Tesis

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATA

SECCIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIN
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BIOMEDICINA MOLECULAR
Caracterizacin molecular de
la poli (A) polimerasa (EhPAP) en
Entamoeba histolytica
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
PRESENTA
JESSICA MARIA GARCIA VIVAS
MXICO, D.F., FEBRERO DEL 2006.
NDICE
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE FIGURAS
iv
LISTA DE TABLAS
vi
RESUMEN
vii
ABSTRACT
viii
1.
INTRODUCCIN
1.1
Antecedentes histricos de la amibiasis
1.2
Taxonoma de E. histolytica
1.3
Ciclo de vida de E. histolytica
1.4
Epidemiologa de la amibiasis
2.
ANTECEDENTES
2.1
Generalidades sobre la regulacin de la expresin gnica en
eucariontes
2.2
10
Procesamiento del pre-RNAm en eucariontes
2.2.1 Capping del pre-RNAm
11
2.2.2 Splicing del pre-RNAm
12
2.2.3 Corte y poliadenilacin del pre-RNAm
14
2.3
Secuencias cis-reguladoras que participan en el corte y
poliadenilacin
16
2.4
20
Maquinaria de corte y poliadenilacin
2.4.1 Factor de especificidad del corte poliadenilacin (CPSF)
20
2.4.2 Factor de estimulacin de corte (CstF)
21
2.4.3 Factores de Corte (CFlm y CFllm)
21
2.4.4 oli (A) polimerasa (PAP)
22
2.4.5 rotena de unin al tracto de poli (A) II (PABP II)
22
2.4.6 Protenas adicionales
22
2.5
23
Mecanismo de corte y poliadenilacin
2.5.1 Corte del pre-RNAm
24
2.5.2 Poliadenilacin
26
2.6
Readenilacin citoplsmica
28
2.7
Importancia de la cola de poli (A) del RNAm
30
2.8
Poli(A) polimerasa en eucariontes
31
2.8.1 Generalidades
31
2.8.2 Participacin de la PAP en el splicing del RNAm
35
2.9
36
Poli (A) polimerasa en el ciclo celular
2.9.1 Generalidades del ciclo celular
36
2.9.2 Mecanismos de regulacin del ciclo celular
38
2.9.3 Papel de la PAP en el ciclo celular
39
2.10
Identificacin de las posibles secuencias en cis y
el procesamiento del pre-RNAm en E. histolytica
41
2.10.1 Identificacin de protenas involucradas en el

procesamiento del pre-RNAm en E. histolytica
44
2.10.2 Papel de la poliadenilacin en el fenotipo de

resistencia a mltiples frmacos
46
48
JUSTIFICACION
OBJETIVOS
49
4.1 Objetivo general
49
4.2 Objetivos especficos
49
5 MATERIALES Y METODOS
50
5.1 Estrategia Experimental
50
5.2 Anlisis in silico de la secuencia del gen EhPap
50
5.3 Subclonacin del gen EhPap en el vector pRSET-A
52
5.3.1 Restriccin enzimtica
53
5.3.2 Ligacin
56
5.3.3 Preparacin de bacterias competentes
56
5.3.4 Transformacin de bacterias por choque trmico
57
5.3.5 Mini-preparacin de DNA plasmdico
58
5.4 Expresin de la protena EhPAP recombinante
59
5.5 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)
61
5.6 Purificacin de la protena EhPAP recombinante
62
5.7 Electroelucin de la protena EhPAP recombinante
63
5.8 Inmunizacin de ratones para obtener anticuerpos
64
5.9 Cultivo de trofozotos
66
5.10 Obtencin de extractos nucleares y citoplsmicos de la clona A
66
5.11 Ensayos de Western blot
67
5.12 Sicronizacin de trofozoitos de la clona L-6
69
5.13 Obtencin del RNA total de los trofozoitos sincronizados
69
5.14 Ensayo de RT-PCR semi-cuantitativa
70
6 RESULTADOS
73
6
6.1 Anlisis in silico: La EhPAP es una protena evolutivamente

conservada
73
81
81
6.2.2 Ligacin
84
6.2.3 Anlisis de clonas y mini-preparaciones de DNA
87
6.3 Expresin de la protena EhPAP recombinante
90
92
6.5 Electroelucin de la protena EhPAP recombinante
95
6.6 Inmunizacin de ratones para la obtencin de anticuerpos
95
6.7 Localizacin subcelular de la EhPAP
96
6.8 La expresin de EhPAP aument en la fase G1 y S

del ciclo celular
97
7 DISCUSION
101
8 CONCLUSIONES
106
9 BIBLIOGRAFIA
108
LISTA DE ABREVIATURAS
3 UTR
regin 3 no traducida
5 UTR
regin 5 no traducida
aa
aminocidos
ATP
trifosfato de adenosina
cdk
cinasa dependiente de ciclina
cDNA
cido desoxirribonucleico complementario
CTD
Dominio carboxi terminal de la RNA polimerasa II
CF I m
Factor de corte I de mamfero
CF II m
Factor de corte II de mamfero
CPSF
Factor de especificidad de corte y poliadenilacin
CstF
Factor estimulante del corte
DEPC
dietilpirocarbonato
DNA
cido desoxirribonucleico
DSE
Elemento o secuencia ro abajo
DTT
ditiotreitol
dNTPs
didesoxinucletidos trifosfatados
dT
didesoxitimidina
EhPap
gen codificante de la protena EhPAP
EhPgp5
gen codificante de la protena EhPGP5
EDTA
cido etilen diamino tetra-actico
EC
extractos citoplsmicos
EN
extractos nucleares
8
FIP 1
factor de interaccin con la protena PAP
G1
fase de la mitosis, intervalo 1
G2
fase de la mitosis, intervalo 2
GT
enzima guanililtransferasa
kb
kilobases
kDa
kiloDaltones
LB
medio de cultivo para bacterias Luria-Bertani
fase de la mitosis, mitosis
MDR
resistencia a mltiples drogas
microgramos
microlitros
micromolar
ml
mililitros
mM
milimolar
MT
enzima metiltransferasa
nt
nucletidos
OMS
Organizacin Mundial de la Salud
PAGE
electroforesis en gel de poliacrilamida
PAP
poli (A) polimerasa
PAPB
protena de unin al tracto de poli (A)
pb
pares de bases
PBS
solucin salina amortiguadora de fosfatos (NaCl, KCl, Na2PO4,

KH2PO4)
PCR
reaccin en cadena de la polimerasa

9
pre-RNAm
cido ribonucleico mensajero precursor
rpm
revoluciones por minuto
RNA
cido ribonucleico
RNAm
cido ribonucleico mensajero
RNA poli (A+)
cido ribonucleico mensajero poliadenilado
RNA poli (A-)
cido ribonucleico mensajero no poliadenilado
RNApol II
RNA polimerasa II
RNPsn
ribonucleoprotena nuclear pequea
RT
transcripcin reversa
RTP
enzima RNA 5 trifosfatasa
fase de la mitosis, sntesis
TAE
solucin amortiguadora (Tris, cido actico glacial y EDTA)
TBE
solucin amortiguadora (Tris, cido brico y EDTA)
U1 RNPsn
ribonucleoprotena nuclear pequea rica en uridina 1
U2 RNPsn
ribonucleoprotena nuclear pequea rica en uridina 2
U2AF
factor auxiliar de U2 RNPsn
USE
secuencia localizada ro arriba
xg
gravedades
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de vida de E. histolytica
Figura 2. Diagrama esquemtico que muestra las secuencias

conservadas en los intrones
13
Figura 3. Proceso de eliminacin de intrones o splicing
15
Figura 4. Comparacin de las secuencias cis-reguladoras que

participan en el corte y poliadenilacin del pre-RNAm de mamferos
y levaduras
19
Figura 5. Esquema del reclutamiento de los factores

involucrados en la reaccin de corte del pre-RNAm en mamferos
25
Figura 6. Diagrama esquemtico que muestra las protenas

que participan en la reaccin de poliadenilacin
27
Figura 7. Estructura molecular de la poli (A) polimerasa II de

humano (PAP II)
32
Figura 8. Diagrama tridimensional de la estructura cristalina

de la poli(A) polimerasa de bovino
33
Figura 9. Etapas del ciclo celular en eucariontes y su regulacin
40
Figura 10. Representacin del alineamiento mltiple de 8

secuencias genmicas (gDNA) y de cDNA de diferentes genes
de E. histolytica
42
Figura 11. Esquema de las secuencias cis-reguladoras del

43
Figura 12. Modelo de la maquinaria del procesamiento del

11
extremo 3 del pre-RNAm en E. histolytica
47
Figura 13. Estrategia experimental
51
Figura 14. Esquema del vector pRSET
54
Figura 15. Secuencia de la EhPAP obtenida del banco de datos
74
Figura 16. Blast realizado tomando como referencia la

secuencia de EhPAP
76
Figura 17. Alineamiento mltiple de EhPAP con PAP de

H. sapiens y PAP1 de S. cerevisiae
79
Figura 18. Representacin esquemtica de la estructura molecular

de PAPs de diferentes organismos incluyendo la EhPAP de
E. histolytica
80
Figura 19. rbol filogentico sin raz de las PAPs de diferentes

organismos
82
Figura 20. Comparacin de la estructura tridimensional de la

EhPAP y la PAP de bovino
83
Figura 21. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los

productos de la restriccin enzimtica del vector pRSET-A y
TA-EhPap
85
Figura 22. Purificacin del vector pRSET y el gen EhPap
86
Figura 23. Restriccin enzimtica de minipreps de 9 clonas

correspondientes a la ligacin de pRSET-EhPap
88
Figura 24. Electroferograma de la secuencia del gen

EhPap clonado en el vector pRSET
89
12
Figura 25. Expresin de la protena recombinante EhPAP
91
Figura 26. Purificacin de la protena recombinante EhPAP
93
Figura 27. Inmunodeteccin de la protena recombinante

EhPAPr purificada
94
Figura 28. Ensayo de Western blot con el anticuerpo especfico

anti-EhPAP
98
Figura 29. Anlisis de la expresin del RNAm del gen EhPap en

trofozotos de la clona L6 sincronizados en el ciclo celular
100
13
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificacin taxonmica de E. histolytica
Tabla 2. Tabla comparativa de los factores que participan en

el procesamiento del extremo 3 de E. histolytica, H. sapiens
y S. cerevisiae
45
Tabla 3. Comparacin de EhPAP con otras PAPs de eucariontes
77
14
RESUMEN
En eucariontes, la poliadenilacin del extremo terminal 3 del pre-RNAm es esencial
para el transporte, estabilidad y traduccin del RNAm. Se identific y se clon el gen
que codifica para la protena poli(A) polimerasa nuclear (EhPAP) en Entamoeba
histolytica. Mediante un alineamiento de secuencias de distintas PAPs de otros
eucariontes se demostr que EhPAP contiene una regin de unin al RNA y un dominio
cataltico central descritos en otras PAPs nucleares pertenecientes a la familia de las
nucleotidil transferasas. La EhPAP recombinante expresada en bacterias se us para
generar anticuerpos especficos, los cuales reconocieron dos isoformas de la EhPAP de
60 y 63 kDa en extractos nucleares y citoplsmicos en ensayos de Western blot. Por
ensayos de RT-PCR de la expresin el RNAm gen EhPap en las fases del ciclo celular
se observ un incremento en las fases G1 y S.
15
ABSTRACT
In eukaryotes, polyadenylation of pre-mRNA 3 end is essential for mRNA export,
stability and translation. Here we identified and cloned a gene codifying for putative
nuclear poly(A) polymerase (EhPAP) in Entamoeba histolytica. Protein sequence
alignments with eukaryotic PAPs showed that EhPAP has the RNA-binding region and
the PAP central domain with the catalytic nucleotidyl transferase domain described for
the other nuclear PAPs. Recombinant EhPAP expressed in bacteria was used to
generate specific antibodies, which recognized two EhPAP isoforms of 60 and 63 kDa in
nuclear and cytoplasmic extracts by Western blot assay. RT-PCR assay showed that
EhPap mRNA expression is about 10- and 7-fold increased in G1 and S phase,
respectively, through cell cycle progression.
16
1. INTRODUCCIN
1.1 Antecedentes histricos de la amibiasis
El trmino amiba proviene del griego amoibe que significa cambio (morfologa y
gran movilidad), de ah el nombre de la enfermedad conocida como amibiasis. La
amibiasis humana es una infeccin del tracto gastrointestinal producida por el parsito
protozoario Entamoeba histolytica al ser ingerido en agua o alimentos contaminados por
heces fecales (Schaudinn, 1903). Desde el siglo XVIII se consider una enfermedad
tropical, sin embargo, actualmente se sabe que es una enfermedad distribuida
mundialmente con predominio en las ciudades con grandes concentraciones humanas y
que ataca fundamentalmente a grupos con desnutricin y deficientes prcticas de
higiene.
El descubrimiento y la descripcin inicial de la amibiasis la dio el mdico ruso

Fedor Lsch en 1873 (Kean, 1978), quien sugiri que exista una relacin entre la
presencia de E. histolytica y la amibiasis al tratar a un paciente en San Petersburgo. Sin
embargo, al infectar a un perro con el parsito obtenido del paciente, no logr
reproducir la enfermedad en el animal y no pudo demostrar la relacin entre el parsito
y la patologa. No es hasta 1891, cuando Councilman y La Fleur, describieron la
evidencia clnica y patolgica de la asociacin de E. histolytica con la disentera y el
absceso heptico en humanos (Councilman, 1891). En 1893, Quincke y Roos
describieron al parsito en su forma de quiste (Kean, 1978). Posteriormente Walter y
Sellards (1913) determinaron que: 1) la transmisin de la enfermedad se da por los
quistes no por los trofozotos, 2) los portadores asintomticos son los reservorios y
17
probablemente los responsables de la transmisin, 3) existe un grupo de individuos de

riesgo, y 4) existen diferencias de virulencia en los parsitos.
En Mxico, existen registros de la enfermedad desde 1611 cuando fue relatada
por Fernndez del Castillo al efectuar la autopsia de Fray Garca Guerra, arzobispo y
virrey, quien falleci a dos aos de su llegada a la Nueva Espaa de una enfermedad
descrita como flaqueza de nimo, congoja y calores y en la cual, se encontr un
absceso heptico (Fournier, 1956).
En 1925 Emile Brumpt sugiri que haba dos especies: una capaz de causar
enfermedad invasora, E. histolytica, y otra que nunca causa enfermedad, a la que l
llam Entamoeba dispar. La hiptesis de Brumpt no fue reconocida por otros
investigadores en su momento. En la dcada de los 70s se empezaron a acumular
observaciones que apoyaban a la hiptesis de Brumpt de la existencia de dos
organismos distintos en lo que se conoca como E. histolytica. Se continuaron
acumulando datos bioqumicos, inmunolgicos y genticos y en 1993 se public una
redescripcin formal de E. histolytica, separndola de E. dispar (Diamond-Clark, 1993).
Adems, con base a la informacin gentica obtenida de los bancos de datos, se ha
confirmado que son especies diferentes (Britten y col., 1997; Nunez y col., 2001;
Blessmann y col., 2001).
18
1.2 Taxonoma de E. histolytica

E. histolytica es un parsito protozoario, el cual pertenece a los Rhizopodos que
son organismos que tienen como caracterstica formar pseudpodos en alguna etapa
de su vida y a los Entamoebidae, cuyos miembros son parsitos (Tabla 1). Es una de
las seis diferentes especies de Entamoeba conocidas que infectan al hombre las cuales
son: E. coli, E. gingivalis, E moshkovskii, E. hartmanni, E. polecki y E. histolytica
(Bruckner, 1992).
E. histolytica es un parsito protista del intestino humano, caracterizado por su
estructura celular simple y metabolismo primitivo. Estudios basados en la estructura, el
metabolismo, la organizacin del DNA y RNA, as como la carencia de mitocondria,
aparato de Golgi, retculo endoplsmico rugoso y citoesqueleto microtubular (MartnezPalomo, 1986), sugieren que es uno de los eucariontes ms primitivos, o
protoeucariontes (Bakker-Grunwald y Wostman, 1993). Presenta cromosomas que no
estn condensados, con variaciones en tamaos que dificultan el poder determinar el
nmero exacto de stos (Loftus 2005). Es considerada como una reliquia viviente de la
fase temprana de la evolucin de los eucariontes, la cual ocurri antes de que la
simbiosis promitocondrial surgiera, aunque la existencia o ausencia de mitocondrias en
E. histolytica sigue siendo un tema de debate, ya que no contiene una mitocondria con
estructura y forma caracterstica o enzimas tpicas del metabolismo energtico.
19
Tabla 1. Clasificacin taxonmica de E. histolytica
Reino:
Protista
Subreino:
Protozoo
Phylum:
Sarcomastigophora
Superclase:
Rhizopoda
Clase:
Lobosea
Subclase:
Gymnamoebida
Orden:
Amoebida
Suborden:
Tubulina
Familia:
Entamoebidae
Gnero:
Entamoeba
Especie:
histolytica
Fuente: Levine et al., 1980
20
Se han descrito tres genes en el genoma nuclear de E. histolytica que codifican

para tres protenas asociadas tpicamente a la mitocondria en otros eucariontes,
aunque estructuralmente parece carecer de ella. La chaperonina 60 (cpn 60 Hsp 60),
es exclusiva de mitocondria, hidrogenosomas y cloroplastos (Clark y Rogers, 1995); la
nucletido
piridina
(NAD/NADP)
transhidrogenasa
(PNT:
pyridine
nucleotde
transhydrogenase, por sus siglas en ingls), que es una protena de tipo mitocondrial,
junto con la enzima metablica, piruvato: ferrodoxin-oxidoreuctasa (POR) (Huber y
col.,,1988); y la alcohol dehidrogenasas ADH1, ADHE, ADH3 (Yang, 1994). Adems,
diferentes grupos de investigacin, han identificado una serie de pequeos organelos a
los cuales han llamado mitosoma, crypton (Tovar y col., 1999, Mai y col., 1999, Ghosh y
col., 2000) o Ehko (Orozco y col., 1997, Marchat y col., 2002), los cuales contienen DNA
y/o protenas especficas que comparten con algunas caractersticas biolgicas de la
mitocondria. La razn por la que se considera a este organelo una mitocondria
remanente, se ha predicho por la deteccin de los genes de las protenas
mencionadas que tienen como blanco la mitocondria en otros eucariontes (Ghosh y col.,
2000).
1.3
Ciclo de vida de la amiba
E. histolytica presenta diferentes fases o estados en su ciclo de vida: trofozoto,

prequiste, quiste, metaquiste y trofozoto metaqustico (Dobell, 1928), entre los cuales
los ms importantes en la transmisin de la infeccin son el quiste y el trofozoto. La
infeccin se adquiere por la ingestin de comida o agua contaminada con quistes de E.
histolytica provenientes de las heces fecales de humano y por contacto directo oral21
fecal. La transmisin de E. histolytica u otros parsitos por agua contaminada es muy

comn en pases de tercer mundo, donde la mayor parte del agua potable no es
tratada. El uso de heces fecales como abono o fertilizantes tambin es una fuente
importante de infeccin (Markell, 1986).
El quiste maduro tiene cuatro ncleos (tetranucleado) (Gathiram, 1990), es

inmvil, esfrico (8.5-19 m de dimetro) y resistente a cambios ambientales y a los
jugos gstricos, puede permanecer viable durante tres meses en el agua o alimentos.
Sin embargo, puede ser eliminado por hipercloracin o iodinacin (Kahn, 1975). Al
entrar en el tracto digestivo, se desenquista en el intestino delgado transformndose en
metaquiste, el cual duplica sus ncleos (ocho ncleos) formando as los trofozotos
metaqusticos que miden 8 m de dimetro (Martnez-Palomo, 1982). Estos se
alimentan y crecen hasta transformarse en trofozotos maduros (12-60 m) que se
establecen en el colon, donde se adhieren a la mucosa intestinal y se alimentan de
bacterias y restos celulares (Walsh, 1986). Los trofozotos presentan gran motilidad, son
hialinos, forman pseudpodos y son muy sensibles a cambios ambientales.
Los trofozotos, una vez en el intestino delgado, pueden tener diferentes destinos
los cuales podran estar relacionados por malos hbitos alimenticios, el alcoholismo, el
uso de esteroides y problemas del sistema inmune. Por lo tanto: 1) pueden habitar el
intestino grueso como comensal, dividirse y alimentarse de desechos orgnicos,
azcares y bacterias; 2) pueden invadir la mucosa intestinal produciendo disentera
amibiana aguda (con una duracin de 14 das) o crnica (ms de 15 das); 3) tambin
22
pueden causar colitis amibiana fulminante o amibiasis extraintestinal caracterizada por

la invasin del hgado y la formacin de abscesos hepticos principalmente, o bien la
invasin de otros rganos como son: piel, pulmn y el corazn; 4) o bien, los trofozotos
pueden enquistarse, en un proceso aparente estimulado por condiciones luminales no
ideales para los trofozotos, aqu el trofozoto reduce su tamao y compacta su DNA en
un solo ncleo (uninuclear) formando al prequiste, el cual realiza una divisin nuclear
hasta formar nuevamente los cuatro ncleos del quiste que ser eliminado con las
heces. La infeccin de un nuevo individuo puede producirse con tan slo un quiste en
el agua o alimentos contaminados (Fig. 1). Con inculos ms grandes el periodo de
incubacin puede acortarse en unos pocos das en vez de 1-2 semanas. Los trofozotos
que son excretados durante los perodos de colitis aguda no transmiten la infeccin, ya
que se desintegran rpidamente en el medio ambiente (Dobell, 1928; Lushbaugh y
Millar, 1988).
1.4
Epidemiologa de la amibiasis
Segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), la amibiasis es la 4 causa de

muerte a nivel mundial producida por un parsito, despus de la malaria, la enfermedad
de Chagas y la leishmaniasis; y es la 3 causa de morbilidad por un parsito despus
de la malaria y tricomoniasis (Espinosa-Cantellano y col., 2000)
La amibiasis es considerada un problema de salud pblica ya que entre el 10-12

