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POLIMORFISMO GENTICO DE
Echinococcus granulosus AISLADOS DE
DIFERENTES HOSPEDEROS DE REAS
ENDMICAS DEL PER
[2002]
TITULO DE LA INVESTIGACIN
Autores
M.Sc.: Elizabeth Snchez Roman
Laboratorio de Biotecnologa y Biologa Molecular del Centro Nacional en Salud
Pblica- INS. Telf. 4719920 anexo 129. Capac Yupanqui 1400 Jess Mara
esanchez@ins.gob.pe
Apoyo Tcnico
Tec. Lab. David Garca Neyra
Divisin de Biotecnologa y Biologa Molecular del Centro Nacional en Salud
Pblica- INS
Telf. 4719920 anexo 129. Cpac Yupanqui 1400 Jess Mara
leongarcia2000@yahoo.com.mx
RESUMEN ESTRUCTURADO
susceptibilidad
quimioterapia,
patognesis
caractersticas
Las diferencias entre los genotipos de Echinococcus granulosus representan una de los
puntos principales a ser considerados en cualquier estudio epidemiolgico dirigido al
establecimiento del programa de control de la hidatidosis. Estas diferencias no solo reflejan
distintas caractersticas biolgicas, con importantes implicaciones en el estudio serolgico a
nivel poblacional y en el desarrollo futuro de estrategias para quimioterapia y vacunacin,
sino tambin refleja el potencial infectivo de estos diferentes genotipos para el hombre.
Objetivo General:
Determinar la variabilidad gentica o polimorfismo gentico de Echinococcus
granulosus circulantes en las diferentes reas endmicas del Per.
Objetivos Especficos:
Estandarizacin de los procedimientos para la extraccin de ADN a partir de
protoesclices de Echinococcus granulosus.
Determinacin del Polimorfismo gentico del parsito utilizando PCR-SSCP de
los genes COI y NDI
HIPTESIS :
Echinococcus granulosus presenta variantes genticas o polimorfismo gentico distribuidos
en las diferentes reas endmicas del Per.
METODOLOGA
Tipo de estudio
Es un estudio Descriptivo y Analtico cuya duracin es de un ao
rea de estudio (Describir las caractersticas del rea relevantes para el estudio)
La zona Sierra del Per es considerada rea endmica a Hidatidosis sobre todo aquellas
donde existe crianza de ganado ovino, bovinos entre otros. Por esta razn se visitaran los
camales en donde se beneficia al ganado para colectar el lquido hidatdico de los
departamentos de Ica, Ayacucho, Cajamarca y Ucayali.
Sujetos (Mencionar el tamao de la poblacin y el nmero de sujetos en la poblacin con la
condicin a estudiar en el centro de salud u hospital donde se realizar el estudio)
Se obtendr liquido hidatdico de por lo menos 10 animales de cada especie (ovino, vacuno,
etc.) sacrificados e infectados con el parsito en cada camal de un rea endmica del Per.
Los datos de las muestras obtenidas sern registradas en una ficha epidemiolgica
elaborada para tal fin ( anexo I ).
Se procurara obtener, en todo momento, las capas germinativas de cada quiste elegido.
Criterios de Inclusin y Exclusin
Criterios de Inclusin: Se obtendrn muestras de lquido hidatdico transparente de
pulmn y/o hgado de ganado ovino, bovino, caprino y camlidos.
Criterios de Exclusin: No se tomaran en cuenta lquido hidatdico contaminado (color
amarillo) ni quistes calcificados.
Diseo Muestral (Determinar el tamao mnimo muestral y el tipo de muestreo empleado)
Se trabajara con 10 animales de cada especie que presente quistes hidatdicos y que lleguen al camal
para ser sacrificados, por lo tanto el muestreo es al azar pues depender de la existencia de animales
infectados del total de animales sacrificados en el camal.
las muestras colectadas en esta oportunidad as como las muestras previamente colectadas
(Cuzco, Arequipa, Puno, Junn y Huancavelica) sern centrifugados a 5000 r.p.m por 10
minutos con la finalidad de colectar los protoesclices, los cuales sern lavados con
solucin salina isotnica para luego ser fijados en alcohol al 95% y mantenidos a -20C
hasta su procesamiento.
