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Projet de recherche: Rapport final

Programme de dveloppement des marchs des produits de lrable.

(pdmp)-agriculture canada.
Projet #003
Cooprative les producteurs de sucre drable du Qubec

Caractristiques chimiques et nutritives du sirop drable.

Les acides amins de la sve et du sirop drable.

Par: Johanne Dumont, chimiste

Collaborateur Jacqueline Beaupr, technicienne

Publication no : 300-FIN-0394

St-Hyacinthe, mars 1994

Rsum

Des chantillons de sve, de concentr dosmose invers et de sirop drable rcolts chez trois
producteurs lors du printemps 1993 ont t analyss pour en dterminer la teneur en acides amins
libres.
Les acides amins les plus souvent dtects dans ces chantillons sont lacide aspartique,
larginine, la tyrosine et la cistathionine. Les chantillons les plus riches peuvent en compter plus
de 10 diffrents des teneurs variant de 1 100 nmol/g de sucre alors que certains sirops nen
comptent aucun.
On note un enrichissement en teneur et en varit en fonction de la saison, que lon peut relier
deux facteurs, soit, la contamination microbienne accrue lorsque la temprature ambiante se
rchauffe et laugmentation du mtabolisme de larbre lapproche de lclosion des bourgeons.
On peut dailleurs lier les dfauts de got dit de bourgeon une teneur accrue dacides amins dans
la sve.
On note aussi des variations dans les profils dacides amins de la sve au sirop. Ces variations
peuvent aussi tre lies au traitement thermique, les acides amins ayant des ractivits variables,
alors que dautres acides amins peuvent tre librs lors de lhydrolyse de rsidus protiques
prsents dans la sve.
Le rle des acides amins dans les produits drable, par leur faible teneur et les faibles varits,
demeurent avant tout, un rle de prcurseur de got, bon ou mauvais, par leur participation aux
ractions de Maillard, pour former des armes plus ou moins souhaitables dans le sirop selon leur
identit et leur concentration. Il serait donc intressant de relier les profils dacides amins
observs aux autres proprits de ces chantillons comme les profils darmes et leur qualit
gustative.

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Table des matires

Introduction ...................................................................................................................................................1
Matriel et mthode.......................................................................................................................................2
chantillons de sirop de concentr d'osmose inverse et deau drable ..................................................2
Mthodes danalyses .................................................................................................................................2
Particularits de la mthode: .................................................................................................................3
Prparation des sirops drable..............................................................................................................3
Prparation des sves drable. .............................................................................................................3
Rsultats et discussion...................................................................................................................................4
Conclusion.....................................................................................................................................................5
Remerciements ..............................................................................................................................................5
Bibliographie.................................................................................................................................................9

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Introduction
Les constituants des protines sont les acides amins communs au nombre de 20. Dans les plantes,
comme dans le rgne animal, on rencontre au moins une centaine dautres acides amins, que lon
rencontre habituellement sous forme dacides amins libres ou de petits peptides et de trs faibles
concentrations. Ils peuvent alors avoir diffrentes utilisations, comme dulcorant ou mme comme agent
bactriostatique (Bodwell et Lipton, 1978).
Ds 1963, Underwood (1963) avait reli le got particulier du sirop drable de fin de saison (sirop de
bourgeon) une augmentation en composs azots dans la sve. Le test la ninhydrine tant positif, ces
composs azots seraient donc de type amin. Plus tard, Morselli et Whalen (1986) observent aussi que la
teneur en acides amins totaux augmente juste avant lclosion des bourgeons. Plus tard, Waseem et coll.
1991 rapporte laugmentation en concentration de composs azots, comme les cytokinines et lacide
abscisique, qui peuvent aussi avoir des effets sur le got (Kuninaka, 1981).
Dautre part, la prsence dacides amins peut aussi avoir un effet positif sur le dveloppement du got.
On connat leur rle dans les ractions de Maillard (Danehy, 1986). Lidentit des acides amins a alors
une importance prpondrante, les armes dvelopps variant selon le type dacide amin, allant du got
de caramel, au got de noisette, de viande ou de pain grill.
Les acides amins libres sont prsents de trs faibles concentrations dans les vgtaux et dans les
produits dorigine vgtale. Ainsi, Astonen et Kallio (1989) ont dtect des teneurs de lordre de
1 mg/litre dans la sve de bouleau. Dans le miel, les teneurs sont un peu plus importantes, de lordre de
quelques dizaines de mg/100 g (Gilbert et coll., 1981). Mis part les sirops de fin de saison, les acides
amins libres seraient prsents des concentrations beaucoup plus faibles dans la sve drable, soit de
lordre du nanomole par gramme de matire sche (Morselli et Whalen, 1986).
Pour dtecter et caractriser de si faibles concentrations dacides amins, nous devons donc utiliser une
mthode sensible. Les mthodes habituelles de chromatographie gazeuse ou liquide, ncessitent une
drivation des acides amins pour les rendre plus facilement dtectables (Robert et coll., 1987, Winspear
et Oaks, 1983, Bindlingmeyer et coll., 1987).
Dans le prsent travail, nous avons choisi la mthode Picotag, parce quelle correspond nos exigences
de sensitivit, quelle est relativement rapide et que le systme de chromatographie ncessaire pour ce
type danalyse tait dj partiellement en place dans notre laboratoire (White et coll., 1986).
Des analyses dacides amins seront donc effectues dans des chantillons deau, de concentr dosmose
inverse et de sirop drable pour en vrifier la variation de teneur et didentit. Leffet du procd de
transformation sur ces teneurs sera pris en compte. Le rle et le potentiel possibles des acides amins
identifis pourront tre proposs.

