BIOSEGURIDAD

El trabajo en el laboratorio de microbiologa mdica debe ser considerado de alto riesgo para
todo el personal de laboratorio, debido al manejo de diferentes tipos de muestras clnicas
(muestras de tejidos, sangre y otros fluidos biolgicos) potencialmente contaminadas con
patgenos microbianos y de cultivos de microorganismos obtenidos a partir de tales muestras
clnicas.
Para minimizar este riesgo existe un plan de bioseguridad que usted debe seguir
rigurosamente.
Recomendaciones generales para los alumnos durante el desarrollo de las actividades
prcticas
El uniforme y la pechera es de uso obligatorio, le protege del material infeccioso, de reactivos y
colorantes entre otros.
Los alumnos deben asistir con una presentacin adecuada al trabajo del laboratorio, con el
pelo tomado y las manos con las uas cortas
Todos los artculos personales, como bolsos, tiles y maletines, deben ser guardados fuera del
rea de laboratorio
Deben lavarse las manos peridicamente, cada vez que entren en contacto con material
infeccioso y siempre que se haga abandono del rea del laboratorio (ver tcnica del lavado de
manos gua bsica)
Se debe evitar tocarse, frotarse o rascarse con las manos las diferentes partes del cuerpo
mientras se permanezca en el laboratorio.
Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas diariamente e inmediatamente despus
de que ocurra algn derrame de material infeccioso (muestras clnicas o cultivos)
Esta rotundamente prohibido pipetear con la boca.
Esta prohibido comer, beber o fumar en el rea de laboratorio. Tampoco est permitida la
aplicacin de cosmticos en el rea de laboratorio.
Las agujas y cualquier otro material cortopunzante debe ser descartado en cajas de material
resistente y con tapa.
Todos los procedimientos con muestras clnicas y cultivos microbianos deben ser realizados
muy cuidadosamente de manera que se reduzca al mximo la formacin de aerosoles,
particularmente en la estriacin de placas, al destapar recipientes conteniendo muestras
clnicas y cultivos microbianos, y al pipetear o centrifugar material infeccioso.
Cuando alguna persona tenga cortes o lesiones en la piel de las manos debe vendarse
adecuadamente y utilizar guantes protectores en todo su trabajo en el laboratorio.
Se deben utilizar guantes protectivos cuando sea inevitable el contacto con material infeccioso
o cuando se trabaje en el nivel de bioseguridad 3
Cada alumno tendr un puesto en el mesn de trabajo, el cual debe mantenerse limpio y
ordenado. Adems ser responsable del microscopio y del material que se le asigne
En caso de ruptura de tubos o placas conteniendo un cultivo, avise de inmediato al docente

NOTA: Frente a un derrame:

Lavado. Primero se eliminan los restos groseros de cristal, plstico, agar, etc., en un recipiente
para ser autoclavado, despus se lava con abundante agua y un detergente acuoso y a
continuacin se inicia la desinfeccin. Hay que tener en cuenta que cualquier sustancia
orgnica (agar sangre, restos de peptona, etc.) es extraordinariamente bloqueante de la
capacidad oxidativa del hipoclorito sdico y de la capacidad de actuacin de los iodforos; por
ello, la norma es primero limpiar y despus desinfectar.
Desinfeccin. Se emplear un desinfectante preferentemente lquido. Los ms tiles en el
laboratorio son:
1. Hipoclorito sdico (presentacin comercial 5% y se diluye a 0.5% diariamente) De eleccin
para suelos, cermicas, etc. No debe usarse en superficies metlicas. Se vierte haciendo un
crculo alrededor del derrame, o mejor sobre papel absorbente, y se deja actuar 20 minutos.
2. Iodforo. Se utiliza a la dilucin indicada por el fabricante. Adecuado en superficies
metlicas.
3. Alcohol etlico al 70%.
4. Productos detergentes desinfectantes, de fcil manejo, no corrosivo, no irritante,
especialmente activo en presencia de materia orgnica y que cambia de color cuando deja de
ser activo ej. Dextran

ETAPAS DEL DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

Introduccin.
El diagnstico de las enfermedades infecciosas, se basa en el estudio de los sntomas y signos
clnicos, as como en la demostracin de la presencia del agente etiolgico, de sus productos o
de la reaccin que este ha dejado en su contacto con el sistema inmune del individuo.
El Laboratorio de Microbiologa Clnica tiene como principal objetivo entregar al mdico
informacin relevante para el diagnstico y tratamiento de un paciente, como tambin para
que pueda aplicar medidas preventivas.
Desde que el Mdico solicita el examen hasta que recibe la informacin con el resultado, se
realiza una serie de acciones bien definidas las cuales, deben estar sujetas al control de calidad
y constituyen las fases del diagnstico microbiolgico. Cada integrante del equipo de salud,
debe ser responsable de realizar su trabajo dentro de las normas de eficacia y eficiencia y con
la mayor rapidez de respuesta, procurando minimizar o eliminar los errores.
Fases del diagnstico microbiolgico:
Existen tres etapas en la generacin de los resultados, por el laboratorio clnico:
i)

FASE PRE-ANALTICA, comprende:

Solicitud del examen por parte del Mdico. Esta orden debe tener todos los datos
demogrficos del paciente, el diagnstico clnico, examen solicitado y tipo de muestra,
tratamiento antibitico, fecha y hora de toma de muestra
Indicaciones para preparacin del paciente.
Toma de muestra:
La informacin diagnstica que el laboratorio de Microbiologa puede proporcionar, depende
de la calidad de la muestra recibida.
Una muestra mal tomada, en escasa cantidad o mal transportada, determinara un posible fallo
en la recuperacin del agente patgeno, induciendo errores en el diagnstico, como tambin
en un tratamiento inadecuado del enfermo.
.Requisitos para obtencin de una muestra de buena calidad:
.Indicaciones claras al paciente
.Tcnica asptica
.Cantidad adecuada
.Envase apropiado ( estril, limpio, protegido de la luz)
.Rotulada correctamente
.Representativa del cuadro clnico
.Previa a la terapia antibitica
.Debe ser transportada rpida y adecuadamente al laboratorio, con la orden de examen
correspondiente.
Transporte Las muestras recolectadas en tubos estriles sin medio de transporte, deben ser
enviadas al laboratorio, a la brevedad.
Como normativa de bioseguridad, las muestras deben transportarse al laboratorio, dentro de
unidades trmicas, sin hielo o unidad refrigerante, a excepcin de los aspirados nasofarngeos

para pesquisa de virus respiratorios. Las muestras deben ser trasladadas en gradillas que
permitan mantener los contenedores en forma vertical para evitar derrames.
Medios de transporte.
El uso de medios de transporte se hace necesario para impedir la desecacin de la muestra,
asegurando la viabilidad de la bacteria, sin multiplicacin significativa de los microorganismo
existentes, sobre todo si son escasos, a la vez que impiden el crecimiento exagerado de otra
flora bacteriana no deseada, desde el momento de la obtencin de la muestra hasta su
posterior estudio.
Los medios de transporte ms frecuentemente utilizados son los de Stuart, Amies, usados para
muestras de secreciones y Cary Blair, para coprocultivo.
Almacenamiento.
-Muestras para virus: en refrigerador, salvo sangre, mdula sea.
-Muestras para hongos: en refrigerador, salvo LCR, piel, pelo, uas, vaginal y balano-prepucial.
-Muestras para anaerobios: a Temperatura ambiente.
-Muestras para micobacterias: en refrigerador, salvo contenido gstrico.
-Muestras para cultivo bacteriolgico:
a) A temperatura ambiente: mdula sea, lquidos estriles (pleural, peritoneal, articular,...),
muestras oculares, muestras de cavidad oral, heridas, abscesos, fstulas, adenopatas, del
tracto genital, y biopsias.
b) En refrigerador: orinas, heces, catteres.
c) En estufa: hemocultivos, LCR, placas y tubos inoculados.
Recepcin y registro de datos
Verificar que los datos de la solicitud de examen, la muestra y el cdigo de barras coincidan.
(Datos demogrficos - nombre, edad, sexo, procedencia, Orden de Trabajo, Tipo de muestra)
Registro en el sistema informtico o manualmente en libros para tal efecto

Distribucin de las muestras

El laboratorio clnico debe tener instrucciones precisas escritas en un Manual de toma de
muestras y aplicar criterios de rechazo de muestras.

