada


0,6 mL/min
2000 psi
5 L (amostra)
85oC (forno)
40oC (detector)

As concentraes de cido succnico, cido actico, cido ltico e cido frmico (Figura
4.11), foram determinadas por CLAE em cromatgrafo Waters (Sistema de bombeamento
modelo 510, injetor Rheodyne), acoplado a uma coluna C18 (250mm x 4,6 mm, 9 m; StrodsII
Peek), com ndice de deteco no UV, 210 nm, prpria para quantificao de cidos
orgnicos. As condies operacionais utilizadas para as anlises encontram-se na Tabela
4.11..

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Tabela 4.11. Condies operacionais do cromatgrafo


Fase mvel:
100% Tampo Fosfato
Vazo de fase mvel:
0,9 mL/min
Presso mxima:
2000 psi
Volume de amostra:
20 L (amostra)
Texterna
50oC (forno)
Tinterna
35oC (detector)
Fonte: MARTINS et al. (2004 ).

Figura 4.11. Cromatograma tpico com identificao dos cidos orgnicos

As concentraes das substncias analisadas nas amostras foram calculadas por


comparao com padres externos de concentrao conhecida, com reas cromatogrficas
calculadas pelo prprio equipamento.

Conc . da amostra =

rea da amostra conc . do padro


rea do padro

diluio

(Equao 4.10)

4.12.3. Medida do pH
O pH do meio livre de clulas foi determinado utilizando o potencimetro da Marca
Digimed, modelo MS-21, na temperatura de 25C.

4.13. Avaliao de resultados


4.13.1. Clculo de eficincia do processo
A eficincia de cido succnico medida de acordo com a quantidade de cido
sucnico produzido/1 g de substrato consumido (expressos em porcentagem), a partir do
valor de Yp/s terico para A. succinogenes. Para cada 1 mol de substrato so produzidos
1,714 mols de cido succnico (LIU et al., 1999). Logo, a partir da razo 1,714 x
MMAS/MMSUBSTRATO, tm-se o rendimento mximo terico.

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Clculo de eficincia :
(Equao 4.11)
Onde, Yp/s (Terico) para glicose = 1,12 g.g-1,
Yp/s (Terico) para xilose = 1,34 g.g-1
(MMGl) Massa molecular da glicose = 180 g
(MMXl) Massa molecular da xilose = 150 g
(MMAS) Massa molecular do cido succnico = 118,09 g
4.13.2. Taxa instantnea especfica de crescimento microbiano
Durante o intervalo de tempo (dt), o aumento de nmeros de microrganismos (dx), na
fase exponencial, onde as clulas absorvem os nutrientes, sintetizando seus constituintes,
crescendo e se duplicando, pode ser representado por:

1 dX
dX
= X = .
dt
X dt

= d.

[ ]

LnX 1
T
dt

(Equao 4.12)

Onde: a taxa instantnea especfica de crescimento por unidade de tempo = x


(taxa especfica de crescimento, na fase exponencial). Ao plotar o grfico Ln X versus Tempo,
a tangente a cada ponto da curva obtida fornece o valor de , durante a fase exponencial de
crescimento. Analogamente, as taxas especficas para formao de produto e consumo de
substrato, em g/g.h, so representados por:

qp =

1 dP
.
X dt

qs =

1 dS
.
X dt

(Equao 4.13)

Os valores das taxas de crescimento celular (rx), de consumo de substrato (rg),


formao dos cidos succnico (rs), cido actico (ra) e cido frmico (rs), foram obtidas
plotando-se a concentrao celular, substrato ou produto com o tempo.
4.13.3. Tempo de duplicao
Tempo de gerao (tg) que o tempo de duplicao da massa celular pode ser
representado por:
Ln 2X0/X0 = x tg

tg = Ln 2 / m

td = 0,693/

(Equao 4.14)

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4.13.4. Variveis de Resposta


Os parmetros prprios de processos de fermentao foram considerados da seguinte
forma:

a) Fator de rendimento de produo de cido succnico (g/g)

Y P / S = (P S ) = (P Po

) (S o

S)

(Equao 4.15)

Sendo:
P:
Po:
S:
So:

Concentrao final de cido succnico (g/L)


Concentrao inicial de cido succnico (g/L)
Concentrao final de substrato (g/L)
Concentrao inicial de substrato (g/L)

b) fator de rendimento para crescimento celular (g/g)

YX

/ S

= (X S ) = ( X X o

) (S o

S)

(Equao 4.16)

Sendo:
X:
Xo:
S:
So:

Concentrao final de biomassa (g/L)


Concentrao inicial de biomassa (g/L)
Concentrao final de substrato (g/L)
Concentrao inicial de substrato (g/L)

c) Produtividade volumtrica (g/L.h)


Q

(P

Po

(Equao 4.17)

Sendo:
P:
Po:
tf:

Concentrao final de cido succnico (g/L)


Concentrao inicial de cido succnico (g/L)
Tempo de fermentao (h)

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CAPTULO 5
RESULTADOS E DISCUSSO

O presente captulo foi destinado exposio e discusso dos resultados, obtidos a


partir da concluso dos experimentos planejados para elaborao da tese. Nos estudos sobre
a otimizao dos parmetros operacionais, foram desenvolvidos planejamentos experimentais
sequenciais e os efeitos de impacto sob a varivel de resposta foram analisados a partir de
metodologias de superfcie de resposta (MSR), definindo as condies timas para a
conduo do processo. Para finalizar, foram iniciados estudos preliminares de modelagem,
atravs de analogias abstratas que possibilitam a predio de fenmenos inerentes ao
processo, como a inibio pelo substrato e pelo produto. Para visualizar os estudos acerca do
modelo gerado, os perfis cinticos para o consumo de substrato, formao de produto e o
crescimento celular foram apresentados.

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5.1. Levantamento de informaes e panorama geral das pesquisas sobre cido


succnico
A partir de pesquisas realizadas pela base de dados do software SciFinder, que inclui
modelos de estrutura qumica e pesquisas pela combinao e reao entre elementos, que
podem ser empregados para verificar informaes em atividades de pesquisa, na psgraduao, um levantamento de informaes pertinentes foram sumarizadas na presente
seo. Ao utilizar o software, foram encontradas 212 referncias correlacionando o termo
cido succnico com Actinobacillus succinogenes e, 110 especificamente, sobre a
produo de cido succnico.
A Figura 5.1.mostra que o nmero de depsitos de patentes, sobre a produo de
cido succnico, at 2009 ainda relativamente baixo, enquanto o nmero de trabalhos
publicados aumentou exponencialmente nos ltimos quatro anos.

Figura 5.1. Nmero de patentes (Patent) e Trabalhos publicados (Article), sobre a produo
de cido succnico, at o ano de 2010. Fonte: ScienceFinder (2011)
Em 2003, foi depositada a primeira patente abordando o tema aproveitamento de
materiais lignocelulsicos, com os resultados obtidos por LEE et al. (2003). Em 2006, os
estudos envolvendo o uso de microrganismo geneticamente modificado (E.coli), para
produo de cido succnico, foram patenteados por BENNET et al. (2006). Em 2009 podem
ser encontrados os trabalhos patenteados por LAURENTE & BENNET (2009), que
apresentaram um review, abordando os diversos processos j estudados para a produo de
cido succnico; os resutados obtidos por LEE et al. (2009), onde foram realizadas
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modificaes genticas em M. succiniproducens e, tambm, o trabalho envolvendo estudos de


mutao com Sacharomyces cerevisiae e Aspergilus Nger por RENE et al. (2009).
A Figura 5.2 mostra que a maioria dos trabalhos foi publicada nos seguintes peridicos,
em ordem decrescente: Applied Microbiology and Biotechnology (15), Applied Biochemistry
Biotechnology (11) e Journal Industrial Microbiology and Biotechnology (9), que inclui uma das
publicaes do presente trabalho.

Figura 5.2. Peridicos com maior nmero de publicaes (a) e os temas mais estudados (b),
at o ano de 2010. Fonte: ScienceFinder (2011)
Entre outras informaes, como nome de autores e regies (pases, universidades)
com maior quantidade de publicaes (artigos, patentes e teses), o software tambm
apresenta os temas mais recorrentes acerca desta temtica, onde a rea de processos
fermentativos e o uso de Actinobacillus succinogenes encontram-se entre os mais discutidos
na literatura.

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5.2. Morfologia da linhagem Actinobacillus succinogenes


Os experimentos tiveram incio aps a ativao das clulas, armazenadas em ampolas
de liofilizao. Por se tratar de uma linhagem recentemente descoberta (GUETLER et al.,
1996), as caractersticas morfolgicas (formato, dimenso e arranjo celular) foram
rotineiramente observadas em microscopia, durante os estudos de crescimento celular. Cabe
ressaltar, que as observaes microscpicas foram efetuadas apenas para motitorar a pureza
da cultura, pois o foco do presente trabalho estava voltado para a engenharia do bioprocesso,
conforme mencionado anteriormente.
A Figura 5.3a, mostra uma microfotografia de uma colnia de clulas, mediante o uso
da tcnica colorimtrica Gram. Atravs da colorao rosa foi possvel confirmar a composio
e textura do tipo Gram (-), de acordo com a parede celular da bactria Actinobacillus
succinogenes CIP 106512.

a)

b)

Figura 5.3. Observao microscpica das linhagens com aumento de 1000 vezes. a)
Actinobacillus succinogenes CIP 106512; b) Actinobacillus succinogenes 130Z (DATTA, 1992)

Alm da existncia de uma camada peptideoglicana, as bactrias Gram (-) apresentam


uma membrana externa (lipopolissacardeos e protenas) a sua parede celular (TORTORA &
FUNKE, 2004). As dimenses de bactrias do genro Actinobacillus variam de 0,4 a 1,0 m,
podendo atingir, ocasionalmente, 6,0 m quando presentes em um meio contendo glicose,
xilose, sacarose ou maltose. Possuem respirao anaerbica facultativa, com crescimento
ideal a 37C, podendo apresentar variaes quanto a sua morfologia, visualmente esfrica,
oval ou, de maneira geral, em forma de bacilos (BERGEY & HOLT, 1994).
Tais mudanas morfolgicas na bactria ocorrem de acordo com a fase de
crescimento, com formato bacilo na fase lag e exponencial, para formas de espiral na fase de
desacelerao do crescimento. DATTA et al. (1992) observaram a mesma variao
morfolgica em estudos realizados com Actinobacillus succinogenes 130Z, a partir de glicose
como fonte de carbono.

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108

5.3. Padronizao da metodologia para ativao celular e preparo de inculo

A etapa de propagao celular um procedimento de suma importncia para


ampliao em escala, durante processos fermentativos. Para evitar o perodo marcado por
uma fase de aclimatao, durante o cultivo de novas clulas, repiques realizados 24 horas
antes de cada experimento foi desenvolvido.
Com o objetivo de padronizar o tempo utilizado em cada uma das etapas de
propagao celular (cultura de ativao e obteno de inculo) foi realizado o monitoramento
das principais variveis do processo: crescimento celular e concentrao de cido succnico.

5.3.1. Cultivo de ativao em meio sinttico

Inicialmente, os ensaios para obteno de clulas viveis (pr-inculo) foram


realizados em meio sinttico, conforme mencionado no captulo anterior. As concentraes da
fonte de carbono (glicose), cido succnico e de biomassa, foram analisadas. Cabe ressaltar,
que todos as etapas de pr-inculo do presente trabalho foram realizadas a partir de glicose,
devido a estequiometria para manuteno de potencial redox do metabolismo, garantindo um
bom desempenho face ao crescimento celular.
Uma quantidade suficiente de experimentos foi desenvolvida para constatar e
padronizar o tempo necessrio para o preparo do pr-inculo. Para garantir uma alta
concentrao de clulas e um estado metablico adequado, foi escolhido um tempo final para
o cultivo de ativao de 24 horas para todos os ensaios iniciais. Nesse perodo as clulas j
alcanavam a fase final da faixa de crescimento exponencial.
De acordo com a Figura 5.4, o tempo de aclimatao (fase lag) foi praticamente
inexistente, tendo a concentrao celular aumentado com o correspondente consumo de
substrato e formao de cido succnico. Observa-se o esgotamento da fonte de carbono
aps 15 horas de fermentao, tendo a biomassa se estabilizado em 0,74 g/L e com uma
concentrao final de cido succnico de 4,16 g/L.
O tempo de duplicao (Equao 4.17) foi de 3,72 horas e taxa especfica de
crescimento (x) de 0,186 h-1. Aps as 12 horas, a fermentao ficou caracterizada pelas fases
de desacelerao e estacionria do crescimento celular, para ambas as fontes de carbono
utilizadas.

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25

10

20

15

10

Biomassa (g/L)
c. Succnico (g/L)

Glicose (g/L)

109

0
0

10

15

20

Tempo (h)
Glicose

c. Succnico

Biomassa

Figura 5.4. Cintica de crescimento do cultivo de ativao da bactria A. succinogenes CIP


106512 em meio sinttico, para glicose (20 g/L).

5.3.2. Cultivo de crescimento para obteno de inculo


As clulas ativadas, nas condies descritas anteriormente, foram utilizadas para a
obteno do inculo. Cabe ressaltar, que dois tipos de meio foram avaliados para essa etapa,
um meio que continha xilose comercial (meio sinttico) e outro onde foi utilizado hidrolisado
hemiceululsico em propores apropriadas para obter uma concentrao de xilose prxima
utilizada no meio sinttico (20 g/L).
Cabe ressaltar que a metodologia usada para propagao celular foi realizada de
forma semelhante para o uso de glicose, em ensaios paralelos, uma vez que a utilizao de
celulignina, para obteno de cido succnico, tambm foi investigada no decorrer da tese.
Nas Figuras 5.5 e 5.6 so apresentados os perfis cinticos do inculo em meio sinttico
com 20 g/L de fonte de carbono (xilose e glicose), onde a formao de produto ocorreu de
forma associada ao crescimento, para ambos os casos. Nesta etapa, a exemplo do que
ocorreu no ensaio anterior, no houve uma fase de aclimatao, sendo tambm observado um
perfil de crescimento exponencial da bactria desde o incio do processo, constatado pela
linearizao desta fase. Este comportamento caracterstico de cultivos nos quais as clulas
foram devidamente ativadas, validando-se assim as condies utilizadas para o cultivo de
ativao descrito anteriormente.

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110
25

Xilose (g/L)

4
15
3
10
2
5

Biomassa (g/L)
c. Succnico (g/L)

20

0
0

10

15

20

Tempo (h)
Xilose

c. Succnico

Biomassa

Figura 5.5. Cintica de crescimento do inculo (A. succinogenes CIP 106512) em meio sinttico,
para xilose (20 g/L)

25

Glicose (g/L)

4
15
3
10
2
5

Biomassa (g/L)
c. Succnico (g/L)

20

0
0

10

15

20

Tempo (h)
Glicose

c. Succnico

Biomassa

Figura 5.6. Cintica de crescimento do inculo (A. succinogenes CIP 106512) em meio sinttico,
para glicose (20 g/L)

Em aproximadamente 18 horas de fermentao, a xilose foi totalmente esgotada, com


uma concentrao de 5,20 g/L de cido succnico e 1,20 g/L de biomassa. Para o perfil com
glicose, a concentrao de biomassa se estabilizou em 0,98 g/L, com uma concentrao de
4,85 g/L de cido succnico, em aproximadamente 14 horas de fermentao.
A Figura 5.7 mostra o comportamento observado para o cultivo de inculo em meio
contendo o hidrolisado hemicelulsico diludo, cujo perfil foi semelhante ao obtido
anteriormente, porm, o esgotamento de xilose ocorreu de forma mais lenta, sendo consumida
em aproximadamente 23 horas de fermentao. De toda forma, os resultados sinalizam para
importantes deslocamentos tecnolgicos, como o aproveitamento e utilizao da frao

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111

hemicelulsica,

oriunda

do

pr-tratamento

de

biomassa

residual

de

composio

lignoeclulsica.

Figura 5.7. Cintica de crescimento do inculo (A. succinogenes CIP 106512) contendo
hidrolisado diludo
Para o crescimento celular, tambm foi observado um tempo maior para atingir a
estabilizao, de aproximadamente 18 horas. Aps esse perodo as concentraes de cido
succnico e biomassa foram de 5,3 g/L e 1,0 g/L, respectivamente.
Na Tabela 5.1 esto sumarizados os resultados mais relevantes obtidos com o
processo do crescimento celular (inculo), analisados no final da fase exponencial de
crescimento, para cada ensaio, durante o processo de fermentao proposto por um perodo
de 24 horas de processo.
Tabela 5.1. Parmetros relevantes nos processos de propagao de clulas de A.
succinogenes CIP 106512 (cultivo de inculo) obtidos com um tempo total de fermentao de
24 horas.
Processo

S0
(g/g)

T
(h)

X
(g/L)

x
(h1)

td
(h)

*QP
(g/L.h)

YP/S
(g/g)

YX/S
(g/g)

AS
(g/L)

Cultivo de Ativao
em Meio Sinttico
(Glicose)

21,5

24

0,82

0,186

3,72

0,346

0,454

0,0396

4,16

Inculo em Meio
Sinttico (Glicose)

21,0

24

0,98

0,273

2,53

0,415

0,240

0,0476

4,98

Inculo em Meio
Sinttico (Xilose)

20,9

24

1,2

0,305

2,13

0,433

0,261

0,0462

5,20

Inculo em
Hidrolisado Diludo

22,0

24

0,9

0,278

2,49

0,378

0,252

0,0379

5,30

*O tempo utilizado como base de clculo para obteno do valor de produtividade refere-se ao
tempo de esgotamento total da fonte de carbono, necessrio para obteno do valor mximo de
concentrao final de cido succnico (AS) e crescimento celular, em cada perfil descrito.
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112

Observa-se que o fator de rendimento em biomassa (YX/S) foi ligeiramente inferior no


ensaio com hidrolisado hemicelulsico, durante o preparo do inculo, possivelmente pela
presena de inibidores no hidrolisado. Porm, de uma forma geral, as concentraes finais de
biomassa mantiveram-se bastante prximas. Cabe destacar que em nenhum dos casos
avaliados houve fase lag, indicando que os procedimentos de ativao e propagao celular
foram adequados. Com estes resutlados iniciais, foi possvel registrar a capacidade da
linhagem em consumir xilose e glicose, abrindo uma oportunidade para o aproveitamento e a
utilizao das fraes hemicelulsica e celulsica, oriundas do pr-tratamento de biomassa
residual de composio lignocelulsica.

5.4. Processo de fermentao mediante estratgias de aclimatao celular

Na Figura 5.8 apresentado o perfil cintico para fermentao em meio sinttico, que
foi utilizado como referncia para as fermentaes realizadas em presena do hidrolisado, ou
seja, com concentrao inicial de xilose de aproximadamente 52 g/L. O esgotamento da fonte
de carbono ocorreu aps 22 horas, com uma concentrao final de cido succnico igual a
15,5 g/L, com concentrao celular de aproximadamente 2,8 g/L.

60

25

20

40
15
30
10
20
5

10
0

Biomassa (g/L)
c. Succnico (g/L)

Xilose (g/L)

50

0
0

10

15

20

25

30

Tempo (h)
Xilose

Biomassa

c. succnico

Figura 5.8. Cintica de fermentao de em meio sinttico


A Figura 5.9 apresenta o perfil cintico para o crescimento celular, consumo de
substrato e formao de produto, separadamente, para facilitar a compreenso de
desempenho entre as fermentaes desenvolvidas com hidrolisado hemicelulsico, mediante
a metodologia de aclimatao, para ambos os casos.