% de la poblacin mundial (500 millones) es portadora de trofozotos de E. histolytica y
23
Figura 1. Ciclo de vida de E. histolytica. El proceso inicia cuando E. histolytica es

eliminada en forma de quistes en las heces fecales (1), que contaminan agua o
alimentos y son ingeridos por va oral por otro husped (2). Se desenquistan en el
intestino delgado (3) formando los trofozotos, que migran al intestino grueso (4), los
cuales se alojan en ste. (A) El individuo puede permanecer asintomtico, y se pueden
producir desde sntomas leves hasta disentera grave, o invadir otros rganos, tales
como el hgado, pulmn o cerebro (C).
24
Etapa infectiva
Etapa diagnstica
Ingesta de
quistes maduros
Excrecin en
heces fecales
Colonizacin no invasiva
Enfermedad intestinal
Enfermedad extraintestinal
Trofozotos
Salida del
husped
Multiplicacin
Desenquistamiento
Trofozotos
Quiste
25
el 10% de sta (50 millones) sufre la enfermedad, la letalidad por complicaciones se

estima entre el 0.1 y 0.25% (70-100,000 muertes) al ao (OMS, 1998). En Mxico, el
8.4% de la poblacin es seropositivo para la deteccin de antgenos de E. histolytica y
un
1.1
de
stos
present
abscesos
hepticos
entre
1999-2000
(http://www.ssa.gob.mx).
2. ANTECEDENTES
2.1 Generalidades sobre la regulacin de la expresin gnica en eucariontes
En todos los seres vivos, la regulacin de la expresin gnica es de gran
importancia ya que de esta depende el buen funcionamiento del organismo. Con los
recientes anlisis de genomas de diferentes organismos, principalmente en eucariontes,
se
ha
observado
que
slo
una
pequea
fraccin
del
material
gentico,
aproximadamente el 1.5%, codifica para protenas, mientras que la mayor parte del
DNA genmico participa en la regulacin de la expresin gentica (Mignone, 2002). La
informacin gentica se encuentra contenida en el DNA nuclear y mitocondrial, la cual
se traduce a protenas por medio del RNAm, que es el encargado de llevar la
informacin contenida en el DNA, hacia afuera del ncleo. Es en este proceso en donde
se encuentran diversos niveles o puntos de control que regulan la expresin gentica.
En eucariontes, los principales puntos de control se dan a nivel de: i) la transcripcin,
que permite la sntesis del pre-RNAm (transcrito primario) a partir del DNA por medio de
la RNA polimerasa II (RNA pol II) y otros factores de transcripcin; ii) el procesamiento
del pre-RNAm, por medio del cual se genera un RNAm maduro funcional que pueda ser
traducido a protena; en este procesamiento se incluye principalmente el capping, el
26
splicing y la reaccin de corte/poliadenilacin del extremo 3; y iii) la traduccin, que

consiste en la sntesis de una protena funcional a partir del RNAm, incluyendo posibles
modificaciones post-traduccionales (Day y Tuite, 1998). En este trabajo nos
enfocaremos en los mecanismos moleculares del procesamiento del pre-RNAm.
2.2 Procesamiento del pre-RNAm en eucariontes

En eucariontes, el hecho de obtener una copia de la informacin gentica del
DNA para generar un transcrito no significa que se ha completado la sntesis del RNA
mensajero maduro, sino que se obtiene un pre-RNAm el cual requiere de un
procesamiento nuclear para poder ser funcional.
El pre-RNAm, presenta una estructura tripartita que consiste en una regin 5 no

traducida (5 untranslated region: 5UTR por sus siglas en ingls) la cual tiene un rango
de longitud de 100 a 200 nucletidos (nt) y es rica en G y U; una regin codificante que
est constituida por exones que codifican para aminocidos e intrones no codificantes
que son eliminados en el proceso de splicing; y una regin 3 no traducida (3UTR),
cuya longitud es muy variable ya que puede ser de 200 nt en plantas y hongos, a 800 nt
en humanos y otros vertebrados (Mignone, 2002). El procesamiento del pre-RNAm se
lleva a cabo en el ncleo (Dreyfus, 2002) y requiere de varios eventos moleculares, los
cuales estn ligados entre s y pueden influenciarse uno a otro en especificidad y
eficiencia, adems de estar intimamente ligadas a la transcripcin, es por eso que
actualmente se conoce que la mayora de las reacciones de este procesamiento
ocurren co-transcripcionalmente (Proudfoot 2002).
27
2.2.1 Capping del pre-RNAm

La formacin de un capuchn, o estructura cap (capping en ingls), en el
extremo 5 protege el RNAm de la degradacin exonucletica en direccin 5 3
(Furuichi, 1997) y desempea un papel importante en el inicio de la traduccin (Shatkin,
1976). Este capuchn consiste en una guanosina metilada en la posicin 7 localizada
en el primer ribonucletido de la cadena de RNA en el extremo 5 del RNAm por medio
de una unin 5-5 trifosfato, y se conoce como m7G(5)ppp(5)N (donde N representa el
primer nucletido) o simplemente m7G (Day y Tuiter, 1998). La reaccin se lleva a cabo
por la enzima formadora del capuchn o guanililtransferasa (GT) asociada al dominio
carboxi-terminal (CTD) fosforilado de la RNA pol II. Este proceso se inicia en el extremo
5 del pre-RNAm el cual posee un trifosfato derivado del primer trifosfato del nucleido
incorporado en el sitio de inicio de la sntesis del transcrito. La enzima RNA 5
trifosfatasa (RTP: RNA 5 triphosphatase por su siglas en ingls) elimina el ltimo
fosfato (fosfato ), dejando un difosfato en el extremo 5, mientras que la GT transfiere
un GMP del GTP al difosfato, dejando el extremo 5 de la guanosina frente al extremo 5
de la cadena de RNA, formando as el puente 5-5 trifosfato de guanosina. El extremo
terminal de la guanosina se metila en la posicin 7 de la guanina por medio de la
enzima metiltransferasa (MT), mientras que el segundo nucletido del lado interno del
puente de trifosfato se metila en la posicin 2 de la ribosa (Cho y col., 1988; Proudfoot
2002). La estructura cap inicial es reconocida por el complejo de unin al cap o CBC
(cap binding complex, por sus siglas en ingls), el cual est formado por las protenas:
CBP20 y CBP80, que estimulan el paso del RNAm a travs del poro nuclear para ser
exportado al citoplasma. Ya en el citosol, CBP20 y CBP80 son remplazadas por el
28
factor citoplsmico de inicio de la traduccin eIF-4E (Shatkin y Manley, 2000). La

estructura cap es importante en la regulacin de la expresin gnica, debido a que los
RNAm sin esta estructura presentan una traduccin deficiente adems de que el RNA
es menos estable (Horikami y col., 1984).
2.2.2 Splicing del pre RNAm

El splicing es el proceso mediante el cual los intrones son removidos del preRNAm para dejar slo la regin codificante (exones). En eucariontes, este proceso se
inicia con el reconocimiento de tres secuencias en el intrn, las cuales son altamente
conservadas en los pre-RNAm de los eucariontes: el dinucletido GU en el extremo 5;
el dinucletido AG en el extremo 3 del intrn y el sitio de ramificacin interno cercano al
extermo 3, el cual est prximo a un sitio rico en pirimidinas (Fig. 2). La protena U1
RNPsn (ribonucleoprotena pequea nuclear, rica en Uridina) se une a la secuencia GU
en el 5 del intrn, mientras que la protena U2 RNPsn, reconoce el sitio de ramificacin
que se encuentra previo a una secuencia rica en pirimidinas, ro arriba de la secuencia
AG del extremo 3 del intrn, a la cual se une dejando una adenina invariable libre que
posteriormente participa en el proceso de eliminacin del intrn. Se reclutan otras tres
protenas RNPsn: U4, U6 y U5, que interactan con U1 y U2. U6 es una ribozima y es la
encargada de realizar el corte en el extremo 5 del intrn, el cual al ser liberado, se une
a la adenina que qued libre en el sitio de ramificacin, formando una estructura en
forma de lazo del intrn. U5 acerca los extremos de los dos exones para unirlos,
mientras que U6 corta el extremo 3 del intrn el cual es liberado junto con los dems
componentes. U4 no interacciona directamente con el pre-RNAm pero su funcin
29
Figura 2. Diagrama esquemtico que muestra las secuencias conservadas de los

intrones. Se observan los dinucletidos conservados en los extremos 5 y 3 del intrn,
GU y AG respectivamente, adems del sitio de ramificacin, as como la frecuencia de
cada nucletido en una posicin especfica y la distancia aproximada entre los sitios de
ramificacin y de splicing 3.
30
Sitio de splicing 5
pre-RNAm
Sitio de ramificacin
Sitio de splicing 3
Regin
rica en Py
(~15b)
Frecuencia
(%)
31
principal es reclutar a U5 y U6 para llevarlos al sitio de accin. En eucariontes

superiores, se identific tambin la protena U2AF (U2 snRNP auxiliary factor por sus
siglas en ingls) que reconoce a una secuencia rica en pirimidinas en el intrn y se une
a esta, facilitando la unin de U2 al pre-RNAm (Fig. 3). En conjunto las snRNPs y otras
protenas accesorias forman el spliceosoma que constituye la maquinaria de splicing
nuclear.
En el splicing, se ha demostrado que no slo participan las protenas RNPsn,

sino tambin otras protenas como RNA helicasas y protenas involucradas en el
procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm como veremos ms adelante (Li, 2001;
Vagner, 2000; Evans, 2001, Garca- Blanco, 2003)
2.2.3 Corte y poliadenilacin del pre-RNAm

El procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm incluye el corte y la adicin de un
tracto de 100-250 residuos de adeninas (tracto o cola de poli (A)), en el lugar donde se
realiz el corte endonucleoltico del transcrito primario. Una vez que el RNAm est
poliadenilado, es maduro o funcional y est listo para ser transportado al citoplasma
para ser traducido por los ribosomas, los cuales son los encargados de sintetizar la
protena codificada por el RNAm (Wahle, 1995; Colgan, 1997; Mignone, 2002)
Las UTRs tienen un papel muy importante en la regulacin post-transcripcional

de la expresin gentica. Ambas (5 y 3 UTR) tienen funciones importantes ya que
participan en el transporte del RNAm maduro del ncleo al citoplasma, La 5 UTR
32
Figura 3. Proceso de eliminacin de intrnes o splicing. Las ribonucleoprotenas U1 y

U2 reconocen al dinucletido GU y a la adenina presente en el sitio de ramificacin,
respectivamente. Posteriormente se reclutan U4, U5 y U6.
U6 realiza el corte del
extremo 5 del intrn y se forma un lazo. Esta misma ribonucleoprotena corta el

extremo 3 del intrn mientras que U5 que funciona como ligasa uniendo los dos
exones.
33
Producto ligado
RNAm
34
participa en el inicio de la traduccin, mientras que la 3 UTR participa el control de la

localizacin subcelular, en la estabilidad, as como en la eficiencia de la traduccin del
RNAm (Mignone, 2002). Esto se debe a la interaccin de la 3 UTR con protenas
especficas de unin al RNA, tanto en ncleo como en citoplasma (Kataoka y col.,
2000). A continuacin se describen las secuencias, factores y eventos moleculares del
procesamiento de la 3 UTR en eucariontes.
2.3
Secuencias cis-reguladoras que participan en el corte y poliadenilacin

del pre-RNAm
El procesamiento de la 3UTR del pre-RNAm, requiere de secuencias cisreguladoras, las cuales se han estudiado ampliamente en eucariontes superiores (Zhao,
1999; Colgan, 1997; Wahle, 1995; Wahle 1999) y estas incluyen:
1. La seal de poliadenilacin, formada por el hexanucletido AAUAAA, la cual se

localiza de 10-30 nt ro arriba al sitio de corte/poliadenilacin. Es una secuencia
consenso y uno de los elementos ms conservados en mamferos, la cual se
encontr en un 90% de todos los pre-RNAm. En el 10% restante, cambia esta
secuencia en una sola base A U, dando la variante ms comn: AUUAAA, la
cual tambin acta como seal de poliadenilacin. Estudios realizados con
mutaciones en esta seal y sus variantes, concluyen que esta secuencia es
esencial tanto para el proceso de corte como para la adicin de la cola de poli
(A), ya que al mutarla se inhibe el proceso de poliadenilacin (Zhao, 1999).
35
2. El sitio de poliadenilacin o de corte que se encuentra de 10 a 30 nt ro abajo de

la seal de poliadenilacin. La secuencia que rodea al sitio de corte no es
conservada aunque en un 70% de los mRNA de vertebrados, se encuentra una
adenosina al extremo final del sitio de corte nucleoltico. El penltimo nucletido
ms frecuente antes del corte es normalmente una C, por lo que el dinucletido
CA define el sitio de poliadenilacin en la mayora de los genes (Zhao y col.,
1999).
3. El elemento ro abajo (DSE: down stream element por sus siglas en ingls), rico
en GU/U, est localizado de 20-40 nt ro abajo del sitio de corte. Esta secuencia
slo est presente en un 70% de los pre-RNAm de mamferos. Este elemento no
es tan conservado y puede ser de dos tipos: un elemento rico en U y un
elemento rico en GU. El elemento rico en U es una cadena corta de residuos de
U, mientras que el elemento rico en GU tiene el consenso YGUGUUYY (Y =
pirimidina). Esta secuencia DSE puede tener slo uno de estos elementos, o
ambos, que en este caso trabajan juntos sinrgicamente. Sin embargo, algunos
elementos ro abajo no contienen ninguno de estos dos motivos. Mutaciones
puntuales en cualquiera de estos elementos no alteran su funcin, sin embargo,
si se pierden grandes fragmentos de esta secuencia, se puede inhibir su funcin
al no ser identificada por los factores de procesamiento del 3 terminal. La
proximidad de estas secuencias ro abajo del sitio de poliadenilacin pueden
afectar la posicin del sitio de corte y la eficiencia del mismo.
36
4. El elemento ro arriba (USE: upstream element, por sus siglas en ingls) de la

seal de poliadenilacin es una secuencia rica en U que participa en el corte del
extremo 3 del pre-RNAm en el ncleo, y tambin puede ser identificada como
CPE (cytoplasmic polyadenylation element), la cual participa en la readenilacin
citoplsmica del RNAm como veremos ms adelante (Fig. 4A).
En levadura se han descrito secuencias homlogas a las secuencias

identificadas en eucariontes superiores, con algunas diferencias que radican tanto en la
organizacin molecular como en la secuencia propiamente dicha. Las secuencias cisreguladoras de los pre-RNAm de levaduras son menos conservadas que en eucariontes
superiores (Fig. 4B). Al menos tres seales son necesarias para realizar el
procesamiento en el extremo 3 en S. cerevisiae (Zhao y col., 1999):
1.
Un elemento posicionador (PE: Position element, por sus siglas en ingls) rico
en A que funciona como la seal de poliadenilacin representada por la
secuencia AAUAAA, la cual puede ser no conservada y presentar una
variante que es AAAAAA y se localiza de 10 a 30 nt ro arriba del sitio de
corte. Slo un 50% de todos los RNAm la presentan (Wahle y Seller, 1992)
2.
El sitio de corte o poliadenilacin, que generalmente corresponde al

dinucletido AA.
3.
El elemento de eficiencia (EE) el cual se encuentra ro arriba del elemento

posicionador, es rico en UA y su funcin es activar al elemento posicionador.
4.
No se ha identificado el dominio DSE rico en GU.
37
Figura 4. Comparacin de las secuencias cis-reguladoras que participan en el corte y

poliadenilacin del pre-RNAm de mamferos y levaduras. USE: Elemento ro arriba por
sus siglas en ingles: Upstream element; SP: Seal de poliadenilacin, DSE: Elemento
ro abajo, por sus siglas en ingls: Downstream element. EE: Elemento eficiente, PE:
Elemento Posicionador.
38
Mamferos
STOP
10-30 nt
30 nt
USE
SP
Sitio Poli(A)
DSE
U-rica
AAUAAA
CA
U/GU-rica
3 UTR
S. cerevisiae
STOP
10-30 nt
EE
PE
Sitio Poli(A)
UAUAUA
AAUAAA
Py(A)n
AAAAAA
3 UTR
39
2.4 Maquinaria de corte y poliadenilacin

El procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm se puede dividir en dos eventos
principales que son el corte y la poliadenilacin, en donde participan diversas protenas
las cuales pueden intervenir simultneamente en uno o ambos eventos. El corte y la
poliadenilacin son dos procesos que se llevan a cabo con espacios de separacin de
tiempo muy cortos in vivo, pero pueden dividirse ampliamente para su estudio in vitro. A
continuacin, se describen las protenas involucradas en este procesamiento en
eucariontes superiores.
2.4.1 Factor de especificidad del cortepoliadenilacin (CPSF)

El complejo CPSF, (Cleavage/polyadenylation specificity factor CPSF, por sus
siglas en ingls), pesa 360 kDa y est constituido por cuatro subunidades de 30, 73,
100 y 160 kDa. Participa tanto en el corte como en la poliadenilacin, reconoce la seal
de poliadenilacin en el RNA y se une a sta por la subunidad de 160 kDa (Jenny y col.,
1994; Colgan y col., 1997; Wahle y col., 1999; Zhao y col., 1999; Li y col., 2001; Ryan y
col., 2004). Se ha reportado que la protena Fip1 de humano (o factor interacting with
PAP, en ingls), es otra subunidad del complejo CPSF. Se une al elemento USE rico en
U (que se encuentra ro arriba de la seal de poliadenilacin) y acta junto con el
CPSF-160, en reconocer la seal de poliadenilacin y reclutar a la poli (A) polimerasa
(Poly (A) polymerase o PAP por sus siglas en ingls) hacia el sustrato de RNA
(Kaufman y col., 2004)
40
2.4.2 Factor de estimulacin de corte (CstF)

El complejo CstF (Cleavage stimulation factor CstF por sus siglas en ingls), es
una protena heterotrimrica formada por tres subunidades de 77, 64 y 50 kDa. La
subunidad de 64 kDa reconoce e interacta con la secuencia DSE rica en GU/U que se
encuentra ro abajo del sitio de corte y la subunidad 77 kDa interacta con el complejo
CPSF estabilizando el complejo ternario CPSF-CstF-RNA (Colgan y col., 1997; Wahle y
col., 1999; Zhao y col., 1999; Li y col., 2001; Ryan y col., 2004). Existen reportes que
demuestran que CstF-64 tambin participa en el proceso de splicing en Caenorhabditis
elegans (Evans y col., 2001)
2.4.3 Factores de Corte (CFIm y CFIIm)