Criterios De Rechazo De Una Muestra

Muestras sin orden, con datos incompletos o discordantes
- Muestras derramadas, o rotas,...
- Envase y/o volumen inadecuados
- Muestras sin medio de transporte adecuado.

ii)

FASE ANALTICA:

En esta fase es de gran importancia el recurso humano, capacitado y bien entrenado, los
reactivos y los equipos de laboratorio, controlados y calibrados.
El Laboratorio de Microbiologa clnica tiene un rol fundamental en la identificacin de
bacterias en una muestra determinada.
El anlisis microbiolgico de una muestra, por lo general sigue la siguiente secuencia:
a) Observacin directa al microscopio
b) Cultivo
c) Identificacin fisiotaxonmica (pruebas bioqumicas o batera bioqumica)
d) Estudios de susceptibilidad a agentes antimicrobianos
La observacin directa de la muestra teida con Gram entrega informacin sobre su contenido
bacteriano. Es de gran utilidad, sobre todo, en casos de infecciones graves en las cuales el
resultado de la observacin orienta al mdico para iniciar tratamiento emprico, a la espera del
resultado de los cultivos de la muestra.
Los cultivos permiten observar la morfologa de las colonias bacterianas en un medio
determinado. Ambos estudios orientativos se complementarn con los anlisis de
identificacin del microorganismo (gnero y especie) mediante pruebas o bateras bioqumicas
y el tratamiento del paciente con un agente antimicrobiano se orienta con las pruebas de
susceptibilidad
Un Laboratorio clnico debe tener instrucciones precisas escritas en un Manual de
procedimientos donde se define paso a paso el correcto desarrollo de las tcnicas del
laboratorio, el mantenimiento y calibracin de los equipos utilizados, un programa de control
de calidad interno y externo, para la deteccin y correccin de los errores analticos posibles
III) FASE POSTANALTICA.
Incluye:
Validacin de los resultados
Informe del laboratorio en el formato establecido
Puntualidad en la entrega del resultado
Confidencialidad de la informacin de los resultados.
Aviso de valor crtico
Registro de incidentes
Respaldo de informacin
Responsabilidad del Microbilogo frente al mdico, al paciente y las autoridades
sanitarias.
Almacenamiento de las muestras
Eliminacin de muestras

CONTROL DE CALIDAD
El control de calidad en el laboratorio tiene como objetivo, que el producto final del trabajo
tenga un grado aceptable de seguridad, de conformidad con los lmites establecidos. Debido a
que la mayora de los resultados en microbiologa son producto de interpretaciones y
evaluacin de reacciones bioqumicas de seres vivos, donde la capacidad y experiencia del
evaluador tienen un gran valor, los clculos de coeficientes de variacin y desviaciones
estndares que son parte de funciones analticas, tienen poca aplicacin en el laboratorio de
microbiologa. Es por ello que algunos expertos consideran que el control de calidad en
microbiologa es mas un arte que una ciencia.
El control de calidad en resumen, es un elemento vital en el laboratorio, ya que ayuda en la
confiabilidad de las pruebas, su reproducibilidad, asegura la calidad de los materiales, reactivos
y equipos empleados, mejora la auto confianza del personal, detecta fallas que pueden
reflejarse en el informe de resultados y en general provee un entorno de excelencia en todos
los aspectos del trabajo.
1.

CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Cada lote preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario, por eficiencia o
calidad, mediante la inoculacin de microorganismos cuyo comportamiento conocemos, tanto
para reacciones positivas como negativas. Puede utilizarse para ello cepas bacterianas
domsticas o cepas control comerciales ( ATCC ).
Pruebas bsicas de control de calidad de medios preparados:
a.
Ph
b.
Esterilidad
c.
Capacidad de crecimiento y reaccin
d.
Estabilidad
Criterios de rechazo de los medios preparados:
a.
Rajadura del plato o envase.
b.
Rajadura en la superficie del medio.
c.
Variaciones en el volumen del medio.
d.
Hemlisis.
e.
Cristales en el medio.
f.
Presencia de burbujas.
g.
Presencia de cogulos.
h.
Cambio del color normal.
i.
Contaminacin.
j.
Falla en la inhibicin de microorganismos saprfitos.

EVALUACION DE LA EFICIENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS :

MEDIO DE CULTIVO

ORGANISMO CONTROL

TSI
TSI
TSI
MIO
MIO
Citrato de Simmons
Citrato de Simmons
Caldo de urea (o Agar)
Caldo de urea

E. coli
Shigella flexnerii
Pseudomona aeruginosa
Proteus mirabilis
K. pneumoniae
K.pneumoniae
E. coli
Proteus mirabilis
E. coli

Agar sangre
Agar sangre
Agar sangre
McConkey
McConkey
McConkey
EMB
EMB
SS agar
SS agar
OF medio

Estr.Betahem.Grupo B
S. pneumoniae
K.pneumoniae
E. coli
Proteus sp
Estafilococos
E. coli
Proteus sp
Salmonella sp
E. coli
E. coli

OF medio
OF medio
Lysina decarboxylasa
Lysina decarboxylasa
Lysina decarboxylasa
Bili-Esculina
Bili-Esculina
Caldo Malonato
Caldo Malonato
NaCl 6.5%
NaCl 6.5%
Sabouraud-Dextrosa agar
Sabouraud-Dextrosa agar
Sabouraud-Dextrosa agar
Caldo Cerebro-Corazn
Tioglicolato

Pseudomona sp
Moraxella sp
Citrobacter freundii
Proteus vulgaris
Salmonella arizonae
Streptococcus mitis
Enterococcus faecalis
Klebsiella pneumoniae
E. coli
Streptococcus mitis
Enterococcus faecalis
Levaduras
Dermatofitos
Estafilococos
Flora mixta
Flora mixta

REACCION ESPERADA
cido/cido
alcalino/cido
alcalino/alcalino
movilidad positiva
movilidad negativa
color azul. Crece
color verde. No crece.
Rojo-Morado. Positivo.
color Naranjao amrillento.
Negativo.
Crece. Betahemlisis.
Crece. Alfahemlisis.
Crece. No hemoltico.
Crece. Colonias moradas.
Crece. Colonias claras.
No crece.
Brillo metlico
colonias Claras
Crece. Colonias claras con H2S
No crece.
Amarillo ambos tubos.
ferrmentador
Un tubo amarillo. Oxidativo
Ningn tubo amarillo. Inerte
alcalino/cido H2S +
Rojo/cido H2S Alcalino/alcalino H2S +
Incoloro
Negro
Azul
No cambia el color
No crece
Crece
Crece
Crece
Crece
Crece
Crece

Control de calidad de los suplementos :

Es importante tener en cuenta que los suplementos de los medios de cultivo, pudieran
confrontar problemas de eficiencia o inhibicin, ya que como todo producto pudiera no haber
sido almacenado y/o transportado adecuadamente.
Solo el uso rutinario de los medios de cultivo preparados con stos suplementos, pudieran
darnos la alarma de problemas en los mismos.
Muchos suplementos son lbiles al calor, por ello se aaden al medio despus de la
esterilizacin para evitar su deterioro. Los medios preparados con la mezcla inhibidora VCN ,
deben ser utilizados dentro de los 8 das siguientes a su preparacin ya que la eficacia de la
mezcla decrece muy rpidamente. La misma advertencia es aplicable a los frascos de
VCN rehidratados, por lo que conviene guardarlos congelados si no se va a usar de inmediato.
No sobrepasar los 15 das.
En el caso de la sangre para la preparacin del agar sangre, es importante cada vez que se
reciba un nuevo lote, anotar su apariencia, observar por presencia de cogulos, hemlisis,
nmero de lote, fecha de recibo y expiracin, hacerle una determinacin de hemoglobina, la
cual debe medir entre los 13.0 - 15.0 g/dl, y por supuesto se debe tomar con una jeringuilla
una pequea muestra del vial para sembrarla en agar sangre y tioglicolato para determinar su
esterilidad. Tambin se debe examinar el agar sangre preparado con sangre, por adecuada
formacin de hemlisis, especialmente utilizando Estreptococos hemolticos.

2.

CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS:

Un elemento fundamental en el trabajo diario del laboratorio, lo constituyen los reactivos,

tanto comerciales como de preparacin domstica, que son utilizados en la caracterizacin de
microorganismos. Estos reactivos merecen una especial atencin, toda vez que fallas en su
funcionamiento pueden generar en identificaciones equivocadas.
Por ello, se recomienda correr controles diarios con las bacterias tipo y seguir estrictamente
las indicaciones en cuanto almacenamiento de los reactivos, metodologa de la prueba y
tiempo de lectura.
Es recomendable que los reactivos comerciales sean examinados inmediatamente cuando se
abre un nuevo lote o vial y llevar un registro de su funcionamiento.