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113
60

c. su ccn ico (g/L)

20

50

Xilose (g/L)

B io m a ssa (g/L)

3
2

40
30
20

10

10

20 30
Tempo (h)

40

50

15
10
5
0

10

20

30

40

Tempo (h)

50

10

20 30 40
Tempo (h)

50

Figura 5.9. Perfil de crescimento celular (a), de consumo de xilose (b) e de formao de produto
(c), em fermentaes de hidrolisado hemicelulsico utilizando clulas previamente cultivadas em
diferentes estratgias de propagao: aclimatao celular em duas etapas, com 25 e 50% de
hidrolisado (); uma etapa, 25% de hidrolisado () e no aclimatadas ()

Pela anlise do crescimento celular, nota-se que ocorreu um aumento da concentrao


de clulas conforme foram implementadas as etapas de aclimatao durante o processo de
propagao celular. No caso em que foram utilizadas duas etapas de aclimatao foi
alcanada a mxima concentrao celular (3,4 g/L), em um perodo de fermentao menor em
relao s outras estratgias, as quais apresentaram valores de concentrao celular
inferiores. De acordo com BETANCUR et al. (2010), os microrganismos consomem de forma
mais eficiente o substrato, quanto maior o grau de aclimatao, a exemplo de processos de
fermentao, por Pichia stipitis a partir de licor sulftico.
Para o consumo de substrato, um comportamento similar tambm foi observado. A taxa
de consumo foi semelhante durante as primeiras 8 horas, para todos os casos. Porm, para a
fermentao a partir de clulas aclimatadas em duas etapas, a taxa de consumo foi mantida
durante todo o processo, levando um tempo total de fermentao de 28 horas, prximo ao
observado no processo realizado em meio sinttico, de 26 horas (Figura 5.8). Nos
experimentos com clulas no aclimatadas e aclimatadas, em uma nica etapa, a taxa de
consumo caiu com o decorrer do tempo, sendo o substrato completamente esgotado em 48 e
36 horas de fermentao, respectivamente.
No perfil de formao de produto, o processo com clulas aclimatadas em duas etapas
apresentou o melhor resultado, com uma concentrao final de produto (16,0 g/L) e a
produtividade volumtrica em cido succnico (0,61 g/L.h) superiores aos respectivos valores
encontrados para os perfis com uma nica etapa de aclimatao celular (12,0 g/L e 0,33 g/L.h)
ou com clulas sem aclimatao (10,0 g/L e 0,20 g/L.h).
A Tabela 5.2 apresenta os parmetros analisados de forma mais objetiva, como: tempo
de fermentao (tf), concentrao final de cido succnico (P) e biomassa (X), fator de

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rendimento em biomassa (YX/S), em produto (YP/S), e produtividade volumtrica de cido


succnico (QP).

Tabela 5.2. Variveis de Resposta na Avaliao do Efeito da Aclimatao.


S0

*tf
(h)

P
(g/L)

X
(g/L)

Em Hidrolisado com Clulas


No Aclimatadas

51,0

48

10,0

2,3

Em Hidrolisado com Clulas


Aclimatadas Em Uma Etapa

50,5

36

12,0

Em Hidrolisado com Clulas


Aclimatadas em Duas Etapas

49,8

28

Em Meio Sinttico

51,4

26

Fermentao

**YP/S
(g/g)

**YX/S
(g/g)

QP
(g/L.h)

0,195

0,014

0,20

2,7

0,259

0,024

0,33

16,0

3,4

0,330

0,033

0,61

15,0

2,8

0,284

0,020

0,67

* tf :Tempo necessrio para o esgotamento total de xilose e crescimento celular


** Clculos de rendimento em funo do consumo de xilose

O fator de rendimento em produto (YP/S) apresentou um aumento com as etapas de


aclimatao no processo de propagao celular, ultrapassando o valor obtido com a
fermentao conduzida em meio sinttico, realizada como controle comparativo. Cabe
ressaltar, que alm da xilose, foram detectados no hidrolisado, glicose, em concentraes de
at 3 g/L, e arabinose, em concentraes de at 8 g/L. A glicose foi consumida durante as
primeiras horas de cultivo sem influenciar fermentao, enquanto o consumo de arabinose
no foi constatado no decorrer de ambos os processos analisados. Alm disso, nota-se que a
concentrao final de cido succnico para aclimatao em duas etapas foi muito prxima do
valor obtido em meio sinttico, com uma diferena de apenas 9 %.
A produtividade volumtrica (QP) aumentou de 0,20 g/L.h com clulas no aclimatadas,
para 0,33 g/L.h com clulas aclimatadas em uma etapa e, finalmente, atingiu o valor de 0,61
g/L.h no caso de clulas aclimatadas em duas etapas. Este incremento deve-se ao o aumento
progressivo da concentrao final de cido succnico e, principalmente, queda no tempo no
tempo de fermentao do processo.
Dessa forma, pode-se concluir que a incluso de duas etapas de aclimatao, durante
o processo de propagao celular, permitiu a reduo do tempo de fermentao, alm de
aumentar a concentrao de cido succnico, com efeitos positivos sobre a produtividade.
Normalmente, o meio de cultivo importante para o rendimento dos produtos da
fermentao. Fatores tais como concentrao inicial de acar, fontes complexas de
nitrognio, concentraes de ons carbonato, pH e temperatura do meio de crescimento so
reportados como os fatores mais crticos que afetam tanto o crescimento celular como a
formao de produto (SAMUELOV et al., 1991; NGHIEM et al., 1997; LEE et al., 1999a, b).
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5.5. Avaliao do efeito da fonte de carbono e influncia da relao C:N no


crescimento celular

De acordo com Gonzales et al. (2008), a razo carbono-nitrognio (C:N) no meio um


dos fatores mais importantes que influenciam o crescimento celular e a produo de
metablitos de muitos processos fermentativos. Portanto, para a otimizao dos processos de
fermentao, devem ser estudadas as melhores razes de C:N presentes no meio (MADIHAH
et al., 2001; ROSFARIZAN & ARIFF, 2000; NDEGWA & THOMPSON, 2000).
Os ensaios realizados nesta etapa foram baseados nos estudos sobre os efeitos da
razo C:N e da fonte de carbono de Gonzales et al. (2008), com diferenas em relao
composio do meio de cultivo e condies de processo (metodologia de incorporao de
CO2). Foram utilizadas como fontes de carbono glicose e xilose e realizados um total de 10
ensaios com meios apresentando diferentes razes C:N, que variaram entre 2.6:1 at 35.1:1.
A Figura 5.10 mostra os efeitos de xilose glicose sobre o crescimento celular da linhagem
Actinobacillus succinogenes. A priori, nota-se que os valores com concentraes celulares
ligeiramente maiores foram obtidas com os experimentos envolvendo o uso de xilose como
substrato. Resultados com este perfil cintico tambm foram encontrados por Gonzales et al.
(2008), onde os autores estudaram tambm o uso de sacarose como fonte de carbono.

xilose

1,4

glicose

Biomassa (g/L)

1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
2,5
5 7,5
15 17,5 19,4
20 22,5
30 32,5
35
2,6 5,2
7,4 10
9,7 12,5
13 16,2
22,7 25
25 27,5
27 29,1
32 35,1

Relao C:N

Figura 5.10. Efeitos de diferentes fontes de carbono sobre a produo de biomassa

Os maiores valores de concentrao celular a partir de xilose e glicose, em 24 horas de


processo foram iguais a 1,3 e 1,28 g/L, respectivamente. As Figuras 5.11 e 5.12 mostram os
efeitos da razo C:N no crescimento celular e verifica-se que os resultados mais prximos
esto entre 12,5 e 25:1. No entanto, diferena pouco significativa foi observada entre os
valores de mximas concentraes de biomassa.
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116

Figura 5.11. Crescimento celular em presena de xilose ecomo fonte de carbono.


* Colunas com diferentes letras representam diferena significativa em um intervalo de confiana de 95%,
pelo teste de Tukey.

Figura 5.12. Crescimento celular em presena de glicose ecomo fonte de carbono.


* Colunas com diferentes letras representam diferena significativa em um intervalo de confiana de 95%,
pelo teste de Tukey

Valores ligeiramente maiores do que estes foram encontrados por Gonzales et al.
(2008), porm semelhantes. Os autores encontram at 1,6 g/L de biomassa ao realizar os
ensaios com xilose. Pode-se notar que uma reduzida quantidade de nitrognio nos ensaios
com elevadas razes C:N no limitou o crescimento bacteriano, sinalizando para uma maior
influncia por parte da fonte de carbono em relao a fonte de nitrognio (MADIHAH et al.,
2001). HEERDE & RADLER (1978) investigaram a produo de cido succnico, sob
condies anaerbicas, atravs de Saccharomyces cerevisiae, e verificaram que as fontes de
nitrognio tiveram maior influncia sobre a converso de glicose em cido succnico.
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117

A maioria dos microrganismos sofre inibio do crescimento celular em concentraes


iniciais de glicose como fonte de carbono acima de 20,0 g/L (GONZALES et al., 2008;
CORONA et al., 2008). Porm, observando-se a Tabela 5.3 e as figuras anteriores, nota-se
que no houve inibio do crescimento celular nos experimentos com xilose, indicando que a
bactria Actinobacillus succinogenes se desenvolve adequadamente em concentraes de at
55,0 g/L conforme tambm foi constatado por Gonzales et al., 2008. Porm, quando utilzada a
glicose como fonte de carbono verifica-se um relativa reduo do crescimento celular,
sugerindo um comeo de inibio para concentraes acima de 36 g/L (C:N 22.5:1-29.1:1).
Comportamento semelhante foi observado por outros autores, alm de Gonzales et al. (2008)
durante experimentos com variao na concentrao inicial de glicose, entre 10 e 90 g/L, por
CHEN et al. (2010), onde efeitos de inibio sobre o crescimento de Actinobacillus
succinogenes NJ113 foram observados em 50 g/L de glicose.
Verifica-se que para os diferentes ensaios, os resultados foram semelhantes nos dois
experimentos (glicose e xilose), principalmente para as razes C:N entre os nmeros de
ensaios (N.E) 5 e 8, com exceo da razo C:N de 16.2:1 para glicose como fonte de carbono.
Tabela 5.3. Influncia da concentrao inicial de substrato e da razo C:N no crescimento
celular e concentrao de cido succnico.

N.E

Glicose
e
Xilose
(g/L)

Biomassa (g/L)
C:N

1
4,0
2,6:1
2
8,0
5,2:1
3
10,0
6,5:1
4
15,0
9,7:1
5
20,0
13:1
6
25,0
16,2:1
7
30,0
19,4:1
8
35,0
22,7:1
9
45,0
29,1:1
10
55,0
35,1:1
N.E: Nmero de ensaios

Xilose
0,5
1,17
1,16
1,3
1,2
1,22
1,24
1,3
1,15
1,2

Glicose
0,3
0,72
1,16
1,14
1,3
1,15
1,29
1,25
1,2
1,18

cido succnico
(g/L)

Xilose
1,7
3,2
5,3
5
6,5
6
5,7
6,1
5,3
7,5

Glicose
1
2,6
4,8
5
5,7
5,5
5,2
5,8
4,9
4,4

Pode-se verificar ainda que, na maioria dos ensaios, houve um sinergismo entre o
crescimento celular e a produo do cido succnico. Estes resultados mostram que os limites
tolerveis de C:N para o mximo crescimento celular apresentam uma ampla faixa,
possibilitando o uso de diferentes razes C:N (WU et al., 2004), confirmando a adequao da
linhagem face utilizao diversas fontes de carbono, como xilose e glicose.

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118

Adicionalmente, as Figuras 5.13 e 5.14, mostram os efeitos das diferentes relaes C:N
na produo cido succnico, para xilose e glicose, respectivamente.
8

xilose

glicose

c. succnico (g/L)

6
5
4
3
2
1
0
2,6 5,2
7,4 10
9,7 12,5
13 16,2
17,5 20
19,422,5
22,725
25 27,5
27 29,1
32 35,1
2,5
5 7,5
15 17,5
30 32,5
35

Relao C:N

Figura 5.13. Efeitos de diferentes fontes de carbono sobre a concentrao final de cido succnico
8

xilose

c. succnico (g/L)

glicose

6
5
4
3
2
1
0

2,6
2,5

5,2
5

6,2
6,5

9,7
10

13
12,5 16,2
15

19,4
20

22,7
25

29,1
30

35,1
35

Relao C:N
Figura 5.14. Efeitos de diferentes fontes de carbono sobre a concentrao final de cido succnico

Foi possvel concluir que o crescimento celular e a produo de cido succnico foram
reduzidos em presena de glicose, com concentrao acima de aproximadamente 40 g/L. Os
resultados obtidos esto de acordo com as afirmaes reportadas na literatura, a respeito da
habilidade da bactria A. succinogenes para a produo de cido succnico a partir de uma
variedade de substratos, como celobiose, frutose, galactose, lactose, maltose, manitol,
manose, sorbitol, glicose, xilose e sacarose, em condies adequadas de processo
(GUETLER et al., 1998).
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119

As etapas seguintes referem-se aos estudos de otimizao. Para desenvolver um


processo com a mxima produo de cido succnico, deve-se delinear um planejamento
experimental e padronizar as condies de produo e meio de cultivo (ISAR et al., 2006a).

5.6. Planejamentos experimentais seqenciais para otimizao das condies do


processo
Para avaliar a influncia de dos nutrientes utilizados para a composio do meio de
fermentao, foi realizado um Planejamento Experimental Fatorial Fracionrio PFF 24-1,
seguido de um Delineamento Composto central Rotacional (DCCR).
5.6.1. Planejamento Experimental Fatorial Fracionado 24-1

As Tabelas 5.4 e 5.5, apresentam os resultados obtidos a partir do Planejamento


Fatorial Fracionrio PFF 24-1 (8 experimentos com adio de dois pontos centrais), tendo como
varivel de resposta a concentrao final de cido succnico, aps 24 horas de fermentao
para xilose e glicose, respectivamente.
Tabela 5.4. Matriz experimental do PFF 24-1 e concentrao final de cido succnico, para
xilose como fonte de carbono
Parmetros e nveis reais
Ensaios

1
2
3
4
5
6
7
8
9 (PC)
10 (PC)
11 (PC)

K2HPO4
(g/L)

MgSO4
(g/L)

0.0
10.0
0.0
10.0
0.0
10.0
0.0
10.0
5.0
5.0
5.0

0.0
0.0
2.0
2.0
0.0
0.0
2.0
2.0
1.0
1.0
1.0

C
Extrato de
Levedura
(g/L)
0.0
0.0
0.0
0.0
5.0
5.0
5.0
5.0
2.5
2.5
2.5

Resposta
D
NaHCO3
(g/L)
0.0
10.0
10.0
0.0
10.0
0.0
0.0
10.0
5.0
5.0
5.0

cido succnico
(g/L)
5.53
4.74
8.36
5.96
7.66
4.96
6.08
9.02
7.16
7.58
7.23

Total: 8 ensaios com 3 repeties do ponto central - PC

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120

Tabela 5.5. Matriz experimental do PFF 24-1 e concentrao final de cido succnico, para
glicose como fonte de carbono
Parmetros e nveis reais
Ensaios

1
2
3
4
5
6
7
8
9 (PC)
10 (PC)
11 (PC)

K2HPO4
(g/L)

MgSO4
(g/L)

0.00
10.00
0.00
10.00
0.00
10.00
0.00
10.00
5.00
5.00
5.0

0.00
0.00
2.00
2.00
0.00
0.00
2.00
2.00
1.00
1.00
1.0

C
Extrato de
Levedura
(g/L)
0.00
0.00
0.00
0.00
5.00
5.00
5.00
5.00
2.50
2.50
2.5

Resposta
D
cido succnico
(g/L)

NaHCO3
(g/L)
0.00
10.00
10.00
0.00
10.00
0.00
0.00
10.00
5.00
5.00
5.0

4.06
3.21
6.83
4.43
6.13
3.43
4.55
7.49
6,15
6.38
6,12

Total: 8 ensaios com 3 repeties do ponto central - PC

A anlise estatstica dos modelos foi realizada usando ANOVA. Os valores obtidos
mostram que a concentrao de cido succnico variou de 4.74 a 9.02 g/L e 3,21 a 7,49 g/L
para os ensaios conduzidos a partir de xilose e glicose, respectivamente.
Para as duas fontes de carbono, os resultados apresentaram comportamento
semelhante. As maiores concentraes de cido succnico tiveram como caracterstica a
presena de NaHCO3 no meio de fermentao. No caso do experimento 2, onde tambm foi
utilizada NaHCO3, a baixa concentrao de cido succnico pode ser explicada pela ausncia
tanto de extrato de levedura como de MgSO4.
Nas fermentaes em que foi utilizado extrato de levedura, a concentrao de cido
succnico esteve acima de 7,0 e 6,0 g/L (experimentos 3, 5, 8, 9 e 10) para xilose e glicose,
respectivamente; exceto para os ensaios de nmero 6. Nesses experimentos, apesar de ter
sido utilizado o maior nvel de extrato de levedura, a ausncia de MgSO4 e NaHCO3 pode ter
levado baixa concentrao de cido succnico obtida, sinalizando para a importncia de
interao entre estes componentes do meio.
Concentraes acima de 5,96 e 4,43 g/L (xilose e glicose) de cido succnico foram
obtidas sempre que a soluo de MgSO4 foi adicionada ao meio de fermentao, com
exceo do experimento 5. No entanto, para este ensaio, o extrato de levedura e NaHCO3
estiveram presentes em nveis superiores. Os maiores valores de concentrao final de cido
succnico (9,02 e 7,49 g/L para xilose e glicose, respectivamente) foram obtidos coma adio
de todos os nutrientes nas dosagens estimadas em nvel superior (ensaio 8): K2HPO4, 10.0
g/L; MgSO4 2.0 g/L; extrato de levedura 5.0 g/L e NaHCO3 10.0 g/L.
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Para o processo de fermentao, usando xilose como fonte de carbono, a


concentrao de cido succnico foi relativamente maior do que o valor encontrado por KIM et
al. (2004), que obtiveram aproximadamente 7,0 g/L de cido succnico, em condies de
cultivo similares.
A adio de fosfato di-bsico de potssio (K2HPO4) no meio de fermentao no
apresentou efeito estatisticamente significativo sobre a concentrao final de cido succnico.
Apesar disso, cabe ressaltar que as menores concentraes de cido succnico, foram
resultantes das fermentaes que continham fosfato no nvel superior (experimentos 2 e 6),
sendo estas concentraes menores que aquela apresentada no ensaio 1, onde no h
adio de nutrientes e, foi produzido 5,53 e 4,06 g/L de cido succnico para xilose e glicose,
respectivamente.
Os resultados sugerem tambm a necessidade da adio conjunta de soluo de
MgSO4 e NaHCO3 (corridas 3 e 8, por exemplo) para a alcanar bons resultados. Essa
interao constatada com as baixas concentraes obtidas nas fermentaes em que foram
adicionadas de forma exclusiva a soluo de MgSO4 ou NaHCO3, apesar da presena de
KH2PO4 no meio (corridas 1, 2 e 4).
A seguir, a anlise de varincia (ANOVA) apresenta importantes dados do experimento,
como os valores de Probalidade de Fisher, que indica a significncia estatisica dos fatores
avaliados, as suas interaes, erros e a falta de ajuste do experimento. A soma dos
quadrados (SM) dos fatores, interaes e resduos (Lack of fit somado ao erro puro) tambm
representam alternativas para a avaliao do experimento e a escolha do modelo. Quanto
maior o valor da soma dos quadrados maior o efeito estimado dos fatores avaliados sobre a
resposta do processo (RODRIGUES, 2010)
De acordo com a anlise de varincia (Tabelas 5.6 e 5.7), em ambos os casos, nota-se
que o modelo quadrtico reduzido apresentou um ajuste adequado aos resultados
experimentais, para este tipo de planejamento, com um coeficiente de correlao R 2 de 0.992
e 0,994; um baixo erro puro (0.064 e 0,088) e, uma falta de ajuste (Lack of fit de 0,120 e
0,184) sem significncia para o intervalo de confiana de 90% (p-level < 0,1) para xilose e
glicose, respectivamente. Ambos os modelos gerados foram significativos, com valores de
Fisher (F) iguais a 29.85 e 25,93, respectivamente.