Existen dos complejos de corte (Cleavage Factor o CF, por sus siglas en ingls),
los cuales son los principales responsables de la reaccin de corte. El CFIm est
formado por cuatro subunidades de 25, 59, 68 y 72 kDa, de las cuales se sabe que los
polipptidos 25 kDa y 68 kDa participan en la reaccin de corte. La subunidad de 25
kDa se une al RNA cerca del sitio de corte e interacta con la subunidad CFIm-68, PAP
y la protena de unin a la Poli (A) (PABP II: poly(A) binding protein II, por sus siglas en
ingls) (Dettwiler 2004). La funcin exacta del CFIIm no se reconoce, pero se sabe que
est formado por dos protenas denominadas CIP 1 y Pcf II, que se reclutan y participan
en el corte del extremo 3 (Wahle y col., 1999). CIP 1 interacta con CFIm-25 y CPSF100 (Vries y col., 2000). Los factores CFIm y CFIIm tienen una actividad de
endonucleasa, al igual que el factor CPSF-73 (Ryan y col., 2004)
41
2.4.4 Poli (A) polimerasa (PAP)

La Poli (A) polimerasa es la enzima que sintetiza del tracto de poli (A), pero
tambin participa en la reaccin de corte mediante su interaccin con el complejo
CPSF. Es probablemente la protena mejor estudiada y conocida de la maquinaria del
procesamiento del extremo 3. Es un polipptido monomrico que presenta diferentes
isoformas debido a un splicing diferencial. La forma activa en mamferos tiene un peso
molecular alrededor de 80 kDa (Wahle y col., 1999). De las isoformas enzimticamente
activas se encuentran la PAP I, PAP II y PAP IV (Zhao y Manley, 1996), de las cuales la
ms predominante es la PAP II. Sobre esta protena se hablar ampliamente ms
adelante.
2.4.5 Protena de unin al tracto de poli (A) II (PABP II)

La PABP II es monomrica con un peso molecular de 33 kDa (Wahle, 1995) y
presenta una alta afinidad por el tracto de poli (A). Cuando el tracto de poli (A)
comienza a ser sintetizado, la PABP II se une a l formando un multicomplejo con
CPSF y PAP, estabilizando as a la PAP en extremo 3 del RNA, lo que facilita la
agregacin de adeninas permitiendo que el proceso sea ms rpido (Bienroth y col.,
1993). La PABP II tambin participa estimulando la traduccin de los RNAm, mediante
la interaccin con algunos factores de la traduccin tales como el eIF4.
2.4.6 Protenas adicionales

Recientemente se han identificado otras protenas que tambin participan en
este procesamiento las cuales incluyen la Symplekina, Rrbp6, PNAS-120 y PC4, de las
42
cuales se sabe que tambin participan como coactivadores del la RNA polimerasa II en
humano.
En S. cerevisiae, se han identificado protenas homlogas a estos factores. El

complejo CPSF (160, 100, 73 y 30kDa) de mamferos, se encuentra representado en
levadura
por
las
protenas
Cft1p/Yhh1p,
Cft2p/Ydh1p,
Brr5/Ysh1p
Yth1p,
respectivamente (Zhao y col., 1999). Existe un homlogo de PAP y FIP 1 denominados

pap1 y fip 1 respectivamente, adems de otra protena identificada como Ptalp que en
humano se le conoce como Symplekina, las cuales no se han caracterizado en la
levadura. En levadura slo se identifican dos protenas homlogas al complejo CstF 77
y 64 de humano, conocidos como RNA14 y RNA15; mientras que la subunidad 50 kDa
del CstF de mamfero no tiene una protena homloga en S. cerevisiae. No se han
encontrado protenas homlogas al complejo CF Im (25, 59, 68 y 72 kDa) pero s al CF
IIm, las cuales son Clp1 y Pcf II, adems de otras protenas adicionales como son Hrp
1, Mpe I, Ssu 72 y Sub1, de las cuales no se sabe exactamente su funcin en la
reaccin de corte y poliadenilacin. Las protenas Mpe I, Ssu 72 y Sub1 son homlogas
a las protenas de mamfero Rrb6, PNAS-120 y PC4 respectivamente.
2. 5 Mecanismo de corte y poliadenilacin

La poliadenilacin es una reaccin en la que participan mltiples secuencias en
cis y protenas, las cuales son requeridas para la reaccin de corte de pre-RNAm y la
adicin de adeninas en eucariontes. A continuacin se descibe el mecanismo de corte y
poliadenilacin del pre-RNAm.
43
2.5.1 Corte del pre-RNAm

La subunidad de 160 kDa del CPSF se une a la seal de poliadenilacin
AAUAAA del 3 UTR del pre-RNAm. Por otro lado el factor CstF-64 identifica la
secuencia DSE rica en GU, que se encuentra ro abajo de la seal de poliadenilacin.
El CstF interacta con el CPSF-160 por medio de la subunidad de 77 kDa del CstF,
provocando un cambio conformacional del extremo 3 del pre-RNAm, formndose un
complejo ternario estable (CPSF-CstF-RNA), al cual se une la PAP, interactuando con
el CPSF y FIP 1. PAP interacta tambin con el CFIm-25 que se une al sitio de
poliadenilacin. El factor CF I m recluta al CF II m en donde CIP 1 interacta con CFIm25 y CPSF-100. CPSF interacta con el CTD (dominio carboxi- terminal carboxy
terminal domain, por sus siglas en ingls) de la RNA pol II estableciendo una relacin
funcional entre el procesamiento del 3 y la terminacin de la transcripcin (Steinmetz,
1997). Una vez reclutada toda la maquinaria, se realiza el corte del RNAm. El CstF y los
factores de corte CF I m y CF II m, junto con el fragmento de RNA donde se encuentra
la secuencia rica en GU se liberan, dejando una molcula de RNA con un extremo 3
OH libre en donde se inicia la sntesis de la cola de poli (A) (Fig. 5). El fragmento de
RNA liberado es degradado con rapidez.
El procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm est estrechamente relacionado

al inicio y terminacin de la transcripcin. Se ha demostrado que el complejo CPSF-160
es reclutado por el factor de transcripcin TFIID formando un complejo estable con ste
al inicio de la transcripcin. Posteriormente, durante la elongacin se transfiere al CTD
de la RNA po II, que se encuentra hiperfosforilado, y permanece unido a ste durante la
transcripcin (Dantonel y col., 1997). Existen reportes de que CstF tambin se asocia al
44
Figura 5. Esquema del reclutamiento de los factores involucrados en la reaccin de

corte del pre-RNAm en mamferos. CPSF reconoce a la seal de poliadenilacin por la
subunidad de 160 kDa, CstF reconoce la regin rica en G y U ro abajo del sitio de corte
por su subunidad de 64 kDa, e interactan ambas por la subunidad de 77 kDa del CstF,
reclutando a los factores de corte I y II (CFI y CFII), a PAP, a FIP entre otras.
45
RN
Po A
lI
I
CPSF
160
STOP
5
AAUAAA
CT
D
30 K
77K
64 K
50 K
rica G/U
CstF
73K
PAP
FIP1
100 K
25
CIP1
72
CA
68
Sitio de
corte
59
CF I
PcfII
CF II
46
CTD (McCracken y col., 1997). Cuando la RNA pol II identifica la seal poliadenilacin
AAUAAA en el pre-RNAm que se est sintetizando, existen dos posibles mecanismos
de cmo participa este factor en el procesamiento del extremo 3 (Li y col., 2001):
1) CPSF y CstF se disocian del CTD y se unen a las secuencias AAUAA y DSE
rica en GU del RNAm, respectivamente, para iniciar el corte del extremo 3
(Dantonel y col., 1997; McCracken y col., 1997) bien
2) CPSF y CstF permanecen asociados con el CTD, ya que ste tambin
participa en el corte del extremo 3 (Hirose y Manley, 1998)
2.5.2 Poliadenilacin
Inmediatamente despus del corte se inicia la poliadenilacin, donde la protena
PAP que contina unida al CPSF, comienza a agregar adeninas en el extremo 3. La
adicin de los primeros 10 residuos de adeninas se lleva a cabo con lentitud, a partir de
la cual le sigue una polimerizacin rpida de hasta 250 residuos de adenosina extras.
(Zhao y col., 1999). Tambin es necesaria la PABP II que se une a la cola de adeninas,
formando un complejo cuaternario junto con las protenas CPSF, PAP y el sustrato de
RNA. Esta protena estabiliza la unin de PAP al RNA en el extremo 3 y da soporte a
la sntesis de la cola de poli(A), al unirse a 10 adeninas del tracto recin sintetizado.
Adems de que facilita la agregacin de adeninas, permitiendo que sea ms rpida
(Bienroth y col., 1993) (Fig. 6). El RNAm maduro sale del ncleo ayudado por las
protenas que interactan con el cap del extremo 5 y la cola de poli (A) que son las
47
Figura 6. Diagrama esquemtico que muestra las protenas que participan en la

reaccin de poliadenilacin. La PAP sintetiza el tracto de poli (A) y su actividad es
estimulada por interacciones con las protenas CSPF, CFIIm25 y PABP II. La protena
PAPB II forma un complejo cuaternario con CPSF, PAP y el RNA para estabilizar a la
PAP, adems de que protege el tracto de poli (A) recin sintetizado.
48
CPSF
160
30 K AAUAAA
STOP
PAB
100 K
P1
CI
PAP
II
73K
I
fI
Pc
II
A
AA
AA
AA
AA
AA
AA
CF
160
PAB
PAP
II
AA
AA
A
A
AA
A
A
AA
A
A
AAA
AAA
A
AAAAAA
A
A
AAAAAA
A AAA
49
encargadas del transporte del RNAm y guiarlo hacia el citoplasma para ser identificado
por los ribosomas y ser traducido a protenas. Una vez que el RNAm se encuentra en
citoplasma y es traducido, comienza a ser degradado progresivamente por medio de
ribonucleasas especficas. Este proceso lo podemos dividir en tres fases principales:
1) El tracto de poli(A) se corta progresivamente por deadenilasas especficas como

Caf 1, POP2 y PAN, las cuales van eliminando las adeninas del tracto hasta
dejarlo aproximadamente en 10 adeninas, que es el mnimo necesario para que
se una la molcula de PABP II.
2) El decapping del extremo 5, que es un proceso en donde es removida la
estructura cap (m7GpppG) del extremo 5 por medio de la hidrlisis de la unin
del trifosfato mediante la enzima , y
3) Finalmente el RNAm es degradado por actividades de exonucleasa en direccin
53 y 35.
2.6 Readenilacin citoplsmica

La regulacin de la estabilidad, traduccin y localizacin del RNAm es esencial
en el desarrollo, crecimiento celular, homeostasis y plasticidad neuronal. La cola de
poli(A) en el extremo 3 del RNAm es clave para el control de la estabilidad y traduccin
del RNAm. Cuando la cola de poli(A) se acorta en el citoplasma, la traduccin se
detiene y el RNAm se degrada, con lo que se puede afirmar que la estabilidad del
RNAm y la activacin de la traduccin dependen de la longitud del tracto de poli(A)
(Kwan 2004). Todos los RNAm salen del ncleo con un tracto de poli(A) aproximado de
50
150-200 adeninas, el cual se va perdiendo por la accin de ribonucleasas, las cuales

eliminan las adeninas en una direccin 35. Es en este momento, en que algunos
RNAm pueden alargar su tracto de poli(A) estando en el citoplasma, proceso conocido
como readenilacin citoplsmica (Dreyfus y Regnier, 2002). Se ha reportado la
existencia de diversas Poli(A) polimerasas citoplsmicas (PAPc) diferentes en
secuencia a la PAP nuclear, que catalizan la readenilacin de los mRNAs para que su
eficiencia de traduccin sea mayor. Las PAPc comparten la misma funcin, aunque
requieren de otras seales en el extremo 3 del RNAm.
Las PAPc son una familia reciente de polimerasas que se descubri

primeramente en Schizosaccharomyces pombe y en Caenorhabditis elegans. Difieren
de las PAPs principalmente en su secuencia y en su estructura, sin embargo tienen la
misma funcin. Fueron identificadas y llamadas GLD-2 ya que estaban involucradas en
el desarrollo y en embriognesis, de ah se deriva el nombre de GLD (Germline
development, por sus siglas en ingls). Se ha reportado que GLD-2 posee una baja
actividad de poli (A) polimerasa, y que necesita de otra protena que es GLD-3, que
pertenece a la familia de protenas de unin a RNA (Wang 2002). Mientras que la PAP
nuclear es monomrica, GLD-2 requiere de una protena de unin a RNA para realizar
su funcin. Recientemente, se han descrito una poli (A) polimerasa citoplsmica
homloga en humano conocida como Hs1 o hGLD-2, que se estudi en ovocitos de X.
laevis la cual no contiene el extremo C-terminal y que funciona como una poli (A)
polimerasa citoplsmica, aunque se cree que tambin participe como un estimulador de
51
la traduccin. Adems se han encontrado transcriptos de esta protena en la mayora de

los tejidos (Kwak y col., 2004).
Se ha demostrado que puede tambin existir readenilacin del RNAm en el

citoplasma en X. laevis y en Drosophila melanogaster (Dickson y col., 2001, Wickens,
1990; Richter, 1999; Juge 2002). Las enzimas involucradas se conocen como GLD-2 y
GLD-3 (Kwak y col., 2004; Keller y Martin, 2002), en donde participa la seal AAUAAA y
una seal cercana a est, rica en U y que se encuentra ro arriba, llamada elemento de
poliadenilacin citoplsmica; CPE (ver pag. 18); adems de los factores CPSF, PAP y
CPEB o protena de unin al CPE (cytoplasmic polyadenylation element binding, por
sus siglas en ingls). Al ser reunidas las secuencias AAUAAA y CPE por CPSF y CPEB
respectivamente, reclutan a la PAPc para iniciar la readenilacin del RNAm.
2.7 Importancia de la cola de poli(A) del RNAm

En las clulas animales, todos los RNA mensajeros excepto los de las histonas
poseen una cola de poli (A) en el extremo 3. Las funciones propuestas de esta cola
incluyen: promover la eficiencia de la transcripcin del RNA, en el transporte del mRNA
del ncleo al citoplasma y conferir estabilidad al mRNA. Los defectos en la formacin de
la cola de poli (A) pueden alterar profundamente la viabilidad, el crecimiento y el
desarrollo de la clula alterada. (Zhao y col., 1999). La vida media del RNAm depende
de su estabilidad, dada por el tracto o cola de poli(A) en el extremo 3 y por la estructura
cap en el extremo 5. La formacin del extremo 3 del RNAm es la clave en la expresin
de muchos genes y en algunos casos, una poliadenilacin aberrante lleva a una
enfermedad.
52
2.8 Poli(A) polimerasa

2.8.1 Generalidades
La PAP es un regulador postranscripcional de la expresin gentica, ya que al
sintetizar el tracto de poli(A) le da estabilidad el RNAm y permite que la traduccin del
RNAm sea ms eficiente. El peso molecular de la PAP en diferentes especies va desde
70 hasta106 kDa. La PAP de humano es un polipptido con una masa molecular de 84
kDa (Raabe y Manely, 1991; Wahle y col., 1991), la cual presenta mltiples sitios de
fosforilacin en su extremo amino (Raabe y Manley, 1994). En eucariontes, 2/3 partes
del extremo amino es altamente conservado y contiene un dominio cataltico homlogo
al de la familia de las nucleotidiltransferasas, el cual se caracteriza por presentar tres
residuos de aspartato (D) conservados en las posiciones 113, 115 y 167 en la PAP de
bovino. Un dominio de unin al RNA, est localizado entre los nucletidos 488 y 508, en
el extremo carboxi-terminal, el cual se traslapa a la seal de localizacin nuclear (NSL1)
que se localiza entre los nucletidos 493 y 538. A 140 nucletidos ro debajo de esta
NLS1, se encuentra la segunda seal NSL2. A partir de la seal NLS1, hasta el extremo
carboxil, es un segmento rico en serina y treonina, los cuales permiten mltiples
fosforilaciones las cuales regulan la actividad de la PAP (Fig. 7 y 8).
La PAP ha sido identificada en diversos eucariontes como levadura, humano,

ratn, bovino, rana y gallina y se han observado mltiples isoformas. Los mecanismos
moleculares que generan estas isoformas an no son completamente entendidos, sin
embargo, se sabe que la fosforilacin y el splicing alternativo contribuyen a que existan
PAPs con diversos pesos moleculares (Kyriakopoulou y col., 2001). La generacin de
diferentes isoformas, se lleva a cabo al menos, por tres mecanismos distintos:
53
Figura 7. Estructura molecular de la poli (A) polimerasa II de humano. PAP II est

formada por 689 aa, con un dominio central cataltico conservado donde se realiza la
transferencia de nucletidos e interaccin con el ATP y un dominio de unin a RNA, que
presenta 2 seales de localizacin nuclear (por sus siglas en ingls NLS). Adems
presenta varios posibles sitios de fosforilacin por las cinasas CK2 y cAMP.
54
Dominio
central cataltico
Dominio de
unin al RNA
HsPAP
689 aa
F/YGS DD
CK2 CK2
cAMP
NLS1
NLS2
55
Figura 8. Diagrama tridimensional de la estructura cristalina de la poli(A) polimerasa de

bovino. En naranja se localiza el dominio cataltico (aa 60-173); en azul el dominio
central y en morado el dominio terminal de unin al RNA. En magenta se seala la
molcula de ATP interactuando con el sitio cataltico.
56
57
duplicacin
gnica,
procesamiento
alternativo
de
RNA
modificaciones
postranscripcionales. Con esto, podra parecer razonable la hiptesis de que diferentes

PAPs son responsables de diferentes funciones in vivo, ya que la PAP participa en el
corte de pre-RNAm, dependiente o independiente de la seal de poliadenilacin
AAUAAA y en la sntesis de la cola de poli(A). De estas isoformas, la ms abundante en
mamferos es la PAP II o , sin embargo existen otras como la PAP que presenta las
mismas caractersticas que la PAP II nuclear de 90 kDa, incluyendo la interaccin que
tiene con la protena U1A (Kyriakopoulou 2001).
Se ha reportado que existe una expresin diferencial de la PAP II durante el

desarrollo y de manera tejido especfica, as como en diferentes lneas celulares, por
ejemplo en extractos nucleares (EN) de clulas HeLa se han encontrado tres isoformas
con aparentes masas moleculares de 90, 100 y 106 kDa (Thuresson y col., 1993;
Kyriakopoulou 2001). Otro ejemplo es una nueva isoforma de la poli (A) polimerasa
conocida como TPAP (Testis-specific poly(A) polymerase, por sus siglas en ingls), la
cual se presenta especficamente en el citoplasma de clulas espermatognicas.
Presenta un peso molecular de 70 kDa y una identidad del 86% con respecto a la PAP
II (Kashiwabara 2000). Adems, se ha identificado otra PAP, la Neo-Poli(A) polimerasa
la cual presenta una masa molecular de 82.8 kDa y 71% de homologa con la PAPII de
humano, y que es sobreexpresada en tumores humanos (la Neo Poli(A) polimerasa). La
Neo PAP es una enzima importante en el procesamiento del RNA, pero que es
regulada de una manera distinta a la utilizada por la PAP (Topalian y col., 2001), lo que
sugiere que algunas isoformas de PAP son restringidas o caractersticas con ciertas
58
etapas de desarrollo o tejidos. Recientemente se identific una PAP mitocondrial, con

un peso de 65-68 kDa y que participa en la sntesis del tracto de poli(A) de los RNAm
mitocondriales, aunque se observ que este tracto no participa en la estabilidad de los
RNAm mitocondriales (Tomecki 2004). En S. cerevisiae tambin se ha identificado una
PAP nuclear (Zhelkovsky 1995; Bard 2000), la cual presenta una masa molecular de
63 kDa (Linger 1991). Al ser comparada con la PAP de mamferos se observ que la
regin carboxi-terminal no es conservada mientras que los primeros 400 aa son
idnticos en un 47%. Se ha demostrado que la Pap1 no es requerida en el proceso del
corte del pre-RNAm, sin embargo es reclutada aparentemente para reconocer el sitio de
poliadenilacin (Zhao 1999)
2.8.2 Participacin de la PAP en el splicing del pre-RNAm