REACTIVO

MICROORGANISMO

REACCION ESPERADA

Coagulasa

Staphylococcus aureus

Cogulo. Coagulasa positiva

Coagulasa

Cepa ATCC 25923

Cogulo. Coagulasa positiva

Coagulasa

Stafilococcus epidermidis

Inerte. Coagulasa negativa

Oxidasa

Pseudomona aeruginosa

Negro. Oxidasa positiva

Oxidasa

E. coli

Inerte. Oxidasa negativa

Catalasa

Staphylococcus sp

Burbujas. Catalasa positiva

Catalasa

Streptococcus sp

Inerte . Catalasa negativa

Betalactamasa

S. aureus ATCC 29213

Rojo. Positiva

Betalactamasa

H. influenzae ATCC 10211

Inerte. Negativa

Optoquina

S. pneumoniae

Halo de >/= 12 mm

ONPG

E. coli

Amarillo. Positivo

ONPG

Proteus sp

Incoloro. Negativo

Kovacs

E. coli

Anillo rojo. Indol positivo

Kovacs

S.pneumoniae

Incoloro. Indol negativo

Cloruro frrico

Proteus sp

Verde. Fenilalanina positivo

Cloruro frrico

E. coli

Incoloro.Fenilalanina
negativo

Sobres de Anaerobiosis

Bacteroides sp

Crecimiento en Anaerobiosis

Suero para tubos germinales

Candida albicans

Tubos germinales positivo

3.

CONTROL DE CALIDAD DE LOS REACTIVOS UTILIZADOS PARA TINCIONES:

La clasificacin correcta de las bacterias de acuerdo a las reacciones bioqumicas, dependen de

la pureza, reactividad y estabilidad de los reactivos. La concentracin de las soluciones por
efecto de la evaporacin de los solventes o las variaciones introducidas en los mtodos
recomendados, puede afectar los resultados de modo adverso. Este es el caso de las tinciones
para diferenciar bacterias por su reaccin al Gram y la morfologa bacteriana, tintes para
cpsulas, esporas, etc.

El control de calidad de stos tintes debe realizarse primero con cada nuevo lote preparado;
luego basta con un control cada semana para mantener un grado de seguridad apropiado en
su uso.
En el caso de la tincin de Gram, sin lugar a dudas una de las herramientas ms importantes
del microbilogo, se recomienda tener especial cuidado con la mezcla de alcohol-acetona para
decolorar la placa. Es posiblemente ste reactivo el que produce mayores problemas ya sea
por decoloracin excesiva o por dbil decoloracin de los microorganismos. Es tambin la
etapa de la tincin de Gram en la que el tiempo de exposicin es ms determinante.
Para facilitar el control de los tintes, se recomienda preparar placas con microorganismos
aislados en el trabajo rutinario, utilizando cepas frescas, tomando en cuenta aquellos que
pudieran ser ms tiles segn la tincin a evaluar.
Algunos ejemplos son:

TINCION

MICROORGANISMO

REACCION ESPERADA

Gram

Estafilococo sp

Morado. Gram-Positivo.

Gram

E. coli

Rosado. Gram-Negativo.

Gram

Mezcla de ambos

Mezcla de ambas colores.

Zielh-Neelsen

Mycobacterium sp

Rosadas. BAAR positivo

Zielh-Neelsen

E. coli

Azul. BAAR negativas.

Kellung

S. pneumoniae

Deteccin de cpsula positiva

Kellung

E. coli

Verde malaquita

Clostridium sp

Verde malaquita

E. coli

Deteccin
de
cpsula
negativa
Espora de color verde. Resto
de la clula rosada.
Clula completa rosada.

4.

CONTROL DE CALIDAD DE ANTISUEROS:

El mundo de la microbiologa ha sido inundado cada vez ms por productos comerciales

hechos con el objetivo de detectar agentes etiolgicos de enfermedades en el menor tiempo
posible, con el mayor grado de especificidad , sensibilidad y algunos de ellos con la intencin
de eliminar el cultivo bacteriano como nica forma diagnstica. Estos sistemas actan algunos
con solo la muestra del paciente y otros requieren de la cepa aislada o detectan sus
metabolitos. Estos sistemas se han convertido en un arma imprescindible para el microbilogo
y en muchos casos dan confianza en la seguridad del diagnstico y en otras se utilizan en la
deteccin de microorganismos difciles de cultivar.

Estos productos para la deteccin directa del espcimen o la cepa bacteriana, son
considerados exmenes bacterianos y no test serolgicos. En forma general estos kit deben ser
probados cada vez que se recibe un nuevo lote y cada vez que se utilicen, se le deben correr
sus controles positivo y negativo que vienen con cada kit.
Consideraciones generales en el uso de antisueros :
a)
Los sistemas son para uso exclusivo de diagnstico in vitro.
b)
Conservar todos los reactivos en refrigeracin.
c)
Anotar la fecha en que se abre el kit.
d)
No congelar los reactivos.
e)
No utilizar los reactivos si se sospecha deterioro de los mismos, tales como si se
observa cambio de color, autoaglutinacin en el envase, no producen la reaccin esperada con
los controles respectivos, reactivos contaminados o con signos de evaporacin.
f)
El personal de laboratorio calificado, debe utilizar las tcnicas aspticas y las
precauciones habituales para protegerse de los agentes infecciosos.
g)
Nunca pipetear con la boca las muestras y/o los reactivos.
h)
No utilizar reactivos de lotes diferentes.
i)
No utilizar los reactivos despus de la fecha de caducidad.
j)
Despus de sacar los reactivos de la refrigeradora, dejarlos a temperatura ambiente
antes de utilizar.
k)
Todos los productos inoculados deben ser considerados como potencialmente
infecciosos.
l)
No volver a utilizar las tarjetas desechables, despus de haber sido utilizadas.
m)
Algunas pruebas deben estar precedidas por su apropiado cultivo, aislamiento y
pruebas bioqumicas preliminares, antes de realizar mtodos serolgicos y una identificacin
final.
n)
Al terminar la prueba, todo el material sucio y productos inoculados deben ser
sometidos a esterilizacin por autoclave, incinerados o sumergidos en un desinfectante
germicida adecuado, antes de su eliminacin.
)
La interpretacin de los resultados debe ser hecha por personal calificado, que tomar
en cuenta el contexto clnico, el origen de la muestra, los aspectos macro y microscpico y su
experiencia.
o)
Aglutinacin por Antgenos de Estreptococos:

Un test positivo est indicado por la aparicin de una aglutinacin ntida de ltex en 2
minutos en un crculo, lo cual permite la identificacin de grupo.

No tomar en cuenta las aglutinaciones dbiles que pudieran aparecer en otros crculos.

Una aglutinacin intensa en varias suspensiones de ltex, representa una mezcla de

grupos o una cepa autoaglutinable. Volver a hacer el aislamiento de la colonia y el test de
ltex.

Una vez a la semana verificar la reactividad de las suspensiones bacterianas. Para ello
seguir las indicaciones del fabricante y reemplazar la cepa a analizar, por el control positivo.
Debe aparecer una aglutinacin en cada suspensin ltex.

Tambin la especificidad del test se puede analizar utilizando cepas control como el
Streptococcus pyogenes ATCC 19615 seguir la tcnica sin emulsionar colonias en la enzima
de extraccin, o mezclar los reactivos de ltex con una gota de NaCl 0.15 mol/l. No debe
aparecer aglutinacin en las suspensiones de ltex.

Pueden aparecer resultados falsamente negativos si se estudia una cantidad

insuficiente de colonias


Cuando se utiliza el mtodo de deteccin directa de antgenos en muestras del tracto
respiratorio superior, hay que tener en cuenta la baja sensibilidad del test, por lo que todo
resultado negativo debe ser seguido por su correspondiente cultivo para verificar.
p)
Aglutinacin por Salmonella sp :

Sea estricto en el tiempo de la reaccin.

Miembros del grupo Salmonella estn antignicamente relacionados a Citrobacter y

Arizona. Antgenos de stos microorganismos tienen estructuras compartidas, por lo que
puede haber reacciones cruzadas.
Por esto es importante que la prueba de aglutinacin para Salmonella solo se realice a aquellas
cepas que muestran patrn bioqumico del gnero Salmonella.
5. CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS MEDIANTE
DISCO:
Hemos querido resaltar los aspectos de control de calidad de la prueba de sensibilidad a los
antibiticos por difusin simple en agar, utilizando discos de sensibilidad, ya que es la prueba
de mayor utilidad en nuestro medio.
Es importante tener presente que sta prueba a sido designada exclusivamente para examinar
microorganismos de rpido crecimiento, utilizando la normativa NCCLS M2-A6 , volumen 13,
nmero 24.
Este mtodo no es til para organismos fastidiosos, de crecimiento lento o para anaerobios.
El mtodo de difusin simple en agar es sin lugar a dudas el sistema de mayor uso para la
realizacin de la sensibilidad bacteriana. Hay que tener en cuenta el gran valor de sta prueba
en la deteccin temprana de multiresistencia, escogencia y valoracin de un antibitico frente
a un microorganismos patgeno, proteccin de infeccin, estudios epidemiolgicos, etc .
La prueba de sensibilidad a los antibiticos consta de varios elementos que deben ser tenidos
en cuenta: El medio de cultivo, inoculo, incubacin, lectura e interpretacin y el reporte.