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122

Tabela 5.6. Anlise de varincia (ANOVA) da concentrao de cido succinico, no PFF 241
para xilose como fonte de carbono
Efeito

Modelo

SM

DF

QM

F valor

p>F

18.0797875

1.80797875

29.85843805

.. < 0.0001

1.9110125

1.9110125

19.49093364

0.1159

3.0876125

3.0876125

47.64834105

0.0916

2.9701125

1.9701125

41.40297068

0.0982

7.7815125

7.7815125

120.0850694

0.0579

AB

0.8385125

0.8385125

12.94000772

0.1726

AC

2.4090125

2.4090125

31.17611883

0.0922

AD

0.0820125

0.0820125

1.265625

0.4626

Curvature

1.3140625

1.3140625

30.27874228

0.0952

Lack of Fit

45.641850

4.564185

27.43712

0.1204

Pure Error

1.5634

0.0648

Cor Total

19.04526

19

[cido succnico]: [R-Squared = 0.9926, Adj R-Squared = 0.9399]

Tabela 5.7. Anlise de varincia (ANOVA) da concentrao de cido succinico, no PFF 241
para glicose como fonte de carbono
Efeito

SM

DF

QM

F valor

p>F

Model

21,6841796

2,16841796

39,48785425

<0.0001

2,4875931

2,4875931

29,49093364

0.1035

4,0578431

4,0578431

47,64834105

0.0816

2,8549831

2,8549831

42,45687068

0.0956

9,1205431

9,1205431

131,0845264

0.0542

AB

0,9452131

0,9452131

12,94000772

0.1978

AC

3,5589231

3,5589231

39,58611883

0,0987

AD

0,0975231

0,0975231

1,265625

0.5246

Curvature

1.3140625

1.3140625

40,1568944

0.0862

Lack of Fit

50,489560

5,048956

29.45268

0.1845

Pure Error

1.35764

0.0881

Cor Total

20,145878

19

[cido succnico]: [R-Squared = 0.9946, Adj R-Squared = 0.9399]


A: K2HPO4, B:MgSO4, C: Extrato de Levedura; D: NaHCO3.
SQ: Soma Quadrtica (Sum of Squares); MQ: Mdia Quadrtica (Mean square); F= Fisher Calculado; p
>F= Probabilidade de Fisher.
Os valores em vermelho so os correspondentes as variveis que apresentaram significncia estatstica
(p-Level < 0,1)
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123

A magnitude do efeito estimado de cada varivel apresentada pelo histograma de


influncia das variveis (Figura 5.15) ou atravs do diagrama de Pareto (Figura 5.16),
mostrando a importncia estatstica mais relevante dos fatores e interaes entre os mesmos.
A influncia das variveis, para ambos os processos desenvolvidos (xilose e glicose)
apresentaram a mesma ordem de efeito significativo estatisticamente, com maiores valores da
soma quadrtica para os resultados obtidos a partir da glicose.

Figura 5.15. Histograma de influncia das variveis e suas interaes, de acordo com a soma
quadrtica (Sum of Squares), do PFF 24-1 para xilose (a) e glicose (b), respectivamente,
considerando o intervalo de confiana de 90% (p<0,1). A: K2HPO4, B:MgSO4, C: Extrato de
Levedura, D: NaHCO3.

Devido similaridade entre os dois casos, a apresentao de apenas um Diagrama de


Pareto, mostra-se suficiente para visualizao da ordem de efeitos estimados pelas variveis
analisadas.
O Diagrama de Pareto revela que o maior efeito positivo gerado pelo NaHCO3,
seguido pelo efeito da soluo de MgSO4, ambos com significncia estatstica, sugerindo um
aumento na concentrao destes em um prximo planejamento. Em seguida, o extrato de
levedura apresentou um efeito positivo prximo do limite estabelecido para o modelo (p-level =
0,1). O K2HPO4 mostrou um efeito negativo sobre a concentrao final de cido succnico,
sendo tambm o efeito de menor significncia estatstica, com valores de p=0,1159 e 0,1035 a
p<0,1; sugerindo a eliminao deste componente na formulao do meio, em ensaios futuros.
Porm, a interao entre K2HPO4 e extrato de levedura (AC) mostrou ser significativa
estatisticamente (p = 0,0922 e 0,0987), a p<0,1 (Tabelas 5.6 e 5.7). Por conter magnsio e
fsforo, o MgSO4 e o K2HPO4 representam um papel importante na fisiologia e morfologia
celular (GUETLER et al., 1999). O fsforo tem uma funo importante para as vias
metablicas, que so iniciadas com uma fosforilao do substrato, sendo um elemento
constituinte das molculas de ATP, que esto presentes no mecanismo energtico das
clulas. O MgSO4 a umas das melhores fontes de enxofre, por servir tambm, como de
fonte de magnsio, uma vez que o magnsio responsvel pela estabilidade estrutural de
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124

diversas enzimas e, tambm por prevenir a formao de vesculas na membrana externa da


clula (PEREIRA JR, 1991).

Figura 5.16. Diagrama de Pareto para o efeito estimado das variveis sob a concentrao final de
cido succnico, pelo PFF 24-1, considerando o intervalo de confiana de 90% (p<0,1). A: K2HPO4,
B:MgSO4, C: Extrato de levedura, D: NaHCO3.

Em termos gerais, a fermentabilidade do processo foi aumentada com a adio da


fonte de CO2 (NaHCO3), Magnsio e de Nitrognio. Porm, o uso em conjunto de pelo menos
NaHCO3 ou MgSO4 com a fonte de nitrognio permitiu melhorar a eficincia da fermentao.
Com a adio de KH2PO4 foi observado um comportamento contrrio. De acordo com os
resultados, a maior concentrao de cido succnico (9,02 e 7,49 g/L) foi obtida quando foram
adicionados ao meio todos os nutrientes no seu nvel superior (ensaio 8), para ambos os
processos, usando xilose e glicose.
A anlise de ANOVA mostrou que maiores valores de concentrao final ocorreram
quando os parmetros B e C estiveram em seus nveis superiores, combinados com uma
baixa concentrao de K2HPO4, indicando a existncia de um valor de mximo absoluto,
conforme pode ser visto na Figura 5.17, pela Metodologia de Superfcie de Resposta (RSM).
Quando se utiliza do planejamento fatorial fracionado, informaes importantes acerca
dos efeitos principais individuais e das interaes de primeira ordem entre as variveis podem
ser obtidos (BRUNS, 2003). Entretanto, efeitos das interaes de segunda ordem e superiores
so aceitas como desprezveis. Em outras palavras, embora esta seja uma ferramenta de
grande importncia quando se deseja analisar a influncia de um grande nmero de variveis
sobre determinada resposta, o fracionamento do planejamento experimental e a reduo do
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nmero de experimentos realizados acarretam perdas quanto anlise da influncia de


interaes entre as variveis de estudo sobre a resposta de interesse, sem a possibilidade de
visualizao do ponto de mximo absoluto, devido inexistncia de uma superfcie de
resposta e curvas de contorno (RODRIGUES, 2010).

Figura 5.17. Superfcie de resposta mostrando o efeito da interao entre AC e AB.


A: K2HPO4, B: MgSO4 e C: Extrato de Levedura

Os valores na concentrao final de cido succnico podem ser aumentados com o


acrscimo dos pontos axiais, na medida em que aumentam a tendncia em direo ao
mximo absoluto. Como todas as variveis analisadas foram significativas (valores de F
elevados), elas sero mantidas no modelo seguinte, inclusive o K2HPO4, respeitando a
hierarquia das interaes.

5.6.2. Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR)


O Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) uma das mais importantes
metodologias utilizadas em estudos de otimizao de processos, cujo objetivo desenvolver
um modelo emprico para o processo estudado e obter respostas mais com maior preciso
para determinao de condies timas (BRUNS, 1995)
De acordo com os resultados do planejamento PFF4-1, os nveis de NaHCO3 e MgSO4
podem ser aumentados, enquanto os nveis de K2HPO4 podem ser reduzidos. Em
concentraes elevadas, a presena do K2HPO4 pode reduzir a produo de cido succnico e
outros cidos orgnicos, como os cidos actico e frmico e, os sais (HPO4--) podem causar
uma diminuio no rendimento da extrao do cido succnico, em etapas posteriores de
separao da fase aquosa, devido a fatores de fora inica (GAMEZ et al., 2006, HU et al.,
2006).
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126

Os resultados do planejamento DCCR, so apresentados nas Tabelas 5.8 e 5.9 para


xilose e glicose, respectivamente. Um total de 27 ensaios e 3 repeties no ponto central, foi
gerado.
Avaliando ambos os planejamentos experimentais seqenciais, foi possvel perceber
um aumento na concentrao final de cido succnico de 9.02 e 7,48 g/L (ensaios de nmero
8, PFF4-1) para 12.8 e 10,86 g/L (ensaios de nmero 2, DCCR) para xilose e glicose,
respectivamente.
A concentrao final de cido succnico variou entre 6.04 e 12.8 g/L (xilose) e entre
5,07 e 10,86 g/L (glicose). A mxima concentrao de cido succnico foi obtida segundo a
seguinte composio, de acordo com o ensaio 2: fonte de carbono 20 g/L; K2HPO4 5.0 g/L;
MgSO4 2.0 g/L; extrato de levedura 3.0 g/L e NaHCO3 10 g/L.
Dessa forma, a metodologia estatstica de superfcie de resposta pelo DCCR foi usada
para otimizar a produo de cido succnico, atravs do monitoramento dos efeitos interativos
entre as variveis, acrescidas de seus respectivos pontos axiais. O efeito da concentrao de
10 g/L de NaHCO3 foi similar ao obtido com o uso de MgCO3, por VEMURI et al. (2002), que
obtiveram uma concentrao final de cido succnico igual a 10.53 g/L. Os autores verificaram
ainda que concentraes de NaHCO3 ou MgCO3, no promovem diferenas significativas sob
a produo de cido succnico, mediante resultados obtidos com um planejamento fatorial
completo.

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127

Tabela 5.8. Matriz experimental do DCCR investigando os efeitos de K2HPO4, MgSO4, extrato
de levedura e NaHCO3 na concentrao final de cido succnico, para xilose como fonte de
carbono
Parmetros e nveis reais
A
B
C
D
Ensaios
Extrato de
K2HPO4 MgSO4
NaHCO3
levedura
(g/L)
(g/L)
(g/L)
(g/L)
1
5.0
4.0
3.0
5.0
2
5.0
2.0
3.0
10.0
3
10.0
3.0
5.0
15.0
4
10.0
3.0
1.0
15.0
5
7.5
2.0
0.0
10.0
6
7.5
4.0
3.0
1.5
7
5.0
4.0
1.0
5.0
8
7.5
2.0
3.0
10.0
9
10.0
2.0
1.0
15.0
10
10.0
1.0
5.0
15.0
11
10.0
4.0
5.0
5.0
12
10.0
3.0
1.0
5.0
13
12.5
4.0
3.0
10.0
14
10.0
4.0
3.0
20.0
15
5.0
2.0
5.0
15.0
16
7.5
2.0
3.0
10.0
17
7.5
3.0
3.0
10.0
18
5.0
4.0
1.0
15.0
19
5.0
3.0
5.0
5.0
20
7.5
3.0
5.0
5.0
21
5.0
4.0
1.0
5.0
22
10.0
3.0
1.0
5.0
23
2.5
2.0
3.0
10.0
24
5.0
2.0
1.0
15.0
25
5.0
3.0
5.0
15.0
26
7.5
3.0
7.0
10.0
27
7.5
2.0
3.0
10.0
28 (CP)
7.5
3.0
3.0
10.0
29 (CP)
7.5
3.0
3.0
10.0
30 (CP)
7.5
3.0
3.0
10.0
Total: 27 ensaios com 3 repeties do ponto central - PC

Resposta
cido Succnico
(g/L)
11.55
12.85
11.12
11.42
6.04
10.45
10.26
9.42
9.10
8.45
12.15
12.10
12.27
12.45
7.85
7.12
12.20
12.41
11.02
10.78
7.56
10.23
8.86
6.54
7.45
11.24
9.25
10.15
11.23
11.12

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128

Tabela 5.9. Matriz experimental do DCCR investigando os efeitos de K2HPO4, MgSO4, extrato
de levedura e NaHCO3 na concentrao final de cido succnico, para glicose como fonte de
carbono
Parmetros e nveis reais
A
B
C
D
Ensaios
Extrato de
K2HPO4 MgSO4
NaHCO3
levedura
(g/L)
(g/L)
(g/L)
(g/L)
1
5.0
4.0
3.0
5.0
2
5.0
2.0
3.0
10.0
3
10.0
3.0
5.0
15.0
4
10.0
3.0
1.0
15.0
5
7.5
2.0
0.0
10.0
6
7.5
4.0
3.0
1.5
7
5.0
4.0
1.0
5.0
8
7.5
2.0
3.0
10.0
9
10.0
2.0
1.0
15.0
10
10.0
1.0
5.0
15.0
11
10.0
4.0
5.0
5.0
12
10.0
3.0
1.0
5.0
13
12.5
4.0
3.0
10.0
14
10.0
4.0
3.0
20.0
15
5.0
2.0
5.0
15.0
16
7.5
2.0
3.0
10.0
17
7.5
3.0
3.0
10.0
18
5.0
4.0
1.0
15.0
19
5.0
3.0
5.0
5.0
20
7.5
3.0
5.0
5.0
21
5.0
4.0
1.0
5.0
22
10.0
3.0
1.0
5.0
23
2.5
2.0
3.0
10.0
24
5.0
2.0
1.0
15.0
25
5.0
3.0
5.0
15.0
26
7.5
3.0
7.0
10.0
27
7.5
2.0
3.0
10.0
28 (CP)
7.5
3.0
3.0
10.0
29 (CP)
7.5
3.0
3.0
10.0
30 (CP)
7.5
3.0
3.0
10.0
Total: 8 ensaios com 3 repeties do ponto central - PC

Resposta
cido Succnico
(g/L)
9,55
10,86
9,02
9,31
5,07
8,42
8,23
7,31
7,01
6,44
10,05
10,00
10,10
10,41
5,94
5,13
10,14
10,40
9,04
8,67
5,75
8,25
6,78
5,47
5,87
9,14
7,62
8,15
8,22
8,10

Corroborando com os resultados obtidos pelo PFF 241, as Tabelas 5.10 e 5.11
mostram que o modelo mais adequado para o ajuste dos fatores, foi Modelo Quadrtico
Reduzido, baseado nos altos valores de R 2, indicando 99 % de viabilidade da resposta, para
ambos os experimentos.

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129

Tabela 5.10. Anlise de varincia (ANOVA) para concentrao de cido succnico no


delineamento composto central rotacional (DCCR), para xilose como fonte de carbono

Efeito

SM

Model

149.903075 14

14.9903075

34.81492204

<0.0001

0.88166667 1

0.881666667

0.624275956

0.4418

22.0800164 1

22.0800164

45.63405313

0.0013

8.40166657 1

8.40166657

35.948913221

0.0276

87.1645267 1

88. 1645267

62.42759559

< 0.0001

AB

7.1824

7.1824

5.085595039

0.0395

AC

0.126025

0.126025

10.089233698

0.7693

AD

1.177225

1.177225

20.833550014

0.3757

BC

4.3264

4.3264

33.06336578

0.1000

BD

4.2849

4.2849

8.033981146

0.1020

CD

0.912025

0.912025

0.645771583

0.4342

21.1845416715

1.412302778

Lack of Fit 39.18699167 9

3.918699167

35.80263114

0.0486

Residual

Pure Error 5.99755

DF

QM

F valor

p>F

0.39951

[cido succnico]: [R-Squared = 0.995, Adj R-Squared = 0.9699]


A: K2HPO4, B:MgSO4, C: Extrato de Levedura; D: NaHCO3.
SQ: Soma Quadrtica (Sum of Squares); MQ: Mdia Quadrtica (Mean square);
F= Fisher Calculado; p >F= Probabilidade de Fisher.
Os valores em vermelho so os correspondentes as variveis que apresentaram significncia
.........estatstica (p-Level < 0,1)

O modelo quadrtico reduzido mostrou um bom ajuste aos dados experimentais,


apresentando valores elevados de Fisher iguais a 34.81 e 40,17, para os ensaios conduzidos
a partir de xilose e glicose, respectivamente. A falta de ajuste no foi significativa, com p > 0.1,
confirmando o ajuste do modelo aos dados experimentais, em um intervalo de confiana de
90%.
Conforme foi observado, anteriormente, no PFF4-1, a combinao entre K2HPO4 e
extrato de levedura foi mantida no DCCR, confirmando o efeito significativo da interao entre
ambos, com valores de probabilidade de Fisher iguais a 0,039 e 0,021 para xilose e glicose,
respectivamente.

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130

Tabela 5.11. Anlise de varincia (ANOVA) para concentrao de cido succnico no


delineamento composto central rotacional (DCCR), para glicose como fonte de carbono
Efeito

SM

DF

QM

F valor

p>F

Model

151.17895 14

15,117895

40,17589563

<0.0001

1,04529163 1

1,045289163

0,421589630

0.47859

25,1459564 1

25.14589564

48,24526333

0.00089

9,25487667 1

9,254879667

41.94785966

0.01969

92,154263 1

92,1548263

67,1254896

< 0.0001

AB

8,5479625

8,5479625

6,457812568

0.02147

AC

0,3457894

0,3457894

11,145878962

0.84563

AD

2,2458963

2,2458963

22,0457896

0.47867

BC

6,154889

6,154889

40,147891

0.1000

BD

5,12789

5,12789

39,145789

0.1020

CD

1,120589

1,120589

0,8495662

0,5124

Residual

19,452789 15

1.2145868

Lack of Fit

34,125789

3,4125789

31,4587896

0.0315

Pure Error

4,124566

0.247851

[Succinic acid]: [R-Squared = 0.992, Adj R-Squared = 0.9588]


A: K2HPO4, B:MgSO4, C: Extrato de Levedura; D: NaHCO3.
SQ: Soma Quadrtica (Sum of Squares); MQ: Mdia Quadrtica (Mean square);
F= Fisher Calculado; p >F= Probabilidade de Fisher.
Os valores em vermelho so os correspondentes as variveis que apresentaram significncia estatstica
(p-Level < 0,1)

O modelo obtido pela anlise estatstica da fermentao realizada por A. succinogenes


representado pelas equaes ajustadas (1) e (2), que equivalem concentrao de cido
succnico, em g/L, para os ensaios a partir de xilose e glicose, respectivamente.
[c. Succnico] = +12.02 +3.13 * A +0.60 * B+0.32 * C+0.75 * D+0.88 * A * B+0.91 * A * +1.31 * A *
D-0.39 * B * C+0.73 * B * D+0.38 * C * D+0.55 * A^2-0.58 * B^2-0.50 * C^2+0.29* D^2
(1)

[c. Succnico] = +10.42 +2.48 * A +0.45 * B+0.24 * C+0.67 * D+0.72 * A * B+0.78 * A * +1,04 * A *
D-0.27 * B * C+0.63 * B * D+0.25 * C * D+0.42 * A^2-0.47 * B^2-0.39 * C^2+0.18* D^2
(2)

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131

O histrograma de influncia das variveis individuais e interaes, analisadas pelo


planejamento DCCR, apresentado na Figura 5.18 para xilose e glicose, respectivamente. De
forma similar ao PFF4-1, o parmetro D (NaHCO3) apresentou maior influncia na
concentrao final de cido succnico, seguido do parmetro B (MgSO4) e do parmetro C
(extrato de levedura). Somado a isso, as combinaes que apresentaram maior influncia
foram entre AB, seguido de BC, AD e CD, os quais apresentaram maior influncia do que o
parmetro A (K2HPO4), quando analisado de forma isolada.

a)

b)

Figura 5.18. Histograma de influncia das variveis e suas interaes, de acordo com a soma
quadrtica (Sum of Squares), para o DCCR com xilose (a) e glicose (b), respectivamente,
considerando o intervalo de confiana de 90% (p<0,1). A: K2HPO4, B:MgSO4, C: Extrato de
Levedura, D: NaHCO3.