La PAP no slo participa en la poliadenilacin, sino tambin en otros eventos del
procesamiento del pre-RNAm, como lo es el splicing. La maquinaria basal de
poliadenilacin no contiene snRNPs, sin embargo, existen evidencias en las que se
sugiere que el splicing y la poliadenilacin estn ligados, estableciendo un enlace
funcional entre ellos. Por ejemplo, una seal funcional de poliadenilacin, puede facilitar
el splicing del extremo 5 terminal del intrn in vivo. Adems, en estudios recientes se
sugiere que los factores de splicing pueden actuar como auxiliares en la seleccin del
sitio de poli(A) (Colgan, 1997)
El mejor ejemplo estudiado de cmo una protena del spliceosoma influye en la

poliadenilacin es la protena U1 snRNP A (U1A). El pre-RNAm de la protena U1A
contiene una secuencia ro arriba del sitio de poliadenilacin, la cual es un sitio de unin
59
a U1A, de esta forma, el RNAm de U1A es autorregulado negativamente cuando dos

molculas de U1A se unen al pre-RNAm de U1A, dando como resultado una inhibicin
de la poliadenilacin (Boelens
1993). Al examinar esta reaccin por separado, se
determin que la unin de U1A no afecta al proceso de corte, sin embargo la

poliadenilacin se inhibe, sugiriendo que existe una relacin directa entre U1A y PAP,
algo que se haba propuesto anteriormente en un estudio realizado en EN de hepatoma
(Raju y Jacob, 1988). Existen estudios en donde se demostr que el extremo carboxiterminal de la PAP, incrementa la eficiencia de la protena U2AF 65, que participa en el
proceso de splicing, estimulando y facilitando su unin al intrn, ya que en el extremo
carboxi-terminal de PAP interacta con los residuos 17-47 de U2AF 65 (Vagner 2000).
Otro estudio reporta que la protena U2AF participa en el control de la longitud del tracto
de poli (A) (Gu y Schoenberg, 2003)
2.9
Poli (A) polimerasa en el ciclo celular
2.9.1 Generalidades del ciclo celular

El concepto de ciclo celular naci con el estudio de cultivos in vitro de clulas que
se dividen a intervalos regulares, en donde una clula madre da origen a dos clulas
hijas, cada clula hija se desarrolla y sufre posteriormente un nuevo proceso de divisin
para originar dos clulas idnticas dando con esto un fenmeno, llamado ciclo celular,
ya que estos procesos se repiten en cada generacin (Murray y col, 1993).
Originalmente se crea que el ciclo celular estaba compuesto por dos fases, las cuales
son la interfase y la divisin celular propiamente dicha o mitosis; sin embargo, se
observ que en algn momento en la interfase se duplicaba el DNA nuclear, para que
se divida en forma equitativa entre las clulas hijas. Actualmente sabemos que la
60
interfase se ha dividido en 3 fases denominadas: G1, S, y G2 (Fig. 9) (Murray y col,

1993; Lodish y col, 2002, Karp, 1996)
G1: (Intervalo 1 o Gap 1 en ingls) es el intervalo que va de la etapa final de la

mitosis hasta el inicio de la fase S. En este periodo, las clulas pueden permanecer
estacionadas, o prepararse para entrar en la fase S para iniciar el proceso de divisin.
S: (Sntesis) es la etapa en donde el DNA se duplica para poder obtener dos

ncleos con la misma informacin gentica que el ncleo de la clula madre.
G2: (Intervalo 2 o Gap 2 en ingls) es el tiempo que transcurre entre el final de la

sntesis del DNA y el inicio de la mitosis. Durante esta etapa la clula contiene el doble
de la cantidad de DNA presente en la clula original. Le provee a la clula un lapso
durante el cual actan mecanismos de seguridad para controlar si las molculas de
DNA se replicaron correctamente. A esta fase, tambin se le conoce como etapa de
crecimiento (Growing) ya que aumenta su tamao para dividirse.
M: (mitosis) es la etapa del ciclo celular donde se realiza la divisin celular y

tanto el citoplasma, como el material gentico se dividen equitativamente. En el
citoplasma, se forma el huso mittico, que est compuesto por microtbulos y es un
sistema generador de fuerzas que controla la posicin de los cromosomas y su
distribucin en las clulas hijas. Los microtbulos se implantan en los centrmeros. La
divisin del citoplasma de manera equitativa se conoce como citocinesis. En esta etapa,
la sntesis de DNA y RNA se interrumpen casi totalmente. Esta fase, a su vez se divide
61
en cuatro fases: profase, metafase, anafase y telofase. La profase es el primer estadio

de la mitosis, en donde la cromatina se condensa, la membrana nuclear se disuelve, los
centrolos (si se encuentran presentes) se dividen y los pares migran a los polos, se
forma el cinetocoro y las fibras de ste, adems se forma el huso mittico. En la
metafase, los cromosomas migran al ecuador de la clula donde las fibras del huso se
"pegan" a las fibras del cinetocoro. En la anafase se inicia la separacin de los
centrmeros y el arrastre de los cromosomas a los polos opuestos y por ltimo, la
telofase en la cual los cromosomas llegan a los polos de sus respectivos husos
mitticos, la membrana nuclear se reconstituye, los cromosomas se desenrollan para
formar la cromatina y el nucleolo, que desapareci en la profase se vuelve a constituir.
Donde antes haba una clula ahora existen dos pequeas con exactamente la misma
informacin gentica. Estas clulas pueden luego diferenciarse durante el desarrollo
(Lodish y col, 2002, Earnsshaw y col, 1994).
2.9.2 Mecanismos de regulacin del ciclo celular

Hay mecanismos especializados para coordinar los procesos de divisin en el
ncleo y en el citoplasma y determinar el inicio y el fin de las fases del ciclo celular. En
esta regulacin participan varias protenas: las ciclinas y las cinasas dependientes de
ciclinas (cdc o cdk por sus siglas en ingls de cyclin dependent of kinases). En
mamferos, la regulacin de este ciclo se inicia con una protena conocida como Rb, la
cual se encuentra unida al factor de transcripcin E2F. Las cdk 4 y 6, se unen a la
ciclina D para activarla. Cuando se activa la ciclina D en la fase G1, fosforila a Rb la
cual libera el factor de transcripcin E2F, que activa la expresin gentica como de los
genes que codifican para la cdk2 y las ciclinas A y E, en la fase G1 del ciclo celular. Al
62
expresarse esta la cdk2, se une a la ciclina E y la activa, y contina fosforilando a Rb,

durante la fase G1 y al inicio de la fase S. En la fase S, la cdk2 se une a la ciclina A,
inactivando a la ciclina E, la cual desfosforila a Rb que se une nuevamente al factor
E2F; la ciclina A/cdk2 se mantiene activa toda la fase de S y parte de la fase G2. Al
finalizar la fase G2, la ciclina A/cdk 2 disminuye mientras que al inicio de la fase M
aumenta la ciclina B/cdk2 y se mantiene activa durante toda la fase (Downes y col,
1994; Morgan, 1997; Lodish, 2002)(Fig. 9).
2.9.3 Papel de la PAP en el ciclo celular

En X. laevis se ha observado que la poli (A) polimerasa se hiperfosforila por la
ciclina B durante la fase M del ciclo celular, lo que causa una inactivacin de la misma
(Colgan et al., 1996). Por otra parte se sabe, que durante la fase M en el ciclo celular, la
sntesis de protenas disminuye y que la longitud de los tractos de poli (A) del RNAm
tambin disminuyen. Por lo anterior, se propone que la poli (A) polimerasa inhibe la
expresin gentica durante la mitosis, es decir cuando la p34cdc2/ciclina B, que es el
regulador de la fase M, hiperfosforila a la poli (A) polimerasa, sta se inactiva en esa
misma fase, lo que va a generar RNAm poli (A-) y esto a su vez lleva a una traduccin
ineficiente y por lo tanto a un silenciamiento en la expresin gentica (Colgan et al.,
1998).
De acuerdo con estos trabajos se puede hacer la interrogante de que en otros

organismos suceda algo similar; al inactivarse la poli (A) polimerasa, se inhibe la
expresin gentica en la fase M y que probablemente cambios en la expresin del
63
Figura 9. Etapas del ciclo celular en eucariontes y su regulacin. La ciclina D/cdk4 o 6,

fosforila a Rb que se encuentra unido al factor de transcripcin E2F y lo libera. La
transcripcin de la ciclina E y de cdk 2, permite que Rb contine fosforilada. En la fase
S, se activa la ciclina A/cdk2 e inactiva a la ciclina E/cdk2, que desfosforila a Rb y se
une nuevamente a E2F. Al entrar en la fase M, se activa la ciclina B/cdk2 y se inactiva
la ciclina A/cdk2.
64
Ciclina B
Ciclina D
Cdk 2
Cdk 4, 6
E2F Rb
E2F
Rb
Ciclina A
Ciclina E
Cdk 2
Cdk 2
65
RNAm del gen de la PAP durante la fase M del ciclo celular puedan tambin generar
este fenmeno.
2.10 Identificacin de las posibles secuencias en cis que participan en el

El procesamiento del extremo 3 terminal en E. histolytica, es poco conocido. La
informacin obtenida del proyecto del genoma de E. histolytica (Loftus 2005), ofrece
nuevas aproximaciones experimentales en el estudio de la expresin gentica y facilita
la determinacin completa de los genes involucrados en el metabolismo del RNA. En un
anlisis in silico Lpez-Camarillo y col (2005) alinearon 320 nt (donde 240 nt
corresponden a la 3 UTR) de 50 diferentes secuencias genmicas, y se observ que
las 3UTR estn constituidas por una alta cantidad de los nucletidos AT (80%) y hay
una alta frecuencia de Ts en los primeros 10-50 nt de las 3UTR. Se identific la seal
de poliadenilacin, UA(A/U)UU, en un 65% de los genes y en 8% de ellos, esta
secuencia incluye el codon de paro (Fig. 10). Tambin se identificaron dos regiones
ricas en U, una localizada de 1-30 nt ro abajo del sitio de poliadenilacin y la otra a 330 nt ro arriba de sitio de poliadenilacin; se sugiere que el 35% de los genes del
parsito que no presentan esta secuencia puedan usar otras secuencias regulatorias
diferentes para este procesamiento.
Todo lo anterior demuestra que existen cuatro secuencias cis-reguladoras del

procesamiento del 3UTR del pre-RNAm en E. histolytica (Fig. 11), las cuales son:
66
Figura 10. Representacin del alineamiento mltiple de 8 secuencias genmicas

(gDNA) y de cDNA de genes de E. histolytica. Se muestran las seales de
poliadenilacin (cajas amarillas), asterisco indica los nucleotidos que no coinciden con
la secuencia consenso de poliadenilacin, en negrita se muestran el sitio de corte y
poliadenilacin y subrayadas las regiones ricas en U.
67
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
68
Figura 11. Esquema de las secuencias cis-reguladoras del procesamiento del preRNAm en E. histolytica. La seal de poliadenilacin se localiza de 10-30 nt ro arriba del
sitio de corte y poliadenilacin. Se localizan 2 secuencias ricas en U, una est
localizada ro arriba del sitio de corte y la otra se encuentra de 3-30 nt ro abajo del sitio
de corte. El codn de paro (TAA) est remarcado (lnea superior roja)
69
Codn
de paro
variable
pre-RNAm
UAAUU
UA(A/U)UU
Seal de
poliadenilacin
10-30 nt
3-30 nt
Rica en
N
U
Rica en
U
Sitio de
poliadenilacin
70
1)
Una seal del sitio de poliadenilacin (UA(A/U)UU)
o con alguna
variante, localizada de 10-30 nt ro arriba del sitio de poliadenilacin

2)
Una regin rica en U localizada de 1-30 nt ro arriba del sitio de

poliadenilacin
3)
El sitio de poliadenilacin, sin una secuencia consenso conocida
4)
Un elemento rico en U localizado 3-30 nt ro abajo al sitio de

poliadenilacin
Estas secuencias difieren de las descritas en mamferos y levaduras, por lo que

podra ser un modelo adecuado de estudio de los cambios evolutivos en las secuencias
de reconocimiento en el procesamiento del 3 UTR del pre-RNAm
2. 10. 1 Identificacin de protenas involucradas en el procesamiento del

extremo 3 del pre-RNAm en E. histolytica
En una bsqueda de la maquinaria que participa en el procesamiento del
extremo 3 del pre-RNAm en diferentes organismos y al compararlas entre ellos, se
observ que en E. histolytica existen protenas homlogas a la mayora de los factores
identificados en humano y en levadura. Se encontraron homlogos al CPSF-160,
CPSF-100, CPSF-73, CPSF-30, PAP, FIP 1, CstF 77, CstF 64, CstF 50, CstF 25, Cip 1,
Pcf II; adems de Rrbp6, PNAS-120 y PC4 que han sido identificadas recientemente
en humano. No se identificaron homlogos a las protenas de humano symplekina,
CFIm 59, CFIm 68 ni CFIm 72; pero se identific la protena Pfs2, homloga a Pfsp de
S. cerevisiae (Tabla 2) (Lpez-Camarillo y col., 2005). Adems, se propone que el
71
72
Protena
Nmero
de acceso b
Valor E
Prote na
Nmero
de acceso b
Valor E
miento del extremo 3 de E. histolytica , Homo sapiens y S. cerevisiae
nd: no determinado
a TIGR Banco de informaci n del proyecto de secuenciaci n genmica de la E. histolytica
b Banco de datos Swiss -Prot/TrEMBL
c Participaci n en el procesamiento del extremo 3 terminal del pre -RNAm no ha sido estudiado experiementalmente
experiemntalmente
Protena
Tabla 2 . Tabla comparativa de los factores que participan en el procesa
procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm en E. histolytica, sea semejante al de

mamferos, ya que presenta una gran homologa con las protenas requeridas por stos
(Fig.12).
2.10.2 Papel de la poliadenilacin en el fenotipo de resistencia a mltiples

frmacos en E. histolytica
En un estudio a nivel postranscripcional realizado en E. histolytica (Lpez
Camarillo y col., 2003), en los trofozoitos de la clona C2 mutante que presenta el
fenotipo de resistencia a mltiples frmacos (MDR), se observ que la vida media del
RNAm del gen EhPgp5 es mayor en los trofozotos de la clona C2 mutante crecidos en
altas concentraciones de emetina, donde la vida media del RNAm del gen EhPgp5
obtenido de la clona C2 es 2.1 horas, en la clona C2 crecida a una concentracin de 90
M de emetina fue de 3.1 horas, mientras que en la clona C2 crecida a 225 M de
emetina fue de 7.8 horas (Lpez-Camarillo y col., 2003). Tambin se demostr que la
longitud del tracto de poli (A) del RNAm del gen EhPgp5 aument en los trofozotos de
la clona C2 (225), sugiriendo que la actividad de la PAP es la responsable del aumento
de la longitud del tracto de poli (A) y la estabilidad del RNAm del gen EhPgp5. Estos
datos muestran que la PAP es un regulador importante de la estabilidad del los RNAm,
por lo que su estudio ayudara en el entendimiento de los mecanismos moleculares que
regulan la expresin gnica a nivel postranscripcional.
73
Figura 12. Modelo de la maquinaria del procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm E.
histolytica. (A) Reconocimento de la seal de poliadenilacin por medio del CPSF, PAP
y Fip1. (B) EhCstF se une a la secuencia rica en U, localizada ro abajo del sitio de
poliadenilacin y se une a la subunidad 160 del CPSF. Los factores de corte CFIm y
CFIIm reconocen el sitio de poliadenilacin y realizan el corte. (C) Despus del corte,
PAP se une al CPSF para sintetizar la cola de poli (A). Las interacciones entre estas
protenas y el RNA son hipotticas.
74
rica U
Seal de
poliadenilacin
rica U
Sitio de poli (A)
rica U
Sitio de
corte
rica U
rica U
rica U
Degradacin
Lpez-Camarillo et al., 2005
75
JUSTIFICACION
En eucariontes se sabe que el procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm es un
evento importante dentro de la regulacin de la expresin de diferentes genes,

incluyendo genes involucrados en virulencia y resistencia a drogas de diversos
patgenos, ya que de esto depende la estabilidad del RNAm en el citoplasma y la
eficiencia de la traduccin. La formacin de la cola de poli (A) en el extremo 3 del
RNAm se ha estudiado en diferentes organismos eucariontes y se han identificado las
diferentes protenas que participan en este proceso. Entre ellos se encuentra la poli (A)
polimerasa (PAP) que es directamente responsable de la adicin de adeninas. Sin
embargo, la informacin que se tiene acerca del procesamiento y la estabilidad del
RNAm de los genes de E. histolytica es casi nula y aunque se sabe que se presenta un
control de la longitud del tracto de poli(A) en el extremo 3 del RNAm del gen EhPgp5,
se desconocen los mecanismos que lo regulan. El anlisis funcional y estructural de la
EhPAP nos permitir entender la reaccin de procesamiento y poliadenilacin del
mRNA en este parsito, as como analizar su importancia en el recambio del RNAm y
su papel en la regulacin de la expresin gentica durante el ciclo celular.
76
OBJETIVOS
4.1 Objetivo general

Caracterizar estructural y funcionalmente la poli(A) polimerasa EhPAP de
Entamoeba histolytica.
4.2 Objetivos especficos

1. Realizar un anlisis in silico de la secuencia de la EhPAP.
9 Bsqueda de secuencias similares a la EhPAP en las bases de
datos de protenas.
9 Relacin filogentica de la EhPAP con otras PAPs.
9 Determinacin de patrones y motivos conservados.
9 Prediccin de la estructura terciaria de la EhPAP.
2. Determinar el perfil de la expresin del mRNA del gen EhPap durante el

ciclo celular.
3. Subclonar el gen EhPap en un vector de expresin.
4. Expresar y purificar la protena EhPAP recombinante.
5. Generar anticuerpos policlonales especficos contra la EhPAP.
6. Determinar la localizacin subcelular de la EhPAP en trofozotos de E.

histolytica.
77
5.
MATERIALES Y METODOS
5.1 Estrategia Experimental

Para cumplir con los objetivos de este proyecto, seguimos la estrategia
experimental presentada en la Fig. 13
5.2 Anlisis in silico de la secuencia de aminocidos de la EhPAP

Tomando como referencia primaria la secuencia de la EhPAP (tesis Doctorado
Dr. Lpez-Camarillo), se hizo una bsqueda de secuencias similares en los bancos de
datos de la secuencia de PAPs de diferentes especies por medio del programa BLAST
2.0 (por sus siglas en ingls Basic Local Alignament Search Tool), que se encuentra en
el servidor en lnea de ExPASy Proteomics Server (por sus siglas en ingls Expert
Protein Analysis System) (http://www.expasy.org), el cual se especializa en el anlisis
protemico y que detecta regiones con similitudes presentes en otras protenas
reportadas en la base de datos.
Posteriormente se realiz un alineamiento mltiple de EhPAP con otras PAPs de

diferentes especies que presentaban mayor homologa entre ellas, las cuales fueron
obtenidas del BLAST usando el programa CLUSTALW. Para establecer los dominios
conservados entre las diferentes protenas se usaron los programas Prosite
(http://www.expasy.org) y Pfam (http://www.sanger.ac.uk) con los cuales se predijeron
los dominios funcionales y estructurales. Para realizar el rbol filogentico se us el
programa
Molecular
Evolutionary
Genetics
Analysis:
MEGA
(http://www.megasoftware.net). Primeramente se realiz un alineamiento mltiple con

las secuencias de las especies ms representativas de cada grupo: Vertebrados: H.
78
Figura 13. Estrategia experimental. La cual consiste en el anlisis in slico de la

secuencia obtenida de gen EhPap clonado en el vector TA. Subclonacin del gen
EhPap en un vector de expresin (pRSET-A), con el cual se transformaron bacterias
E.coli BL21 (DE3) pLysS para obtener la protena EhPAPr, que se purific para generar
anticuerpos especficos en ratones. Se obtuvieron extractos nucleares y citoplsmicos
de trofozotos de la clona A, que se analizaron por ensayos de Western blot con el
anticuerpo especfico para determinar su localizacin subcelular. Trofozoitos de la clona
L-6 fueron tratados con colchicina para obtener el RNA de cada fase, con el cual se
realizaron ensayos de RT-PCR para analizar la expresin del gen de EhPap.
79
TA-EhPAP
Secuenciacin
de la EhPAP
pRSET-EhPAP
Secuenciacin
Anlisis in silico de
la secuencia de protenas
Induccin de la expresin de
EhPAP recombinante en E. coli
Trofozotos de la clona
L6 sincronizados en el
ciclo celular
Purificacin de la
EhPAP recombinante
Trofozotos
clona A
Extraccin
RNA total
RT-PCR
Generacin de
anticuerpos en ratones
Extractos
nucleares y
citoplsmicas
Western
blot
80
sapiens, Invertebrados: C. elegans; Plantas:

Protozoarios: P. falciparum,
A. thaliana; Levaduras: S. cerevisiae;
y E. histolytica, usando el programa BIOEDIT
(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), y posteriormente se us el parmetro

de Neighbor-Joining (N-J) del programa MEGA.
Para predecir la estructura terciaria de la EhPAP se hizo una bsqueda de la

secuencia de la PAP de bovino, la cual se ha reportado su estructura en el PDB
(Protein Data Base, www.pdb.com) con la clave 1F5A y se tom como referencia para
compararla con la secuencia de la EhPAP usando el programa de Geno3D
(http://ww.pbil.ibcp.fr) que
predice la estructura terciaria y el programa Rasmol
(http://www.umass.edu/microbio/rasmol/getras.htm) que permite ver la estructura en un

plano tridimensional.