Control de calidad del medio de cultivo:

Utilizar agar de Mueller-Hinton.

La calidad del agua es determinante, ya que la misma debe estar libre de iones
metlicos. Las variaciones de cationes divalentes, principalmente calcio y magnesio,
afectar los resultados con aminoglicsidos, tetraciclina y colistina, cuando se prueban
ante cepas de Ps. Aeruginosa. Un contenido excesivo en catin, reducir la zona de
inhibicin, mientras que un escaso contenido en catin, puede dar un inaceptable
aumento en el tamao de la zona.
Servir en placas Petri de 100 x 15 mm, con una profundidad de 4 a 5 mm
Aproximadamente se utilizan 25 cc para platos de 100 mm
Volmenes mayores de medio provocan disminucin en el tamao del halo de
inhibicin, y volmenes menores halos ms pequeos.
Se deben seguir las normas generales establecidas para almacenamiento del medio de
cultivo.

Las placas Petri deben ser colocadas en la incubadora para secarlas de restos de agua
producto de la condensacin, antes de ser utilizadas para no diluir el inoculo
bacteriano.

Control de calidad de los discos de sensibilidad:

Las metas de un programa de control de calidad van destinadas a monitorear:
La precisin y exactitud del procedimiento de la prueba de susceptibilidad, el comportamiento
de los reactivos utilizados en la prueba y la actuacin de las personas que llevan a cabo las
pruebas y sus resultados.
1.
Los discos deben ser almacenados a un temperatura entre 20 y +8C. Algunos discos,
especialmente los de antibiticos -lactmicos deben guardarse congelados a -20C. Solo los
viales en uso deben mantenerse a temperatura de refrigeracin.
2.
Al sacarlos del refrigerador para su uso, espere a que los viales alcancen la
temperatura ambiente por 1 a 2 horas.
3.
Siempre utilice primero los viales con fecha de caducidad ms prxima.
4.
Siempre que un cartucho a sido extraido del paquete, ste debe guardarse en un
desecador que cierre perfectamente.
5.
Cuando se utilice el aparato dispensador que contiene los discos deber mantenerse
siempre refrigerado.
6.
Los discos son colocados en el medio a una distancia de ms de 24 mm del centro de
uno al centro del otro.
7.
Procurar no colocar discos de antibiticos bactericidas (Ej. Penicilina, Cefalosporinas,
Aminoglicsidos, Vancomicina) al lado de antibiticos bacteriostticos (Ej. Cloranfenicol,
Tetraciclina, Sulfonamidas) para evitar el antagonismo antibitico.
8.
Colocar las placas en la incubadora dentro de los 15 primeros minutos despus de su
aplicacin.
9.
Para verificar el estado de los discos de sensibilidad, utilice cepas control ATCC, las
cuales son seleccionadas por su estabilidad gentica y por su utilidad en el mtodo utilizado.
Estas cepas se corren como una muestra ms y se correlaciona el tamao de los halos de
inhibicin con las medidas expresadas en los Manuales NCCLS M2-A6.

Entre las cepas ATCC (American Type Culture Collection ) recomendadas estn:

Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Haemophilus influenzae ATCC 49247 y 49766
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Escherichia coli ATCC 25922 y 35218
(La E coli 35218 como organismo de control para combinaciones con inhibidor de
betalactamasa, como aquellos que contienen cido clavulnico, sulbactam o
tazobactam).
Staphylococcus aureus ATCC 25923 y 29213
Pseudomona aeruginosa ATCC 27853
Enterococcus faecalis ATCC 29212 ( Para ser utilizado con discos de alto contenido de
Aminoglicsidos ).

EL ESTANDAR McFARLAND :

La densidad de la turbidez del Estndar McFarland deber ser verificada utilizando un

espectrofotmetro con direccin de luz de 1 cm y cubetas adecuadas para determinar
absorbancia. Para realizar el control de un estndar McFarland de 0.5, la absorbancia
deber leer entre 0.08 a 0.10 a una longitud de onda de 625 nm.
La suspensin de Sulfato de Bario deber transferirse en alcuotas de 4 a 6 ml dentro
de tubos con rosca. Estos tubos debern guardarse a temperatura ambiente en un
lugar fresco y oscuro.
Antes de ser usados, los patrones debern agitarse para una adecuada
homogenizacin.
Mensualmente los patrones son descartados y vueltos a preparar, o en su defecto se
debe comprobar su densidad.

Habituales causas de error en la prueba con disco:

a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.

Error administrativo en la transcripcin de los datos del control de calidad.

Lectura errnea al medir el dimetro de la zona.
Contaminacin u otros cambios en la cepa control.
Suspensin del inculo demasiado fuerte o demasiado dbil.
Mala agitacin del estndar McFarland o estndar daado.
Incorrecta temperatura, tiempo o atmsfera de incubacin.
Perdida de la potencia del disco durante su transporte, su manejo o su almacenaje en
el laboratorio.

Control de calidad de la lectura e interpretacin:

Cuando se va a determinar la sensibilidad del S. pneumoniae a la Penicilina, utilizar un

disco de Oxacilina de 1 g. Las cepas de S. Pneumoniae con zonas de Oxacilina de >/- a
20 mm son susceptibles a penicilina ( CIM </- 0.06 g/ml ).
Se recomienda utilizar un disco de Oxacilina de 1 g para probar Resistencia a
Oxacilina y Meticilina de los Estafilococos. Esto se debe a que la Oxacilina es ms
resistente a la degradacin durante el almacenaje y porque es ms probable que
detecte a las cepas heteroresistentes de Estafilococo.
Las pruebas para detectar Estafilococos Meticilina Resistentes ( MRSA), deben
incubarse a 35 C por 24 horas exactas.
Los Estafilococos meticilina resistentes debern informarse como resistentes a todos
los Cefems y otros betalactmicos, as como Ampicilina/cido clavulnico,
Ampicilina/Sulbactam, Ticarcilina/cido clavulnico, Piperacicilina/Tazobactam e
Imipenem, independiente de los resultados in vitro con dichos agentes.
Los Enterococos pueden ser resistentes a Penicilina y a Ampicilina debido al desarrollo
de poca afinidad de las protenas fijadoras de penicilina ( PBPs) o a la produccin de
betalactamasa. Las pruebas de difusin en disco pueden detectar con exactitud los
aislamientos que poseen alteradas las PBPs , pero no detectarn con fiabilidad las
cepas productoras de betalactamasa. Estas ltimas han de detectarse con pruebas
directas de betalactamasa ( Ej. Cefinasa ). Las placas han de leerse con luz transmitida
para visualizar cualquiera pequea colonia dentro del halo, que hara la cepa
resistente.
Todo caso de Estafilococo resistente a la Vancomicina, debe ser confirmado, enviado a
un laboratorio de referencia e informar a las Autoridades de Salud Pblica.

Cuando se trata de Sulfonamidas, los microorganismos deben desarrollarse por varias

generaciones antes de que ocurra inhibicin, por lo que se hace caso omiso del
crecimiento leve, al igual que de un vestigio de proliferacin dentro del halo de
inhibicin.
Si se observan colonias dentro de un halo de inhibicin, deber confirmarse la pureza
de la cepa y repetir la prueba.
La difusin ( " swarming ") de los Proteus sp no es inhibida por todos los antibiticos,
por lo que no se toma en cuenta.
Ocasionalmente se pueden observar varis colonias esparcidas por una zona de
inhibicin. Este fenmeno es constante para la Serratia sp y la Polimixina. Las colonias
se considerarn significativas y la cepa resistente
Solo es necesario probar una Tetraciclina y sus resultados son equivalentes a la
Tetraciclina, Minociclina, Doxiciclina.
Los resultados obtenidos con al Polimixina, pueden aplicarse a la Colimicina. Su halo es
pequeo debido a su pobre difusin en agar.
Se ha informado que algunas cepas de Providencia sp dan resultados de sensibilidad
falsos con discos de Cefprozil , las cepas de ste gnero no deben analizarse ni
informarse con ste disco.
Los Estafilococos resistentes a la Meticilina, Oxacilina o Nafcilina, tambin puede ser
informados como resistentes a la Penicilina, Cefalosporinas , carbapenem y
combinaciones de inhibidores de betalactamasa, a pesar de su aparente sensibilidad in
vitro, lo cual no se refleja in vivo.
La Cefalotina puede utilizarse para representar Cefalotina, Cefradina Cefaclor y
Cefadroxil
Los datos de sensibilidad al cido nalidxico, Nitrofurantoina, Norfloxacina,
Sulfonamidas y Trimethoprim, se aplican solamente a cepas aisladas de infecciones
urinarias.
El disco de Sulfisoxazol puede ser usado para representar cualquiera de las
Sulfonamidas disponibles.
En cepas de Salmonella y Shigella, solo Ampicilina, una Quinolona y
Trimethoprim/sulfametoxazol deben ser probados e informados de rutina en heces.
Adems el Cloranfenicol y una cefalosporina de tercera generacin deben ser
probados e informados en cepas de Salmonella sp extraintestinal.
En cepas de Salmonella sp y Shigella sp, los aminoglicsidos y las cefalosporinas de
primera y segunda generacin, pueden aparecer como activos in vitro pero no son
efectivos clnicamente y no deben ser informados como susceptibles.
La prueba de la betalactamasa predice la resistencia a la Penicilina, Ampicilina y
Amoxicilina.
Las cefalosporinas pueden aparecer activas in vitro contra Listeria sp, pero no son
efectivas clnicamente y no deben ser informadas como susceptibles.
Los Enterococos sp las cefalosporinas, los aminoglicsido ( Excepto por resistencia de
nivel alto ), Trimethoprim/sulfametoxazole y la Clindamycina, pueden aparecer activos
in vitro pero no son efectivos clnicamente y stas cepas no deben informarse como
susceptibles.
La susceptibilidad y resistencia a Azitromicina, Claritromicina y Diritromicina puede ser
interferida por la prueba de Eritromicina.
Solo los resultados de las pruebas de Ampicilina, una cefalosporina de tercera
generacin, el Cloranfenicol y Meropenem deben ser informados de rutina en todas
las cepas aisladas de H. influenzae aisladas de sangre y LCR de pacientes con
infecciones severas.