As Figuras 5.19 e 5.20 mostram o contorno da superfcie de resposta, em trs


dimenses (3-D), que representam as equaes ajustadas para concentrao final de cido
succnico para xilose e glicose, respectivamente. Ambos apresentaram o mesmo
comportamento, como era de se esperar, com alteraes apenas na concentrao final de
cido succnico.
Em ambas as Figuras, 5.19a e 5.20a, podemos observar que o aumento das
concentraes de MgSO4 e extrato de levedura contribuem para aumentar a concentrao
final de cido succnico. Analisando as Figuras 5.19c e 5.20c, o aumento na concentrao de
K2HPO4 contribui exerce efeito negativo, reduzindo a concentrao final de cido succnico.
Porm, conforme pode ser visto nas Figuras 5.19b e 5.20b, h uma interao com efeito
estatisticamente significativo entre K2HPO4 e extrato de levedura (AC).
A combinao entre as quatro variveis mostram tambm um alto valor de Fisher,
como foi mencionado nas tabelas de ANOVA, indicando um amplo grau de sinergismo entre
estes nutrientes durante a fermentao por A. succinogenes, resultando em variaes na
concentrao de cido succnico, dependendo da concentrao utilizada no meio. As Figuras
5.19d e 5.20d, mostram uma elevada interao entre MgSO4 e NaHCO3, confirmando a
anlise estatstica.
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132

a)

b)

c)

d)

Figura 5.19. Superfcie de resposta dos efeitos combinados entre os parmetros sobre a
concentrao final de cido succnico, pelo DCCR para xilose, como fonte de carbono. Interao
entre os parmetros AB (a); AC (b); AD (c); BD (d). A:K2HPO4, B: MgSO4, C: extrato de levedura,
D NaHCO3.

A produo de cido succnico por A. succinogenes foi incrementada quando a


combinao de todos os nutrientes foi utilizada. Avaliando o fator de resposta (concentrao final
de cido succnico), verifica-se que o ensaio de nmero 2 foi o mais eficiente, para ambos os
aucares utilizados.

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133

a)

b)

c)

d)

Figura 5.20. Superfcie de resposta para os efeitos combinados dos parmetros sobre a
concentrao final de cido succnico, pelo DCCR para glicose como fonte de carbono. Interao
entre os parmetros AB (a); AC (b); AD (c); BD (d). A:K2HPO4, B: MgSO4, C: extrato de levedura,
D NaHCO3.

Mantendo MgSO4 em seu nvel inferior (2.0 g/L) e extrato de levedura no ponto central
(3.0 g/L), o ponto de mximo na concentrao final de cido sucnico pode ser obtido quando
NaHCO3 encontra-se em seu nvel superior (10.0 g/L). Todavia, quando a fermentao ocorre em
presena de nveis elevados de K2HPO4, a concentrao final de cido succnico afetada. Como
todos os nutrientes so necessrios e essenciais para o metabolismo, em concentraes
adequadas, os resultados mostraram a faixa ideal para cada varivel, principalmente do extrato de
levedura (fonte de nitrognio), NaHCO3 (ons sdio e fonte de CO2) e MgSO4 (fonte de magnsio e
enxofre), de forma semelhante ao encontrado por SONG & LEE (2007). LIU et al. (2008)
demonstraram que no houve inibio significativa do crescimento celular ou na produo de
cido succnico por ons de magnsio, em meio contendo K2HPO4 por A. succinogenes
CGMCC1593. Dessa forma, anlise de varincia mostrou que o modelo quadrtico reduzido
escolhido, foi adequado para o ajuste dos dados experimentais, tornando possvel a validao de
resultados em biorreator, segundo condies otimizadas.

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134

Em suma, os componentes do meio, aps esta etapa de otimizao e estudo da


influncia das variveis foram definidos com a seguinte composio: xilose e glicose 20 g/L;
extrato de levedura 5.0 g/L, MgSO4 3.0 g/L, NaHCO3, 10 g/L e K2HPO4 5.0 g/L.
Com relao ao extrato de levedura, LIU et al. (2008) obtiveram respostas diferentes,
pois observaram que ao aumentar a concentrao deste nutriente no meio de cultivo havia um
aumento na concentrao do cido succnicio. Vale ressaltar que estes autores isolaram uma nova
cepa de Actinobacillus succinogenes diferente da utilizada neste trabalho. De qualquer forma, o
efeito da concentrao de extrato de levedura ser re-avaliado no prximo planejamento
experimental, em concentraes maiores, associado aos efeitos da fonte de carbono (glicose e
xilose) e das condies de cultivo do processo: pH, agitao, temperatura.

5.7. Planejamento Experimental Fatorial Fracionado 25-1


Foi desenvolvido um Planejamento Experimental Fatorial Fracionado 25-1 (PFF), baseado
em Gonzales & Ubeda (2008), com dois nveis (inferior, -1 e superior, +1), totalizando 19 ensaios
(16 ensaios independentes e 3 repeties do ponto central PC), para avaliar o efeito das
seguintes variveis: concentrao das fontes de carbono (glicose e xilose), concentrao de
extrato de levedura, temperatura, pH inicial e agitao. Cabe ressaltar, que a composio dos
outros componentes do meio de fermentao so diferentes daqueles propostos por Gonzles &
Ubeda (2008), alm do acrscimo de ensaios paralelos com xilose como fonte de carbono, durante
os estudos com o presente trabalho.
A hierarquizao dos efeitos foi estimada, de forma similar aos estudos anteriores,
mediante anlise de varincia (ANOVA), diagrama de Pareto e Metodologia de Superfcie de
Resposta (MSR).
As Tabelas 5.12 e 5.13 apresentam os resultados da matriz dos experimentos realizados
por um perodo de 24h e 48h de fermentao, para glicose e xilose, respectivamente. Observou-se
que, na maioria dos ensaios, houve uma correlao entre o crescimento celular e a produo do
cido succnico.
Analisando estes resultados, verifica-se que a concentrao final de cido succnico
variou de 2,75 a 14,18 g/L e 4,18 a 15,12 g/L para glicose e xilose, respectivamente.
Os maiores valores de concentrao final de cido succnico foram obtidos nos
ensaios 1 e 4, para cada caso, respectivamente, porm sob as mesmas condies: fonte de
carbono 40 g/L; extrato de levedura 11g/L; temperatura 410C; pH 8,0 e agitao de 300rpm,
num tempo de 48h de fermentao. Estes resultados esto de acordo com alguns
encontrados na literatura, tendo comportamento semelhante a Gonzles & Ubeda (2008),
conforme esperado, aumentando o grau de confiabilidade destes estudos.

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135

Tabela 5.12. Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado PFF 25-1 e resultados
correspondentes para a concentrao final de cido succnico, para glicose como fonte de
carbono, em 24 e 48 horas de fermentao

Ensaios

Glicose
(g/L)

E.L
(g/L)

Temperatura
(C)

pH

Agitao
(rpm)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17 (PC)
18 (PC)
19 (PC)

40
40
40
40
40
40
40
40
20
20
20
20
20
20
20
20
30
30
30

11
11
11
11
5
5
5
5
11
11
11
11
5
5
5
5
8
8
8

42
42
32
32
42
42
32
32
42
42
32
32
42
42
32
32
37
37
37

8
6
8
6
8
6
8
6
8
6
8
6
8
6
8
6
7
7
7

300
100
100
300
100
300
300
100
100
300
300
100
300
100
100
300
200
200
200

c. succnico
(g/L)
24 h
48 h
14,18 13,61
4,72
4,93
8,79
11,34
4,58
4,48
11,30 10,68
4,18
4,16
8,26
12,66
4,47
4,77
10,98 10,60
2,91
3,08
8,08
8,75
4,31
4,74
11,27 11,83
4,58
5,65
8,6
8,72
2,8
2,75
9,65
9,63
8,10
8,44
9,45
10,23

Tabela 5.13. Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado 25-1 e resultados


correspondentes a concentrao final de cido succnico, para xilose como fonte de carbono,
em 24 e 48 horas de fermentao

Ensaios

Xilose
(g/L)

E.L
(g/L)

Temperatura
(C)

pH

Agitao
(rpm)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17 (PC)
18 (PC)
19 (PC)

40
40
40
40
40
40
20
20
20
40
40
20
20
20
20
20
30
30
30

11
5
5
11
11
11
11
11
11
5
5
11
5
5
5
5
8
8
8

32
42
42
42
42
32
42
32
32
32
32
42
32
32
42
42
37
37
37

6
8
6
8
6
8
6
8
6
8
6
8
8
6
8
6
7
7
7

300
100
300
300
100
100
300
300
100
300
100
100
100
300
300
100
200
200
200

c. succnico
(g/L)
24 h
48 h
6,11
5,94
9,98
9,51
5,71
5,62
15,01 15,12
5,25
5,93
10,32 11,00
5,44
5,54
8,51
9,24
6,84
6,2
8,79
9,66
5,00
5,96
12,89 12,16
10,13
9,52
4,33
4,18
10,08 10,06
6,11
10,65
11,08
11,73
10,52
10,23
9,6
9,44

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136

Com 20 g/L de concentrao inicial de glicose foram obtidos aproximadamente 11,0 g/L
de cido succnico (Tabela 5.12), valor similar ao encontrado por CORONA et al. (2007), de
10,5 g/L, durante 32 horas de fermentao, a 37C, pH 7.0 e 200 rpm.
ISAR et al. (2006), estudando a produo de cido de succinico por E. coli, sob
condies anaerbicas, a partir do Delineamento Composto Central de Faces-centradas
(DCCCF) na avaliao das condies de cultivo, encontraram uma concentrao final de cido
succnico de, aproximadamente, 14 g/L, sob agitao de 250 rpm, em 48 horas, com uma
composio de meio de cultivo que incluia MgCO3 ao invs de NaHCO3.
Foi possvel verificar que as maiores concentraes de cido succnico, acima de 8,08
g/L e 8,51 g/L para glicose e xilose, respectivamente, tiveram como caracterstica o ajuste de
pH para 7,0 ou 8,0 no meio de fermentao. VAN DER WERF et al. (1997) relataram que o
crescimento celular afetado de forma negativa em valores de pH inferiores a 6,0, resultando
em maiores gastos de energia durante as atividades metablicas do microrganismo.
As Tabelas 5.14 e 5.15 apresentam os efeitos das cinco variveis estudadas e seus
respectivos erros, obtidos a partir de anlise estatstica, na concentrao final de cido
succnico, em 24 horas de fermentao para glicose e xilose, respectivamente. Uma
alternativa interessante para simplificar o modelo, realizada com amplo aval da literatura,
consiste em excluir os parmetros com pequena ou nenhuma influncia sobre o resultado do
ajuste final. Com isso teremos um modelo com nmero reduzido de dados, portanto mais
simples, , tambm utilizado por Gonzales & Ubeda (2008), ao qual denominamos Modelo
Reparametrizado Reduzido da tabela ANOVA (RODRIGUES, 2010).
Tabela 5.14. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 sob a
concentrao de cido succnico, em 24 horas de processo a partir de glicose.
Parmetros
MDIA
Glicose
Extrato de Levedura
Temperaturaa
pHa
Agitao
a
p < 0,1

Efeito
7,01
0,22
0,20
3,15
7,25
-0,48

Erro
t(2)
Padro
0,51
14,1
1,57
0,15
1,57
0,06
1,57
2,65
1,57
6,02
1,57
-0,46

p-valor
<0,0001
0,96
0,962
0,0485
<0,0001
0,6015

Pela tabela ANOVA, o ajuste mais adequado com os dados experimentais foi obtido,
novamente, modelo quadrtico reduzido, com valores de R2 iguais a 0.992 e 0,995, erro
padro de 0,51 e 0,58, para glicose e xilose, respectivamente.

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137

Tabela 5.15. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 sob a
concentrao de cido succnico, em 24 horas de processo a partir de xilose.
Parmetros
MDIA
Xilose
Extrato de Levedura
Temperaturaa
pHa
Agitao
a
p < 0.1

Efeito
7,56
0,31
0,29
3,45
7,41
-0,65

Erro
t(2)
Padro
0,58
14,55
2,06
0,19
2,03
0,21
2,06
3,42
2,04
6,57
2,09
-0,63

p-valor
<0,0001
0,97
0,99
0,0416
<0,0001
0,6485

Analisando os efeitos principais de cada parmetro, verifica-se que as variveis pH e


temperatura foram estatisticamente significativas a p<0.1, com efeito positivo, sinalizando
para um aumento nos respectivos valores para conduo do processo. Comparando a mdia
dos efeitos, o pH foi a varivel que apresentou maior influncia, indicando um aumento de at
7,25 e 7,41 g/L na concentrao de cido succnico para tempo de fermentao de 24h,
quando altera-se o valor do nvel -1(pH 6.0) para o +1(pH 8.0) para glicose e xilose,
respectivamente. Gonzles & Ubeda (2008) encontraram valores iguais a 6,97g/L. O mesmo
comportamento foi detectado em vrios estudos envolvendo avaliao das melhores
condies de processo para microrganismos produtores de cidos orgnicos, com valores de
pH iguais a 7.2 (LEE et al., 1998; SAMUELOV et al., 1991).
O efeito estimado para o extrato de levedura apresentou uma pequena variao na
concentrao de cido succnico, de 0,20 e 0,29 g/L para glicose e xilose, respectivamente. A
agitao no promoveu influncia estatisticamente significativa, e ainda apresentou efeito
negativo sobre a produo de cido succnico de -0,48 e -0,65g/L para glicose e xilose,
respectivamente. Isto ocorre quando a velocidade de agitao alterada do nvel inferior (100
rpm) para o nvel superior (300 rpm).
A concentrao de glicose e xilose apresentaram um efeito positivo, em 24 horas de
fermentao, porm um efeito negativo para 48 horas, mas no significativo, de p=0,3897 e
0,3004 (Tabelas 5.16 e 5.17).

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Tabela 5.16. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 sobre a
concentrao de cido succnico como resposta (48h) para glicose

Parmetros

Efeito

MDIA
Glicose
Extrato de Levedura
Temperaturaa
pHa
Agitao

7,62
-1,42
-1,56
1,30
7,10
-0,90

Erro
t(2)
Padro
0,50
19,48
1,05
-1,06
1,05
-1,42
1,05
1,15
1,05
7,75
1,05
-0,84

p-valor
<0,0001
0,3897
0,2001
0,3112
<0,0001
0,4998

p < 0.1

Tabela 5.17. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 sobre a
concentrao de cido succnico como resposta (48h) para xilose.
Parmetros
MDIA
Xilose
Extrato de Levedura
Temperaturaa
pHa
Agitao
a
p < 0.1

Efeito
8,52
-1,19
-1,21
1,42
7,22
-0,94

Erro
Padro
0,55
1,12
1,12
1,12
1,12
1,12

t(2)

p-valor

20,12
-1,64
-1,23
1,42
8,06
-0,95

<0,0001
0,3004
0,1102
0,2986
<0,0001
0,5102

Os resultados foram semelhantes aos encontrados por Gonzales & Ubeda (2008) e
mostraram que a produo de cido succnico, no tempo de 48horas, teve influncia positiva
e significativa (p<0.1) apenas do pH inicial, promovendo um aumento na concentrao de
cido succnico de 7,10 e 7,22 g/L para os processos com glicose e xilose, respectivamente.
Assim como ocorrido em 24 horas de fermentao, o extrato de levedura no foi significativo,
alm de gerar efeitos negativos sobre a produo de cido succnico, iguais a -1,56 e -1,21
g/L para glicose e xilose, respectivamente.
O efeito quantitativo estimado que cada uma das variveis possui sobre a concentrao
final de cido succnico, em 24 horas de processo, pode ser visto no diagrama de Pareto
(Figura 5.21), que estabelece do mesmo modo que a tabela ANOVA, quais destes efeitos
encontram-se dentro do grau de confiana estabelecido para a anlise (90%).
Para 24 horas, a ordem dos efeitos, sobre a produo de cido succnico iniciada
pelo pH, seguida da temperatura, fonte de carbono e extrato de levedura, que apresentou
pouca influncia sobre a varivel de resposta. Mesmo que a influncia do extrato de levedura
no seja estatisticamente significativa, de acordo com valores de p, o efeito foi negativo,
indicando uma reduo da concentrao de extrato de levedura (nvel inferior).
.
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139

a)

b)

Figura 5.21. Diagrama de Pareto para os efeitos estimados pelo PFF 2


xilose (b), em 24 horas de fermentao

5-1

para glicose (a) e

Normalmente, a bactria A. succinogenes caracterizada por ser um microrganismo


exigente em relao composio dos nutrientes. Sendo assim, o extrato de levedura,
contendo protenas, lipdeos, vitaminas e outros, considerado um nutriente importante para o
crescimento celular e, consequentemente para a obteno de cido succnico (JIANG et al.,
2010). Porm, o seu uso pode aumentar os custos do processo (URBANCE et al., 2003). Por
outro lado, estudos recentes demonstram que a deficincia da fonte de nitrognio estimula a
sntese de outros metablitos secundrios, como o cido actico e cido frmico, que podem
inibir o crescimento celular (PAPANIKOLAOU et al., 2004). Sendo assim, o modelo proposto
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140

sugere o uso de extrato de levedura em concentraes inferiores, uma vez que os outros
parmetros exercem maiores efeitos sob a concentrao final de cido succnico. Para 48
horas de fermentao, a ordem de efeitos estimados foi semelhante ao caso anterior,
conforme mostra a Figura 5.22, onde o pH foi a varivel de efeito majoritrio, seguido da
temperatura que no foi significativa a p<0,1 mas seu efeito foi positivo, para glicose e xilose,
respectivamente, indicando a conduo do processo em nveis superiores de pH.

a)

b)

Figura 5.22. Diagrama de Pareto para os efeitos estimados pelo PFF 2


xilose (b), em 48 horas de fermentao

5-1

para glicose (a) e

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141

Nas Figuras 5.23 e 5.24 esto apresentados os resultados, obtidos segundo


Metodologia de Superfcie de Resposta (MSR), para a concentrao de cido succnico em
funo da interao entre a temperatura e o pH, que foram as variveis com os maiores
efeitos estimados, segundo a tabela ANOVA e o Diagrama de Pareto.
a)

b)

Figura 5.23. Superfcie de resposta da concentrao de cido succnico a partir de glicose, em


funo das variveis pH e temperatura, em 24 (a) e 48 (b) horas de fermentao.
a)

b)

Figura 5.24. Superfcie de resposta da concentrao de cido succnico a partir de xilose, em


funo das variveis pH e temperatura, em 24 (a) e 48 (b) horas de fermentao.

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142

Resultados

similares

este

foram

observados

durante

estudos

com

M.

succiniciproducens KCTC 0769, nos quais a produo de cido succnico apresentou um


ligeiro acrscimo com uma temperatura de 39C, ao passo que os efeitos combinados de pH e
temperatura sobre a atividade enzimtica contribuiram para a obteno de maiores
rendimentos em produto (HU et al., 2004).
Pela anlise dos resultados, uma etapa posterior, envolvendo Delineamento Composto
Central Rotacional (DCCR), poderia ser desenvolvida para a avaliao de apenas trs
variveis: pH, temperatura e extrato de levedura. Porm, mesmo sem a visualizao da
curvatura com valor de mximo absoluto, a superfcie de distibuio de frequncia (plana)
mostrou-se suficiente e significativa, indicando o aumento na concentrao de cido succnico,
nas regies onde o pH e temperatura so fixados em seus npiveis inferiores (24 horas), no
havendo a necessidade do desenvolvimento de uma etapa seqencial (DCCR).
Com os resultados apresentados at esta etapa, foi possvel registrar a capacidade da
linhagem em consumir xilose e glicose, abrindo uma oportunidade para o aproveitamento e a
utilizao das fraes hemicelulsica e celulsica, oriundas do pr-tratamento da biomassa
residual, de composio lignocelulsica.