El gen EhPap se encontraba clonado en el vector TA Cloning Vector, pCR2.1,
diseado para clonar directamente productos amplificados por PCR con la enzima Taq
DNA polimerasa, la cual tiene la capacidad de agregar en el extremo 3 una cadena
sencilla de A (3-A) a los productos finales de PCR. El plsmido tiene una secuencia
con una cadena sencilla de T en el extremo 3 (3-T), lo cual permite que la ligacin
entre el producto de PCR y el plsmido sea altamente eficaz. Para expresar la protena
EhPAP recombinante fue necesario liberar el gen EhPap del vector TA, por restriccin
enzimtica para subclonarlo posteriormente en el vector de expresin pRSET T7
Expression Vector (Invitrogen) que est diseado para expresar un alto nivel de
protenas. El vector pRSET tiene 3 versiones: A, B, y C, las cuales poseen un sitio de
81
clonacin mltiple. El inserto se clona ro abajo del promotor T7 el cual se activa por
medio de la T7 RNA polimerasa, que es producida por las bacterias BL21(DE3) pLysS
en presencia de IPTG (isopropil -D-thiogalactoside) adems de producir la lisozima T7
que reduce la expresin basal del gen clonado. El inserto se clona en marco de lectura
abierta con una secuencia nucleotdica que codifica para un tracto de 6 histidinas
(6xHis tag) en el extremo NH2 de la protena recombinante. Este tracto de histidinas
funciona como un dominio de unin al metal Niquel y permite purificar posteriormente la
protena recombinante mediante cromatografa de afinidad. El vector pRSET contiene
genes de resistencia a antibiticos (ampicilina y cloranfenicol) que permiten la seleccin
de las bacterias que contienen el plsmido (Fig. 14).

Usando las enzimas de restriccin BamHI y HindIII (New England Biolabs) se
realiz la restriccin enzimtica para liberar el gen EhPap clonado en el vector TAEhPap y linearizar el vector pRSET-A, en presencia del amortiguador 2 que optimiza la
accin de ambas enzimas. Se realiz la mezcla con 1g de vector TA-EhPap, 2 l del
amortiguador 2 (10X), 1l de la enzima HindIII (20 U/l), 1l de la enzima BamHI (20
U/l), 1l de BSA, en un volumen total de 20 l. Para la restriccin del vector de
expresin se hizo una mezcla de 1 g de vector pRSET-A, 3 l del Buffer 2 (10X), 1l
de la enzima HindIII (20 U/l), 1l de la enzima BamHI (20 U/l), 1l de BSA, en un
volumen total de 30 l. Se hicieron 10 restricciones de TA-Ehpap y pRSET-A para tener
suficiente material purificado para hacer la ligacin. Las mezclas de restriccin
se
incubaron a 37C toda la noche. Para verificar la restriccin enzimtica,
82
Figura 14. Esquema del vector pRSET-A. Diseado para una alta expresin y
purificacin de protenas de genes clonados en bacterias E.coli, ya que presenta un
promotor T7 (PT7), un codon de inicio de la transcripcin (ATG), un tracto de
polihistidinas (6xHis), una secuencia del gen 10 del fago T7 estabilizador el transcrito
(Xpress epitope) un sitio de unin a ribosomas (RBS) y una secuencia de
reconocimiento del corte de enteroquinasa (EK por sus siglas en ingls), adems del
sitio de restriccin mltiple (MCS) y el codon de paro. Presenta adems un gen de
resistencia a antibiticos (ampicilina)
83
84
una alcuota de las reacciones se analiz mediante electroforesis en un gel de agarosa

al 1% en amortiguador TAE 1X (Tris-acetato 0.04 M, EDTA 0.001 M pH 8.0). El gel se
ti con bromuro de etidio (EtBr, 10 mg/ml) y se observ en un transiluminador de luz
UV (UV Transilluminator, UVP). Se cort la banda correspondiente al inserto EhPap
liberado y el vector pRSET-A linearizado en el gel y el DNA se purific por medio del kit
de Gene Clean II (Q-Bio gene), el cual permite purificar el DNA a travs de su unin a
perlas de slice en una alta concentracin y su elucin mediante intercambio inico en
bajas concentraciones de sal y calor. Los fragmentos del gel de agarosa que contienen
el DNA a purificar se pesaron y se incubaron con 3 volmenes de yoduro de sodio (NaI
4.5 M pH 6.0) en un tubo eppendorf. Se incub a 55C durante 5 min (o hasta que se
disolvi toda la agarosa). Se agregaron 5 l de la solucin de perlas (Glassmilk) y se
incub a 4C durante toda la noche. Se centrifug durante 1 min a 14,000 rpm (15,000
xg), desechando el sobrenadante. Se agregaron 500 l de solucin de lavado (New
Wash), se agit y centrifug a 14,000 rpm durante 1 min y se desech el sobrenadante.
Esto se repiti dos veces ms. Se dej secar la pastilla a 42C durante 1 hr (con la tapa
del eppendorf abierta). La pastilla se resuspendi en 10 l de agua de ampolleta y se
incub a 55C durante 10 min para eluir el DNA. Se centrifug a 15,000 x g durante 1
min y se recuper el sobrenadante que contiene el DNA, sin tocar las perlas,
guardndolo en un tubo eppendorf nuevo. Se tom una alcuota y se hizo una dilucin
1:10 para verificar la integridad del DNA purificado y estimar su concentracin mediante
electroforesis en un gel de agarosa al 1% en amortiguador TBE 1X (Tris-borato, Tris 90
mM, EDTA 2mM pH 8 y cido brico 90 mM). El gel se ti en una solucin de EtBr y
se observ en el transiluminador de luz UV.
85
5.3.2 Ligacin
Una vez que se obtuvo el gen EhPap y el plsmido pRSET-A cortados y
purificados, se realiz la ligacin. Se prepar la siguiente mezcla: 50 ng de plsmido
pRSET-A linearizado, 80 ng de inserto EhPap, 2 l de amortiguador 10X de la ligasa, 2
l de ligasa T4 (1U/l, Invitrogen) y 2l de agua, en un volumen final de 20 l. La
mezcla se incub durante toda la noche a una temperatura de 15C. Para comprobar
que hubo una correcta ligacin del gen EhPap en el plsmido pRSET-A, se
transformaron bacterias E. coli (DH5) competentes con la mezcla de ligacin y se
seleccionaron las clonas que crecieron en las placas de LB ampicilina. Finalmente, se
obtuvo el DNA plasmdico mediante minipreparaciones de DNA y se analiz la
presencia del inserto mediante restriccin enzimtica.
5.3.3 Preparacin de bacterias competentes congeladas

En este trabajo, utilizamos dos cepas de bacteria E. coli: DH5 y BL21 (DE3)
pLysS. Ambas permiten la replicacin de plsmidos, sin embargo las bacterias BL21
(DE3) pLysS producen la protena T7 RNA polimerasa la cual reconoce al promotor T7
del plsmido pRSET-A y lo activa, permitiendo altos niveles de expresin de protenas
recombinantes (Hanahan, 1985). Para obtener clulas competentes a la transformacin,
las bacterias se crecieron en cajas Petri con medio LB (Luria-Bertoni)-agar (5g de medio
LB, 3.75 g de agar selecto en un volumen total de 250 ml de agua bidestilada) a 37C
toda la noche. Se recolectaron aproximadamente 10 colonias de bacterias de 2-3 mm
de dimetro y se incubaron en un matraz Erlenmeyer con 100 ml de medio LB (20 g de
86
LB en 1 L de agua bidestilada) a 37 C en agitacin moderada (225 rpm) hasta que el

cultivo alcanz una densidad ptica de 0.4 0.5 a una longitud de onda de 600 nm. Se
colect el cultivo en tubos Falcon de 50 ml y se mantuvo en hielo 15 min. Se centrifug
a 1000 x g (3000 rpm en una centrfuga clnica) durante 15 min a 4 C y posteriormente
se elimin el sobrenadante. Las pastillas se secaron invirtiendo los tubos en papel
absorbente. Se resuspendieron las pastillas y se juntaron en una sola, mezclando
moderadamente en solucin RF1 (RbCl 100mM, MnCl24H2O 50mM, CH3COOK 30 mM,
CaCl22H2O 10mM, Glicerol 15%, pH 5.8) cuyo volumen es 1/3 del volumen inicial (100
ml). Se incubaron las clulas en hielo 5 min para las clulas DH5 y 1hr para las
bacterias BL21(DE3) pLysS. Se centrifugaron bajo las mismas condiciones y se sec la
pastilla. Se resuspendieron las clulas en solucin RF2 (Mops 10mM, RbCl 10mM
CaCl22H2O 75mM, Glicerol al 15%, pH 6.8) utilizando 1/12.5 del volumen original de
100 ml. Se incubaron las bacterias en hielo durante 15 min, se hicieron alcuotas en
tubos eppendorf de 0.5 ml, se congelaron rpidamente en nitrgeno lquido y se
guardaron a -70 C hasta su utilizacin.
5.3.4 Transformacin de bacterias competentes por choque trmico

A 50 l de bacterias competentes (DH5 o BL21 (DE3) pLysS) se agregaron 2
g de la mezcla de ligacin. Se incub en hielo 30 min, despus a 42 C durante 90
segundos y nuevamente en hielo durante 5 minutos. Se adicionaron 300 l de medio LB
en condiciones de esterilidad. Se incub con agitacin a 225 rpm durante 1hr a 37 C y
se espatul la mezcla con asa de vidrio y en condiciones de esterilidad en cajas LBagar con 50 mg/ml de ampicilina para las bacterias DH5 y se incub a 37 C toda la
87
noche. Para las bacterias BL21(DE3) pLysS, se agregaron 50 mg/ml de ampicilina y 34

mg/ml de cloranfenicol. Al da siguiente, se tomaron varias colonias al azar, de las
cuales se extrajo el DNA plasmdico para verificar la presencia del inserto y
posteriormente secuenciarlo para corroborar que estuviera completo y en marco de
lectura abierta con la secuencia de histidinas del vector en el caso de la ligacin en el
vector pRSET-A (Hanahan, 1983).
5.3.5 Minipreparacin de DNA plasmdico

Para verificar la sublonacin, seleccionamos diez colonias de las bacterias DH5
transformadas con el plsmido pRSET-EhPap, y se inocularon en tubos de ensayo con
5 ml de medio LB con ampicilina (50 mg/ml) toda la noche a 37C.
Se hicieron
alcuotas en tubos eppendorf de 1.5 ml y se centrifug 1 min a 14,000 rpm, desechando

el sobrenadante. Se agregaron 100 l de solucin I (50mM Glucosa, 25mM Tris-Cl pH
8.0, 10mM EDTA pH 8.0) y se agit vigorosamente en vortex. Se agregaron 200 l de
solucin II (0.2 N NaOH, 1% SDS), se agit invirtiendo cinco veces el tubo rpidamente
y se incub en hielo durante 5 min. Se agregaron 150 l se solucin III fra (60 ml de
CHO3COOK 5M, 11.5 ml de CH3COOH y 28.5 ml de H2O, la solucin resultante es de
3M con respecto al potasio y 5M con respecto al acetato) y se agit suavemente en
vortex, con el tubo
eppendorf en posicin invertida durante 10 seg y se incub
nuevamente en hielo durante 5 min. Se centrifug a 14,000 rpm durante 5 min y se

recuper el sobrenadante con mucho cuidado. Se agregaron 300 l de etanol al 100%,
se mezcl en vortex y se incub en temperatura ambiente durante 3 min para precipitar
el DNA. Se centrifug nuevamente a 14,000 rpm durante 5 min para obtener la pastilla,
88
se retir el sobrenadante y se invirti el tubo sobre papel absorbente. La pastilla se lav

con 300 l de etanol al 70%, se centrifug a 14,000 rpm durante 5 min, se retir el
sobrenadante y se invirti nuevamente el tubo. Este paso de lavar con etanol al 70% se
repiti 2 veces. La pastilla se dej secar aproximadamente 1 hr a temperatura
ambiente. Se agregaron 30 l de agua bidestilada y 1 l de RNasa 40 U/l. Se incub a
37C durante 30 min. El DNA plasmdico as obtenido, se analiz por restriccin
enzimtica
utilizando las enzimas BamHI y HindIII (New England Biolabs) y
electroforesis en gel de agarosa al 1% en amortiguador TBE 1X. El gel se ti en una

solucin de EtBr y se observ en el transiluminador de luz UV. Se tom una clona
positiva al azar para secuenciarla y comprobar as la identidad del inserto clonado
(Modificacin de los mtodos de Birnboim y Doly, 1979 y Ish-Horowicz y Burke, 1981).
5.4 Expresin de la protena recombinante (rEhPAP)

Una vez que se comprob la subclonacin del gen EhPap en el vector pRSET-A,
se continu con la expresin de la protena EhPAP recombinante. Se transformaron
bacterias competentes E. coli BL21 (DE3) pLysS con el plsmido pRSET-EhPap, y se
incubaron a 37 toda la noche en placas de cultivo LB-agar con antibitico (50 mg/ml de
ampicilina y 34 mg/ml de cloranfenicol). Al da siguiente, se tomaron algunas colonias y
se inocularon en tubos de ensayo con 5 ml de medio lquido 2TY (16g Triptona, 10g
Extracto de levadura, 5g NaCl, 900ml de agua a un pH de 7.5), el cual es un medio ms
rico en nutrientes para las bacterias, adicionndole 50 mg/ml de ampicilina y 34 mg/ml
de cloranfenicol. El cultivo se incub a 37C hasta que alcanz una densidad ptica de
0.4-0.6 a una longitud de onda de 600 nm. Se le agreg IPTG 1mM (Isopropil--D-
89
tiogalactopiranoside) que es un inductor de la expresin gnica y permite que la

protena T7 RNA polimerasa active al promotor T7 del plsmido pRSET-A, y se incub
durante 3 horas bajo las mismas condiciones (37C a 250 rpm). Se hicieron alcuotas
de 1 ml en tubos eppendorf, se centrifugaron a 14,000 rpm durante 1 min y se desech
el sobrenadante. Las pastillas se guardaron a -20C hasta su utilizacin.
Para obtener la protena EhPAPr en cantidades suficientes para realizar el

protocolo de inmunizacin se realiz un cultivo masivo. Para eso se transformaron
bacterias BL21(DE3) pLysS, con la misma metodologa. Al da siguiente, algunas
colonias se inocularon en tubos de ensayo con 5 ml de medio lquido 2TY con 50 mg/ml
de ampicilina y 34 mg/ml de cloranfenicol y se incubaron a 37C durante toda la noche.
De este cultivo, se hizo una dilucin 1:25, es decir, 2 tubos de 5ml se inocularon en
250ml de medio 2TY con antibiticos. Se Incubaron a 37 C hasta
alcanzar una
densidad ptica de 0.5-0.7 a una longitud de onda de 600nm y se realiz la induccin

de la EhPAPr en las mismas condiciones descritas previamente. El cultivo se centrifug
en tubos cnicos Falcon a 14,000 rpm durante 5 min, se desech el sobrenadante y, en
10 ml de medio 2TY, se resuspendieron todas las pastillas para recolectar todas las
bacterias en 10 ml con los que se hicieron alcuotas de 1ml en tubos eppendorf (10). Se
centrifug nuevamente y se desech el sobrenadante y las pastillas se guardaron a 20C hasta su utilizacin.
90
5.5 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)

En este trabajo se hicieron varios ensayos de electroforesis con protenas
obtenidas de las bacterias BL21 (DE3) pLysS y de protenas nucleares y citoplsmicas
de trofozotos de la clona A de E. histolytica.
Las pastillas obtenidas de bacterias BL21 (DE3) pLysS, se resuspendieron en 40
l de PBS pH 6.8 y se sonicaron para romper la pared celular y de esta manera liberar
las protenas. Se centrifugaron a 14,000 rpm durante 5 min y se recolect el
sobrenadante, el cual contiene las protenas que se cuantificaron por el mtodo de
Bradford (1976). Como control negativo, se usaron protenas de bacterias BL21(DE3)
pLysS transformadas con pRSET-EhPap sin inducir. La identidad de la protena
recombinante se comprob posteriormente por Western blot con un anticuerpo de ratn
anti-histidinas (Roche).
Las protenas se analizaron por electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS al

10% (por sus siglas en ingls SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis).
El gel separador se prepar con 4 ml de agua, 3.33 ml de
poliacrilamida al 30%, 2.5 ml de Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 y 100 l de dodecil sulfato de

sodio (SDS) al 10 %. El gel polimeriz al agregar 50 l de persulfato de amonio (PSA)
al 10% y 5 l de N, N, N, N- tetrametil- etilendiamina (TEMED). El gel concentrador al
4% se prepar con 3 ml de agua, 650 l de acrilamida (30%), 1.25 ml de Tris HCl 0.5 M
pH 6.8, 50 l de SDS (10%), 25 l de PSA (10%) y 5 l de TEMED en un volumen final
de 5 ml. Como amortiguador de corrida se us una solucin Tris (0.025M)-glicina (0.192
M)-SDS (0.1%). El volumen correspondiente a 30 g de protenas de las bacterias BL21
91
(DE3) pLysS junto con el mismo volumen de un amortiguador 2X (2.5ml de Tris-HCl 0.5
M pH 6.8, 0.4 mg de SDS, 2 ml de glicerol, 200 l de -mercaptoetanol y 0.1 mg de azul
de bromofenol en un volumen final de 10 ml), se calentaron a 100C durante 5 minutos
para desnaturalizar a las protenas. Tanto los componentes del amortiguador como el
glicerol, adems de ayudar a la desnaturalizacin de las protenas, permiten que las
muestras se mantengan juntas y no floten; mientras que el colorante permite observar
la migracin de las protenas en el gel y saber en que momento detener la
electroforesis. Tambin se cargaron 10 g de marcador de peso molecular para
protenas preteido (Invitrogene). La electroforesis se realiz con una corriente de 100
V durante 1h 30 min aproximadamente. El gel se ti con azul de Coomasie (0.25 g de
Coomassie R-250, 250 ml de metanol y 35 ml de cido actico en un volumen final de
500 ml) durante 20 min y se aclar con una solucin desteidora (Etanol 150 ml, Ac.
actico 50 ml, y agua bidestilada 300 ml) hasta visualizar las bandas proticas (Ausubel
1994).

