Prctica 6: Purificacin de ADN plasmdico, digestin y electroforesis en

gel de agarosa

Autores:
Ana Luca Contreras Gonzlez

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Ana Sofa Piera Morales

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Pedro Gonzalez Castro

iq687093

Fecha de realizacin de prctica: 18 de abril de 2015

Fecha de realizacin de reporte: 25 de abril de 2015

Resultados
LB/CB = Este medio de cultivo en forma liquida de color tendiendo a caf fue
usado para la inoculacin del medio de E. Coli y para el mantenimiento de este,
para que creciera y poder extraer ADN de este.
Para la preparacin del Miniprep (mtodo utilizado para el aislamiento del ADN
plasmdico) realizado en tubos de Eppendorf esterilizados, se obtuvieron los
siguientes resultados:
1) La solucin de lisis Tens: esta solucin fue usada para la
desnaturalizacin del ADN plasmdico y el ADN cromosomal. Como esta
solucin contena NaOH y el detergente SDS provoc la lisis celular, la
desnaturalizacin del ADN cromosmico, de las protenas y la liberacin de los
plsmidos.
2) El acetato de amonio utilizado en esta prctica fue utilizado para
precipitar las protenas. Tras haber centrifugado con esta solucin se obtuvo
de precipitado las protenas y el ADN cromosmico y el sobrenadante era el
ADN plasmdico.
3) El ADN plasmdico (sobrenadante) se le agreg isopropanol fro que
sirvi para precipitar el ADN plasmdico y posteriormente se le agreg etanol
para que se purificara correctamente, se us para la digestin. Para la
digestin se us el tubo que ms precipitado contena (ADN plasmdico).
Para la digestin del ADN plasmdico se utilizaron 2 diferentes enzimas de
restriccin (B14 y D4 (1microlitro respectivamente)), 2 microlitros de Buffer, 4
microlitros del ADN obtenido en el paso anterior y 13 microlitros de H 2O.
Enzimas de restriccin: Tambin conocidas como endonucleasas, cortan los
enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que
reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen
secuencias palindrmicas.

Figura 1. Enzimas utilizadas para la digestin de ADN plasmdico. B14 y D4

Reactivos utilizados para a elaboracin del gel:

EDTA 0.5M pH 8 = sustancia que puede servir como agente quelante que
puede crear complejos con un metal que tenga una estructura de coordinacin
octadrica.
TPE 10X 100 ml = esta solucin fue compuesta por estos diferentes reactivos:
Tris base (10.8gr) = solucin tampn
cido fosfrico (1.55ml)
EDTA 0.5M pH 8
Gel de agarosa = 0.3 g (agarosa) / 25 ml de TPE 1X
Electroforesis: separacin de biomoleculas en disolucin que fueron sometidas
a un campo elctrico. Cuando molculas cargadas son colocadas en un
campo elctrico, estas migran hacia el polo positivo (nodo) o polo negativo
(ctodo) de acuerdo a su carga.

Figura 2. Gel de agarosa cargado con colorante SBRY y la muestra del paso anterior
(electroforesis).

Tras 40 minutos de corrimiento con carga se obtuvo el siguiente resultado:

Figura 3. Corrimiento del ADN plasmdico tras 40 min de corrimiento.

Discusin

a) Qu hay que tomar en cuenta

reactivos?

para la preparacin de los

Para la preparacin de los reactivos se necesita primordialmente de que sola

una persona prepare los reactivos, porque si se preparan ms de dos personas
existe una tendencia a que ya no haya una buena precisin al estar midiendo
los volmenes.
Tambin de comprobar que los reactivos no estn contaminados, junto con el
material que se vaya a usar para la prctica.
Por ltimo, dejarlos en un lugar que no vaya a ser contaminado y/o peligroso
que pueda daarse tanto qumicamente como fsicamente.

b) Qu parmetros crticos existen para obtener un resultado

ptimo? Los cultivos en medio LB deberan ser crecidos hasta 1-1.5
A600 unidades/ml o 1 x 109 clulas/ml.
Existen varios parmetros crticos para obtener un resultado ptimo. Los
cultivos en medio LB deberan ser crecidos hasta 1-15 A600 unidades/ml o 1 x
109 clulas/ml.
Las columnas no deben ser sobrecargadas con DNA plasmdico, para ello
deben de usarse los volmenes de cultivo que se indican. (Repullo, 2015)

c) Por qu no se vieron bandas en los dems carriles?