5.8. Ensaios experimentais em biorreator


Os resultados obtidos com as variveis e valores significativamente mais favorveis
produo de cido succnico, segundo os experimentos conduzidos anteriormente em frascos
agitados, foram validados em biorreator.
Os ensaios de fermentao foram conduzidos em meio sinttico, com concentraes
iniciais de nutrientes anteriores e posteriores aos estudos de otimizao, para facilitar a
avaliao dos possveis ganhos em termos de concentrao final de cido succnico,
produtividade volumtrica (Qp), rendimento em produto (Yp/s) e eficncia de converso em
produto (Ef), de acordo com o tempo para o esgotamento do substrato e crescimento celular.
Adicionalmente, foram desenvolvidos os ensaios em meio contendo o hidrolisado
hemicelulsico, obtido aps a etapa de pr-tratamento da matria-prima.
As concentraes iniciais de xilose, adotadas para a conduo dos experimentos de
fermentao, foram de 22, 52 e 80 g/L, simulando os valores de concentrao inicial de xilose
presentes na frao hemicelulsica do bagao de cana, obtida de acordo com a metodologia
de BETANCUR (2010).
Para cada ensaio, o processo foi desenvolvido em ausncia e presena de suprimento
externo de CO2, visando avaliar sua imprescindibilidade na formao de produto e
subprodutos. A Figura 5.25 apresenta os perfis cinticos de fermentao para a obteno de
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143

cido succnico em meio sinttico, com os valores de concentrao de nutrientes anteriores


aos estudos de otimizao do processo. Os ensaios foram realizados em 24 horas de
fermentao, a 37C sob 150 rpm, com concentrao inicial de xilose igual a 20 g/L e
concentrao inicial de clulas de aproximadamente 2,0 g/L, em ausncia e presena de
suprimento externo de CO2 a 0,05 vvm, respectivamente.

a)
25

10

20

15

10

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)

Xilose (g/L)

Xilose
Biomassa
c. Succnico
c. actico
c. frmico
c. ltico

0
0

10

15

20

Tempo (h)

b)
25

10

20

15

10

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)

Xilose (g/L)

Xilose
Biomassa
c. Succnico
c. actico
c. frmico

0
0

10

15

20

Tempo (h)

Figura 5.25. Fermentao em meio sinttico, com 22,0 g/L de xilose, sob condies controladas
(37C, pH 7.0, 150 rpm). Ausncia (a) e presena (b ) de suprimento externo de CO2, a 0.05 vvm.

Os valores para a concentrao final de cido succnico, produtividade volumtrica, Qp;


rendimento em produto, (Yp/s) e para a eficincia, em relao ao rendimento mximo terico
(Yp/sterico, 1,12g cido succnico/g xilose consumido), mostraram um acrscimo de 6,04 para
9,2 g/L, 0,25 para 0,41g /L.h, 0,23 para 0,36 g/g e de 17,1 para 26,9% para os processos
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144

realizados em ausncia e presena de suprimento externo de CO2, respectivamente. Neste


ltimo, houve uma reduo na concentrao de cido actico, de 2,2 para 1,2 g/L, enquanto a
formao de outros subprodutos no foi identificada, com exceo de cido frmico (0,15 g/L).
Nota-se ainda que, o tempo de esgotamento de xilose foi relativamente menor, de
aproximadamente 22 horas, com efeito positivo sobre a produtividade volumtrica. Alm disso,
nota-se um acrscimo na concentrao final de clulas para 3,5 g/L. No ensaio isento de
suprimento externo de CO2, a concentrao de cido actico continua aumentando (2,2 g/L),
aps aproximadamente 15 horas de fermentao, enquanto a concentrao de cido frmico
(1,3 g/L) manteve-se constante. A concentrao de cido ltico apresentou um ligeiro aumento
(0,67 g/L), no associado ao crescimento celular.
Estes resultados sugerem que, alm da presena de presena de NaHCO3 (fonte de
CO2) no meio de cultivo (WIDELL et al., 1992), as estratgias para o desenvolvimento de um
processo para a produo de cido succnico, devem incluir o suprimento externo de CO2
puro, para aumentar a concentrao final de produto (GUETLER et al., 1996). A ao de
enzimas (PEP carboxiquinase), presentes no metabolismo de A. succinogenes, induzem a
rota metablica preferencialmente para a formao de succinato, dependendo do nvel de CO2
presente no sistema (VEMURI et al., 2002), conforma foi evidenciado na Figura 2.16.
A Figura 5.26 apresenta os perfis cinticos de fermentao para a obteno de cido
succnico, em meio com a concentrao dos nutrientes definida aps os estudos de
otimizao, em 24 horas de fermentao. Os ensaios foram conduzidos com uma
concentrao inicial de xilose igual a 20 g/L e concentrao inicial de clulas de
aproximadamente 2,0 g/L, em ausncia e presena de suprimento externo de CO2 a 0,05 vvm,
respectivamente.
De forma semelhante ao experimento anterior, nota-se um aumento na concentrao
final de cido succnico, quando utilizado o meio com a composio de nutrientes otimizada,
segundo os planejamentos seqenciais. Isso somado ao suprimento de externo de CO2 a 0,05
vvm, durante todo o processo, resultou em uma reduo na concentrao final de cido
actico, de 4,74 para 2,0 g/L, um aumento na concentrao final de clulas, de 3,6 para 4,15
g/L, e um tempo para o esgotamento total de xilose de aproximadamente 21 horas, com um
acrscimo na produtividade volumtrica (QP), de 0,47 para 0,66 g/L.h.
A formao de cido actico, na Figura 5.26a, continuou aumentando aps 12 horas de
fermentao, com incio da estabilizao celular, ao passo que o cido frmico e o cido ltico
se apresentam constantes at o final do processo, com concentraes iguais igual a 1,44 e
1,1 g/L, respectivamente. Na Figura 5.26b, a concentrao de cido actico se mantm
constante (2,0 g/L), aps 12 horas de processo, enquanto o crescimento celular mantm seu
crescimento exponencial. No foram identificados outros subprodutos neste ensaio, alm de
uma concentrao final de cido frmico prxima de zero.
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145

a)

25

20

Xilose (g/L)

15

15
10
10

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)

Xilose
20

Biomassa
c. Succnico
c. actico
c. frmico
c. ltico

0
0

10

15

20

Tempo (h)

b)
20

25

Xilose (g/L)

15

15
10
10

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)

Xilose
20

Biomassa

c. Succnico

c. actico

0
0

10

15

20

Tempo (h)

Figura 5.26. Fermentao em meio sinttico de composio definida aps os estudos de


otimizao, com 22,0 g/L de xilose, sob condies controladas (37C, pH 7.0, 150 rpm) . Ausncia
(a) e presena (b) de suprimento externo de CO2, a 0.05 vvm.

A concentrao final de cido succnico, o rendimento em produto, a produtividade


volumtrica e a eficincia em relao ao rendimento mximo terico (Yp/sterico, 1,12g cido
succnico/g xilose consumido), apresentaram um aumento de 10,04 para 14,2 g/L, 0,37 para
0,57 g/g, de 0,47 para 0,66 g/L.h e de 27,6 para 42,5%, em ausncia e presena do
suprimento externo de CO2, respectivamente. Estes resultados apresentaram uma
concentrao de cido succnico maior do que o valor encontrado por LEE et al. (2002), que
obtiveram 13,5 g/L de cido succnico, quando o meio foi suplementado de forma similar, em
presena de CO2, durante um processo fermentativo por M. succiniciproducens.
A Figura 5.27 apresenta o perfil cintico de fermentao, com clulas aclimatadas em
duas etapas utilizando hidrolisado obtido nas condies timas, preditas estatisticamente, por
BETANCUR (2010). Neste caso, a fermentao foi conduzida por 24 horas, com uma
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146

concentrao inicial de xilose igual a aproximadamente 22 g/L, obtido em meio contendo 25%
de hidrolisado hemicelulsico, suplementado com os mesmos nutrientes essnciais, cuja
composio foi definida aps os estudos de otimizao. Da mesma forma, os ensaios foram
monitorados sob as mesmas condies anteriores. Observando o perfil cintico obtido com os
ensaios, nota-se em ambos os casos, o aparecimento de glicose e arabinose, em pequenas
concentraes, iguais a aproximadamente 1,1 e 3,0 g/L, respectivamente.

a)

14

25

Xilose
20
10
15

10

Biomassa e c. Succnico
e Subprodutos (g/L)

Xilose, Glicose e Arabinose (g/L)

12

Glicose
Arabinose
c. succnico
Biomassa
c. actico

2
c. frmico
0

0
0

10

15

c. ltico

20

Tempo (h)

b)
14

25

12

Xilose

10
15

10

Biomassa e c. succnico
e Subprodutos(g/L)

Xilose, Glicose e Arabinose (g/L)

20
Glicose

Arabinose

Biomassa

c. succnico

4
c. actico

5
2

0
0

10

15

20

Tempo (h)

Figura 5.27. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com concentrao inicial de xilose igual
a 22,0 g/L, sob condies controladas (37C, pH 7.0 , 150 rpm). Ausncia (a) e presena (b) de
suprimento externo de CO2, a 0.05 vvm.

Cabe ressaltar que o hidrolisado obtido em condies otimizadas por BETANCUR


(2010), apresenta as seguintes concentraes de inibidores: cido actico 6,04 g/L;
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147

hidrximetilfurfural (HMF) 0,55 g/L e furfural 0,09 g/L. CHEN et al. (2010) encontraram
concentraes de inibidores muito prximas: 0,6 g/L HMF; 0.3 g/l de furfural, 1.0 g/L de cido
frmico e 3,4 g/L de cido actico em hidrolisado da fibra de milho com concentrao de
acares redutores totais, igual a 70,0 g/L, durante os estudos para produo de cido
succnico, por A. succinogenes.
Nota-se que, nas primeiras horas de processo, ocorre o esgotamento total de glicose a
uma taxa de consumo igual a 0,36 g/L.h, concomitantemente a uma menor taxa de consumo
de xilose, iguais a aproximadamente 0,20 g/L.h, em ambos os ensaios. Em seguida, a taxa de
consumo de xilose aumentou, gradualmente, para cada ensaio com valores finais a 0,87 e
0,96 g/L.h, num perodo de aproximadamente 24 e 22 horas, em ausncia e presena do
suprimento externo de CO2, respectivamente. A concentrao de arabinose manteve-se
praticamente constante durante todo o processo.
Com relao produo de cido succnico, os valores obtidos para a produtividade
volumtrica, concentrao final e rendimento em produto, apresentaram um aumento de 0,27
para 0,45 g/L.h; de 8,5 para 11,7 g/L e de 0,28 para 0,39 g/g de acordo com as figuras 5.32a e
5.32b, respectivamente. A concentrao de cido actico reduziu de 6,5 para 5,6 g/L do
primeiro para o segundo ensaio, respectivamente. As concentraes finais de cido frmico,
ltico e etanol no primeiro ensaio, foram de 2,4; 0,9 e 0,19 g/L. No houve a formao de
cido ltico e etanol em presena do suprimento externo de CO2.
A Figura 5.28 apresenta os perfis cinticos de fermentao, anteriores aos estudos de
otimizao do processo, para concentrao inicial de xilose igual a 52,0 g/L, em 32 horas de
fermentao, com uma concentrao inicial de clulas de aproximadamente 3,0 g/L.
Novamente, o tempo para o esgotamento total de xilose foi maior no primeiro ensaio
(Figura 5.28a), prximo de 28 horas de fermentao, com formao simultnea dos cidos
actico (5,2 g/L), frmico (3,3 g/L) e ltico (1,0 g/L). Quando o crescimento celular atinge a
fase estacionria, em aproximadamente 24 horas, possvel perceber a continuidade na
formao de acido actico, enquanto as concentraes do cido frmico e cido ltico ficam
constantes.
Para o segundo ensaio (Figura 5.28b) nota-se uma reduo no tempo de esgotamento
de xilose para aproximadamente 24 horas, com crescimento celular contnuo at o final do
processo, alm de uma reduo na concentrao final de cido actico (2,4 g/L).
Os valores encontrados para a concentrao final de cido succnico, rendimento em
produto e de eficincia em relao ao rendimento mximo terico, apresentaram um aumento
de 15,5 para 20,1 g/L, 0,26 para 0,40 g/g e de 19,4 para 29,9%, em ausncia e presena de
suprimento externo de CO2, respectivamente.

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148
60

25
Xilose

50

20

40

Xilose (g/L)

15
30
10
20

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)

a)

Biomassa

c. succnico

c. actico

c. frmico

10

c. ltico

0
0

10

15

20

25

30

Tempo (h)

b)
60

25

20

Xilose (g/L)

40
15
30
10
20
5

10

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)

Xilose

50

c. succnico

Biomassa

c. actico

0
0

10

15

20

25

30

Tempo (h)

Figura 5.28. Fermentao em meio sinttico, com 52,0 g/L de xilose, sob condies controladas
(37C, pH 7.0, 150 rpm). Ausncia (a) e presena (b ) de suprimento externo de CO2, a 0.05 vvm.

A Figura 5.29 apresenta os perfis cinticos de fermentao, em meio de composio de


nutrientes com valores de concentrao posterior aos estudos de otimizao, para
concentrao inicial de xilose igual a 52,0 g/L, em 32 horas de fermentao, com uma
concentrao inicial de clulas de aproximadamente 3,0 g/L.

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149
60

30

50

25

40

20

30

15

20

10

10

c. succnico
Biomassa
c. actico
c. frmico
c. ltico
etanol

0
0

b)

Xilose

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)

Xilose (g/L)

a)

10

15

20

25

30

60

30

50

25

40

20

30

15

20

10

10

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)

Xilose (g/L)

Tempo (h)

Xilose

c. succnico

Biomassa

c. actico

c. frmico

0
0

10

15

20

25

30

Tempo (h)

Figura 5.29. Fermentao em meio sinttico de composio definida aps os estudos de


otimizao, com 52,0 g/L de xilose, sob condies controladas (37C, pH 7.0, 150 rpm) . Ausncia
(a) e presena (b) de suprimento externo de CO2, a 0.05 vvm.

Como observado com os perfis cinticos demonstrados anteriormente, para o ensaio


realizado em presena de suprimento externo de CO2, houve uma ligeira reduo no tempo de
fermentao, com maiores valores de crescimento celular e produtividade volumtrica. No
foram observadas a formao de cido ltico e etanol no segundo ensaio (Figura 5.29b). Os
valores para a concentrao final de cido actico e cido frmico, foram reduzidos de 7,35
para 3,1 g/L e de 4,5 para 0,4 g/L, em ausncia e presena do suprimento externo de CO2,
respectivamente. Observou-se que, em aproximadamente 18 horas de fermentao, a
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150

concentrao de cido actico continua aumentando, enquanto as concentraes de cido


frmico e cido ltico ficam constantes, com uma queda na concentrao de etanol. Os
valores de concentrao final de cido succnico, rendimento em produto (Yp/s) e de eficincia
em relao ao rendimento mximo terico, apresentaram um aumento de 20,5 para 25,4 g/L,
0,9 para 1,21 g/g e de 29,9 para 46,3 %, respectivamente.
Estudos prvios mostraram que uma concentrao de cido actico de 9,0 g/L e uma
eficincia um pouco maior (50%), foi obtida por A. succinogenes CGMCC1593, a partir de
aproximadamente 50 g/L de glicose, suplementado com 15 g/L de extrato de levedura em
frascos agitados, sob condies de anaerobiose (LIU et al., 2008).
A Figura 5.30 mostra o comportamento da fermentao realizada com clulas
aclimatadas

em

duas

etapas

utilizando

hidrolisado,

com

uma

concentrao

de

aproximadamente 3,0 g/L. Os ensaios foram conduzidos por 32 horas, com uma concentrao
inicial de xilose igual a aproximadamente 52 g/L, obtido em meio contendo 50% de hidrolisado
hemicelulsico, suplementado com os nutrientes de composio definida aps os estudos de
otimizao.
Foram observadas concentraes iniciais de glicose e arabinose, em torno de
aproximadamente 2,5 e 8,0 g/L, existentes no hidrolisado. A presena de hexoses como
manose, galactose e glicose, e/ou de pentoses, pode promover uma diminuio na utilizao
da xilose, por preferncia metablica por esses glicdeos. Apesar disso, o consumo de xilose
restabelecido quando esgotados esses glicdeos fermentveis (DU et al., 1994). O consumo
total da glicose ocorreu nas primeiras 3 horas de processo, tempo em que a taxa de formao
de produto aumentada. Aps consumo da glicose, a xilose foi degradada em
aproximadamente 28 horas de processo, como mostra a Figura 5.30a. No foi constatado
nenhum consumo de arabinose com o decorrer do processo.
A concentrao final de cido succnico foi de 18,0 g/L, com uma concentrao final de
clulas igual a 4,4 g/L e valores de rendimento em produto e produtividade volumtrica iguais
a 0,30 g/g e 0,69 g/L.h. Com relao formao de subprodutos, foram encontrados 8,7 g/L
de cido actico, que manteve um aumento at o final do processo, 3,8 g/L para o cido
frmico, que se manteve constante aps 20 horas, 1,2 g/L de cido ltico, cujo aumento foi
detecado quando o crescimento celular entrou atingiu fase de crescimento estacionrio e,
concentrao de etanol prxima de zero.
Para o segundo ensaio, em aproximadamente 24 horas de fermentao, os valores de
concentrao final de cido succnico, concentrao final de clulas, rendimento em produto
(Yp/s) e produtividade volumtrica foram de 23,0 g/L, 4,9 g/L, 0,42 g/g e 1,05 g/L.h,
respectivamente. Estes resultados foram inferiores aos obtidos, no procedimento anterior
(Figura 5.29), possivelmente devido presena de inibidores presentes no hidrolisado. Para
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151

este caso (presena de suprimento externo de CO2) a concentrao final de cido actico foi
reduzida para 6,6 g/L, sem a formao de cido ltico e etanol.

a)

60

30

50

25

40

20

30

15

20

10

10

Biomassa e c. Succnico
e Subprodutos (g/L)

Xilose, Glicose e Arabinose (g/L)

Xilose
Glicose
Arabinose
c. succnico
Biomassa
c. actico
c. frmico
0

0
0

10

15

20

25

c. ltico

30

Tempo (h)

60

30

50

25

40

20

30

15

20

10

10

Xilose

Biomassa e c. succnico
e Subprodutos(g/L)

Xilose, Glicose e Arabinose (g/L)

b)

Glicose
Arabinose
Biomassa
c. succnico
c. actico

0
0

10

15

20

25

30

Tempo (h)

Figura 5.30. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com concentrao inicial de xilose igual
a 52,0 g/L, sob condies controladas (37C, pH 7.0 , 150 rpm). Ausncia (a) e presena (b) de
suprimento externo de CO2, a 0,05 vvm.

Resultados semelhantes a

estes foram encontrados por

WAN et al. (2008), em

fermentao a partir do soro de queijo, com uma concentrao inicial de lactose igual a 50 g/L,
com suprimento de CO2 a 0,05vvm e concentrao inicial de clulas de 4 g/L, em pH 6.8,
usando a linhagem Actinobacillus succinogenes 130 Z. Porm, as concentraes de
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152

subprodutos encontradas pelo autor foram maiores, em torno de 8 g/L de cido actico, 5 g/L
de cido frmico, 2,5 g/L de cido ltico e 0,5 g/L de etanol.
A Figura 5.31 apresenta os perfis cinticos de fermentao, em meio de composio de
nutrientes anterior aos estudos de otimizao, para concentrao inicial de xilose igual a 80,0
g/L, em 48 horas de fermentao, com uma concentrao inicial de clulas de
aproximadamente 3,0 g/L.

90

40

80

35

70

30

Xilose (g/L)

60
25
50
20
40
15
30
10

20

Xilose

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)

a)

c. succnico
c. actico
c. frmico
etanol
c. ltico

10

Biomassa

0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

Tempo (h)

b)
40

80

35

70

30

60
25

Xilose (g/L)

50
20
40
15

30

10

20

10
0

Xilose

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)

90

Biomassa

c. succnico

c. actico

c. frmico

0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

Tempo (h)

Figura 5.31. Fermentao em meio sinttico, com 80,0 g/L de xilose, sob condies controladas
(37C, pH 7.0, 150 rpm). Ausncia (a) e presena (b ) de suprimento externo de CO2, a 0.05 vvm.

O tempo de esgotamento total de xilose, na Figura 5.31a, foi de aproximadamente 32


horas, com a estabilidade na concentrao de clulas igual a aproximadamente 4,4 g/L, uma
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concentrao final de cido succnico igual a 33,5 g/L e uma produtividade volumtrica em
cido succnico igual a 1,16 g/L.h. Como ocorrido anteriormente, aps um determinado
perodo (22 horas), a concentrao de cido actico continuou aumentando at atingir 10,4
g/L, enquanto os cidos frmico e ltico atingiram 5,8 e 1,85 g/L, respectivamente. O etanol
apresentou uma concentrao baixa de 0,65 g/L.
Para o ensaio seguinte, em presena do suprimento externo de CO2, o tempo de
esgotamento de xilose foi de aproximadamente 28 horas e as concentraes finais de cido
actico e cido frmico foram reduzidas para 3,6 e 0,70 g/L, respectivamente; sem a formao
dos outros subprodutos.
Ao final do processo, foi encontrada uma concentrao final de clulas de
aproximadamente 4,9 g/L, uma concentrao final de cido succnico de 37,6 g/L e uma
produtividade igual de 1,44 g/L.h. Foi possvel observar ainda que, o crescimento celular
alcanado foi menor que os valores obtidos em concentraes iniciais de substrato menores,
denotando inibio do crescimento para concentraes elevadas de substrato.