La
protena
EhPAP
recombinante
fue
purificada
bajo
condiciones
desnaturalizantes mediante cromatografa de afinidad, usando columnas de agarosaniquel (Ni-NTA) de Qiagen, las cuales interaccionan con el tracto de histidinas en el
extremo amino de la EhPAPr. A cada una de las pastillas obtenidas del cultivo masivo,
se le agregaron 5 ml de buffer de lisis (NaH2PO4 100mM, Tris-Cl 10mM, Urea 8M, pH
8), se dejaron en agitacin durante una hora aproximadamente para lisar a las bacterias
y liberar las protenas. Se centrifug durante 30 min a 10,000 x g a temperatura
92
ambiente para que todos los detritos bacterianos se quedaron en las paredes y el fondo
del tubo cnico y separarlos de las protenas contenidas en el buffer de lisis, el cual se
recuper. El sobrenadante se pas por la columna siete veces para que se uniera la
EhPAPr al niquel y despus se lav dos veces con 4 ml de buffer de lavado (NaH2PO4
100mM, Tris-Cl 10mM, Urea 8M pH 6.3) para eliminar las protenas que no se unieron a
la columna o que tuvieron una unin inespecfica. Se eluyeron protenas de unin dbil
a la columna de niquel (protenas pequeas generalmente) con 2 ml de buffer D (pH
5.9) y la EhPAPr se eluy finalmente con 2 ml de buffer E (NaH2PO4 100mM, Tris-Cl
10mM, Urea 8M pH 4.5). Las fracciones as obtenidas se analizaron por SDS-PAGE al
10% para comprobar la purificacin de la EhPAPr y su identidad se confirm por
Western blot con el anticuerpo de ratn antihistidinas.
El protocolo de purificacin se repiti varias veces para obtener suficiente

protena EhPAPr para el protocolo de inmunizacin. Las fracciones as obtenidas se
concentraron por centrifugacin en un tubo Centricon (Centrifugal Filter Devices,
Amicon, Millipore) a 5000 xg a 4C. Para recuperar la protena recombinante, se invirti
el centricon con el cono pequeo en donde se recuper la protena centrifugando a 300
xg durante 2 min.
5.7
Electroelucin de la protena EhPAP recombinante
La protena EhPAPr purificada se encontraba ahora en el buffer E junto a otras

protenas que tambin se unieron a la columna de Niquel, por lo tanto fue necesario
separarla de las dems protenas y del buffer E para obtenerla pura y poder inocularla a
los ratones para obtener anticuerpos especficos.
93
Una vez concentrada la protena EhPAPr en un volumen aproximado de 600 l,

se realiz un gel preparativo de poliacrilamida al 10%.
La protena junto con el
amortiguador 6X se calentaron a 100 C durante 5 minutos para desnaturalizarla y se

cargaron en el gel junto con 20 g de marcador de peso molecular para protenas
preteido (Invitrogen). La electroforesis se realiz a 40 V (mnimo voltaje) a 4 C
durante toda la noche (o hasta que el colorante llegue al borde). El gel se ti con azul
de Coomasie durante 20 min y se aclar en solucin desteidora. Se cort finamente la
banda de poliacrilamida correspondiente a la EhPAPr y se realiz una electroelucin
para eluir la protena del gel usando una cmara de electroelucin (BIO-RAD), y el
amortiguador de corrida Tris-glicina-SDS (Tris 0.025M - glicina 0.192 M - SDS 0.1%),
durante 1h a 100 V a temperatura ambiente. La protena pura se recuper con mucho
cuidado, se cuantific por el mtodo de Bradford (1976) y se guard a -20C hasta su
utilizacin.
5.8
Inmunizacin de ratones para obtener anticuerpos
Se utilizaron seis ratones Balb/c de 4 semanas de nacidos, cinco se inmunizaron

con EhPAPr y el sexto se us como control negativo. Todos los animales se marcaron
con perforaciones en las orejas, para poder identificarlos. El da 0, se sangraron a los
ratones para obtener el suero preinmune. El sangrado se realiz utilizando pipetas
Pasteur sin bulbo, nuevas y estriles, las cuales se colocaron, sujetando bien al ratn,
en la comisura externa del ojo, teniendo mucho cuidado de no picar directamente el
globo ocular. Suavemente se hizo presin en esta zona para obtener la sangre, ya que
94
por ella corre un plexo sanguneo. La sangre obtenida en la pipeta Pasteur se coloc en
tubos eppendorf con la ayuda de un bulbo, cuidando de no expulsarla muy
violentamente para no lisar a los eritrocitos. La sangre obtenida se incub a 37C
durante 1hr. El cogulo que se form en la superficie del tubo eppendorf se separ de
las paredes con un palillo de madera para obtener una mayor cantidad de suero. Se
centrifugaron a 1,500 rpm durante 5 min y se separ el suero de los eritrocitos en
eppendorfs nuevos. Se hicieron alcuotas y se guardaron a -20 hasta su utilizacin.
Se realizaron tres inmunizaciones intraperitoneales los das 0, 10 y 21. La dosis

utilizada por animal fue aproximadamente de 100 g de protena en un volumen final de
100 l, de los cuales 50 l eran de adyuvante y los 50 l restantes fueron de la
protena recombinante que se completaron con PBS pH 7.4. El adyuvante de Freund es
una solucin oleosa que incrementa la respuesta inmunolgica especfica al antgeno
que se est inoculando. El adyuvante completo despierta una reaccin mayor que el
incompleto, sin embargo produce reacciones secundarias no deseadas como fiebre,
dolor y abscesos. Es por esto que se utiliz el adyuvante completo slo en la primera
inoculacin. El da 0 se inyect la protena EhPAPr con adyuvante completo de Freund,
los das 10 y 21 se inmuniz con la protena EhPAPr en adyuvante incompleto de
Freund y el da 30 se sangraron nuevamente a los ratones para obtener el suero. Para
comprobar la calidad del suero obtenido de los ratones, se realiz un Western blot con
la EhPAPr. Posteriormente, los sueros se utilizaron para determinar la localizacin
subcelular de la EhPAP en los trofozotos mediante Western blot con extractos
nucleares y citoplsmicos.
95
5.9
Cultivo de los trofozotos
En este trabajo, utilizamos trofozoitos de las clonas A y L6 (cepa HM1:IMSS). La

clona A se us para determinar la sublocalizacin celular de EhPAP. La clona L6 es una
clona deficiente en fagocitosis
que puede ser sincronizada por tratamiento con
colchicina (Orozco 1983, 1988), la cual se us para medir la expresin del RNAm de
EhPap en el ciclo celular. Los trofozotos de las clona A y L6 se cultivaron en medio
TYI-S-33 complementando con 20% de suero fetal bovino y 6% de la mezcla de
vitaminas a 37 C(Diamond 1978).
5.10 Obtencin de extractos nucleares y citoplsmicos

El cultivo de trofozotos de la clona A en fase exponencial se coloc en hielo
durante 10 minutos para que las amibas se despegaran de la caja y se vaciaron en un
tubo Falcon de 50ml. Se centrifug durante 7 minutos a 2000 rpm a 4C decantando el
sobrenadante. Se resuspendi la pastilla en 1 ml de PBS y se transfiri a un eppendorf
de 1.5 ml. Se centrifug 15 segundos a 14,000 rpm y se decant el PBS. Se
resuspendi la pastilla en 400 l de buffer A fro (10mM HEPES pH 7.9; 10mM KCl; 0.1
mM EDTA; 0.1 mM EGTA; 1mM DTT; 0.5m M PMSF) pipeteando suavemente. Se
esper a que las clulas se hincharan durante 15 minutos a 4C y se adicion 25 l de
solucin de Nonidet NP-40 al 10%, y 2 l de cocktail inhibidor de proteasas (PMSF
0.5mM, Benzamidina 2mM, Aprotinina 5 g/ml, Pepstatina A 5l/ml, E64 10 g/ml,
Leupeptina 5 l/ml), agitando vigorosamente durante 10 seg. Se centrifug por 30
segundos y el sobrenadante correspondiente a la fraccin citoplsmica (RNA y
96
protenas) se recolect. La pastilla con los ncleos se resuspendi en 50 l de buffer C

fro (20mM HEPES pH 7; 0.4M NaCl; 1mM EDTA; 1mM DTT; 1mM PMSF; 1mM EGTA),
y 1 l del cocktail de inhibidores de proteasas y se agit vigorosamente en el agitador
durante 20 minutos a 4C. La muestra se centrifug 5 minutos a 4C y se recolect el
sobrenadante correspondiente a la fraccin nuclear. Las fracciones citoplsmicas y
nucleares se alicuotaron y se guardaron a -70C hasta su utilizacin (Schreiber y col.,
1989). Una alcuota se us para determinar la concentracin de protenas por el mtodo
de Bradford y para verificar la integridad de los extractos por SDS-PAGE. Los extractos
nucleares y citoplsmicos se analizaron por Western blot para determinar la localizacin
subcelular de EhPAP en los trofozotos.
5.11 Ensayo de Western blot

Las protenas de las bacterias BL21 (DE3) pLysS transformadas con pRSETEhPap y tratadas con IPTG, as como los extractos nucleares y citoplsmicos de los
trofozotos de la clona A, se separaron por SDS-PAGE con la metodologa previamente
mencionada, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Trans-Blot Transfer
Mdium 0.2 m, Bio-Rad), utilizando una solucin de Tris (0.025M)-glicina (0.192M) con
20% de metanol, a 400 mA durante 2 h en un recipiente con hielo, utilizando el sistema
MiniTrans Blot (Bio-Rad). Para corroborar la correcta transferencia de las protenas del
gel a la membrana, se ti la membrana durante 5 min en una solucin de rojo de
Ponceau (100 mg de rojo de Ponceau y 1ml de cido actico en un volumen final de
100ml). Se marcaron los lmites del gel y los carriles con protenas. La membrana se
destii totalmente con H2O y se bloque 2 h a temperatura ambiente y con agitacin
97
suave en una solucin de PBS pH 7.4 (NaCl 137mM, KH2PO4 1.47 mM, NaH2PO412
H2O 6.47 mM y KCl 2.68 mM) con Tween-20 al 0.05% y leche descremada al 5%. La
membrana as bloqueada se guard a -20 C o bien se incub toda la noche a 4C con
agitacin suave con el primer anticuerpo diluido en PBS-Tween (0.05%)-leche (5%). Al
da siguiente se hicieron 3 lavados con PBS-Tween (0.05%) de 10 min cada uno y la
membrana se incub durante 2 hrs a temperatura ambiente y con agitacin suave con
el segundo anticuerpo diluido en PBS-Tween (0.05%), se hicieron 3 lavados con PBSTween de 10 min cada uno. Se revel por el sistema de ECL Plus Western Blottign
Detection Reagents (Amersham Biosciences) en placas radiogrficas.
Para confirmar la identidad de la protena recombinante obtenida en bacterias, se

us como primer anticuerpo un anticuerpo monoclonal anti-histidinas obtenido en
ratones (anti-His6 Mouse monoclonal antibody, clone BMG-His-1 (Roche) 100 g), a
una dilucin de 1:1000 l de PBS-Tween (0.05%)-leche (5%). Como anticuerpo
secundario usamos un anticuerpo de cabra anti-ratn marcado con peroxidasa (Goat
Anti-Mouse IgG (H+L) HRP Conjugate (Zymed) 1 mg/ml), en una dilucin de 1:2000 l
de PBS-Tween (0.05%).
Para determinar la localizacin subcelular de la EhPAP, se us el suero inmune

generado en ratones: anti-EhPAPr, a una dilucin de 1:1000 l PBS-Tween (0.05%)leche (5%) y el mismo anticuerpo secundario y se realizaron ensayos de western blot
utilizando 20 g de extractos nucleares y 20 g de extractos citoplsmicos
98
5.12 Sincronizacin de trofozotos de la clona L-6 en las fases del ciclo

celular
Los trofozotos de la clona L-6 se sincronizaron segn el mtodo descrito por
Orozco y col., (1988). Este mtodo se usa comnmente en el laboratorio y sus
resultados son altamente reproducibles. Trofozotos de la clona L-6 en fase exponencial
crecidos en medio TYI-S-33 en tubos de vidrio, se trataron con colchicina en una
concentracin de 200 g/ml durante 24 horas a 37C. Al trmino de este periodo, las
clulas se cambiaron a un medio TYI-S-33 fresco, se incubaron a 37 C en cajas de
plstico de 50 ml y se cosecharon a diferentes tiempos. Los trofozotos en el tiempo 0
corresponden a la fase M, a las 3 hr a la fase G1, 8 hr a la fase S, y 14 hr a la fase G2.
Los trofozotos as sincronizados se utilizaron para extraer RNA total y medir la
expresin del gen EhPap a travs del ciclo celular por medio de una RT-PCR
semicuantitativa.
5.13
Obtencin del RNA total de los trofozotos sincronizados
Cuando se trabaja con RNA todo el material debe estar libre de RNasa, para lo
cual es necesario trabajar con guantes, limpiar la zona donde se va a trabajar al igual
que las pipetas con solucin libre de RNasas. Los tubos eppendorf deben ser nuevos y
estriles y slo se deben tomar con los guantes puestos. La obtencin del RNA total de
los trofozotos en las diferentes fases se realiz con el reactivo Trizol Reagent
(invitrogen). Los trofozotos sincronizados en cada fase del ciclo celular, se incubaron
10 min en hielo para despegarlos y se vaciaron en 2 tubos Falcon de 50 ml nuevos. Se
centrifugaron durante 7 min a 2500 rpm a 4C y se elimin el medio de cultivo. Se
99
agregaron 250 l de Trizol a la pastilla, resuspendiendo y pasndola a un tubo

eppendorf de 1.5 ml. Se incub 5 minutos a temperatura ambiente para lisar las clulas.
Se agregaron 800 l de cloroformo mezclando suavemente por inversin y se incub 3
min a temperatura ambiente para separar la fase orgnica. Se centrifug a 12,000 rpm
durante 10 minutos a 4C. Se formaron 2 fases: una acuosa, que es transparente y
contiene el RNA y una orgnica, que es rosa y tiene DNA, protenas, fenol, etc. Se
recuper la fase superior acuosa teniendo cuidado de no tocar la interfase. Se
agregaron 800 l de isopropanol incubando a 10 minutos a temperatura ambiente y se
mezcl para que se precipite el RNA. Se centrifug a 12,000 rpm durante 10 minutos a
4C, se elimin el sobrenadante y se sec la pastilla 10 min, sobre papel limpio.
Finalmente, se resuspendi con 80 l de agua DEPC al 0.05% (Dietil-pirocarbonato,
SIGMA preparado con 100 l de DEPC en 2 L de agua destilada) y se hicieron
alcuotas. Se cuantificaron utilizando el espectrofotmetro a una longitud de onda de
260/280 nm, en cubetas de cuarzo a las que se agreg 997 l de agua DEPC y 3l de
RNA, y se prepararon stocks de 300 ng/l de cada una de las fases.
5.14
Ensayo de RT-PCR semicuantitativa
La reaccin de RT-PCR semicuantitativa se realiz segn el protocolo

estandarizado por Lpez y col., (2003). En un tubo eppendorf de 1.5 ml se adicionaron:
7 l de RNA (2 g), 1 l de DNAsa RNasa free 2 U/ul, (Ambion), 1 l de buffer 10X
de la DNAsa, 5 l de H20 DEPC (RNasa free), 1 l de RNAout (invitrogen) 40 U/l
(inhibidor de ribonucleasa) y se incub la mezcla en bao a 37C durante 15 minutos.
Para inactivar la DNAsa se aadi 1l de EDTA 25 M y se incub el tubo de la mezcla
100
en bao mara a 64C por 10 minutos. Se aadieron al tubo con la mezcla inicial 2 l de
oligo dT (100 ng/l) desnaturalizado a 64C por 10 minutos, 4 l de Buffer 5X de la
enzima Superscript II (Invitrogene) (RT), 2 l de dNTPs (20 mM), 2 l de DTT 0.1M y 1
l de RNAout 40 U/l. Se incub el tubo a 25C durante 5 minutos y se la agreg 1 l
de la enzima Superscript II (200 U/l) (Invitrogen). Se incub a 42C durante una hora,
guardando la mezcla final de cDNA a -20C. Se tom 1/5 del cDNA sintetizado y se
realiz una PCR en las siguientes condiciones: 4 l cDNA; 1 l oligo en sentido (100
ng/l); 1 l oligo en antisentido (100 ng/l); 1 l dNTPs (20 mM); 5 l Buffer 10X de la
Taq polimerasa; 1 l MgCl2 50 mM, 0.5 l Taq 5U/l (Invitrogen); 35 l H2O para un
volumen total de 50 l. Los oligos utilizados para amplificar el gen EhPap fueron: EhPap
IR sentido: 5AGATTAAATGTATATGG 3 y el EhPap IR antisentido: 5
CCATAATTTAATAGTACG 3. Para el gen de actina se us, el oligo sentido 5
AGCTGTTCTTTCATTATATGC -3, y el antisentido 5 TTCTCTTTCAGCAGTAGTGGT
3. Se realiz la PCR en el termociclador (Techne Genios) con el siguiente programa:
94C, 5 min; 25 ciclos de 95C, 1 min; Tm (C), 1 min; 72C, 1 min; 72 C, 7 min. La Tm
para los oligos de EhPap fue de 40C y para los oligos de actina de 51C.
Los productos de amplificacin obtenidos para cada una de las fases del ciclo
celular, se resolvieron mediante una electroforesis en un gel de agarosa al 1% en
amortiguador TBE 1X (Tris-borato, Tris 90 mM, EDTA 2mM pH 8 y cido brico 90
mM), a 100 V, durante 1 hr. El gel se ti en una solucin de EtBr y se observ en el
transiluminador de luz UV.
Para estimar la concentracin de los productos
amplificados, se realiz una densitometra con el GelDoc (UVP Laboratory Products
101
EPI-Chemi Darkroom) de cada una de las bandas correspondientes a las diferentes

fases del ciclo celular.
102
6.
RESULTADOS
6.1 Anlisis in silico: La EhPAP es una protena evolutivamente

conservada
El gen completo de EhPap se amplific por medio de PCR a partir DNA
genmico de trofozotos de la clona A utilizando el oligonucletido sentido 5AAGAAAATGAAAAAAGAACT-3 y el antisentido 5-TCAATTTTTTCTTGTAAA-3, con el
siguiente programa: 94C durante 5 min; 30 ciclos de 94C, 1 min; 52C, 90 s y 72C ,
1min; y la extensin final fue a 72C por 7 minutos, usando Taq DNA polimerasa de alta
fidelidad (2U) como se describe en materiales y mtodos. El producto de PCR se clon
en el vector TA (TA cloning vector) y se secuenci de manera automtica (Tesis
doctorado, Lpez-Camarillo, 2003). Esta secuencia se us para realizar una bsqueda
preliminar del gen EhPap en los bancos de datos del genoma de E. histolytica (TIGR:
The Institute of Genomic Research, por sus siglas en ingls) y se identific una
secuencia de DNA de 1560 pb que codifica para una posible poli(A) polimerasa
localizada en el locus 16.m00324 del scaffold 00016, del nucletido 69982 al 71550. El
anlisis de la secuencia de 1566 pb mostr que contiene un marco de lectura abierto
que codifica para una protena de 522 aa (fig 15), con un peso molecular predicho de
59.18 kDa, un punto isoelctrico de 5.39 y una vida media estimada de 30 hr.
Con la secuencia de la protena EhPAP se realiz una bsqueda de secuencias

similares en las bases de datos existentes, usado el programa BLAST de ExPASy
Proteomics Server (http://www.expasy.org) para conocer el valor de E y el porcentaje
de homologa y de identidad de la EhPAP con respecto a las PAPs de otros
103
Figura 15. Secuencia de la protena EhPAP de 522 aa obtenida del banco de datos del
proyecto de secuencia del genoma de la E. histolytica (http://www.tigr.org)
104
MACELKEFLV
YVYGSYRLNV
SMIYLNIEFD
SEEAFRVMVR
YSSWDWLRTP
EIVHEFSSEG
LSEIEEIIEA
DASIKKRSEI
ENSIPNEEKK
KNDMYPMGDQ
YGNNSDIDAC
LNFSRTAYTS
TIKLWTKKRG
VMLGTNDDFN
VNDWAKLFKP
NVIPNGFLDE
PTKFAHSVKR
EQLKKEMKQE
VEKKRKAISK
IVSNSTITRD
LPDNLDILNE
IYGYVYCFLN
DKKKEGVIQI
RHLFCGYYIF
ENEKYFYYVG
SITKSQEIKE
ANTIVKNSST
MTEYIQQWGK
DFYDGLYAEL
NILKNMDELD
GISIEILVAQ
LTPASPSENA
IEFIVTSSSL
MNVKRDCPVD
TSSQVPSSAI
DDDFMKRFTR
KIYIESAGVA
LNNPDVKELK
TRAINGVRNT
VISENYQLDN
AFSITKFSLE
EGLTTTIGKF
ISTPLNSFLS
TETFDIPTKP
KN
DDTDVKAATI
QIPSKRSPHL
DIIDAFVPNH
VRLLEKFFQV
MIKRELKRGQ
ESGLVNLMKG
IVNSGKDLIV
SIEQQLKAKE
60
120
180
240
300
360
420
480
522
105
organismos. El valor de E (Expect value, en ingls) representa la probabilidad que

existe de que la secuencia completa de la EhPAP se parezca o no con respecto a las
otras PAPs, es decir, el programa compara cada uno de los aminocidos de ambas
secuencias y da la probabilidad de error entre las secuencias y este es el valor que
marca el orden en la lista del BLAST (Fig. 16). La protena EhPAP presenta una gran
similitud con respecto a las PAPs de otros organismos eucariontes, desde protozoarios
hasta humanos, pasando por plantas, levaduras y nemtodos. El valor de E indic que
presenta la mayor similitud con la PAP de C. elegans (2e-43), mientras que los valores
obtenidos para los protozoarios son menores (1e-38). Se observ tambin que la
EhPAP presenta mayor homologa e identidad con las poli(A) polimerasas de
eucariontes como S. cerevisiae (52 y 32%), A. thaliana (47 y 26 %), y H. sapiens (48 y
25%) (Tabla 3), mientras que con algunos protozoarios fue menor: P. falciparum (48 y
27%), T. brucei (43 y 26%) y L. major (45 y 24 % respectivamente) (datos no
mostrados), aunque interesantemente es an menor en los protozoarios que en C.
elegans (43 y 25 %). La bsqueda en las bases de datos del genoma de E. histolytica
en el TIGR y en el Sanger revelaron que existe una sola copia del gen EhPap. No se
encontraron otros genes que codifiquen para otra PAP nuclear cannica, sugiriendo que
EhPAP es la nica PAP nuclear en E. histolytica. Sin embargo, se encontraron dos
genes que codifican para posibles PAP citoplsmicas (datos no mostrados). Las PAPs
citoplsmicas son poli (A) polimerasas divergentes que tambin pertenecen a la
superfamilia de las DNA polimerasas nucleotidil-transferasa tipo . Sin embargo,
difieren en secuencia y tamao de las PAPs nucleares aunque contienen el dominio
central y cataltico.
106
Figura 16. Bsqueda de secuencias similares a EhPAP utilizando el algoritmo BLAST.