Los resultados de las pruebas de susceptibilidad con Penicilina, Cefotaxime o

Ceftriaxone, Meropenem y Vancomicina, deben ser informados de rutina en cepas de
S. pneumoniae aisladas de sangre y LCR de pacientes con infecciones severas como
meningitis y bacteremia.

Verificacin de antibiogramas atpicos:

a.
b.
c.
d.

Examine primero por errores de trascripcin.

Reexamine la placa de sensibilidad.
Evalu reportes previos del paciente para observar su patrn de sensibilidad anterior.
Repita los test de identificacin y sensibilidad a los antibiticos.

Condiciones sugeridas que requieren verificacin del resultado de Sensibilidad a los

antibiticos:

S. aureus resistente a Oxacilina.

S. pneumoniae resistente a Penicilina.
Cefalosporinas de amplio espectro (Cefotaxime, Ceftriaxone ) resistente para S.
pneumoniae.
Streptococcus viridans penicilina resistente o intermedio, aislados de reas estriles
del cuerpo.
Estafilococos o Enterococos resitentes a la Penicilina o intermedio.
Enterococos con altos niveles de resistencia a la Gentamicina aislados de reas
striles del cuerpo.
Klebsiella sp o E. coli con potencial espectro de betalactamasa. ( Ej. Resistente a
Ceftazidime ).
Bacilos Gram negativos no fastidiosos resistentes a Gentamicina- TobramicinaAmikacina.
S. maltophilia resistente a Trimethoprim-Sulfametoxazole.
H. influenzae Ampicilina resistente y betalactamasa negativa.
Un aislamiento para el cual el antibiograma es atpico para la especie.
Ampicilina y/o Cefalotina susceptible para Enterobacter sp, Citrobacter freundii,
Serratia marcescen y Ps. Aeruginosa.
Klebsiella sp sensible a Ampicilina.
Bacilos Gram negativos Imipenem resistentes o intermedio, excepto S. maltophilia.
Bacilos Gram negativos Ciprofloxacina resistente, excepto S. maltophilia o B. cepacia.

PATRON DE RESISTENCIA ESPERADA PARA ALGUNOS MICROORGANISMOS:

MICROORGANISMO

RESISTENCIA ESPERADA

Citrobacter, Enterobacter,
Klebsiella, Morganella,
Providencia, Proteus vulgaris,
Proteus penneri, Serratia,
Yersinia.

Ampicilina

Citrobacter freundii, Enterobacter,

Cefazolin, Cefalotina

Morganella, P. Vulgaris,
P. penneri,Providencia, Serratia, Yersinia.
Klebsiella
C. freundii, Enterobacter, Serratia.

Ticarcilina

C. freundii, Enterobacter, P. vulgaris, Serratia.

Cefuroxime

Citrobacter, Enterobacter, Serratia

Acinetobacter baumannii

.Amoxicilina/cidoclavulnico
Ampicilina/Sulbactam
Ampicilina, Cefazolin,

Burkholderia cepacia

Cefalotina, Cefoxitin, Cefotetan,

Ps.aeruginosa,Aeromonas
Stenotrophomonas maltophilia.
Acinetobacter baumannii

Cefmetazole.

B. cepacia, S. maltophilia,

Gentamicina

Ps. aeruginosa

Trimethoprim-Sulfametoxazole.

S. maltophilia

Imipenem, Meropenem.

6.

Cefoxitin, Cefotetan

Ticarcilina, Mezlocilina, Piperacilina.

CONTROL DE CALIDAD DE EQUIPOS Y MATERIALES DE TRABAJO:

Objetivo: Todos los instrumentos utilizados en el laboratorio clnico, deben estar amparados
por un programa de control de calidad y de mantenimiento preventivo, basados en las
instrucciones del fabricante y los procedimientos establecidos.
Programa de mantenimiento: Un programa de mantenimiento preventivo es esencial para
asegurar la exactitud y longevidad del instrumento. El chequeo peridico recomendado es
importante para minimizar el dao o la necesidad de servicio y reparacin. El Director del
laboratorio es responsable por el programa general, recayendo en el jefe de la seccin la
responsabilidad primaria en su rea de trabajo.
Un listado de los equipos debe incluir: nombre, marca, modelo, nmero de serie, fecha de
recibo y nmero de inventario de la institucin.

Un registro debe incluir el mantenimiento preventivo, periodicidad de la inspeccin y fallas del

instrumento.
Manual de Instrucciones del Uso del Instrumento: Estos Manuales deben estar incluidos en el
Manual de Operaciones del instrumento, redactados en forma clara, en el idioma de los
usuarios, inclusive la documentacin del entrenamiento del personal.
Cada protocolo debe incluir precauciones de seguridad y los procedimientos de limpieza y
cuidado del instrumento. Los Manuales deben incluir instrucciones bsicas para resolver
problemas menores y un rcord de incidencias, que incluye el tipo de problema, los pasos
tomados para resolverlo y la accin correctiva para evitarlo en el futuro.
Calibracin del Instrumento : Los equipos que requieren un exacto nivel de precisin para
obtener un resultado seguro, requieren de una calibracin peridica. La fecha de la calibracin,
frecuencia y resultado, deben ser mantenidos en un libro dentro del laboratorio.
Control de Calidad: Todo equipo debe ser evaluado por un programa de Control de Calidad en
base a las instrucciones del proveedor y las regulaciones internas del laboratorio. Debe
mantenerse un libro de todo lo realizado al respecto, con el nombre del instrumento, fecha,
resultado y comentarios.
Referencias y Lectura Suplementaria: Idealmente el laboratorio guardar en un flder toda
literatura extra que se obtenga sobre un equipo, sus accesorios, materiales, estudios forneos
sobre su funcionamiento, etc.
a) INCUBADORAS:

Controle diariamente la temperatura de las incubadoras, antes de sacar las placas y

anote en una hoja control el resultado.
Observe el termoregulador por cualquiera alteracin en su posicin preestablecida.
Coloque las muestras, placas y tubos, en una posicin segura.
Un papel de filtro humedecido con agua en el fondo de la incubadora, es adecuado
para mantener la humedad requerida.
Las incubadoras de CO2 requieren medir el nivel de gas diariamente.
El jefe de seccin debe ser notificado cuando una incubadora falla en mantener el
rango de temperatura aceptable.
Observe macroscpicamente las placas Petri para observar desecacin.
En incubadoras de CO2, se puede colocar un cultivo de N. gonorrhoeae ATCC 43069 ,
subcultivandola cada da, para observar su ptimo crecimiento, ya que es un
microorganismo que necesariamente requiere CO2 para crecer.
Todas las incubadoras deben ser limpiadas mensualmente y llevar un registro de
mantenimiento preventivo.

b) AUTOCLAVES:

POR
CORRIDA

PROCEDIMIENTO
Examine Temperatura y Presin
Utilice
Indicadores
Esterilizacin
Registro
de
uso,
temperaturas, presin
Chequeo del nivel de agua

DIARIO

SEMANAL

MENSUAL

X
de

fecha,

X
X

Uso de Indicadores biolgicos de

Esterilidad
Limpieza del Interior y Exterior.
Limpieza del drenaje y sellos

X
X
X
X

c) CAMARAS DE SEGURIDAD :
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
k)
l)
m)

Apague la lmpara Ultravioleta antes de comenzar a trabajar.