Para realizar sta tcnica, 10 ul. del producto de PCR ser mezclado con 10 ul. de buffer
SSCP (10 mM NaOH, 95% formamida, 0.05% azul de bromofenol y 0.05% xylene
cyanole), denaturado a 95C por 5 minutos e inmediatamente colocado a -20C por 10
minutos.
Un volumen de 3.5 ul. de cada muestra sern colocados en los pocillos de un gel de
poliacrilamida no denaturante tipo secuenciamiento (0.6X MDE: Mutation Detection
Enhancement) y sometido a una electroforesis convencional a 7 W por 20 horas y a 20C.
Las diferencias de corrida sern visualizadas al teir el gel con nitrato de plata segn el
procedimiento descrito por Bassam, B. J. y cols. (1991).
Secuenciamiento de los fragmentos genticos NDI y COI
Para confirmar las diferentes variantes de Echinococcus granulosus detectados por SSCP,
los productos amplificados por PCR de los genes NDI (525 pb) y COI (460 pb) sern
secuenciados y analizados utilizando un secuenciador automtico de ADN (ALF Express,
Amersham Biosciences) para observar las mutaciones presentes en cada variante.
RAPD-PCR de protoesclices de Echinococcus granulosus.
Para evidenciar y confirmar las variantes de Echinococcus granulosus, se utilizar la
tcnica de RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain
Reaction), en este caso DNA genmico e intacto extrado de E. granulosus ser sometido a
un PCR utilizando 4 primers aleatorios reportados (Scott J.C. and McManus D.P 1994).
Los patrones obtenidos sern visualizados en un gel de agarosa al 1.5% teido con bromuro
de etidio. Los diversos productos de amplificacin sern analizados utilizando software
informticos especializados (Gel Compar II) para determinar las variantes de Echinococcus
granulosus.
Polimorfismo Gentico: Variacin a nivel de un gen o regin de ADN que presentan los
individuos de una misma especie, esta variacin ocurre en la secuencia de los
nucletidos de la regin de ADN elegida para el anlisis y que es producto de
mutaciones que suceden a lo largo del tiempo.
SSCP: Tcnica molecular muy utilizada para evidenciar mutaciones en una regin
pequea de ADN, se basa en la movilidad electrofortica diferente de las molculas de
ADN de simple hebra, la diferencia en la movilidad es resultado de las diferentes
estructuras secundarias adoptadas por las simples hebras de ADN.
RAPD: Tcnica molecular muy til para determinar polimorfismo gentico en los
organismos, esta basada en la tcnica de PCR cuya diferencia es que utiliza primers o
iniciadores pequeos (10 bases) cuya secuencia es al azar. Se emplean 2 o 3 pares de
primers los cuales originan un patrn de bandas de amplificacin el cual es especfico
para cada especie o variante gentica.
INDICADORES PARA EL MONITOREO (Describir los indicadores que servirn para supervisar y
monitorear al estudio, este tem necesariamente debe ser llenado)
Todas las muestras de protoesclices sern corroboradas de que son Echinococcus granulosus al
realizarse las mediciones morfomtricas de los ganchos del rostelo; los anlisis moleculares sern
realizados utilizando controles positivos de los diferentes genotipos reportados para Echinococcus
granulosus de otros pases.
ANLISIS DE LOS DATOS (Mencionar las variables dependientes e independientes, las pruebas
estadsticas a utilizar, y el software)
Se utilizar el programa LabWorks 4.0 (UVP) para capturar las imgenes de los geles producto del
SSCP y del RAPD, luego se usar el programa Gel Compar II (Applied Maths) para determinar
exactamente la variabilidad de las cepas y el programa MEGA 2 para analizar las relaciones
filogenticas entre los genotipos de Echinococcus granulosus.
ASPECTOS TICOS (Mencionar si habr consentimiento informado en estudios que impliquen
humanos y explique. Mencionar si solicitar aprobacin de algn Comit de tica)
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Bowles, J.; Blair, D. & Mc Manus, D.P. A molecular phylogeny of the genus
Echinococcus. 1995. Parasitology. 110: 317-328.