Segundo

ZHENG et al. (2009), concentraes acima de 80 g/L de xilose, obtida do hidrolisado da palha,
promovem inibio no crescimento celular da bactria A. succinogenes CGMCC1593.
A Figura 5.32 apresenta os perfis cinticos de fermentao, obtidos com os ensaios
aps os estudos de otimizao, com a mesma concentrao inicial de xilose de 80 g/L, sob as
mesmas condies de pH, agitao e temperatura anteriores.
Uma reduo no perodo necessrio para a fermentao, de aproximadamente 4 horas,
em relao ao perfil cintico do ensaio anterior (Figura 5.31) foi observado, enfatizando assim,
a importncia dos estudos realizados para otimizao do processo.
Pela anlise da Figura 5.32, os valores das de concentraes finais de cido actico e
cido frmico foram reduzidos, de 12,1 para 4,3 g/L e de 6,9 para 0,9 g/L, respectivamente.
Em aproximadamente 18 horas de fermentao, a concentrao de cido actico continuou
aumentando, com estabilizao celular em 4,6 g/L. Os valores de concentrao final de cido
succnico, rendimento em produto e produtividade volumtrica apresentaram um aumento, de
38,4 para 42,5 g/L, 0,49 para 0,66 g/g e de 1,40 para 1,80 g/L.h, em 28 e 24 horas de tempo
de fermentao, respectivamente.

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a)

90

45

80

40

70

35

60

30

50

25

40

20

30

15

20

10

10

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)

Xilose (g/L)

Xilose

Biomassa
c. succnico

c. frmico

etanol

c. ltico
c. actico

10

15

20

25

30

35

40

45

Tempo (h)

90

45

80

40

70

35

60

30

50

25

40

20

30

15

20

10

10

Xilose

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)

Xilose (g/L)

b)

Biomassa

c. succnico

c. actico

c. frmico

0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

Tempo (h)

Figura 5.32. Fermentao em meio sinttico de composio definida aps os estudos de


otimizao, com 80,0 g/L de xilose, sob condies controladas (37C, pH 7.0, 150 rpm) . Ausncia
(a) e presena (b) de suprimento externo de CO2.

Na Figura 5.33 apresenta-se o comportamento da fermentao realizada com clulas


aclimatadas em duas etapas utilizando hidrolisado hemicelulsico. Neste caso, a fermentao
foi conduzida por 48 horas, com uma concentrao inicial de xilose igual a aproximadamente
80 g/L e uma concentrao inicial de clulas de aproximadamente 3,0 g/L.

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155

50

80

45

Xilose

40

Glicose

70

35
60
30
50
25
40
20

Arabinose
Biomassa
c. succnico
c. actico

30
20
10

15

c. frmico

10

c. ltico

etanol

0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

Tempo (h)

b)
90

50

80

45
40

70

Xilose, Glicose e Arabinose (g/L)

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)

90

35
60
30
50
25
40
20

Xilose

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)

Xilose, Glicose e Arabinose (g/L)

a)

Glicose
Arabinose
Biomassa
c. succnico

30
15
20

c. actico

10
c. frmico

10

0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

Tempo (h)

Figura 5.33. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com concentrao inicial de xilose igual
a 80,0 g/L, sob condies controladas (37C, pH 7.0 , 150 rpm). Ausncia (a) e presena (b) de
suprimento externo de CO2, a 0.05 vvm.

Cabe ressaltar, que o processo se inicia com uma concentrao de cido actico em
torno de 5,0 g/L, presente no hidrolisado hemicelulsico. Verifica-se elevadas taxas de
consumo de glicose, iguais a 1,26 e 1,33 g/L.h, concomitantemente a taxa de consumo de
xilose mais reduzida, iguais a 0,66 e 0,50 g/L.h, na ausncia e presena de suprimento
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externo de CO2, respectivamente. Naturalmente, com o rpido esgotamento, a taxa de


consumo de xilose aumentou, gradualmente, com valores finais para cada ensaio iguais a
2,53 e 2,91 g/L.h.
No que diz respeito produo de cido succnico, o perfil cintico no apresentou
inflexes aparentes, aps o esgotamento de glicose, mostrando-se constante e com um
acrscimo nos valores de produtividade, rendimento em produto e eficincia de 1,21 para 1,50
g/L.h; 0,45 para 0,53 g/g; 33,6 para 39,6% (em relao ao mximo terico) e concentraes
finais de produto iguais 35,9 e 40,3 g/L para as Figuras 5.33a e 5.33b, respectivamente.
A formao de subprodutos apresentou maiores valores em termos de concentrao,
sem a deteco de cido ltico e etanol no segundo ensaio (Figura 5.33b). Os valores para a
concentrao final de cido actico e cido frmico, foram reduzidos de 12,1 para 4,3 g/L e de
6,9 para 0,9 g/L, nas Figuras 5.33a e 5.33b, respectivamente. Em aproximadamente 22 horas
de fermentao, a concentrao de cido actico continuava aumentando, enquanto a
concentrao de cido frmico mantinha-se constante, com um aumento na concentrao de
cido ltico, de forma similar aos experimentos anteriores.
A Tabela 5.18 apresenta os parmetros e variveis de resposta, de forma mais
objetiva, como: tempo de fermentao, concentrao inicial de xilose (So), concentrao final
de cido succnico (P) e biomassa (X), fator de rendimento em produto (YP/S), produtividade
volumtrica de cido succnico (QP) e eficincia na converso para produto (Ef), em relao ao
rendimento mximo terico (1,12 g/g).
Comparando os ensaios a partir de meio sinttico inicial e meio sinttico com a
concentrao de nutrientes definida aps os estudos de otimizao, alguns aspectos gerais
podem ser discutidos. Para os experimentos com concentrao inicial de xilose de 22 g/L,
verifica-se um aumento na concentrao final de cido succnico, de 6,04 para 14,02 g/L; na
produtividade, de 0,25 para para 0,66 g/L.h; no rendimento em produto, de 0,23 pra 0,57 g/g e
um aumento na eficincia de 17,1 para 42,5%.
De forma similar, com 52 g/L de concentrao inicial de xilose, houve um aumento na
concentrao final de cido succnico, de 15,5 para 25,4 g/L; na produtividade, de 0,65 para
1,21 g/L.h, no rendimento em produto, de 0,26 para 0,62 g/g e na eficincia de converso, de
19,4 para 46,3 %.

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157

Tabela 5.18. Variveis de resposta obtidos a partir dos processos de fermentao, a partir de
meio sinttico e da frao hemicelulsica do bagao de cana-de-aucar.
Valores mximos

Condies
Processo
de
fermentao
So
(g/L)

tf
(h)

x
(g/L)

P
(g/L)

*QP
(g/L.h)

YP/S
(g/g)

Ef
(%)

x
(g/L)

Ausncia de CO2

Meio
Inicial

Meio
(condies
timas)

P
(g/L)

*QP
(g/L.h)

YP/S
(g/g)

Ef
(%)

Presena de CO2

22.0

24

3,0

6,04

0,25

0,23

17,1

3,5

9,2

0,41

0,36

26,9

52.0

32

4,5

15,5

0,65

0,26

19,4

5,2

20,1

1,00

0,40

29,9

80,0

48

4,4

33,5

1,16

0,42

31,3

4,9

37,6

1,44

0,46

34,3

22.0

24

3,6

10,04

0,47

0,37

27,6

4,15

14,2

0,66

0,57

42,5

52.0

32

5,2

20,5

0,90

0,40

29,9

6,1

25,4

1,21

0,62

46,3

80,0

48

4,6

38,4

1,40

0,49

36,6

5,0

42,5

1,80

0,66

49,3

22.0
24
2,9
8,50
0,27
0,28 20,9
3,2
11,7
0,45
0,39
29,6
52.0
32
4,4
18,0
0,69
0,30 22,4
4,9
23,0
1,05
0,42
31,3
80,0
48
4,1
35,9
1,21
0,45 33,6
4,5
40,3
1,50
0,53
39,6
S0: concentrao inicial de xilose, x: concentrao final de clulas; P: concentrao final de cido
succnico; Qp: produtividade;Yp/s: rendimento em produto; Ef: eficincia em relao ao mximo
terico (Yp/s terico = 1,34g cido succnico/g xilose consumido)
*Varivel de resposta analisada para definir a viabilidade do processo

Hidrolisado

Para os ensaios com 80 g/L de concentrao inicial de xilose inicial, foram obtidos os
melhores resultados para a concentrao final de cido succnico, que aumentou de 33,5 para
42,5 g/L. Para a produtividade, rendimento em produto e eficincia, houve um aumento de
1,16 para 1,80 g/L.h, de 0,42 para 0,66 g/g e de 31,3 para aproximadamente 49,3%, ou seja,
uma diferena total em torno de 22,5%, inferior as diferenas obtidas com os ensaios em
concentraes de 20 e 52 g/L, que aumentaram em torno de 25-27%, na ausncia e presena
de CO2.
No que concerne aos valores de concentrao celular, os acrscimos foram de 3,0 para
4,15; 4,5 para 6,1 e 4,4 para 5,0 g/L, para os ensaios com as concentraes iniciais de 22; 52
e 80 g/L, respectivamente. Tambm foi possvel verificar maiores perodos de fermentao, de
acordo com a concentrao inicial de xilose, influenciando nos valores finais de produtividade
volumtrica.
Os experimentos realizados com o hidrolisado hemicelulsico apresentaram uma
reduo nas concentraes finais de produto em relao aos resultados obtidos em meio
sinttico, alcanando valores iguais a 11,7; 23,0 e 40,3 g/L, para 22, 52 e 80 g/L de xilose,
respectivamente. Estudos anteriores mostraram que o crescimento celular pode ser reduzido
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pelos inibidores, como furfural, hydrximetilfurfural (HMF) e cido actico, bem como
compostos aromticos oriundos da lignina cida (BETANCUR & PEREIRA, 2010; SAHA,
2003; PALMQVIST & HAHN-HGERDAL, 1999).
No foram realizados estudos sobre a influncia desses inibidores celulares no
crescimento celular e na produo de cido succnico, vislumbrando-se a possibilidade de
trabalhos futuros acerca desse aspecto, segundo metodologias para monitoramento dessas
substncias txicas e possvel remoo, sem acarretar perdas de substrato. Porm, com o
presente trabalho ficou demonstrado possibilidade de desenvolver um eficiente processo de
fermentao a partir da frao hemicelulsica, sem a implementao de etapas de
destoxificao, utilizando apenas aclimatao celular, em etapas suscessivas. Ainda de
acordo com a Tabela 5.18, mesmo havendo uma queda no valor dos resultados a partir do
hidrolisado hemicelulsico, eles se mantiveram superiores aos valores encontrados nos
ensaios realizados antes dos estudos de otimizao para a hierarquizao da influncia dos
componentes presentes no meio de fermentao.

5.8.1. Formao de Subprodutos

Toda bactria produtora de cido succnico, durante a fermentao, forma uma mistura
de cidos (Tabela 5.19), produzindo quantidades variadas de produto de interesse e de outros
produtos, incluindo cido actico, cido ltico, cido frmico (ZEIKUS et al., 1999).
De acordo com a anlise dos resultados obtidos, a concentrao de subprodutos pode
ser relacionada, principalmente, a trs fatores: a otimizao dos componentes do meio de
cultivo; a utilizao de suprimento externo de CO2 e a concentrao inicial de substrato
(xilose).
A concentrao de subprodutos foi reduzida em presena de suprimento externo de
CO2, ao passo que acrscimos foram alcanados com a concentrao de cido succnico.
Durante a produo de cido succnico, o fosfoenolpiruvato (PEP), um dos intermedirios
centrais durante fermentao de mistura de cidos, convertido por duas enzimas, presentes
no metabolismo de A. succinogenes, chamada PEP carboxiquinase e piruvato quinase (KIM et
al., 2004). PEP carboxiquinase a enzima responsvel por fixar o CO2 covertendo a PEP em
oxaloacetato, induzindo o fluxo para formao de cido succnico (LEE et al., 1999). Na
ausncia de CO2 (Figura 2.16), a piruvato quinase converte PEP a piruvato, que convertido
em subprodutos da fermentao, como o etanol e os cidos actico, frmico e ltico (VAN
DER WERF et al., 1997).

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Tabela 5.19. Concentrao final de produto e subprodutos dos processos de fermentao


para obteno de cido succnico por A. succinogenes.

Concentrao final de produtos

Condies

(g/L)
Processo de
fermentao
So
(g/L)

Tempo
(h)

AS

AA

AF

AL

Et

AS

Ausncia de CO2

Meio
Inicial

Meio
sinttico
(condies
timas)

Hidrolisado

AA

AF

AL

Et

Presena de CO2

22.0

24

6,04

2,2

1,3

0,67

0,14

9,2

1,2

0,15

---

---

52.0

32

15,5

5,2

3,3

1,0

0,36

20,1

2,4

0,25

---

---

80,0

48

33,5

10,4

5,8

1,85

0,65

37,6

3,6

0,70

---

---

22.0

24

10,0

4,74

1,44

1,1

0,23

14,2

2,0

0,2

---

---

52.0

24

20,5

7,35

4,5

1,4

0,5

25,4

3,1

0,4

---

---

80.0

48

38,4

12,1

6,9

2,2

0,8

42,5

4,3

0,9

---

---

22.0

24

8,50

6,5

2,4

0,90

0,19

11,7

5,6

0,5

--.

--.

52.0

32

18,0

8,7

5,5

1,2

0,41

23,0

6,6

0,64

---

---

80.0

48

35,9

11,0

5,9

1,96

0,7

40,3

7,8

0,75

---

---

AS: cido succnico, AA: cido actico, AF: cido frmico, AL:cido ltico, Et: etanol

A formao dos subprodutos representa um dos principais problemas na produo


biotecnologica do cido succnico, porque reduz sua produtividade e rendimento, devido
inibio do crescimento celular (JENSEN et al., 2003). Dependendo das condies do
processo fermentativo, h alternativas para evitar ou reduzir o efeito de inibio, como por
exemplo, o uso integrado de sistemas para separao de subprodutos e o reciclo de clulas,
como ocorrido com a bactria Enterococcus sp, que converte fumarato at succinato com alta
eficincia (98%), em presena de glicerol como fonte de carbono (VEMURI et al., 2002) a
partir de um detalhado estudo de integrao de etapas de processo. Em muitos casos, o
dixido de carbono essencial para diminuir a formao desses subprodutos, responsveis
pela inibio no crescimento de alguns microrganismos produtores de cido succnico (UEDA
et al., 2008).
Com a otimizao de composio dos nutrientes, o acrscimo observado para
aconcentrao de cido succnico foi maior do que para a concentrao de subprodutos, os
quais foram mantidos em concentraes inferiores a 4,0 g/L para cido actico e 1,0 g/L para
cido frmico, sem a constatao de cido ltico e etanol. Essa diferena, pode ser explicada
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pela incorporao dos nutrientes essenciais em concentraes adequadas, como por exemplo
componentes como MgCO3 ou NaHCO3, que contribuem para a melhoria na produo de
cido succnico, aliviando uma possvel deficincia mineral (em derivados do trigo, por
exemplo); promovendo a liberao de CO2, ao reagir com os cidos orgnicos produzidos
durante a fermentao (DU et al., 2008).
Para o consumo de substrato, verificou-se que em termos de produtividade e
rendimentos, houve um aumento significativo em 80 g/L, porm grandes diferenas no foram
encontradas ao variar a concentrao de xilose entre 20 e 52 g/L. Para as fermentaes
conduzidas em presena de hidrolisado, o fator crucial foi concentrao inicial de cido
actico (4,0-6,0 g/L, para 20-80 g/L, respectivamente), j presente no hidrolisado, contribuindo
para inibir o crescimento celular e reduzir a formao de cido succnico, embora a
concentrao de subprodutos no tenha apresentado uma diferena significativa dos ensaios
anteriores.
Portanto, alternativas podem reavaliadas a respeito da etapa de pr-tratamento do
bagao de cana-de-aucar, visando uma reduo mais efetiva na concentrao de inibidores.
DAVID & CRISTIAN, (2008) alcanaram este objetivo, mediante adsoro com carvo ativado,
em estudos para produo de cido succnico a partir do hidrolisado da madeira. A tcnica foi
desenvolvida e otimizada previamente por CARVALHEIRO et al. (2005), durante o prtratamento de de gros de cervejaria, para produo de de xilitol a partir de Debaryomyces
hansenii CCMI1941.
Pode-se concluir que os cidos actico e frmico foram os subprodutos principais. LIU
et al. (2008) reportaram que acetato e formato de sdio exercem inibiao mediante
interferncias na membrana transporta de fosfato. O transporte de fosfato pela membrana
celular um processo de transporte ativo, que requer consumo de ATP. A primeira etapa da
gliclise envolve, ento, a produo da substncia glicose-6-fosfato, onde as interferncias
resultam em uma maior exigncia de ATP para manuteno. Essas interferncias podem
acontecer de acordo com a concentrao de subprodutos. Estudos mostram que cerca 2,5 g/L
de cido frmico, pode reduzir at 80% da densidade clular. O cido frmico tem uma
solubilidade similar ao actico, portanto, o mesmo mecanismo de inibio pode ocorrer em
valores baixos de concentrao de cido actico (MAIORELLA et al.,1983).
5.9. Avaliao da produo de cido succnico pelo processo SSF (Simultaneous
Saccharification and Fermentation) em biorreator
O processo SSF vem sendo bastante utilizado, como uma alternativa para obteno de
diversos produtos a partir de fontes renovveis, como etanol (WINGREN et al., 2003;
OHGRENAL et al., 2007 e SANTOS & PEREIRA, 2009), cido lctico (ROMAN et al., 2008;
JOHN et al., 2009) e hidrognio (LI & Chen, 2007). Porm, nenhum estudo foi realizado para o
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aproveitamento de bagao de cana-de-aucar para produo de cido succnico. Inicialmente,


foram avaliados os efeitos da concentrao inicial de clulas face utilizao de glicose inicial
do processo SSF, obtida na etapa de pr-hidrlise enzimtica (SANTOS, 2009), com uma
concentrao de aproximadamente 75 g/L.
Os perfis cinticos foram obtidos com 48 horas de processo, sob as seguintes
condies operacionais: relao slido lquido 3:10, atividade enzimtica de 25 FPU/g e
variao da concentrao inicial de clulas (1,0; 2,0; 3,0 e 4,0 g/L) a 37C. A Figura 5.34
mostra que no houve diferena significativa entre as concentraes finais de produto e
subprodutos quando utilizadas concentraes iniciais de clulas iguais a 1,0 e 2,0 g/L. O
mesmo comportamento foi observado para as concentraes de 3,0 e 4,0 g/L.

cido succnico e subprodutos (g/L)

c. frmico

c. actico

c. succnico

40
35
30
25
20
15
10
5
0
1.0

2.0

3.0

4.0

Concentrao de clulas (g/L)

Figura 5.34. Concentrao final de produto e subprodutos do processo de hidrlise enzimtica e


fermentao simultneas de celulose, em frascos agitados, com uma concentrao inicial de
glicose igual a 75 g/L e variao da concentrao inicial de clulas entre 1,0 e 4,0 g/L.

Analisando a Figura 5.35, quando a concentrao inicial de clulas foi aumentada de


1,0 para 3,0 g/L, as concentraes finais de cido succnico alcanadas foram de 28,6 e 35,1
g/L, respectivamente. Ficou constatada uma reduo de 36 para 30 horas no tempo de
fermentao, com um ligeiro aumento no valor da produtividade, de 0,81 para 1,21 g/L.h.