Prenda el blower 15 minutos antes de utilizar.
Observe que no se obstruye el flujo de aire.
Si hay derrame dentro de la cabina, limpie con un desinfectante apropiado,
manteniendo apagada la cabina.
Evite el uso de mecheros de flama dentro de la cabina.
Lleve un control de la medida del flujo de aire.
Lleve un control de la calibracin del flujo de aire.
Lleve un control del remplazo de los filtros.
Compruebe los sistemas de alarma de funcionamiento.
La superficie interior de la mesa de trabajo de la cabina, puede ser cultivada
semanalmente para detectar contaminacin.
Desinfecte la cabina antes y despus de utilizar.
No utilice las cabinas biolgicas para hacer mezclas de sustancias qumicas y viceversa.
Cuando trabaje en la cabina, evite la entrada brusca de aire y el uso innecesario de las
puertas del rea.

d) GENERADORES DE AMBIENTE - SISTEMA GasPak

a) Mantenga los generadores de gas a temperatura ambiente y el sobre sellado.
b) Mantenga los catalizadores en lugar seco, a temperatura ambiente y las bolsas
sellados.
c) Mantenga los indicadores de anaerobiosis a temperatura de refrigeracin ( 2-8C ).
d) El tiempo de generacin de la atmsfera dentro de la jarra es de 30 minutos.

e) El indicador de anaerobiosis cambia de color azul a blanco dentro de la jarra en 4 a 5

horas.
f) Una evidencia sugestiva de ambiente anaerobio, es el cambio de color a rojo vino del
agar sangre.
g) Algunos microbilogos utilizan un agar inoculado con Clostridium novyi B (ATCC
19402) como indicador de ambiente anaerobio, ya que el mismo es anaerobio estricto.
h) Los catalizadores de Paladio, pueden ser regenerados colocndolos en horno a 160 C
por 2 horas.
i) Control biolgico de crecimiento:
Cepa ATCC
Cl. perfringes13124
Micrococcus luteus 9341
Campylobacter jejuni 33291

e)

REFRIGERADORES:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)

f)

Resultado
Crece
No crece
Crece

Control diario de la temperatura.

Coloque las placas Petri en posicin invertida con la tapa hacia abajo.
Mantenga la temperatura entre 4 8 C.
Utilice refrigeradoras que no hacen escarcha.
No coloque medios de cultivo aun ligeramente calientes dentro de la refrigeradora.
Evite abrir con frecuencia la puerta de la refrigeradora.
Lleve un registro de problemas de funcionamiento, causa y solucin.
No guarde alimentos en refrigeradoras para especmenes clnicos.
MICROSCOPIOS:

CUIDADOS Y MANTENIMIENTO
Limpieza del aceite
condensador, etc
Apagar la fuente de luz

de

objetivos,

SEMESTRAL

Limpieza de Ocular, condensador,

diafragma con lquido de limpieza de
lentes
Limpieza y ajuste del sistema ptico
Limpieza y ajuste del sistema lumnico
lubricacin

MENSUAL

Colocar cobertor contra el polvo

Limpieza y
mecnico

DIARIO

del

sistema

X
X
X
X

g)

CENTRFUGAS:

ELEMENTO

POR
CORRIDA

Verificar tubos por rajaduras

Verificar por restos de vidrio o lquido
dentro del portatubo o las copas
Verificar para balance de cada lote
Verificar por la temperatura de
funcionamiento ( Refrigeradas )
Limpieza de cualquier derrame

DIARIO

SEMANAL

MENSUAL

X
X
X
X
X

Limpieza de la olla del rotor

Limpieza externa
Desinfeccin de la olla del rotor

X
X
X

Problemas y Limitaciones:
1.
a.
b.
c.

Vibracin
Chequear por balance apropiado.
Chequear tamao de los tubos.
Mirar si la centrfuga est sobre una superficie plana.

2.
a.
b.
c.

Rotura
Chequear tamao de los tubos.
Balance correcto.
Verificar el interior de los portatubos

3.
a.
b.
c.

Desprendimiento de tapas:
Utilice tapas de rosca.
Si no es posible, use Parafilm sobre los tapones de caucho.
Siempre que sea posible utilice tubos de plstico.

No centrifuge grandes volmenes de lquidos inflamables, los cuales pueden producir

vapores que pueden incendiarse durante la operacin del equipo.
La concentracin de materiales infecciosos para cultivo puede realizarse en el rea
rutinaria de cultivo, siempre y cuando los tubos estn bien cerrados.
No colocar las tazas o los portatubos en el horno o autoclave para descontaminar.
Evitar utilizar para la limpieza soluciones que contengan cloro o sal, ya que son
altamente corrosivas.

7.

CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DESTILADA:

El agua destilada utilizada en la preparacin de medios de cultivos y para reconstituir

reactivos, debe tener un control de calidad bsico que incluye los parmetros qumicos y
bacterianos.
Control de Calidad Qumico:
Este control puede ser realizado teniendo en cuenta una gran variedad de parmetros a
evaluar, tales como:

Ph

Conductividad

Olor

Color aparente

Turbidz

Alcalinidad

Dixido de carbono

Dureza

Iones

Cationes

Metales pesados
Sin embargo, dadas las limitaciones para realizar un estudio profundo, recomendamos el
siguiente mtodo sencillo y apropiado para determinar la calidad del agua, aparte de la
determinacin de su Ph ( 5.0 5.5 ).
Para determinar calidad:
Reactivos:
a) Solucin Acuosa de Nitrato de plata ( NO3Ag )
NO3Ag
5.1 g
Agua destilada 300 ml
b) cido Ntrico
Mtodo:
Colocar en un vaso qumico limpio :
10 ml de agua destilada a examinar
2 gotas de cido ntrico
1 ml de Solucin de NO3Ag
Evaluacin:
El agua deber continuar completamente clara. Si aparece una ligera turbidez blanquecina,
indicar que la calidad es deficiente.
(Ref: manual de Tcnicas Bsicas OPS/OMS N 439, pag. 58)

Control de Calidad Microbiolgico del Agua destilada:

Agregar 1 ml de agua destilada a examinar, a un tubo de Tioglicolato.
Agregar 1 ml de agua destilada a examinar a un plato de agar sangre.
Incubar a 35.5 C por 4 das.
Llevar un libro de registro del control de calidad del agua.

D.

EL CEPARIO :

Los sistemas de Validacin son los procesos que se requieren para asegurar que los
parmetros de funcionamiento de los test, tanto comerciales como los de uso domsticos, son
los esperados y las pruebas pueden ser utilizadas como mtodos de diagnstico en el
laboratorio. La mayora de los procedimientos en Microbiologa Clnica, dependen de que los
microorganismos viables en el cultivo sean capaces de mantener sus caractersticas
morfolgicas , fisiolgicas y que sean tpicas y reproducibles. Para ayudar en este control, las
Cepas Estndar de Control de Calidad, son un componente esencial de un proceso de
validacin.
Existen varias colecciones de cepas utilizables para el control de calidad. Algunos ejemplos son:
ATCC : American Type Culture Collection- Rockville, USA
NCIC : National Collection of Industrial Bacteria- Survey, Inglaterra
JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism- Japn
CCTM : Coleccin Nacional Lille, Francia
RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics- Mosc, Rusia.
NCIB : Coleccin Nacional industrial Aberdeen, Escocia
DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Gottinger, Alemania.
As, la E. coli ATCC 25922 es igual a la DSM 1103 y a la NCIB 12210.
Los organismos que han de ser utilizados en el control de equipos o sistemas de identificacin,
generalmente son estipulados por los fabricantes o bien escogidos por el usuario.
Generalmente se utilizan cepas de referencia como las ATCC y si son cepas domsticas, es
necesario tener un historial del organismo que incluye nombre, rea de aislamiento,
reacciones bioqumicas y patrn de sensibilidad a los antibiticos, forma de almacenaje, fecha
de ltimo transplante, etc
En todo caso, las cepas de referencia deben tener requisitos especficos:
Caractersticas tpicas.
Caractersticas estables.
Reproducibilidad

1. MTODOS DE CONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS:

Los mtodos de conservacin de las cepas estndar de control de calidad, deben asegurar que
las mismas mantengan sus caractersticas tpicas y que puedan ser reproducidas despus. El
medio utilizado para su conservacin debe mantener un mnimo de mutaciones. Estas
mutaciones pueden evitarse permitiendo tambin el mnimo crecimiento del microorganismo
y aportando ptimas condiciones ambientales para su sobre vivencia, con el menor nmero de
subcultivos