Se compararon las secuencias depositadas en todas las bases de datos existentes a la
fecha en el GenBank. Se muestra el valor de E en orden descendente para cada una
de las protenas relacionadas a EhPAP.
107
108
109
Tabla 3. Comparacin de la EhPAP con otras PAPs de eucariontes.
Protena
Organismo
Nmero
E-valor
de acceso
Identidad
Homologa
(%)
(%)
PAP
Caenorhabditis elegans
Q9U2P3
3e-43
25
43
PAP
Homo sapiens
P51003
6e-42
25
47
PAP
Arabidopsis thaliana
Q7XJ91
1e-39
26
47
PAP
Plasmodium falciparum
Q6LF18
1e-38
27
48
PAP 1
Saccharomyces cerevisiae
P29468
2e-35
32
52
Banco de datos SwissProt/TrEMBL
110
Por medio del programa CLUSTALW, se realiz un alineamiento mltiple y se

localizaron los dominios conservados entre las PAPs de diferentes especies incluyendo
la EhPAP (Fig. 17). Adems se realiz la prediccin de los dominios funcionales y
estructurales de la EhPAP usando los programas Prosite y Pfam. Los resultados
obtenidos fueron que la EhPAP pertenece a la superfamilia de las DNA polimerasas
nucleotidil-transferasa tipo . Est altamente conservada en su extremo N-terminal
donde se encuentra el dominio central cataltico caracterstico (36-131 aa) (PF04928).
Presenta tres residuos activos invariantes de aspartato (D76, D78 y D130), un dominio de
transferencia de nucletidos conocido como dominio F/YGS (63-65 aa) el cual es el
responsable de la unin del ATP en otras PAPs (Fig. 17). En el extremo carboxilo, se
identific un dominio de unin a RNA (RBD, RNA binding domain por sus siglas en
ingls) del aminocido 322-444 (Pfam PF04926); as como 2 sitios de fosforilacin
cAMP (425-428 aa y 516-519aa) adems de otros posibles sitios de fosforilacin por la
protena cinasa C (PKC, protein kinase C por sus siglas en ingls) en los residuos 6567, 114-116, 191-193, 196-198, 414-416, 423-425, 437-439 y 519-512 y de casein
cinasa II (CK2, casein kinase II, por sus siglas en ingls) en las posiciones 140-143 y
242-245 aa, las cuales podran ser importantes para la regulacin de la actividad de la
EhPAP. EhPAP no presenta una tpica seal de localizacin nuclear (NLS, nuclear
location signal, por sus siglas en ingls), lo que sugiere que algunas protenas de E.
histolytica pueden usar otra secuencia para llevar a cabo la translocacin nuclear.
Tambin se observ que no presenta un segmento de aproximadamente 100 aa en el
extremo C-terminal, el cual corresponde a una parte del dominio rico en serina y
treonina donde se localiza la NLS 2 en la PAP de humano (Zhao 1999) (Fig. 18).
111
Figura 17. Alineamiento mltiple de EhPAP con la PAP de H. sapiens y PAP1 de S.

cerevisiae. Las cajas negras muestran los aa idnticos, las cajas grises los aa similares.
Cuadro rojo, el dominio F/YGS donde se lleva acabo la interaccin con ATP; residuos
invariantes de aspartato (D76, D78 y D130), donde se realiza la transferencia de
nucletidos. Los nmeros de la izquierda son relativos a la metionina inicial de cada
protena.
112
113
Figura 18. Representacin esquemtica de la estructura molecular de las PAPs de

diferentes organismos incluyendo la EhPAP de E. histolytica. La escala representa el
nmero de aa. El dominio central est representado en gris; en negro, el dominio de
transferencia de nucletidos; las cajas con lneas verticales representa el domino de
unin a RNA. Los sitios de localizacin nuclear estn subrayados y con asteriscos se
localizan los sitios de fosforilacin por cAMP.
114
100
200
300
400
500
600
700
800
aa
H. sapiens
C. elegans
S. cerevisiae
A. thaliana
P. falciparum
E. histolytica
Dominio de transferencia de nucletidos

Domino central
Dominio de unin a RNA
Sitios de fosforilacin por cAMP
Sitios de localizacin nuclear
115
El rbol filogentico es un diagrama que representa el camino que ha seguido la

evolucin para producir la gran diversidad de formas biolgicas. Los puntos terminales
del rbol filogentico siempre estarn ocupados por formas actuales y los nodos
representan eventos de especiacin. Para realizar el rbol filogentico se utilizaron las
secuencias de las PAPs de diversos organismos, alineadas con la EhPAP usando el
programa clustalw. Se utiliz el programa MEGA con el parmetro de Neighbor-Joining,
para realizar la inferencia filogentica. Los resultados muestran una progresiva
evolucin de estas protenas de los eucariontes inferiores a los superiores. EhPAP
aparece en un brazo o rama separada de las PAPs de mamfero, lo que sugiere que
divergi en una etapa temprana en la escala evolutiva. Como era de esperarse, se
encuentra ms cercana a las enzimas de parsitos protozoarios como Plasmodium
falciparum (Fig. 19).
La estructura tridimensional se realiz tomando como referencia la estructura
reportada en los bancos de datos de la PAP de bovino, con la clave 1F5A, usando el
programa Geno3D y el programa Rasmol para poder visualizarlo, y se observa que las
estructuras presentan una gran similitud, lo que podra indicar la posible funcin de esta
protena (Fig. 20).

El gen EhPap completo se amplific por medio de una PCR (descrito en el
anlisis in silico) y se clon en el vector TA Cloning Vector (Tesis Doctorado Dr.
116
Figura 19. rbol filogentico sin raz de las PAPs de diferentes organismos. El
diagrama fue creado con el programa MEGA a partir de alineamientos obtenidos
mediante clustalw y usando las secuencias completas de las protenas. Se observ que
la EhPAP evolutivamente se encuentra cercana a las PAPs de otros protozoarios como
Plasmodium. La barra representa la distancia filogentica entre cada PAP.
117
H. sapiens
C. elegans
S. cerevisiae
A. thaliana
P. falciparum
E. histolytica
0.2
118
Figura 20. Comparacin de la estructura tridimensional de la EhPAP y la PAP de

bovino. A. Estructura tridimensional de la PAP de bovino. B. Estructura tridimensional
de la EhPAP. En ambas figuras en azul dominio cataltico, en verde y amarillo el
dominio central y en naranja-amarillo el dominio terminal de unin al RNA.
119
120
Lpez-Camarillo, 2003). Por medio de una restriccin enzimtica, con las enzimas
BamHI y HindIII (New England Biolabs) se liber el gen EhPap y conjuntamente se
lineariz el vector pRSET-A. Las reacciones de digestin se llevaron a cabo en
presencia del amortiguador 2 y fueron incubadas a 37C durante toda la noche. Al da
siguiente, se realiz una elecroforesis en un gel de agarosa al 1% TBE 1X y se observ
que la resticcin enzimtica se llev a cabo correctamente. El vector pRSET-A
linearizado present un tamao molecular de 2.9 kb (carril 1), mientras que el vector TA
linearizado present un tamao molecular de 3.1 kb (carril 2). Por otro lado, en ese
mismo carril se observa el gen EhPap liberado, que present un tamao molecular
esperado de 1.6 kb (Fig. 21). Para aislar tanto al vector pRSET-A como al gen EhPap,
se realiz nuevamente una electroforesis usando un gel de agarosa al 1% en TAE 1X y
se cort la banda correspondiente al gen y al vector linearizado y se purificaron
utilizando el kit de Gene Clean II (descrito en materiales y mtodos). Con el DNA
purificado se realiz una elecroforesis en un gel de agarosa al 1% TBE 1X para verificar
la integridad del DNA purificado y estimar la concentracin de cada uno de los
fragmentos EhPap y pRSET-A usando diferentes concentraciones de una dilucin de
1:10 (Fig. 22).
6.2.2 Ligacin
Se realiz la ligacin del gen EhPap en el vector pRSET-A usando una relacin
1:5 de vector: inserto, 2 l de ligasa T4 DNA ligase (1U/l) y amortiguador 10X de la
ligasa en presencia de ATP. La mezcla se incub durante toda la noche a 15C. Como
control se realiz una reaccin de ligacin usando slo el vector linearizado.
121
Figura 21. Electroforesis en gel de TAE-agarosa al 1% de los productos de la

restriccin enzimtica. Carril 1, vector pRSET-A (2.9 kb) linearizado con las enzimas
BamHI y HindIII; carril 2, TA-EhPAP (TA de 3.1 kb) cortado con las enzimas BamHI y
HindIII que liberan el inserto de 1.6 kb correspondientes al gen EhPap. M, marcadores
de tamao molecular Hind III .
122
pb
23,130
9,416
6,557
4,361
2,322
2,027
123
Figura 22. Purificacin del vector pRSET-A y EhPap. A. Cuantificacin del
vector
pRSET-A purificado (2.9 kb). B. Cuantificacin del gen EhPap purificado (1.6 kb). En
ambas figuras la dilucin es de 1/10 l. Carril 1, 1 l de la dilucin; carril 2, 3 l de la
dilucin; carril 3, 5 l de la dilucin; carril 4, 2 l del purificado del vector pRSET en
panel A y 2 l del gen EhPap purificado en el B. La flecha muestra el vector linearizado
(pRSET-A) y el asterisco indica el gen EhPap liberado por medio de una restriccin
enzimtica con las enzimas BamHI y HindIII. M, marcadores de tamao molecular
Hind III.
124
pb
23,130
4,361
2,322
pb
23,130
9,416
6,557
4,361
2,322
2,027
125
6.2.3 Anlisis de clonas y mini-preparaciones de DNA

Con el objetivo de identificar las clonas que contenan el inserto EhPap clonado
en pRSET-A, se transformaron bacterias competentes E. coli (DH5) con el total de la
mezcla de ligacin y se espatularon en cajas LB con 50 mg/ml de ampicilina que se
incubaron invertidas a 37C durante toda la noche. Al da siguiente, se seleccionaron
aproximadamente diez colonias del cultivo de la caja y se inocularon en tubos de
ensaye con 5 ml de medio lquido LB con ampicilina (50 mg/ml) durante toda la noche a
37C. Al da siguiente, se hicieron alcuotas del cultivo bacteriano en tubos eppendorf
de 1.5 ml y se empastillaron. Se continu con el procedimiento descrito en materiales y
mtodos hasta obtener el DNA plasmdico. Para liberar el inserto se realiz una
digestin utilizando las enzimas BamHI y HindIII en presencia del amortiguador 2 y se
realiz una electroforesis de los productos de la digestin en gel de agarosa al 1% en
TBE 1X (Fig. 23). Los resultados muestran que la ligacin fue exitosa ya que todas las
clonas analizadas fueron positivas. La digestin con las enzimas BamHI y HindIII liber
el inserto y el plsmido lineal del tamao esperado que es 1.6 y 2.9 kb respectivamente.
Se tom al azar una clona positiva para secuenciarla y comprobar as la identidad del
inserto clonado y que estuviera en marco de lectura abierto con el vector pRSET-A (Fig.
24). El anlisis de la secuencia de DNA mostr que corresponde al gen EhPap
predicho, que se localiza en el locus 16.m00324, del nucletido 69982 al 71550 del
scaffold 00016, obtenida previamente del TIGR. Ambas secuencias fueron idnticas
126
Figura 23. Restriccin enzimtica parcial de minipreparaciones de 9 clonas

correspondientes a la ligacin de pRSET-EhPap. Digestin con BamHI/ HindIII. Kb:
kilobases. Flecha, pRSET-EhPap (4.5 kb); cabeza de flecha, pRSET-A lineal (2.9 kb);
asterisco, gen EhPap liberado (1.6 kb).
127
Kb
3.0
2.0
1.5
128
Figura 24. Electroferograma que muestra la secuencia de nucleotidos del gen EhPap
clonado en el vector pRSET-A. Se muestra el ATG inicial de la EhPAP.
129
130
6.3 Expresin de la protena EhPAP recombinante (EhPAPr)

Para inducir la expresin de la EhPAPr se transformaron bacterias E.coli BL21
(DE3) pLysS con el plsmido pRSET-EhPap y se espatularon en una caja de LB agar
con 50 mg/ml de ampicilina y 34 mg/ml de cloranfenicol y se incubaron invertidas a
37C durante toda la noche. Al da siguiente, se tomaron algunas colonias al azar y se
incubaron en 5ml de medio de cultivo LB ampicilina lquido y se dejaron crecer hasta
alcanzar una densidad ptica de 0.4-0.6 a 600 nm. Posteriormente, se indujo la
expresin de la EhPAPr con IPTG 1mM durante 3 horas a 37C en agitacin a 225 rpm.
Una vez transcurrido este tiempo, el cultivo con las bacterias transformadas se
empastill y se lis para obtener las protenas totales con las cuales se realiz una
electroforesis (SDS-PAGE al 10%). Despus de teir con azul de Coomassie, se
observ la sobreexpresin de una protena de 66 kDa en los extractos de las bacterias
inducidas (Fig. 25 A, carril 2), la cual no aparece en el control de protenas totales de
bacterias no inducidas (Fig. 25 A, carril 1). Para comprobar la identidad de la protena
expresada, se realiz un ensayo de Western blot con extracto proteicos totales de las
bacterias transformadas e inducidas con IPTG, utilizando un anticuerpo monoclonal
anti-histidinas. Los resultados muestran que el anticuerpo reconoci a una protena que
presenta un peso aparente de ~66 kDa, el cual corresponde al peso molecular
esperado para la EhPAPr (~59 kDa) incluyendo la etiqueta de 6 histidinas que
aumentan el peso molecular de la EhPAPr en ~6 kDa. Como control negativo se usaron
extractos proteicos totales de bacterias transformadas sin inducir en los cuales se
reconoci una banda inespecfica probablemente de alguna protena bacteriana (Fig. 25
B).
131
Figura 25. Expresin de la protena EhPAPr. A SDS-PAGE al 10% teido con azul de
Coomassie donde se observa la expresin de la protena recombinante. B Ensayo de
Western blot donde se identifica a la protena recombinante con el anticuerpo antihistidinas. En ambas figuras: carril 1, protenas totales de bacterias E.coli BL21 (DE3)
pLysS transformadas sin inducir; carril 2, protenas totales de bacterias E.coli BL21
(DE3) pLysS transformadas e inducidas. La flecha indica una banda de 66 kDa que
corresponde a la EhPAPr. El asterisco seala una banda inespecfica, probablemente
de una protena bacteriana.
132
B
kDa
kDa
172
250
110
150
79
111
75
62
50
48
37
36
*
24
19
25
133
6.4 Purificacin de la protena EhPAP recombinante (EhPAPr)

Una vez identificada la protena recombinante, se procedi a purificarla bajo
condiciones desnaturalizantes. Para lo cual se crecieron nuevamente bacterias E.coli
BL21 (DE3) pLysS transformadas con el plsmido pRSET-EhPap para expresar la
protena recombinante y se us un amortiguador (B) a un pH 8.0 para lisar las bacterias
y obtener las protenas totales. Estas se pasaron a travs de una columna de Ni-NTA, a
la cual se unieron las histidinas del extremo amino de la EhPAPr, mientras que las
protenas bacterianas no fueron retenidas en la columna. Para comprobar la
purificacin de la EhPAPr, todas las fracciones se analizaron por un SDS-PAGE al
10%. En el carril 1 se usaron como control las protenas totales de bacterias E. coli
BL21 pLysS transformadas sin inducir, mientras que en el carril 2 se observ expresin
de la protena EhPAPr en el amortiguador B o de lisis correspondiente a protenas de
bacterias transformadas e inducidas (Fig. 26, carril 2 y 3). La protena recombinante
purificada se recuper en el amortiguador E de pH 4.5 (Fig. 26, carril 6), mientras que
en los lavados con amortiguador C (pH 6.3) y D (pH 5.9) no presentaron la EhPAPr
(carril 4 y 5). Para confirmar estos resultados, se realiz un PAGE al 10% (Fig. 27 A) y
un ensayo de Western blot con el anticuerpo monoclonal anti-histidinas 6X, donde se
observ que el anticuerpo reconoci una banda de ~66 kDa (Fig. 27 B, carril 2) en la
fraccin de elucin E, la cual correspondi a la EhPAPr purificada (Fig.27 A, carril 2).
Ningn reconocimiento se vi en las bacterias transformadas sin inducir (Fig. 27 A y B,
carril 1)
134
Figura 26. Purificacin de la EhPAPr mediante cromatografa de columna de agarosaNiquel (Ni-NTA). PAGE al 10% de las diferentes fracciones de la purificacin. Carril 1,
protenas totales de bacteria E.coli BL21 (DE3) pLysS transformadas con el plsmido
pRSET-EhPap sin inducir; carril 2, lisado clarificado obtenido en el amortiguador B pH 8
de lisis; carril 3, protenas totales contenidas en el amortiguador B pasado 7 veces por
la columna de Niquel; carril 4, fraccin recuperada del lavado de la columna con
amortiguador C pH 6.3; carril 5, fraccin recuperada con el amortiguador D de pH 5.9;
carril 6, elucin de la protena EhPAPr en el amortiguador E pH 4.5. La flecha indica a
la EhPAPr.
135
kDa
172
110
79
62
48
36
24
19
136
Figura 27. Inmunodeteccin de la protena recombinante EhPAPr purificada. A. Gel

teido con Coomassie conde se muestra la expresin de la EhPAPr. Carril 1, protenas
totales de bacteria E.coli BL21 (DE3) pLysS transformadas y sin inducir; carril 2,
protenas totales de bacteria con 3 hr de induccin; carril 3, fraccin obtenida de la
purificacin por columna de Niquel. B. Ensayo de Western blot con un anticuerpo antihistidinas. Carril 1; protenas totales de bacteria E.coli BL21 (DE3) pLysS transformadas
sin inducir; carril 2, protena EhPAPr purificada. Las flechas muestran la protena
EhPAPr.
137
B
kDa
181
115
82
63
48
kDa
172
110
79
62
48
36
37
24
25
19
138
6.5 Electroelucin de la protena EhPAP recombinante (EhPAPr)

Para obtener grandes cantidades de EhPAPr y poder inmunizar a los ratones, se
realizaron cultivos masivos de bacterias E.coli BL21 (DE3) pLysS transformadas con el
plsmido pRSET-EhPAP y crecidas bajo condiciones semejantes a las descritas
anteriormente (Materiales y Mtodos).
La fraccin de elucin de la protena (amortiguador E pH 4.5) se analiz
mediante un gel preparativo de SDS-PAGE al 10%, el cual se ti con azul de
Coomassie. Una vez identificada la EhPAPr se cort finamente la banda y se realiz la
electroelucin que consiste en realizar una electroforesis para separar la EhPAPr del
gel en una cmara de electroelucin con un buffer de corrida Tris-Glicina-SDS,
durante 1 hr a 100 V, a temperatura ambiente. La protena EhPAPr recuperada se
cuantific por medio de Bradford y se almacen a -20 C hasta su utilizacin.
6.6 Inmunizacin de ratones Balb-c para la obtencin de anticuerpos.