Puede haber varias razones, una de ellas puede ser la concentracin de gel de
agarosa para electroforesis, este es un instrumento que permite visualizar la
integridad de DNA genmica para poder determinar la presencia de diferentes
especies de RNA. Segn (genomica, 2008) este gel no es desnaturalizante los
fragmentos pequeos se mueven ms fcil a travs de los poros del gel de
agarosa, en cambio los fragmentos grandes tienen mayor resistencia a la
movilidad de los cidos nucleicos y permite una mayor resolucin, por lo tanto; a
mayor concentracin, mayor compactacin y por ende menor velocidad de
migracin.
Otra de las posibles razones pudo haber sido una mala extraccin del ADN, a la
hora de verter el sobrenadante se pudo haber tirado el pellet que es lo que nos
interesaba de las muestras.
Por ltimo no se pudo observar claramente en los carriles porque se pudo haber
obtenido ADN cromosomal no plasmdico que es el que se observa en el gel.

d) Las bandas observadas corresponde al tamao en pb del ADN

plasmdico para B y D? si o no y por qu?
plsmido D=5393pb (Scientific, 2008)
plsmido B= 5420pb (Scientific, 2008)
obtenido:
plsmidos B= 8306pb; no concuerda existe una diferencia de pb porque no fue
la concentracin correcta de ADN plasmdico o no fue correcta la medicin.
e) Las bandas que corresponde al ADN plsmido se pueden
apreciar a la misma distancia que aquellas del ruler o marcador de peso
molculas? A qu tamao corresponden?

8000 30 6 bp.
(Scientific, 2008)

3000
70 14

El ADN cromosmico se puede observar a la misma

distancia que el ruler, por lo tanto se puede calcular el
nmero de pares de bases.

3000
70 14

f) Que haras para mejorar los resultados de la practica?

Pesar el adn
Utilizar bromuro de etidio
Considerando que la purificacin del ADN se realiz correctamente, se piensa
que para mejorar los resultados en la practica se debi tener mas cuidado en el
procedimiento para realizar la electroforesis, principalmente en la aplicacin del
SYBR (que fue el sustituto de BrEt) ya que debido a la metodologa que se
utilizo, no se tomo en cuenta la cantidad de ADN, por lo tanto es probable que
la cantidad de SYBR no fue suficiente para visualizar los resultados, o en su
defecto, el colorante no era el indicado para la cantidad de ADN.

g) Hubo o no hubo digestin del ADN plasmdico?

En dos carriles no hubo

digestin del ADN plasmdico,
esto puede se puede saber ya
que los carriles no se ven.
(genomica, 2008)

3000
70 14

3000
70 14

Conclusin
1) En esta prctica no se logr el objetivo ya que no se pudo observar
claramente el ADN plasmdico.
2) A la hora de revisar los resultados en el gel de agarosa solo 2 carriles
presentaron digestin de ADN plasmdico.
3) Estos resultados podran ser gracias a la baja concentracin de ADN
plasmdico.
4) La precisin de los resultados pudo tener varianza gracias a la calidad
de la preparacin de los reactivos y a la inoculacin de la bacteria E.
Coli.

Bibliografa

Scientific, T. (2008). Thermo Scientific. Obtenido de

www.thermoscientific.com/onebio
genomica. (2008). genomica uaslp. Obtenido de protocolos:
www.genomica.uaslp.mx/protocolos
Repullo, J. L. (2015). Purifiacion de ADN plasmidico y electroforesis del
mismo gel de agarosa. Obtenido de uco.es:
www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/38%20PURIFICACI
%C3%93N%20DNA%20PL%C3%81SMIDO.pdf