Bowles, J.; Blair, D. & Mc Manus, D.P. Molecular genetic characterization of the
cervid strain (Northern form) of Echinococcus granulosus. 1994. Parasitology 109:
215-221
Bowles, J.; Blair, D. & Mc Manus, D.P Genetic variants within the genus
Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. 1992. Molecular and
Biochemical Parasitology 54: 165-174
Bowles, J and Mc Manus, D.P. NADH dehydrogenase 1 gene sequences compared for
species and strains of the genus Echinococcus. 1993b. Int. J. Parasitol. 23(7): 969-972
Gasser R. B; Zhu X. and McManus D. P. Display of sequence variation in PCRamplified mitochondrial DNA regions of Echinococcus by single-strand conformation
polymorphism. 1998. Acta Tropica 71: 107-115
Mc Manus, D.P. & Smyth, J.D. Hydatidosis: Changing concepts in epidemiology and
speciation. 1986. Parasitology Today 2: 163-168.
Schantz, P. M. ; Chai, J.; Craing, P.S.; Eckert, J..; Jenkings, D.I.; Macpherson,
C.N.L. & Thakur, A. Epidemiology and Control of Hydatid disease Echinococcus and
Hydadtid disease. 1995. CAB International, Willingford.
Thompson R.C.A. & Lymbery, A.J. The nature extent and significance of variation
within the gens Echinococcus. 1988. Advances in Parasitology. 27:210-263.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDAD/MES
9 10 11 12
x
x
x
x
x x x x
x x x
x x x x x
x
x
x
PRESUPUESTO
PRESUPUESTO DETALLADO
RUBRO
Recursos humanos
COSTO
NMERO DE
UNITARIO UNIDADES
03 Bilogos
01 Mdico
01 Tec. Lab.
TOTAL
800.00
1500.00
02 viales
01 Frasco
1600.00
1500.00
1800.00
02 viales
3600.00
6800.00
1 kit
6800.00
3600.00
1 kit
3600.00
110.00
500.00
3500.00
01 frasco
01 frasco
01 Kit
110.00
500.00
3500.00
MATERIALES E INSUMOS
Insumos:
Marcador de DNA 100 pb
MDE (Mutation Detection Enhancement) gel
de poliacrilamida x 250 mL
Enzima DNA polimerasa de alta fidelidad,
termoactivable 5U/ul x 500 U
Kit de secuenciamiento TermoSequenase Cy5
Dye terminador kit x 100 Rxns
Enzima DNA polimerasa termoactivable
5U/ul x 1000U
Tiosulfato de Sodio pentahidratado x 1kg
Nitrato de plata x 100 g
Kit purificacin Qiaquick para productos de
PCR x 250 rxns
Materiales de laboratorio:
8000.00
Software LabWorks 4.0
700.00
Tubos para PCR de 0.2ml (caja x 1000)
Tubos de microcentrifuga x 1,5 ml (caja x 400.00
500 unidades)
Fotografias instantneas Polaroid 665 caja x 150.00
10 fotos
500.00
Tips con filtro de 200 ul (caja x 1000)
600.00
Tips con filtro de 20 ul (caja x 1000)
500.00
Tips con filtro 0,5-10 ul (caja x 1000)
Sub Total
01 unidad
01 caja
03 cajas
8000.00
700.00
1200.00
04 cajas
600.00
01 caja
01 caja
01 caja
500.00
600.00
500.00
33310.00
PRESUPUESTO MENSUALIZADO
RUBRO/MES
RECURSOS
HUMANOS
MATERIALES
E INSUMOS
Pasajes
terrestres ida y
vuelta a Ica
Pasajes areos
ida y vuelta a
Ayacucho,
Cajamarca y
Ucayali
Viticos por 6
das
TOTAL
1
x
2
x
3
x
4
x
6
x
7
x
8
x
9
x
10
x
11
x
12
x
TOTAL
33310.00
20 soles x
2 personas
= 80.00
5
x
480soles x
2 personas
x 3 dptos
= 2880.00
110soles x
2 personas
x 6 dias x
4 dptos =
5280.00
41550.00
ANEXO I
Tipo de muestra:
Cdigo de la muestra:
Fecha de obtencin de la muestra:...
Tipo de hospedero intermediario: Ovino ( ), Vacuno ( ), Caprino ( ), Otros ( )..
Lugar de procedencia del hospedero intermediario:
Departamento:
Localidad:...
Matadero:
rgano de procedencia de la muestra:
Hgado ( )
Pulmn ( )