Para obtener anticuerpos policlonales especficos contra la EhPAP se utilizaron
seis ratones BALB/c de 4 semanas de nacidos. Cinco se inocularon con 100g de la
protena EhPAPr purificada y el sexto se us como control negativo y no se inocul. La
inmunizacin se llev a cabo conforme a la siguiente metodologa:
Obtencin
de
suero
preinmune
1a inmunizacin (100 g)
50 l de adyuvante
completo de Freund
Da 10: 2a inmunizacin (100 g)
50 l de adyuvante
incompleto de
Freund
Da 21: 3a inmunizacin (100 g)
50 l de adyuvante
Da 0:
volumen final de
100 l
complementando
con PBS pH 7.4
139
incompleto de
Freund
Da 30: obtencin de suero
Para verificar que los anticuerpos policlonales obtenidos reconocan a la

EhPAPr, se realiz un ensayo de Western blot con una fraccin purificada de EhPAPr
en donde se observ que el anticuerpo reconoce una banda ~66 kDa, correspondiente
a la EhPAPr (Fig. 28 A, carril 2), comparada con un control negativo de extractos totales
de bacterias E.coli BL21 (DE3) pLysS transformadas y sin inducir (Fig. 28 A, carril 1).
6.7 Localizacin subcelular de la EhPAP

Para estudiar la localizacin subcelular de la EhPAP, se obtuvieron extractos nucleares
(EN) y citoplsmicos (EC) de trofozotos de la clona A. Se utiliz la metodologa descrita
en materiales y mtodos, la cual consiste en lisar la membrana citoplsmica para
obtener los extractos citoplsmicos y una fraccin enriquecida en ncleos. Se verific
la integridad de los extractos por medio de un SDS-PAGE al 10% y se realiz un
ensayo de Western blot utilizando el suero anti-EhPAPr (Fig. 28 B). En los EN, el
anticuerpo especfico detect una protena de ~60kDa, la cual corresponde al peso
molecular predicho para la EhPAP. Tambin se detect una protena adicional de ~63
kDa, la cual podra ser el resultado de la fosforilacin de EhPAP en los sitios de
fosforilacin anteriormente descritos o de alguna otra modificacin postraduccional. La
presencia de ambas isoformas de la EhPAP de 60 y 63 kDa en el ncleo, correlaciona
con los eventos nucleares de la sntesis del RNA y el procesamiento de extremo 3
terminal del RNAm. De manera interesante, las mismas bandas de 60 y 63 kDa fueron
inmunodetectadas con la
misma intensidad en los EC donde las protenas son

140
sintetizadas, aunque se desconoce si en el citoplasma la EhPAP sea funcional. Para

corroborar que los resultados obtenidos son verdicos y como control del protocolo de
fraccionamiento realizado, se utiliz el anticuerpo Mab8 el cual se haba demostrado
previamente mediante ensayos de inmunofluorescencia que detecta el complejo
EhCPADH en membranas citoplsmicas de trofozotos (Garca-Rivera y col., 1999). Los
anticuerpos Mab8 reconocieron una banda de 116 kDa, la cual corresponde al complejo
EhCPADH que se localiza en citoplasma, pero no fue reconocida en la fraccin nuclear
como se esperaba (Fig. 28 B, carril 3 y 4). Esto demuestra
la
ausencia
de
contaminacin cruzada entre ambas fracciones y confirma

que el protocolo de fraccionamiento usado permite determinar la localizacin subcelular
de EhPAP de manera adecuada.
6.8 La expresin de EhPAP aument en la fase G1 y S del ciclo celular

Como se mencion anteriormente, existen reportes de que la inactivacin por
fosforilacin de la PAP nuclear en mitosis es importante en la progresin del ciclo
celular en otros organismos. Para conocer la posible relacin de la EhPAP con el ciclo
celular de los trofozotos, se realiz un anlisis de la expresin del RNAm del gen
EhPap durante las fases del ciclo celular de E. histolytica. Se utilizaron 1X106
trofozotos de la clona L-6 en fase exponencial crecidos en tubos de vidrio, los cuales
se trataron con colchicina para sincronizarlos en las diferentes fases del ciclo celular,
de los cuales se obtuvo el RNA total. La reaccin de RT-PCR semicuantitativa se
realiz segn el protocolo estandarizado por Lpez y col., (2003) descrito en materiales
y mtodos. Se sintetiz el cDNA por medio de la enzima Superscript II (200U/l). Se
tom 1/5 del cDNA sintetizado y se realiz una PCR usando oligos especficos, los
141
Figura 28. Ensayo de Western blot con el anticuerpo especfico anti-EhPAP. A.

Western blot de la fraccin purificada de la EhPAPr. Carril 1, protenas totales de
bacteria E.coli BL21 (DE3) pLysS transformadas con el plsmido pRSET-EhPap y sin
inducir; carril 2, fraccin purificada y concentrada de EhPAPr. B. Western blot para
determinar la localizacin subcelular de la EhPAP. Carril 1, EhPAP en EN; carril 2,
EhPAP en EC; carril 3, y 4 son control de los EN y EC usando un anticuerpo Mab 8
respectivamente.
142
A
kDa
115
C
1
B
2
kDa
115
82
150
63
100
75
82
63
48
48
50
37
37
37
25
25
143
cuales amplificaron un fragmento interno de 405 pb del gen EhPap. Como control se
usaron oligos para el gen de actina. Se realiz una electroforesis de los productos de
amplificacin en un gel de agarosa al 1% TBE 1X y las diferencias en la cantidad de
transcrito EhPap durante las fases del ciclo celular se analizaron por densitometra.
Los valores obtenidos para el RNAm del gen EhPap se normalizaron como los
valores de actina en cada fase y se expresaron en porcentaje, tomando como 100% el
valor de actina. Los estudios muestran que el RNAm de EhPap se expresa
principalmente en la fase G1 (que corresponde a un 83% con respecto a la expresin
del RNAm de actina) y en la fase S (con un 56 % con respecto a la expresin del RNAm
de actina). Es interesante resaltar que el gen EhPap no parece expresarse en la fase M
ni el la fase G2 (Fig. 29 A y C), sin embargo, no se descarta que la expresin del RNAm
de este gen en las fases M y G2 sea tan baja que no se puede detectar a travs de
ensayos de RT-PCR utilizando RNA total como molde. En contraste, la expresin del
RNAm del gen de actina permanece casi constante durante la progresin del ciclo
celular (Fig. 29 B).
144
Figura 29. Anlisis de la expresin del RNAm del gen EhPap durante el ciclo celular. A.
RT-PCR semi-cuantitativa de EhPap del RNAm total de trofozotos de la L6
sincronizados en las fases M, G1, S y G2. B Control positivo del gen de actina. C.
Anlisis densitomtrico de los niveles de RNAm del gen EhPap y actina en la clona L6
sincronizada. El producto de actina que fue tomado como el 100% de los pixeles en
cada linea y los niveles de los productos de EhPap fueron expresados en pixeles con
respecto a actina en cada linea. Fases del ciclo celular: M, mitosis; G1; S, sntesis; G2
145
actina
EhPap
actina
146
7. DISCUSION
La amibiasis humana es causada por el parsito protozoario E. histolytica que a
nivel mundial afecta aproximadamente del 10 al 12 % de la poblacin, adems de que
representa un grave problema de salud pblica en Mxico. Para poder entender las
bases moleculares del proceso de infeccin de este parsito es necesario conocer los
factores que regulan la expresin gentica en las diferentes etapas de su ciclo de vida,
quiste y trofozoto, as como en las fases del ciclo celular. Dentro del estudio de la
expresin gentica en eucariontes, se encuentran diversos niveles de control que
permiten que la expresin se lleve a cabo de manera eficaz. En E. histolytica no se han
reportado estudios sobre el procesamiento del pre-RNAm el cual incluye principalmente
al capping, el splicing y la reaccin de corte y poliadenilacin, los cuales han sido bien
estudiados en eucariontes superiores (Day y Tuite, 1998; Mignone, 2002; Proudfoot
2002).
En estos procesos se ha reportado la participacin de mltiples factores
proticos y de secuencia que permiten que se lleve a cabo el procesamiento del preRNAm, y que algunos de estos factores no son exclusivos de un proceso, sino que
pueden participar simultneamente en diversos eventos tales como la transcripcin, el
splicing y el capping.
En E. histolytica se identificaron algunos factores involucrados en el

procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm entre los cuales est el homlogo a la poli
(A) polimerasa de eucariontes (Lpez-Camarillo y col, 2005). La poli(A) polimerasa de
eucariontes tambin participa en el proceso de splicing, interactuando con los factores
U1A y U2AF65 (Boelens 1993; Raju y Jacob, 1988; Vagner 2000), lo cual podra
indicar que participa activamente en el proceso de corte de los intrones. Se ha
147
reportado adems, que durante el ciclo celular de los eucariontes, la PAP se inactiva en
la fase M al ser hiperfosforilada por la p34cdc2/ciclina B, inhibiendo su funcin. Este
fenmeno origina que los transcritos celulares no sean poliadenilados afectando de esta
manera su eficiencia de traduccin, lo cual disminuye la expresin gentica de manera
general. Recientemente se ha reportado que la estabilidad del RNAm del gen EhPgp5
participa de manera importante en la regulacin del fenotipo de resistencia a mltiples
frmacos en E. histolytica (Lpez-Camarillo., 2003) en donde se demostr que hay un
incremento en la vida media y el tamao de la cola de poli (A) en el RNA m en
trofozotos de la clona C2 crecidos a altas concentraciones de emetina. Sin embargo,
se desconocen los mecanismos que determinan el aumento en la longitud del tracto de
poli (A) y el papel que podra tener la poli(A) polimerasa en la regulacin del tracto de
poli(A).
En este trabajo nos enfocamos al estudio de la PAP nuclear de E. histolytica

(EhPAP), donde primeramente realizamos un anlisis in silico de la secuencia obtenida
de los bancos de datos del genoma del parsito. Los anlisis de alineamientos mltiples
muestran que la secuencia de EhPAP contiene los dominios conservados descritos en
otras PAPs de diferentes organismos (Fig 17). La EhPAP puede ser clasificada como
una protena de la familia de las DNA polimerasas nucleotidil-transferasas tipo , debido
a que presenta en su extremo N-terminal, de los aminocidos 36 a 131, el dominio PAP
central cataltico caracterstico en los miembros de esta familia (Pfam PF04928), as
como tres residuos activos de aspartato invariantes (D76, D78 y D130) y un dominio de
transferencia de nucletidos de los aminocidos 63 a 65 el cual se conoce como
148
dominio F/YGS y que es el responsable de la unin del ATP (Pfam PF01909); mientras
que en el extremo carboxilo se encuentra un dominio de unin a RNA de los
aminocidos 322-444 aa (Pfam PF04926). Es interesante resaltar que la EhPAP no
presenta una seal de localizacin nuclear tpica (NLS1), lo que sugiere que para
llevarse a cabo la translocacin nuclear de EhPAP otros factores o secuencias pueden
estar involucrados. Al realizar una comparacin de la secuencia de la EhPAP con la
PAP II de humano se observ que no presenta aproximadamente 100 aa en el extremo
C-terminal donde se localiza la segunda seal de localizacin nuclear de humano (NLS
2) y que es un dominio rico en serina y treonina (Fig. 18). En eucariontes superiores, se
ha estudiado el mecanismo del transporte nuclear, el cual est regulado por medio de
diversas protenas que se unen a una seal de localizacin nuclear (NLS) la cual es
conservada en la mayora de las protenas, sin embargo se ha demostrado que no es la
nica y que se han identificado otras seales tales como la seal NES (nuclear export
signal, por sus siglas en ingls) la cual es una secuencia rica en leucina localizada en el
extremo C- terminal, mientras que en el extremo N- terminal tambin se han identificado
en algunas protenas seales de localizacin nuclear conocidas como APE 1. Ambas
seales suplen la funcin de la seal de localizacin nuclear tipica (NLS 1), (Moroianu,
1998, Xiao y col., 2001; Jackson y col., 2005).
Al realizar el anlisis filogentico de la EhPAP con respecto a las PAPs de otros

organismos se observ que existe una evolucin progresiva de estas protenas que va
desde eucariontes inferiores a superiores y que la EhPAP divergi en una etapa
temprana en la escala evolutiva, sin embargo el hecho de que sea un rbol filogentico
sin raz, nos indica que no hay un ancestro comn, sino que estn ligadas entre s.
149
Mediante ensayos de Western blot usando un anticuerpo anti-histidinas, la

protena EhPAPr present un peso molecular de ~66 kDa, el cual es el esperado para la
secuencia predicha (fig. 25). Sin embargo, se identific una banda inespecfica de un
peso molecular de ~27 kDa en los extractos totales de bacterias inducidas. La identidad
de esa protena se desconoce. Por otra parte, mediante ensayos de Western blot en EN
y EC de trofozotos de la clona A usando los anticuerpos dirigidos contra la EhPAP se
identificaron dos bandas de 60 y 63 kDa que corresponden probablemente a isoformas
de la EhPAP. En estudios realizados en humano, bovino y rana, se ha demostrado que
existen diferentes isoformas (PAPs I, II y III) las cuales se generan por medio de splicing
alternativo o por competencia entre la poliadenilacin y el splicing. PAP I y II son las
isoformas ms grandes, presentan el dominio de unin al RNA, la regin cataltica, 2
seales de localizacin nuclear (NLS) y el extremo C-terminal rico en Ser/Thr, mientras
que la PAP III es de menor tamao y carece tanto del extremo C-terminal rico en S/T
as como de las NLSs. En ratn tambin se han identificado diversas isoformas de
PAPs, sin embargo hay reportes donde se observa que la PAP II se expresa en todos
los tejidos mientras que la I se expresa en tejidos especficos (Zhao y col., 1996). Otro
mecanismo por el cual se generan PAPs de diferentes tamaos es por fosforilacin de
residuos especficos. En el ciclo celular de eucariontes, se ha reportado que la
inactivacin de la PAP nuclear en la fase de mitosis ocurre mediante la
hiperfosforilacin de la protena lo que da como consecuencia que se generen RNAm
poli(A-) y un silenciamiento en la expresin gentica (Colgan y col., 1996, 1997, 1998).
Actualmente no sabemos si las isoformas de la EhPAP que detectamos en los ensayos
de Western blot se generan mediante diferentes grados de fosforilacin y si stas son
funcionales in vivo.
150
Mediante ensayos de RT-PCR se observ que existe una disminucin de la

expresin del gen EhPap en la fase M y en la fase G2. Estos datos sugieren que la
disminucin de la expresin del gen EhPap en la fase M pudiera estar regulando de
manera negativa la expresin gentica en el ciclo celular. En eucariontes se conoce que
la PAP regula la expresin de genes en la fase M al ser inactivada por
hiperfosforilacin. Sin embargo no se ha definido si cambios en la expresin del RNAm
de la Pap de eucariontes tambin estn involucrados en este mecanismo.
En conclusin, nuestros resultados indicaron que en el genoma de E. histolytica

existe un gen que codifica para una posible poli(A) polimerasa (EhPAP), la cual
presenta los dominios conservados reportados en PAPs de otras especies, lo que
sugiere que esta protena podra ser la responsable de la poliadenilacin del extremo 3
terminal de los RNAm. En este trabajo se realiz la caracterizacin de la EhPAP, y se
propone que en un futuro se realicen estudios funcionales que demuestren su particin
en la poliadenilacin y/o en otros procesos reportados de otras PAPs de diferentes
organismos, lo que deja abierta la posibilidad conocer ms a fondo la regulacin
postranscripcional del RNAm de los genes de E. histolytica.
151
8. CONCLUSIONES
1. En el genoma de E. histolytica se identific el gen de la EhPap de 1566 pb, el cual no

contiene intrones, que codifica para una protena de 522 aa con un peso molecular
predicho de 59.18 kDa.
2. La EhPAP pertenece a la familia de las las DNA polimerasas nucleotidil-transferasas

tipo , ya que presenta los dominios funcionales caractersticos de stas como como el
dominio de unin a RNA y la regin cataltica, aunque no presenta una NLS
conservada.
3. La EhPAP presenta alta homologa e identidad con PAPs nucleares de otros

organismos.
4.
El gen EhPap se clon en un vector de expresin (pRSET-A), para obtener la
protena EhPAP recombinante (EhPAPr) con la cual se generaron anticuerpos

especficos en ratones.
5. En EN y EC se identificaron 2 bandas de 60 y 63 kDa por medio de ensayos de

Western blot usando los anticuerpos especficos y se comprobaron la identidad de los
extractos con el anticuerpo Mab 8, que identifica el complejo EhCPADH112 que se
encuentra en los extractos citoplsmicos.
152
6. En la fase M y G2 del ciclo celular, la expresin gentica del RNAm del gen EhPap
disminuy con respecto a las fases S y G1 de este gen y con la expresin del gen de
actina en todas las fases en ensayos de RT-PCR.
153
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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATA

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR

JESSICA MARIA GARCIA VIVAS

MXICO, D.F., FEBRERO DEL 2006.

Antecedentes histricos de la amibiasis

Ciclo de vida de E. histolytica

Generalidades sobre la regulacin de la expresin gnica en

Procesamiento del pre-RNAm en eucariontes

2.2.1 Capping del pre-RNAm

2.2.2 Splicing del pre-RNAm

2.2.3 Corte y poliadenilacin del pre-RNAm

Secuencias cis-reguladoras que participan en el corte y

Maquinaria de corte y poliadenilacin

2.4.1 Factor de especificidad del corte poliadenilacin (CPSF)

2.4.2 Factor de estimulacin de corte (CstF)

2.4.3 Factores de Corte (CFlm y CFllm)

2.4.4 oli (A) polimerasa (PAP)

2.4.5 rotena de unin al tracto de poli (A) II (PABP II)

2.4.6 Protenas adicionales

Mecanismo de corte y poliadenilacin

2.5.1 Corte del pre-RNAm

Importancia de la cola de poli (A) del RNAm

Poli(A) polimerasa en eucariontes

2.8.2 Participacin de la PAP en el splicing del RNAm

Poli (A) polimerasa en el ciclo celular

2.9.1 Generalidades del ciclo celular

2.9.2 Mecanismos de regulacin del ciclo celular

2.9.3 Papel de la PAP en el ciclo celular

Identificacin de las posibles secuencias en cis y

el procesamiento del pre-RNAm en E. histolytica

2.10.1 Identificacin de protenas involucradas en el

2.10.2 Papel de la poliadenilacin en el fenotipo de

4.1 Objetivo general

4.2 Objetivos especficos

5.1 Estrategia Experimental

5.2 Anlisis in silico de la secuencia del gen EhPap

5.3 Subclonacin del gen EhPap en el vector pRSET-A

5.3.1 Restriccin enzimtica

5.3.3 Preparacin de bacterias competentes

5.3.4 Transformacin de bacterias por choque trmico

5.3.5 Mini-preparacin de DNA plasmdico

5.4 Expresin de la protena EhPAP recombinante

5.5 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)

5.6 Purificacin de la protena EhPAP recombinante

5.7 Electroelucin de la protena EhPAP recombinante

5.8 Inmunizacin de ratones para obtener anticuerpos

5.9 Cultivo de trofozotos

5.10 Obtencin de extractos nucleares y citoplsmicos de la clona A

5.11 Ensayos de Western blot

5.12 Sicronizacin de trofozoitos de la clona L-6

5.13 Obtencin del RNA total de los trofozoitos sincronizados

5.14 Ensayo de RT-PCR semi-cuantitativa

6.1 Anlisis in silico: La EhPAP es una protena evolutivamente

6.2 Subclonacin del gen EhPap en el vector pRSET-A

6.2.1 Restriccin enzimtica

6.2.3 Anlisis de clonas y mini-preparaciones de DNA

6.3 Expresin de la protena EhPAP recombinante

6.4 Purificacin de la protena EhPAP recombinante

6.5 Electroelucin de la protena EhPAP recombinante

6.6 Inmunizacin de ratones para la obtencin de anticuerpos

6.7 Localizacin subcelular de la EhPAP

6.8 La expresin de EhPAP aument en la fase G1 y S