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Matriel et mthode
chantillons de sirop de concentr d'osmose inverse et deau drable
Les chantillons deau, de concentr dosmose inverse et de sirop drable provenant de 2 producteurs
diffrents furent rcolts durant une partie de la saison 1992 et ont servi dvelopper la mthode
danalyse dacides amins. Des chantillons rcolts lors de la saison 1993 (3 producteurs) ont par la suite
t analyss par cette mthode. Les chantillons deau et de concentr dosmose inverse ont t prlevs
dans des bouteilles de matire plastique de 4 litres et placs au conglateur jusqu leur transport au
laboratoire. Au laboratoire, les chantillons ont t placs -40 C jusqu lanalyse. Le sirop a t
conditionn chaud (85C) lrablire, et entrepos 4 C au laboratoire, jusqu lanalyse.
Mthodes danalyses
Un systme HPLC (chromatographie liquide haute performance) compos de 2 pompes 510 Waters, dun
injecteur automatique 717 Waters, dun chauffe-colonne Waters, dun dtecteur U.V. variable 490E
Waters, dune colonne AminoTag Waters et dun systme de contrle informatis permettant de contrler
le gradient de dbits des luants et de faire lacquisition des donnes et les calculs, constitue
lappareillage principal ncessaire pour faire les analyses requises.
Les autres pices dquipement requises sont un systme dvaporation sous-vide Picotag, un agitateur
vortex et diverses pipettes automatiques pouvant dlivrer de 1 1000 l.
Les conditions danalyse chromatographique sont les suivantes :
gradient des luants A et B dcrits ci-aprs, injection de 20 l, dtection U.V. une longueur donde de
245 nm et une sensibilit de 0.05 AUFS et une temprature de colonne de 46 C
Des prcautions sont ncessaires pour prserver le bon fonctionnement de lappareil: on doit apprter les
pompes chaque dmarrage et purger la cellule du dtecteur ainsi que linjecteur chaque semaine. On
doit toujours laisser un dbit minimum surtout pour la pompe A car le tampon corrode srieusement les
composantes. On doit aussi laisser un dbit minimum la pompe B pour viter le choc de mlange des
luants qui peut crer des bulles dair.
La phase mobile est constitue dun gradient des luants suivant:
luant A:

19.0 g dactate de sodium tri-hydrat et dilu avec de leau ultra-pure dans une fiole
jauge dun litre et ajust un pH de 6.10. Neuf-cent-quarante ml de cette solution sont
mlangs 60 ml dactonitrile et filtr sur filtre 0.45 et conserv au rfrigrateur
(maximum 1 mois). Juste avant lusage, la solution est dgaze au bain ultrasons
pendant 30 minutes.

luant B:

600 ml dactonitrile et 400 ml deau ultra-pure sont mlangs et filtrs sur membrane
0.45 et conservs au rfrigrateur (maximum 1 mois) jusqu utilisation. Juste avant de
sen servir, la solution est dgaze au bain ultrasons pendant 30 minutes.