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a)
90

45

80

40

70

35

60

30

50

25

40

20

30

15

20

10

10

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)

Glicose e Celobiose (g/L)

Glicose

C elobiose

c. succnico

c. frmico

c. actico

0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

Tempo (h)

b)
90

45

80

40

70

35

60

30

50

25

40

20

30

15

20

10

10

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)

Glicose e Celobiose (g/L)

Glicose

C elobiose

c. succnico

c. frmico

c. actico

0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

Tempo (h)

Figura 5.35. Perfil cintico do processo de hidrlise enzimtica e fermentao simultneas de


celulose, em frascos agitados, com uma concentrao inicial de glicose igual a 75 g/L e
concentraes iniciais de clulas iguais a 1,0 (a) e 3,0 g/L (b).

Em maior concentrao inicial de clulas o tempo de fermentao foi reduzido, com


reflexo positivo sobre a produtividade volumtrica em cido succnico, uma vez que a glicose
liberada metabolizada de forma mais rpida em presena de maiores concentraes de
clulas bacterianas (LI et al., 2007). Dessa forma, durante a validao experimental das
condies de cultivo do processo SSF, em biorreator, foram definidas as seguintes condies:
relao slido-lquido 3:10 (g/mL), carga enzimtica 25 FPU/g e uma concentrao inicial de
clulas de aproximadamente 3,0 g/L.

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Concomitantemente ao processo SSF, em biorreator, um experimento em meio


sinttico foi conduzido sob as mesmas condies, com a concentrao inicial de glicose igual
a 81 g/L, simulando o valor obtido ao final da fase de pr-hidrlise enzimtica, que neste caso,
foi um pouco maior do que a quantidade de glicose obtida anteriormente (75 g/L). A eficincia
do processo de fermentao depende da concentrao inicial de glicose produzida durante a
hidrlise enzimtica (SANTOS, 2009).
Cabe ressaltar que, todos esses ensaios foram monitorados com um fluxo contnuo de
suprimento externo de CO2, a exemplo dos estudos para consumo de xilose, onde maiores
concentraes de cido succnico foram atingidas sob esta condio.
A Figura 5.36 apresenta os perfis cinticos para a formao de cido succnico, de
subprodutos e consumo de glicose comercial em meio sinttico, durante 48 horas de
fermentao. A concentrao final de cido succnico foi de 41,6 g/L, com produtividade

90

45

80

40

70

35

60

30

50

25

40

20

30

15

20

10

10

Glicose

Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)

Glicose e Celobiose (g/L)

volumtrica de 1,77 g/L.h, em um tempo de fermentao de aproximadamente 24 horas.

c. succnico

c. frmico

c. actico

0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

Tempo (h)

Figura 5.36. Perfil cintico do processo de fermentao, com uma concentrao inicial de glicose
igual a 81,0 g/L, em biorreator, com concentrao inicial de clulas igual de 3,0 g/L, com
suprimento externo de CO2, a 0,05 vvm.

Na Figura 5.37 esto apresentados os perfis cinticos para formao de cido


succnico, de subprodutos, consumo de glicose e de celobiose, durante o processo SSF em
batelada. A primeira etapa corresponde fase de pr-hidrlise enzimtica, monitorada ao
longo de 12 horas, seguido da fase de sacarificao e fermentao simultneas.

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Figura 5.37. Perfil cintico do processo de hidrlise enzimtica e fermentao simultneas de


celulose, com uma concentrao inicial de glicose igual a 81,0 g/L, em biorreator e concentrao
inicial de clulas igual a 3,0 g/L, com suprimento externo de CO2, a 0,05 vvm. P.E: pr-hidrlise
enzimtica; SSF: fermentao e sacarificao simultneas.

Ao final da fase de pr-hidrlise, foi observada uma concentrao de glicose de


aproximadamente 80,0 g/L e de celobiose igual a aproximadamente 5,0 g/L, que apresentou
uma taxa de consumo baixa, sem exercer influncia significativa sobre o processo. No incio
do procedimento SSF, o reator foi inoculado com 3,0 g/L de clulas no meio com aspecto
liquefeito, e temperatura reduzida para 37C (temperatura tima para a fermentao).
Ao longo do processo foi observada uma reduo da produtividade volumtrica em
cido succnico (QP) em relao ao experimento anterior, realizado em meio sinttico (Figura
5.35), refletindo em uma pequena reduo na taxa de formao de produto e na eficincia de
converso do substrato, conforme mostra a Tabela 5.20. Os resultados foram muito prximos
aos encontrados nos ensaios com frascos agitados (ensaio 3), conduzidos pelo processo SSF.
Uma reduo para aproximadamente 28 horas de fermentao, medida que a concentrao
final de cido succnico e a produtividade aumentaram de 35,1 para 38,4 g/L e de 1,21 para
1,42 g/L.h, mostram que a validao em biorreator foi eficiente.
Pode ser verificado um aumento na produtividade volumtrica com uma reduo do
tempo de fermentao de 36 para 24 horas de processo, do ensaio 1 (frascos agitados) para a
validao em biorreator, respectivamente.
Cabe ressaltar que, em todos os experimentos, a concentrao de subprodutos foi
relativamente baixa, devido ao fluxo contnuo de suprimento externo de CO2, com formao de
cido actico e cido frmico em concentraes inferiores a 4,5 e 1,9 g/L, respectivamente.
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cido ltico e etanol no foram identificados durante todo o processo. Os resultados obtidos a
partir de meio sinttico foram prximos aos valores encontrados por URBANCE et al. (2003),
que obtiveram 35,0 g/L de cido succnico, com concentrao inicial de glicose igual a 65 g/L,
durante fermentao em batelada e uma produtividade inferior, de 0,52 g/L.h.

Tabela 5.20. Variveis de resposta e concentrao de produto e subprodutos durante o


processo SSF.
Condies

Valores mximos

Ensaios
S0
(g/L)

Tempo
(h)

tf
(h)

P
AA
AF
x0
(g/L) (g/L) (g/L)
(g/L)

*QP
(g/L.h)

Fermentao pelo processo SSF


Ensaio 1

75,0

48

36

1,0

28,6

3,1

1,60

0,81

Frascos Ensaio 2
Agitados

75,0

48

32

2,0

30,4

3,3

1,64

0,98

Ensaio 3

75,0

48

30

3,0

35,1

3,8

1,74

1,21

Ensaio 4

75,0

48

30

4,0

35,7

3,87

1,75

1,23

81,0

48

28

3,0

38,4

4,0

1,81

1,42

4,4

1,88

1,77

Biorreator

Fermentao em meio sinttico


Biorreator

81,0

48

24

3,0

41,6

S0: concentrao inicial de xilose, tf: tempo de esgotamento de glicose e mxima concentrao do
produto formado; x0: concentrao inicial de clulas; P: concentrao final de cido succnico; Qp:
produtividade; AA: cido actico, AF: cido frmico
*Varivel de resposta analisada para os estudos da viabilidade do processo

CHEN et al. (2010) alcanaram uma concentrao final de cido succnico, cido
actico, cido frmico e etanol em concentraes iguais a 14 g/L, 7,8 g/L, 1.7 g/L e 5.0 g/L,
durante estudos de fermentao a partir do sake (bebida alcolica japonesa), por A.
succinogenes 130Z, com um rendimento de 0,55 g/g. Os mesmos autores encontraram uma
concentrao de 48 g/L de cido succnico, a partir de estudos de otimizao da hidrlise
enzimtica do sake, durante 51 horas de processo, com concentrao inicial de glicose igual a
63,6 g/L. Porm, a quantidade de nutrientes presentes no sake contribuiu para incrementar o
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rendimento, com concentraes de carboidratos em torno de 37.4%, alm de uma srie de


protenas e sais minerais.
Em um processo SSF com A. succinogenes CGMCC1593 desenvolvido por LI et al.
(2010), usando o sabugo do milho, a concentrao final de cido succnico (15,8 g/L) e valor
de produtividade (1,23 g/L.h) foram inferiores ao presente trabalho. De forma semelhante, os
autores verificaram que a celobiose no foi consumida com o tempo, sendo a glicose
convertida em 48 horas de fermentao. As concentraes de cido actico encontradas
durante o processo foram de 5,0 a 7,0 g/L. Os autores conseguiram um aumento na produo
de cido succnico (45 g/L), alm de uma reduo na concentrao de subprodutos para 2,0
g/L, quando utilizaram celulase (20.FPU/g), 80 g/L de concentrao inicial de glicose, a 38C
em 48 horas de fermentao. Porm, estes pesquisadores utilizaram uma composio de
nutrientes mais complexa, encarecendo o processo em relao ao presente trabalho.

5.10. Evoluo dos experimentos desenvolvidos na produo de cido succnico


Os valores de concentrao final de cido succnico, rendimento em produto e
eficincia, para os ensaios realizados a partir de meio sinttico, esto apresentados na Tabela
5.21, que foi elaborada a partir dos resultados obtidos com a mesma concentrao inicial de
20 g/L dos respectivos substratos (glicose e xilose), para facilitar a anlise das etapas
desenvolvidas.
Nos ensaios iniciais, durante o cultivo de inculo (M.C) foi possvel verificar a formao
de cido succnico, em concentraes de at 5 g/L. Nos experimentos realizados em F1, sob
as mesmas condies do ensaio anterior, o objetivo foi avaliar a relao C:N sob o
crescimento celular. Porm, tambm foi determinada a produo de cido succnico,
resultando em uma diferena pouco significativa, com aumento da eficincia de 21,4 para
24,1% e de 19,4 para 20,9% nos ensaios com glicose e xilose, respectivamente.
Em

seguida,

durante

as

primeiras

fermentaes,

foram

utilizados

recursos

computacionais para o monitoramente e a otimizao do processo, visando melhores


rendimentos de converso do substrato. Em P1, foram determinadas as variveis que
exerceram maior influncia sob a produo de cido succnico, seguido do P2, com a
obteno dos valores de concentrao considerados timos pelo modelo executado, para
cada nutriente presente no meio de fermentao, acarretando em um aumento de eficincia
para 38,1 e 43,8% para xilose e glicose, respectivamente.

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Tabela 5.21. Resultados finais para a produo de cido succnico, durante as etapas de
ensaios iniciais, planejamentos experimentais seqenciais e validao das condies
otimizadas, em meio sinttico com concentrao de substrato de 20 g/L.
Resultados finais
Condies

Etapas

S0

Glicose

Xilose

(g/L)

Tempo
(h)

P
(g/L)

Yp/s
(g/g)

Ef
(%)

P
(g/L)

Yp/s
(g/g)

Ef
(%)

M.C

20,0

24

4,98

0,24

21,4

5,20

0,26

23,2

F1

20,0

24

5,70

0,27

24,1

6,50

0,28

25,0

P1

20,0

24

7,49

0,34

30,4

9,02

0,36

32,1

P2

20,0

24

10,86

0,49

43,8

12,85

0,51

45,5

P3

20,0

24

10,98

0,50

44,7

12,89

0,52

46,4

F2

20,0

24

12,5

0,55

49,2

14,2

0,57

50,1

Ensaios
iniciais

Otimizao

Validao

MC:Meio de crescimento para inculo; F1: Fermentao para estudo da relao C:N sob crescimento
celular e produo de cido succnico; P1: Planejamento Fatorial Fracionado PFF4-1, P2: Delineamento
Composto Central Rotacional (DCCR); P3:Planejamento Fatorial Fracionado PFF5-1, F2: Validao em
meio sinttico.
*Dados calculados a partir do rendimento terico para cada substrato (Yp/s terico = 1,12g cido
succnico/g glicose consumido; 1,34g cido succnico/g xilose consumido)

O efeito das condies de cultivo do processo, como pH, temperatura e agitao foram
avaliados no planejamento P3, confirmando os melhores valores para conduo de trabalho,
usados no decorrer dos ensaios anteriores, iguais a 37C, 150 rpm e pH 7.0. Os resultados
foram prximos aos obtidos com P2, como era de se esperar. A fermentao (F2) para a
validao das condies otimizadas, resultaram em uma concentrao final de cido succnico
igual 12,5 e 14,2 g/L para glicose e xilose, respectivamente.
Atravs de uma viso geral dos experimentos, foi constatado um aumento na produo
de cido succnico de 19,4 para 42,5% e de 21,4 para 49,2%

para xilose e glicose,

respectivamente. Pode-se concluir, que apesar de terem sido alcanados maiores


concentraes finais de produto com os ensaios utilizando xilose como substrato (Figura
5.38), a eficincia dos processos a partir de glicose foram relativamente maiores.

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Resultados muito prximos a estes, foram encontrados por LEE et al. (2000) durante
estudos, em condies anaerbicas, com A. succiniciproducens, onde os autores verificaram a
capacidade da bactria de se desenvolver em meio com composio mnima (20 g/L de
glicose), quando suplementado com milhocina (10-15 g/L), como fonte de nitrognio,
resultando em 12,8 g/L de cido succnico.

16
Glicose

cido succnico (g/L)

14

Xilose

12
10
8
6
4
2
0
MC

F1

P1

P2

P3

F2

Experimentos

Figura 5.38. Evoluo da produo de cido succnico, em meio sinttico com 20 g/L de substrato.
MC:Meio de crescimento para inculo; F1: Fermentao para estudo da relao C:N sob
crescimento celular e produo de cido succnico; P1: Planejamento fatorial fracionado PFF4-1;
P2: Planejamento Composto Central Rotacional (DCCR); P3:Planejamento fatorial fracionado
PFF5-1; F2: Validao em meio sinttico

Resultados muito prximos a estes, foram encontrados por LEE et al. (2000), durante
estudos, em condies anaerbicas, com A. succiniciproducens, onde os autores verificaram a
capacidade da bactria de se desenvolver em meio com composio mnima (20 g/L de
glicose), quando suplementado com milhocina (10-15 g/L), como fonte de nitrognio,
resultando em 12,8 g/L de cido succnico.

5.11. Comparao entre os processos desenvolvidos para produo de cido


succnico, a partir do hidrolisado hemicelulsico e do processo SSF

A Tabela 5.13 mostra os resultados obtidos para a produo de cido succnico,


durante a validao das condies otimizadas, para os ensaios em meio sinttico, em meio
contendo hidrolisado hemicelulsico, bem como a partir do processo SSF. Comparando os
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resultados, foi possvel confirmar a adequao da bactria Actinobacillus succinogenes para


produo de cido succnico, tanto para o uso de xilose como de glicose. Embora similares, os
resultados obtidos a partir de glicose como fonte de carbono foram menores, especialmente,
em relao ao ensaio conduzido com hidrolisado hemiceulsico, onde a concentrao inicial
de cido actico foi maior. Conforme j foi observado anteriormente, em concentraes
elevadas de substrato inicial, a bactria A. succinogenes apresentou uma reduo do
crescimento celular a partir de 44-50 g/L de glicose e 80 g/L de xilose.

Tabela 5.22. Produo de cido succnico a partir da frao hemicelulsica do bagao de


cana e do processo SSF, com uma concentrao inicial de substrato igual a aproximadamente
80,0 g/L, a 37C, 150 rpm, pH 7.0 e fluxo contnuo de suprimento externo de CO2, a 0,05 vvm.

Fermentao
(Condies otimizadas)

Condies
S0
(g/L)

Valores mximos

Tempo
(h)

P
(g/L)

Qp
(g/L.h)

Experimentos a partir de xilose


Meio sinttico

80,0

48

42,5

1,80

Hidrolisado

80,0

48

40,3

1,50

Experimentos a partir de glicose


Meio sinttico

81,0

48

41,6

1,77

SSF

81,0

48

38,4

1,42

S0: concentrao inicial de xilose; P: concentrao final de cido succnico;


Qp: produtividade

Porm, um dos fatores determinantes para a eleio desta bactria, foi pautado,
fundamentalmente em sua tolerncia a elevadas concentraes de substrato. LIN et al. (2008)
estudaram o efeito inibio pelo substrato e pelo produto, sobre o crescimento de
Actinobacillus succinogenes ATCC 55618, em fermentao usando glicose como principal
fonte de carbono e verificaram que o crescimento celular foi completamente inibido com
concentrao de glicose acima de 140 g/L. Cabe ressaltar, que os autores se depararam com
um decrscimo bastante significativo do rendimento e da produtividade, alm de um
prolongamento da fase lag na maioria dos experimentos acima de 70 g/L, ao contrrio do perfil
obtido no presente trabalho. Atravs de estudos cinticos, constataram que as concentraes
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crticas de acetato, etanol, formato, lactato e succinato foram 46, 42, 16, 74 e 104 g/L,
respectivamente. Fenmeno semelhante foi descrito por Guettler et al. (1996) e Liu et al.
(2008), sugerindo que a linhagem em questo poderia tolerar at 160 g/L de glicose inicial,
mas, tambm alcanaram rendimentos e valores de produtividade bastante reduzidos.
Dessa forma, estudos envolvendo a avaliao do comportamento podem facilitar a
compreenso desses fenmenos acerca do metabolismo da bactria Actinobacillus
succinogenes CIP 106512. Uma investigao sistemtica dos efeitos de inibio pelo
substrato e pelo produto , ento, um fator crucial para o desenvolvimento de uma estratgia
de controle efetiva para melhorar a produo de cido succnico.

5.12. Desenvolvimento de um modelo simples para a produo de cido succnico


Nesta sesso, foram desenvolvidos estudos preliminares de modelos cinticos
empricos simples para a produo de cido sucnico em batelada, a partir de uma srie de
pesquisas na literatura, com foco nos estudos de Song et al. (2008) que estudaram a linhagem
M. succiniproducens. Dessa forma, o comportamento cintico da bactria A. succinogenes foi
investigado a partir de fermentaes conduzidas em diferentes concentraes iniciais de
glicose, uma vez que de acordo com os experimentos apresentados at o momento fora o
substrato que apresentou maiores valores em termos de eficincia do processo, quando
considerado o rendimento mximo terico.
5.12.1. Crescimento celular
De acordo com Monod (1942), apresenta uma variao em diferentes valores de S, e
a taxa especifica de crescimento mxima (mx) para uma dada espcie microbiana em
determinadas condies representa um valor terico constante atingido assntoticamente
somente quando S , sendo o carto de identidade do microrganismo par aquele S
especfico. A constante de saturao Ks representa a afinidade da espcie microbiana com o
substrato em questo, valores pequenos de S indicam maiores afinidades, portanto maiores
fases exponenciais de crescimento. Para a determinao desses parmetros (mx e KS),
foram estimados em uma faixa contendo baixos valores de concentrao inicial de glicose ,
entre 2,0 e 6,0 g/L, j que Monod props sua equao sem levar em conta possveis efeitos
de inibio.
possvel constatar que nestas fermentaes os efeitos de inibio pelo substrato ou
pelo produto foram inexistentes, resultando em valores de S2/Ki e P/PCRIT prximos de zero
(SONG et al., 2008). Consequentemente, a equao 4.2 pode ser reduzida para a clssica
equao de Monod. Os valores de KS e mx foram obtidos mediante linearizao, obtendo o
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Grfico dos inversos Lineweaver-Burk, plotando-se 1/ versus 1/S. Na literatura existem


diversos trabalhos de determinao de KS e mx que fornecem informao importantes sobre
a afinidade dos microrganismos por um dado substrato em particular, alm de serem teis na
modelagem matemtica dos referidos processos (SCHMIDELL et al., 2001). Em seguida, Ki foi
calculado a partir das fermentaes desenvolvidas em concentraes elevadas de glicose,
entre 20 e 70g/L, usando os dados resultantes da fase exponencial de crescimento, nas
primeiras horas do processo, visando evitar os efeitos inibitrios sobre o crescimento celular,
causados pela formao do produto(s). Dessa forma, a expresso de Levenspiel (equao
4.2) foi reduzida a expresso de Andrews (equao 4.1), onde o valor de P/PCRIT igual a
zero.
De forma anloga, plotando-se os valores de 1/ em funo de S, o valor de Ki foi
determinado (R2=.981). Os valores de KS, Ki e m esto listados na Tabela 5.23. Os dados
obtidos foram comparados com aqueles resultantes dos estudos de Song et al. (2008) e
outros existentes na literatura.
Tabela 5.23. Dados dos parmetros cinticos obidos pelo modelo
Parmetro de formao do produto associado
ao crescimento celular (g/g)

AA
0,555

FA
0,590

LA
0

SA
1,436

Parmetro de formao do produto no associado


ao crescimento celular (h1)

AA
0,110

FA
0,093

LA
0,186

SA
0,315

Rendimento em produto e subprodutos (g/g)

YAA
0,887

YFA
1,359

YLA
0,886

YSA
1,162

Constantes do perfil cintico

Kd (h1)
0,009

KS (g/L)
0,996

Ki (g/L)
78,40

Rendimento em clulas, taxa de crescimeto e


concentrao crtica de produto

mx (h1)
0,883

YX (g g1)
0,678

PCRIT (g L1)
16,29

O aspecto real da curva de Monod, demonstrando a ocorrncia dos efeitos de inibies


pelo substrato em excesso, causando diminuio na taxa de crescimento celular, pode ser
observado na Figura 5.39, onde os resultados preditos pelo modelo foram comparados com os

dados experimentais. Nota-se que, para valores elevados de concentrao de substrato


presente no meio, a inibio um fenmeno que no pode ser ignorado, por gerar limitaes do
crescimento celular. De acordo com os dados obtidos, em uma concentrao inicial de xilose

igual a aproximadamente 20,0 g/L, o valor encontrado para a taxa de crescimento especfico
mximo (mx) alcanado pode ser prximo de 0,883 h1.