Para una mejor clasificacin de los mtodos de conservacin de cepas, los dividiremos en tres
categoras: Cultivos Stock, Semistock y Cultivos de Trabajo diario.
A) CULTIVOS STOCK:
Estos representan el verdadero " Banco de Cultivos" . Estos son mantenidos en un
sistema cerrado de conservacin, minimizando su actividad gentica y fisiolgica, para
evitar su potencial mutacin.
Los dos ms importantes mtodos para conservacin en Stock, son la Liofilizacin y el
Ultracongelamiento.
LIOFILIZACION: Se hace una suspensin fuerte de un cultivo puro y joven en
leche estril o similar, y se coloca en tubos con rosca y se siguen las instrucciones del
aparato liofilizador, que puede ser tan sencillo como un simple bomba de vaco, hasta
un sofisticado sistema. Durante este proceso evitar que el cultivo se derrame dentro el
aparato liofilizador y la formacin de aerosoles
Este sistema tiene la ventaja de ser el que permite la sobrevivencia por un mayor
periodo de tiempo y mayores facilidades para el transporte de las cepas.
ULTRACONGELAMIETO: Hacer una suspensin fuerte de la colonia pura en
caldo Brucella conteniendo 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en pociones de 0.5
ml en pequeos tubos con rosca y coloque en lo profundo del congelador a -45C.
Tambin se puede utilizar la modificacin de Ultracongelamiento en Nitrgeno lquido,
que consiste en colocar en una ampolla especial dentro de un aparato especficamente
designado para el mantenimiento de cepas en nitrgeno lquido.
Ambos sistemas preservan las bacterias por largos periodos de tiempo.
B) CULTIVOS SEMISTOCK:
Este trmino se refiere al mantenimiento de cultivos por un periodo intermedio entre
el relativamente permanente cultivo en Stock y el cultivo de cepas control para el
trabajo diario. De las 5 tcnicas listadas a continuacin, solo la de congelamiento es
utilizable para el mantenimiento de cepas de anaerobios.
a) Congelamiento en congelador convencional :
Los congeladores convencionales pueden mantener una temperatura entre-10 a
25C. Los cultivos se preparan de la misma manera como en el caso de la
ultracongelacin y son colocados en el congelador. El mtodo permite la sobrevivencia
de bacterias y levaduras en algunos casos por aos y en la mayora de las veces por al
menos de 6 a 12 meses.
b) Cultivo en CTA:
Se preparan tubos con rosca conteniendo Cistena-Tripticasa y Soya agar.
Inocular el cultivo puro y joven e incube por 18 a 24 horas para obtener un crecimiento
moderado, afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o preferiblemente en
refrigeracin, si es posible en la oscuridad. Microorganismos menos delicados
sobreviven bien por un ao y los fastidiosos por 6 meses.
c) Secado en discos con gelatina:
Este mtodo es conocido tambin como mtodo Stamp en honor de su creador. Corte
pequeos crculos de papel encerado y colquelo en una placa Petri de vidrio.
Esterilice en autoclave por 15 minutos a 15 libras de presin.

Prepare una suspensin de caldo nutriente con 10% de gelatina en polvo (Peso por
Volumen) y 0.25% de cido ascrbico (P x V) y dispense en tubos con rosca y esterilice
en autoclave.
Haga una suspensin fuerte de un cultivo puro y joven y coloque una gota del mismo
con una pipeta estril sobre uno de los discos de papel acerado estril en una placa
Petri. Con una pinza estril, transfiera el disco a un desecador de vaco conteniendo
Penaxido de fsforo. Evacue el desecador con la bomba de vaco. Cuando el disco
est seco, aspticamente introducir en un tubo estril con tapa de rosca y colocar en el
refrigerador.
Para hacer un subcultivo del disco, aspticamente retire un crculo de papel con las
colonias y colocarlo en un tubo conteniendo un caldo de cultivo e incubar por 24 horas
a 35C y luego hacer transplante a agar sangre e incubar nuevamente.
d) Conservacin en medio de cultivo inclinado con aceite mineral:
Es un mtodo especialmente utilizado para hongos, pero es til tambin para algunas
bacterias.
En el caso de los hongos, se utiliza un cultivo joven y bien esporulado en un medio de
cultivo inclinado, tal como agar de Sabouraud-dextrosa. Cubrir completamente con
aceite mineral estril. El aceite debe ser esterilizado a 15 libras de presin por 45
minutos, para asegurar su esterilidad absoluta.
Para reactivar la cepa, colocar la boca del tubo cerca de la llama de un mechero o
incinerador y remueva una porcin visible de crecimiento con una asa estril larga o
una aguja. Este mtodo permite la sobrevivencia por muchos aos.
Si el mtodo se va a utilizar para conservar bacterias, se utiliza Agar de CerebroCorazn o agar Mueller-Hinton suplementados con hemoglobina al 2% e Isovitalex al
1%. Los medios se sirven en tubos con rosca. Se esterilizan y luego se les hace coagular
en forma inclinada.
Las bacterias son inoculadas en el medio e incubadas a 35C por 24 horas, tomando en
cuenta sus requerimientos de oxgeno. Luego las cepas son cubiertas con aceite
mineral estril, hasta 1 cm por encima del final del inclinado. Los cultivos son viables
por 2 aos a temperatura ambiente.
e) Mantenimiento en tierra estril:
Es utilizado primeramente para hongos y bacterias esporuladas.
Esterilice en autoclave tierra suelta en tubos con rosca a 15 libras de presin por 1
hora. Haga una suspensin fuerte del microorganismo joven y esporulado y colquelo
en el tubo con tierra estril. Deje secar y colocarlo en un refrigerador.
C) CULTIVOS DE TRABAJO DIARIO:
Los cultivos control para el trabajo diario, son una forma conveniente para realizar el
control de calidad de pruebas de uso frecuente y que requieren una lectura
comparativa al momento de su lectura. Tal es el caso de las pruebas de coagulasa y
oxidasa, entre otras. Para ste propsito se utilizan cultivos de 24 horas y son
transplantados diariamente.
Bacterias resistentes:
Tal es el caso de Estafilococos y Enterobacteriaceas. Se transfiere una colonia joven de
un cultivo en Stock o semistock y se transfiere a un tubo con agar nutritivo inclinado e
incubar por un mnimo de tiempo tal que haya crecimiento. Guardar en refrigerador.
Los cultivos para trabajo diario, son transferidos a otros tubos de agar inclinado cada
mes por un intervalo de 6 meses. Despus de ste tiempo, se debe volver a hacer otro
pase del cultivo stock.

 Bacterias delicadas :
Los cultivos de trabajo diario de organismos delicados como N. Meningitidis, N.
Gonorrhoeae, S. pneumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes, son
preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios apropiados como
agar chocolate en ambiente de CO2 , para luego ser colocados en refrigeracin.
Despus de una serie de 6 transplantes consecutivos, se debe preparar otro cultivo
para uso diario a partir de la cepa en stock.
Bacterias anaerbicas:
Los cultivos para trabajo diario de la mayora de las bacterias anaerbicas, pueden ser
mantenidos en medio de carne cocida o en Tioglicolato con 0.5% de carbonato de
sodio adicionado despus de esterilizar por autoclave.
Los cultivos se incuban por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente.
Hongos:
Los cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos en tubos con agar Sabouraud o
sustituto. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente hasta que haya crecimiento,
y ocurra la esporulacin, para luego ser colocados en refrigeracin. Los cultivos de
trabajo deben ser transferidos cada 2 meses. Pasado ste tiempo se debe preparar
otro cultivo de trabajo a partir de la cepa en stock.
Cultivos de trabajo comerciales:
Son preparados por casa comerciales utilizando cepas conocidas como la ATCC. Estas
son estables en refrigeracin por un ao. Tal es el caso de Bact-Chek de Roche
Diagnostics, Bactrol Disk de Difco, entre otras.
Para reactivar las cepas se colocan en un caldo nutritivo como el caldo de Tripticasa y
Soya e incubados por 24 horas a 35C. Luego se hace un transplante a un medio de
enriquecimiento o a agar sangre.
2.

MANTENIMIENTO DEL CEPARIO:

Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cepario, ya que el mismo constituye
una ayuda importante en la validacin de equipos, materiales, reactivos y habilidad del
personal. Debe existir un programa metdico de transplantes de cepas , archivo de cada uno
de los cultivos con sus caractersticas bioqumicas, sensibilidad a los antibiticos, origen de la
cepa, mtodo de identificacin, fecha de siembra y prximo transplante, etc
3.
CEPAS ATCC:
En nuestro medio por situaciones muy especiales y altamente beneficiosas, podemos tener
acceso a las cepas control del American Type Culture Collection ( ATCC ) , la coleccin ms
grande e importante del mundo. Estas cepas bacterianas pueden ser utilizadas como control
en una gran variedad de utilidades, lo cual nos permite conocer el grado de confiabilidad de los
productos comerciales o elaborados en el laboratorio.