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Particularits de la mthode:
Il faut toujours porter des gants car les acides amins de nos mains sont le plus grand risque de
contamination. On peut congeler les chantillons aprs chaque tape de schage.
La sarcosine forme un compos instable et ne peut pas tre dos quantitativement par
la mthode PicoTag.
L'ansrine sort entre la 1-mthyl histidine et la 3-mthyl histidine mais nest pas bien
rsolue. On suggre de jouer avec le pH.
L'thanolamine ne peut pas tre analyse car elle est volatile et svapore pendant le
second schage.
Lure ne se drive pas et nest donc pas dtecte.
Un exemple de chromatogramme est donn en annexe.
Prparation des sirops drable.
Environ 40 l de sirop est pes exactement dans une fiole de 350 l identifie au stylo indlbile. On y
ajoute ensuite 10 l de solution dtalon interne (acide -amino-caproque) et on agite vigoureusement au
vortex. Quarante l deau ultra-pure sont ajouts et lchantillon est nouveau pass au vortex.
Les fioles de 350 l (environ 13) sont places dans un tube vide lequel est plac sous-vide dans le
systme Picotag muni dune trappe solvants propre et contenant suffisamment de glace sche. Le vide
est dabord ajust environ 500 millitorrs pour viter de faire bouillir les chantillons. Le sirop ayant
tendance former une crote de sucre, il faut faire monter la lecture jusqu 1 torr pour quelques
secondes peine avant de laisser les chantillons pour la nuit. Ceci aura pour effet de faire mousser le
sirop redevenu visqueux, vitant ainsi la formation de la crote. Lchantillon doit scher toute la nuit.
Le matin, quand les chantillons sont secs, le robinet vide est ferm en laissant la pompe fonctionner.
On ajoute 20 l de solution de schage (mthanol: actate de sodium tri-hydrat 1M : trithanolamine
(TEA), 2:2:1) et la prparation est passe vigoureusement au vortex. On sche sous vide jusqu 65
millitorrs (environ 2 heures), puis on ajoute 20 l de solution de drivation (mthanol:
phnylisothiocyanate (PICT):eau : TEA, dans les proportions de 7:1:1:1) et le tout est nouveau pass
vigoureusement au vortex. On laisse ragir ainsi temprature de la pice pendant 30 minutes puis on
sche sous vide 65 millitorrs, environ 2 heures.
Enfin, on ajoute 200 l de diluant chantillon (luant B) et on agite au vortex. Lchantillon est ainsi
prt tre inject dans le systme de chromatographie pour tre analys. La prparation reste stable
pendant 10 heures la temprature de la pice et jusqu 60 heures, si rfrigre.
Prparation des sves drable.
Pour les sves et les concentrs, on procde comme pour les sirops en pesant exactement 300 l de sve
ou 100 l de concentr.