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Por falta de predio de fenmenos inibitrios a equao hiperblica de Monod ficou


respeitada e utilizada at os dias atuais nos estudos cinticos. No entanto a ausncia de inibio
na verdade uma situao pouco comum de ocorrer na prtica, principalmente em cultivos
descontnuos,

onde

ocorre

um

acmulo

de

metablitos

que

acabam

interferindo

desfavoravelmente no metabolismo e crescimento microbiano. Isto poderia ser atenuado se


fossem sempre usadas baixas concentraes de substrato, o que na maioria das vezes no se
torna rentvel j que com isto seriam obtidas baixas concentraes de produto acarretando em
custos elevados de separao e purificao (BAILEY & OLLIS, 1986).

Figura 5.39. Avaliao dos efeitos da concentrao inicial de glicose sobre a taxa especfica de
crescimento de A. succinogenes CIP 106512. Dados simulados (-) e experimentais ()

A taxa especfica mxima de crescimento determinada pelo modelo foi mais alta que
valores j reportados na literatura (0.39-0.41 h1) (MCLINKAY et al., 2008) e (0,5 h1 (LIN et
al., 2008). CORONA-GONZALS et al. (2008) encontraram valores para a taxa de
crescimento celular que foi reduzida de 0,41 para 0,09 com o aumento da concentrao inicial
de glicose de 10 para 100 g/L, por A. succinogenes ZT-130, ao estudarem a cintica pelo
modelo proposto por JERUSALIMSKY (1967) para descrever o perfil cintico microbiano e,
Song et al. (2008) encontraram um valor igual a 1,3245 h1, mas a linhagem utilizada foi
diferente daquela usada no presente trabalho.
Baseando-se no valor encontrado de m, pode-se concluir que a bactria A.
succinogenes CIP 106512 apresenta um desempenho promissor para a produo de cido
succnico, por fermentao. Esta diferena pode ter sido ocasionada pela composio de
nutrientes do meio, de influncia previamente hierarquizada com os estudos de planejamento.
Com relao aos efeitos de inibio dos cidos orgnicos no crescimento celular, tem sido
reportado na literatura, que existe uma dependncia entre esses efeitos com o pH do meio de
cultura, com a constante de dissociao dos cidos (pKa) e com a concentrao molar dos
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cidos (NARENDRANATH & THOMAS, 2001; VASSEUR et al., 1999). Assim, o termo de
produto nas equaes (4.2 - 4.4) pode ser assumido como sendo a soma das quantidades
individuais de cada cido presente no meio de fermentao, para simplificar o modelo (SONG
et al., 2008). A Figuras 5.40 e 5.41 mostram os perfis de crescimento da bactra A
succinogenes,

formao de produto e subprodutos. Pode ser observado que os dados

experimentais e simulados para formao de cido succnico e crescimento celular


apresentaram um timo ajuste.

Figura 5.40. Perfil cintico de consumo de substrato (), produo de cido succnico () e
crescimento celular (o) em fermentao por batelada simples, por A succinogenes, com
diferentes concentraes inicias de glicose (a) 10 g L1, (b) 20 g L1, (c) 30 g L1, (d) 40 g L1,
(e) 50 g L1e (f) 70 g L1. Dados simulados (linhas) e experimentais (smbolos circulares)
.
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Atravs da Figura 5.40 verificou-se que o crescimento celular reduzido gradualmente


com o aumento das concentraes de cidos orgnicos presentes no meio de fermentao.
Foi possvel constatar que a concentrao de cido succnico aumentou proporcionalmente
com a concentrao celular, durante a fase de crescimento exponencial, mantendo-se
tambm na fase estacionria de crescimento, comportamento tpico de cintica mista.

Figura 5.41. Perfil cintico da formao dos cidos actico (), frmico () e ltico () durante a
fermentao, por A succinogenes, a partir de diferentes concentraes iniciais de glicose. (a)
10 g L1, (b) 20 g L1, (c) 30 g L1, (d) 40 g L1, (e) 50 g L1e (f) 70 g L1. Dados simulados (linhas) e
experimentais (smbolos).
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Portanto, Isto significa que a produo de cido de succnico por A. succinogenes CIP
106512 segue o modelo proposto por Luedeking-Piret, indicando que a taxa de formao de
produto est relacionada tanto com a taxa de crescimento celular (rX), como tambm com a
concentrao de biomassa (X) (LUEDEKING-PIRET, 1959).
5.12.2. Avaliao e classificao do perfil cintico de formao de produto(s)
De acordo com os grficos os valores preditos pelo modelo apresentaram um ajuste
adequado aos dados experimentais, diminuindo a distncia entre eles. O coeficiente no
associado, para formao de cido succnico (SA = 0.315 h-1), foi determinado quando no foi
identificado nenhum crescimento celular, ou seja, para valores de P PCRIT. J o coeficiente
de crescimento associado foi obtido para valores de P < PCRIT. Os coeficientes para formao
dos subprodutos foram obtidos de maneira semelhante identificao do cido succnico,
atravs da equao 4.6. Estes valores foram muito prximos aos encontrados por SONG et
al.(2008), mostrando que a linhagem M. succiniciproducens possui comportamente
semelhante a bactria A. succinogenes.
Como ocorrido com o perfil para cido succnico, o perfil cintico para formao do
cido actico e cido frmico foi classificado como associado ao crescimento celular, de
acordo com a Figura 5.41. Entretanto, percebe-se que o cido ltico comeou a ser produzido
quando a taxa de crescimento celular foi reduzida, em um perfil tipicamente no associado ao
crescimento. Comportamento diferente deste observado com outros microrganismos, como
Escherichia coli, Lactobacillus, Lactococcus, e Saccharomyces, onde o cido ltico
apresentado como um produto de formao associada ao crescimento, (AKERBERG et al.,
1998; HA et al., 2003; YOUSSEF et al., 2005 e SHULER et al., 1992).
5.12.3. Avaliao e classificao do perfil cintico de consumo de substrato
No ajuste entre os dados simulados e experimentais, para o consumo de glicose, foram
observadas pequenas discrepncias na fase de crescimento estacionrio, que ficaram
ligeiramente maiores, com o aumento das concentraes iniciais de glicose, como mostrado
nas Figuras 5.40 (d-f). Para simplificar o modelo, no foi incorporada a produo de CO2,
pelas clulas, que acontece atravs de reaes de descarboxilao, o que pode ter causado
esta ligeira discrepncia entre os dados analisados. Parte desse carbono tambm liberada
durante a lise celular. Adicionalmente, mudanas na morfologia celular durante a fase de
crescimento estacionrio (DATTA et al., 1992), podem ter resultado esta variao.

Uma

anlise elementar (C,H,O e N) da linhagem poderia contribuir para definir a quantidade de


substrato que encaminhado, efetivamente, para a composio celular (SONG et al., 2008).
.
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No entanto, o desenvolvimento deste modelo simples descreve satisfatoriamente o


comportamento cintico do crescimento celular, formao de produto e consumo de substrato,
podendo ser usado para aperfeioar o processo para a produo de cido succnico. Por
exemplo, a concentrao tima de substrato (glicose) pode ser selecionada para alimentar um
processo de fermentao em batelada ou contnuo.
O emprego de modelos mais aprimorados pode ampliar o conhecimento dos
mecanismos de controle sobre a linhagem estudada, tornando-se uma etapa crucial para
identificar os objetivos corretos para a otimizao de um processo, contribuindo para aumentar
o desempenho operacional e, conseqentemente, aumentar a concentrao do produto
desejado, uma vez que a partir da degradao do substrato diversas reaes paralelas e
consecutivas ocorrem, formando diferentes produtos. Para avaliar os resultados mais
expressivos obtidos com o presente trabalho, recomenda-se uma apreciao final da Tabela
2.3 (Reviso Bibliogrfica), onde esto descritas diversas estratgias de fermentao para a
produo de cido succnico, reportadas pela literatura.

5.13. Consideraes finais


Os

parmetros

que

determinam

viabilidade

econmica

de

um

processo

biotecnolgico so a concentrao final de produto, o fator rendimento e a magnitude da


produtividade. Enquanto o rendimento est mais relacionado ao custo varivel de matriaprima, a concentrao final de produto e a produtividade esto mais ligadas com o custo fixo e
investimento total. As taxas de produo raramente esto alcanando o valor estipulado pelo
Departamento de Energias do EUA (DOE), fixado em 2.5 g/L.h. Sendo assim, atravs da
avaliao dos diversos resultados disponveis na literatura e, conseqentemente do processo
biotecnolgico para a produo de cido succnico, nenhum estudo desenvolvido at a
presente data, pode ser considerado economicamente competitivo em relao ao processo
por rota qumica. Mesmo assim, vrias companhias anunciaram a produo de cido
succnico, como sendo considerado o produto comercial do futuro.
O objetivo e o desenho experimental adotado para a execuo do presente trabalho,
pautaram-se, fundamentalmente, na identificao de uma linhagem at ento pouco explorada
e nas questes econmicas do processo, mediante o uso de um meio simplificado para a
produo de cido succnico, ao contrrio das atuais pesquisas realizadas, em que a
complexidade do meio de cultivo aliado a tcnicas avanadas de engenharia gentica e
integrao de processos de separao e purificao (PSP) so recorrentes na busca por
rendimentos considerveis.
Concernente com esta realidade, os resultados alcanados com o presente trabalho
foram bastante satisfatrios, pois foi possvel confirmar a adequao da bactria Actinobacillus
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succinogenes CIP 106512 para a produo de cido succnico, a partir de diferentes fontes de
carbono, em meio de composio mnima. Alm disso, o modelo proposto pode ser til para o
desenvolvimento e o aperfeioamento dos processos para a produo de cido succnico a
partir de fontes renovveis.

O Brasil encontra-se em posio bastante


privilegiada
para
assumir
a
liderana
no
aproveitamento integral de biomassas e seguir sua
vocao natural para desenvolvimentos nesta
temtica. O momento nunca foi to propcio.
Nei Pereira Jr

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CAPTULO 6

CONCLUSES

6.1. Concluses
 A bactria Actinobacillus succinogenes mostrou-se um microrganismo agente do
processo de produo de cido succnico bastante promissor. Sua habilidade de
consumir os acares que aparecem em maior proporo nos hidrolisados de materiais
lignocelulsicos, aliada a elevada capacidade de produo desse cido orgnico
ficaram

evidenciadas,

gerando

oportunidades

para

futuros

interessantes

desenvolvimentos tecnolgicos;
 Nos experimentos iniciais, o tempo de preparo do inculo ficou padronizado entre 12 a
15 horas de cultivo, atravs de monitoramento do perfil cintico. Aps este perodo, a
fermentao ficou caracterizada pelas fases de desacelerao e estacionria do
crescimento celular, para ambas as fontes de carbono utilizadas;
 A incluso de duas etapas de aclimatao, durante o processo de propagao celular,
permitiu a reduo do tempo de fermentao em hidrolisado hemicelulsico, com efeito
positivo sobre o valor da produtividade volumtrica, alm de aumentar a produo final
de cido succnico, com uma concentrao muito prxima ao valor obtido em meio
sinttico (diferena de apenas 10 %), o que denota a robustez da bactria face a
utilizao de um hidrolisado contendo agentes txicos .
 Os melhores resultados da razo C:N sobre o crescimento celular esto entre 13,0 e
22,7:1. Estes valores representam uma concentrao de nitrognio de 0,65 g/L no meio
de cultivo. A linhagem se desenvolveu adequadamente em concentraes elevadas de
xilose. Porm, para os ensaios com glicose, houve um decrscimo no crescimento
celular, indicando inibio acima de 36,0-40,0 g/L;
 Com a aplicao da tcnica de planejamento experimental seqencial foi constatada
uma maior importncia estatstica da interao entre os componentes NaHCO3 e
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MgSO4, com valores de p-level abaixo do estabelecido para a anlise (0,1). O KH2PO4
mostrou um efeito negativo sobre a concentrao final de cido succnico, no entanto
apresentou a menor significncia estatstica entre as variveis analisadas.
 O pH mostrou-se uma varivel de elevada importncia estatstica, em ambos os
tempos de fermentao (24 e 48 horas), com aumento do seu valor do nvel inferior
(pH=6.0) para o superior (pH=8.0), conforme j evidenciado por outros autores. A
temperatura tambm apresentou efeito significativo, em 24 horas de fermentao;
 As concentraes de glicose e xilose apresentaram um efeito positivo, em 24 horas de
fermentao, porm negativo para 48 horas de fermentao, mas no significativo. A
anlise de varincia (ANOVA) mostrou que o modelo mais adequado para o ajuste dos
dados experimentais foi o modelo quadrtico reduzido, possibilitando a validao das
condies otimizadas, em biorreator;
 A produo de cido succnico a partir da frao hemicelulsica do bagao de cana-deacar, resultou em uma concentrao final de produto igual a 40,3 g/L, com 80,0 g/L de
concentrao inicial de xilose, sob agitao de 150 rpm a 37C. Nos ensaios com 80 g/L

de concentrao inicial de xilose comercial, foram obtidos os melhores resultados,


atingindo uma concentrao final de cido succnico de 42,5 g/L, um valor de
produtividade volumtrica igual a 1,80 g/L.h e um rendimento em produto igual a 0,66
g/g. Porm, efeitos inibitrios sobre o crescimento celular, alm do registro de maiores
concentraes de subprodutos, foram observados;
 Para as fermentaes conduzidas em presena de hidrolisado hemicelulsico, o fator
crucial foi concentrao inicial de cido actico (4,0-6,0 g/L para 20-80 g/L de xilose,
respectivamente) j presente no hidrolisado, desde o nicio do processo, contribuindo
para inibir o crescimento celular e reduzir a formao de cido succnico, em relao
aos ensaios conduzidos em meio sinttico;
 Para o processo SSF conduzido em frascos agitados, com uma concentrao inicial de
glicose igual a 75 g/L, com as seguintes condies: relao slido-lquido 3:10 (g/mL),
carga

enzimtica

25

FPU/g,

concentrao

inicial

de

clulas

de

g/L

aproximadamente 32 horas de processo, foram obtidos uma concentrao final de


cido succnico e uma produtividade volumtrica iguais a 35,1 g/L e 1,21 g/L.h,
respectivamente;
 Para o aproveitamento da celulose, em biorreator, ao final da fase de pr-hidrlise, foi
observada uma concentrao de glicose de aproximadamente 80,0 g/L e, o processo
SSF apresentou respostas muito prximas aos ensaios conduzidos em frascos
agitados. Foi observada uma reduo no tempo de fermentao para 28 horas, com
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um aumento na concentrao final de cido succnico e produtividade, de 35,1 para


38,4 g/L e de 1,21 para 1,42 g/L.h, respectivamente. A reduo no perodo de
fermentao foi decorrente do aumento na concentrao inicial de clulas.
Adicionalmente, sob as mesmas condies em biorreator, o ensaio conduzido a partir
de meio sinttico apresentou uma concentrao final de cido succnico de 41,6 g/L,
com uma produtividade volumtrica de 1,77 g/L.h, em aproximadamente 24 horas,
mostrando que a validao em biorreator foi eficiente;
 Atravs dos estudos dos modelos cinticos simples, para a produo de cido sucnico
em batelada, a elevada taxa especfica mxima de crescimento (m), mostrou que a
bactria A. succinogenes CIP 106512 possui um bom desempenho na produo de
cido succnico, por fermentao. Foi observado que o crescimento celular reduzido
gradualmente com o aumento das concentraes de cidos orgnicos, cessando
completamente quando so alcanados valores de aproximadamente 16 g/L (PCRIT);
 O crescimento celular de A succinogenes CIP 106512 pode ser representado, de
acordo com os estudos de modelagem, por um modelo de Monod expandido, incluindo
as constantes de inibio de substrato e de produto, sugeridas por Andrews (1968) e
Levenspiel (1980), respectivamente;
 A produo de cido de succnico segue o modelo de Luedeking-Piret (1959),
indicando que a taxa de formao de produto est relacionada tanto com a taxa de
crescimento celular (rX), como tambm com a concentrao de clulas (X), com os
parmetros de crescimento associado e no associado, para cido succnico, iguais a
1.436 e 0.314 h1, respectivamente. A formao do cido actico e cido frmico foi
associada ao crescimento celular. Entretanto, o cido ltico comeou a ser produzido
quando a taxa de crescimento celular foi reduzida, em um perfil tipicamente no
associado ao crescimento;
 No ajuste entre os dados simulados e experimentais, para o consumo de glicose, foram
observadas pequenas discrepncias na fase de crescimento estacionrio, que ficaram
ligeiramente maiores, com o aumento das concentraes iniciais de glicose (40,0; 50,0
e 70,0 g/L);
 O modelo permitiu a identificao de concentraes de glicose e cidos orgnicos,
consideradas timas em um biorreator, tanto para o crescimento celular como para a
produo do cido succnico. Foi possvel elucidar as caractersticas da bactria A.
succinogenes e explicar sua habilidade em sintetizar cido succnico;

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6.2. Sugestes
 Como o desenvolvimento do modelo simples descreveu satisfatoriamente os
comportamentos cinticos do processo, ele poder ser usado para aperfeioar a
produo de cido succnico. Por exemplo, a concentrao tima de substrato (glicose)
pode ser selecionada para alimentar um processo de fermentao contnuo ou em
batelada alimentada. Esta forma de conduo permitiria estender a fase exponencial de
crescimento e controlar os nveis de substrato, evitando assim, os efeitos repressores
sobre o metabolismo da bactria;
 Outras concepes podem ser incorporadas ao presente trabalho, como a estratgia
de operao denominada SSCF (Simultaneous Saccharification and Cofermentation SSCF), no qual a co-fermentao se refere fermentao de ambos os acares,
pentoses e hexoses, em uma mesma etapa. Nesta configurao o hidrolisado
hemicelulsico e a celulose no so separados aps a etapa de pr-tratamento,
permitindo que os acares da hemicelulose sejam convertidos a cido succnico
juntamente com a sacarificao e fermentao da celulose;
 Verificar a habilidade da bactria Actinobacillus succinogenes face utilizao de
outros aucares como lactose, galactose e maltose, incluindo o uso de reestimao de
resultados, como rendimento e produtiviade, mediante a utilizao de meios de cultivo
mais complexos do que o meio utilizado no decorrer do presente trabalho;
 Utilizar a metodologia de Plackett-Burman para a determinao dos parmetros
cinticos do modelo gerado com o presente trabalho e, verificar a influncia destes
sobre os perfis das variveis de estado;
 Estudar uma etapa de incluso de membranas de eletrodilise bipolares aps
micro/ultrafiltrao em membranas de fibra oca (hollow fiber), para separao da forma
aninica (succinato) e purificao, seguida de cristalizao;
 Caracterizar as membranas com relao aos dados de resistncia, fouling (queda de
fluxo do permeado/retido), temperatura, pH e presso transmembrana durante o
processo de separao.
 Realizar balanos de massa e finaceiro visando a o escalonamento do processo,
desenvolvido com o presente trabalho, a partir de estudos de viabilidade industrial.

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