A continuacin algunas referencias de las cepas ATCC:

MICROORGANISMO ATCC

MEDIO

CARACTERSTICA

E. coli 25922

McConkey

Colonia rosada

S.typhimurium 14020

McConkey

Colonia incolora

P. mirabilis 12453

McConkey

Colonia incolora

E. faecalis 29212

McConkey

No crece

St. Pyogenes 19615

Agar sangre

-hemlisis

St. pneumonia 6305

Agar sangre

alfa-hemlisis

S. epidermidis 12228

Agar sangre

no hemoltico

Candida albicans 60193

Agar sangre

no hemoltica

Candida albicans 60193

Tubos germinales

Positivo

Candida tropicalis 66029

Tubos germinales

Negativo

S. aureus 25922

Manitol sal

Colonia amarilla

S. epidermidis 12228

Manitol sal

Colonia incolora

P. mirabilis12453

Manitol sal

No crece

M. tuberculosis (TBC) 2577

Low-Jensen

Crece. Incoloro

M. kansassi ( I ) 12478

Low-Jensen

Crece. Amarillo + luz

M. scrofulaceum (II ) 19981

Low-Jensen

Crece. Amarillo luz

intracellulare ( III ) 13950

Low-Jensen

Crece. Incoloro

M. fortuitum ( IV ) 6841

Low- Jensen

Crece. < 7 das.

E. coli 25922

Low-Jensen

No crece

LISTADO DE CEPAS ATCC SUGERIDAS PARA CONTROL DE CALIDAD

MICROORGANISMO
Campylobacter jejuni ATCC 33290
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Escherichia coli ATCC 25922
Escherichia coli ATCC 35218
Proteus vulgaris ATCC 8482
Pseudomona aeruginosa ATCC 27853
Salmonella typhimurium ATCC 14028
Shigella sonnei ATCC 9290
Shigella sonnei ATCC 25911
Shigella flexnerii ATCC 12022
Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Haemophilus influenzae ATCC 49247
Haemophilus influenzae ATCC 49766
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Escherichia coli 0157:H7 ATCC 43894

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Staphylococcus aureus ATCC 29213
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
Steptococcus pyogenes ATCC 19615
Streptococcus pneumoniae ATCC 6305
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
Streptococcus faecalis ATCC 19433
Clostridium sporogenes ATCC 19404
Clostridium tertium ATCC 19405
Clostridium novyi A ATCC 19402
Clostridium perfringes ATCC 3624
Fusobacterium nucleatum ATCC 25586
Bacteroides fragilis ATCC 23745
Fusobacterium necrophorum ATCC 25286

4. CONTROL DE CALIDAD EXTERNO:

Es recomendable que los laboratorios de microbiologa puedan participar en programas de
evaluacin externa. Estos programas miden la capacidad del laboratorio para evaluar un
desconocido y llegar a un resultado seguro. Los mismos consisten en la identificacin de
muestras o microorganismos desconocidos en los cuales se debe informar del resultado de la
identificacin, pruebas utilizadas para el diagnstico etiolgico y sensibilidad a los antibiticos.
El Director del laboratorio debe escoger el programa que sea consistente con el nivel de
calidad de su laboratorio. Generalmente estos desconocidos vienen con un abstracto clnico y
son recibidos al menos 2 veces al ao. Los laboratorios que ofrecen stos programas invalidan
aquellos laboratorios que fallan en responder el cuestionario, por lo que es necesario
mantener un contacto muy especial para no perder ste beneficio. Los resultados de la
evaluacin de los desconocidos deben ser discutidos por todo el personal antes de su informe
al laboratorio generador del programa.

5. CERTIFICACIN DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA:

Un nuevo concepto en la organizacin de los laboratorios es la acreditacin a Asociaciones
especializadas que promueven la excelencia en la calidad de los servicios de sus miembros.
Esta calidad est enfocada no solo en los aspectos tcnicos, sino tambin en los
administrativos, racionalizacin de recursos, planificacin gerencial, costos de operaciones,
calidad de servicio al cliente, es decir, un enfoque de Calidad Total. En Latinoamrica algunas
asociaciones de laboratorios han creado comits de acreditacin para laboratorios pblicos y
privados.
El enfoque moderno en un mundo en que las distancias se han acortado y los conceptos de
globalizacin son una realidad, la acreditacin proporciona a los miembros la posibilidad de
comunicarse mejor con otros laboratorios del mundo, lo cual permite un intercambio de
experiencias en metodologas, compra de equipos, entrenamiento de personal, etc

Los problemas legales y altos costos de operaciones, han obligado a los grandes laboratorios a
encontrar un modelo an ms complejo de aseguramiento de la calidad, con el fin entre otros,
de bajar costos. La Organizacin Internacional de Estndares ha desarrollado una gua llamada
ISO 9000 que establece un flujograma de trabajo en los programas de aseguramiento de la
calidad y unifica los diferentes actividades del control de calidad. La categora apropiada para
los laboratorios clnicos en general es el ISO 9002 el cual comprende 18 elementos de control.
Para que un laboratorio pueda ser certificado bajo la norma ISO, debe cumplir con todos los
elementos del estndar.
En stos casos un equipo de Aseguramiento de la Calidad implementa las medidas en cada una
de las rea con el fin de que cuando se est listo, pueda pasar las pruebas a que es sometido
todo el sistema por parte de auditores certificados. La obtencin de sta certificacin ISO 9002
es el mximo galardn a la excelencia en control de calidad en los laboratorios clnicos.
BIBLIOGRAFA
Koneman, Diagnstico Microbiolgico, 6 ta edicin 2006.
Perea, enfermedades infecciosas y Microbiologa Clnica.
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/
http://www.monografias.com/trabajos/mmbiologia/mmbiologia.shtml

ACTIVIDADESA DESARROLLAR EN EL LABORATORIO

SEMANA DEL 5 AL 7 DE AGOSTO 2014
1. Los alumnos evaluarn la eficiencia de los medios de cultivo preparados (mnimo 2)

MEDIO DE CULTIVO

ORGANISMO CONTROL

REACCION ESPERADA

TSI
TSI
TSI
MIO
MIO
Agar sangre
Agar sangre
Agar sangre
McConkey
McConkey
McConkey
OF medio

E. coli
Shigella flexnerii
Pseudomona aeruginosa
Proteus mirabilis
K. pneumoniae
Estr.Beta-hem.
Streptococcus gama- hem
K.pneumoniae
E. coli
Proteus sp
Estafilococos
E. coli

OF medio
Lysina decarboxylasa
Lysina decarboxylasa
Bili-Esculina
Bili-Esculina
Sabouraud-Dextrosa agar
Sabouraud-Dextrosa agar
Caldo Cerebro-Corazn
Tioglicolato

Pseudomona sp
Proteus vulgaris
Salmonella spp.
Streptococcus mitis
Enterococcus faecalis
Levaduras
Estafilococos
Flora mixta
Flora mixta

cido/cido
alcalino/cido
alcalino/alcalino
movilidad positiva
movilidad negativa
Crece. Betahemlisis.
Crece. Alfahemlisis.
Crece. No hemoltico.
Crece. Colonias moradas.
Crece. Colonias claras.
No crece.
Amarillo ambos tubos.
ferrmentador
Un tubo amarillo. Oxidativo
Rojo/cido H2S Alcalino/alcalino H2S +
Incoloro
Negro
Crece
Crece
Crece
Crece

2. Los alumnos evaluarn la eficiencia de los reactivos (mnimo 2)

REACTIVO
Coagulasa
Coagulasa
Oxidasa
Oxidasa
Catalasa
Catalasa
Kovacs
Kovacs
Cloruro frrico
Cloruro frrico
Sobres de Anaerobiosis
Suero para tubos germinales

MICROORGANISMO
Cepa ATCC 25923
Stafilococcus epidermidis
Pseudomona aeruginosa
E. coli
Staphylococcus sp
Streptococcus sp
E. coli
S.pneumoniae
Proteus sp
E. coli
Bacteroides sp
Candida albicans

REACCION ESPERADA
Cogulo. Coagulasa positiva
Inerte. Coagulasa negativa
Negro. Oxidasa positiva
Inerte. Oxidasa negativa
Burbujas. Catalasa positiva
Inerte . Catalasa negativa
Anillo rojo. Indol positivo
Incoloro. Indol negativo
Verde. Fenilalanina positivo
Incoloro.Fenilalanina negativo
Crecimiento en Anaerobiosis
Tubos germinales positivo

3. Los alumnos evaluarn los tintes (mnimo 2)

Gram
Gram
Gram
Verde malaquita

Staphylococcus sp
E. coli
Mezcla de ambos
Clostridium sp

Verde malaquita

E. coli

Morado. Gram-Positivo.
Rosado. Gram-Negativo.
Mezcla de ambas colores.
Espora de color verde. Resto
de la clula rosada.
Clula completa rosada.

4. Los alumnos evaluarn los antisueros para Streptococcus spp.

Aglutinarn Streptococcus grupo A y Grupo B.
5. Los alumnos evaluarn un antibiograma