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Rsultats et discussion
Des essais prliminaires ont t effectus avec les chantillons du printemps 1992 pour mettre au point la
mthode dcrite ci-haut. Les rsultats sont prsents en annexe et montrent que lon peut dtecter des
quantits traces (nanomole, soit 10-9 mole, soit environ 0.0000002 gramme par ml de sve 2Brix).
ces concentrations, la reproductibilit est variable dun compos lautre et dun chantillon lautre,
lcart type relatif pouvant varier de 2 20%.
Au tableau 1, 2 et 3 on prsente les analyses des chantillons du printemps 1993. Les principaux acides
amins dtects dans la sve sont larginine, la proline lansrine, la 3-mthyl-histidine, et la tyrosine. On
dtecte aussi des frquences moindres, lacide aspartique, lacide glutamique, la 1-mthyl-histidine,
lacide a-amino-n-butyrique, la valine, la cystathionine, la cystine et la lysine. Les concentrations sont en
gnral, de lordre de 0,5 nanomol/g dchantillon 1 Brix avec quelques exceptions dont les
concentrations dpassent les 100 nanomol/g. Ce profil est un peu diffrent de celui que nous obtenions
avec les chantillons ayant servi au dveloppement de la mthode (1992), o on observait principalement
lacide aspartique, lacide glutamique, larginine, lacide a-amino-n-butyrique et la mthionine des
concentrations qui ont tendance tre un peu plus leves. Sachant que les acides amins peuvent la
fois provenir du mtabolisme de larbre et de celui des contaminations microbiennes et que le
mtabolisme de larbre de mme que lactivit microbienne augmentent avec la temprature, on sattend
effectivement observer des concentrations plus importantes dacides amins en fin de saison.
Le tableau 2 illustre les profils dacides amins observs dans les chantillons de concentr dosmose
inverse. On observe une variation du profil des acides amins par rapport ceux observs dans la sve.
Les principaux acides amins sont alors lacide a-amino-adipique, lhydoxy-proline, larginine, la 3mthyl-histidine, la tyrosine et la lysine. On observe aussi la b-alanine, la proline, la 1-mthyl-histidine, la
valine, la cystathionine, la cystine et la d-hydroxylysine. Les concentrations ont tendance tre plus
faibles que dans les sves suggrant.une perte de ces composs lors de ltape de concentration par
osmose inverse, soit par ractions chimiques, consommations par les microorganismes ou par affinit
pour la membrane dosmose inverse.
Au tableau 3, on retrouve les profils dacides amins des sirops. Les principaux acides amins observs
sont alors, lacide aspartique, larginine, la tyrosine et la cystathionine. On dtecte aussi lacide a-aminoadipique, la glycine, la proline, la 3-mthyl-histidine et lacide a-amino-n-butyrique. Les concentrations
normalises par gramme de saccharose ont tendance tre plus importantes que dans le concentr
dosmose inverse. On observe aussi une augmentation de la concentration totale en fonction de la saison.
Le traitement thermique agirait ainsi de deux faons sur le profil et la concentration en acides amins dans
les sirops drable. Premirement, la disparition de certains composs peut sexpliquer par leur
participation des transformations chimiques provoques par le traitement thermique subi dans
lvaporateur. En effet, on connat le rle que joue les acides amins dans les ractions de brunissement
non-enzymatique, telles que les ractions de Maillard (Danehy, 1986) o ils servent de catalyseur pour la
formation de composs de type caramel. Ils participent aussi la formation de pyrazines, composs ayant
des gots assez relevs dont la prsence a dj t dtecte dans le sirop drable (Alli et coll., 1990).
Deuximement, laugmentation de la concentration globale en acides amins pourrait provenir de
lhydrolyse de protines prsentes dans leau drable, dont la prsence a dj t dtecte dans la sve
(Bois et Nadeau, 1938) et qui peut tre de lordre de 50 100 ppm (Dumont et coll., 1993).

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Conclusion
Les acides amins dtects dans les divers chantillons sont principalement des acides amins communs
composants des protines, sauf Iansrine, lacide amino-n-butyrique, lacide a-amino-adipique et la
cystathionine. Les acides amins communs participent aux ractions de Maillard. Par exemple, larginine
ragirait avec les sucres prsents pour donner des gots sapparentant au pain, alors que la proline donne
des gots de craquelin. Lacide amino-n-butyrique pourrait donner des gots de noisette et lacide
aspartique gote simplement sucr (Danehy, 1986). Lansrine et la cystathionine sont connus pour tre
dorigine animale. Ils peuvent alors provenir dune contamination ou bien sont des artefact de la mthode
danalyse (Merk,1983).
Le rle des acides amins dans les produits drable, par leur faible teneur, demeure avant tout, un rle de
prcurseur de got, bon ou mauvais. Bien que lon peut dores et dj lier les fortes teneurs en acides
amins des sves de fin de saison au got de bourgeon, il serait intressant de relier les variations plus
subtiles des profils dacides amins des autres chantillons aux autres observations obtenues dans les
autres volets du prsent projet, comme le profil darmes et la qualit gustative.

Remerciements
Nous dsirons dabord souligner la contribution financire du programme de dveloppement des marchs
des produits drable dAgriculture Canada ce projet et nous remercions les producteurs pour leur
collaboration lchantillonnage de mme que le personnel technique du Service des technologies
alimentaires pour leur assiduit au travail.

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