INSTITUTO TECNOLGICO DE LA PAZ

FUNDAMENTOS DE
ESPECTROMETRA
ULTRAVIOLETA-VISIBLE Y
CURVAS DE CALIBRADO
Tcnicas Bsicas Experimentales
Alumnas:
Arciga Plascencia Marisol
Calixto Heredia Lidda Mariam

Ingeniera Bioqumica
Profesor: M.D. Francisco Nieto Navarro

FUNDAMENTOS DE ESPECTROMETRA
ULTRAVIOLETA-VISIBLE Y CURVAS DE
La Paz, Baja California Sur a 06 de Mayo del 2015
1. INTRODUCCIN
La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que nos permite
determinar la concentracin de un compuesto presente en una solucin, como
la cantidad de protenas. Est basada en que las molculas absorben las
radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida
depende de forma lineal de la concentracin. La relacin entre la absorbancia
de la muestra y su concentracin puede representarse grficamente en lo que
denominamos Curva de calibracin, que son construidas para, mediante
interpolacin, poder obtener la concentracin de muestras problemas que se
adapten a la curva. Para hacer este tipo de anlisis se emplea un
espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz
que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma
[1]
.

Foto:
Luz
visible
Espectro:
Espectro de
radiacin
electromagnti
ca

Espectrometra

Metra:
Medici
n

. 2. ESPECTROMETRA ULTRAVIOLETA-VISIBLE
2.1 El espectro electromagntico
La radiacin ultravioleta (UV) y visible comprende slo una pequea parte del
espectro electromagntico, que incluye otras formas de radiacin como radio,
infrarrojo (IR), csmica y rayos X (Ilustracin 1). La regin UV del espectro
electromagntico se encuentra entre 0.6 y 380 nm y la regin visible, se
localiza entre los 380 y 780 nm[2].
El fundamento de la
espectroscopa
se
debe a la capacidad
de las molculas
para
absorber
radiaciones,
entre
ellas las radiaciones
Ilustracin 1. Espectro electromagntico

dentro del espectro UV- visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que
una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen
de la estructura atmica y de las condiciones del medio (pH, temperatura,
fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica constituye un
valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de biomolculas
[1]
.
La energa asociada con la radiacin electromagntica se define por la
siguiente ecuacin:
E = h
Donde E es la energa (en julios), h es la constante de Planck (6.62 10-34 Js)
y es la frecuencia (en segundos) [2].

2.2 Fenmenos de interaccin entre luz y materia: Origen de los

espectros UV-Visible
Cuando la radiacin interacciona con la materia, pueden ocurrir varios procesos
como
reflexin,
dispersin,
absorbancia,
fluorescencia/fosforescencia
(absorcin y reemisin) y una reaccin fotoqumica (absorbancia y rotura de
enlaces). En general, cuando se miden espectros UV-visible, slo es deseable
que ocurra absorbancia[2].

2.2.1 Fenmeno de absorcin

Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en
forma de energa interna. Cuando la luz es absorbida por una molcula
se origina un salto desde un estado energtico basal o fundamenta, a un
estado de mayor energa o excitacin. Slo se absorbe la energa que
permita el salto al estado excitado. Cada molcula tiene una serie de
estados excitados que la distingue del resto de molculas. Como
consecuencia, la absorcin que a distintas longitudes de onda presenta
una molcula (espectro de absorcin), constituye una sea de identidad
de la misma. Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la
que la sustancia estudiada absorbe la mayor cantidad de luz [3].

2.2.1 Fenmeno de emisin

Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado
fundamental produciendo la emisin de energa radiante. Fenmeno en
el que se basa la fluorescencia.

2.3 Longitud de onda y frecuencia

La radiacin electromagntica puede considerarse una combinacin de campos
elctricos y magnticos alternos que viajan por el espacio con un movimiento

de onda. Como la radiacin acta como una onda, puede clasificarse segn la
longitud de sta o la frecuencia, relacionadas por:
=c
Donde es la frecuencia (en segundos), c es la velocidad de la luz (3 108
ms-1) y es la longitud de onda (en metros). En espectroscopa UV-visible, la
longitud de onda normalmente se expresa en nanmetros (1 nm = 10-9 m). En
espectroscopa UV-visible, la luz UV de longitud de onda ms pequea tiene la
energa ms alta. En algunos casos, esta energa es suficiente para causar
reacciones fotoqumicas no deseadas al medir los espectros (recuerde, es el
componente UV de la luz el que causa las quemaduras solares) [4].

2.4 Transmitancia y Absorbancia

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io
incide perpendicularmente sobre una disolucin de un compuesto qumico que
absorbe luz o cromforo, el compuesto absorber una parte de la radiacin
incidente (Ia) y dejar pasar el resto (It), de
forma
que
se
cumple[2]:

Io = Ia + It
2.4.1 Transmitancia
Es la relacin entre la cantidad de luz
transmitida
que
llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, I t, y la cantidad
de luz que incidi sobre ella, I o, y se representa normalmente en tanto
por ciento:

T=

lt
lo

x100

La Transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad

incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relacin entre %T y la
concentracin no es lineal, pero asume una relacin logartmica inversa
[1]
.

2.4.2 Absorbancia
Es un concepto ms relacionado con la muestra, puesto que nos indica la
cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de
1/T, en consecuencia:
A = log 1/T = -log T = -log It/ Io.
Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (I o = It), la
transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una
determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0. La cantidad

de luz absorbida depender de la distancia que atraviesa la luz a travs

de la solucin del cromforo y de la concentracin de ste.
Para la mayora de las aplicaciones se utilizan valores de absorbancia, ya
que la relacin entre sta y tanto la concentracin como el paso ptico
es como ya se mencion, normalmente lineal [2].
A diferencia de la transmitancia, la absorbancia de una solucin aumenta a
medida que aumenta la atenuacin del haz de luz [6].

2.5 Leyes de Absorcin

De manera independiente, Pierre Bouguer en 1729 y Johann Heinrich
Lambert en
1760
establecieron
una relacin emprica que relaciona
la absorcin de luz con las propiedades del material atravesado [1,5].

T= I/Io = e

kb

Donde Io es la intensidad incidente, I es la intensidad transmitida, e es la base

de los logaritmos naturales, k es una constante y b es el paso ptico
(normalmente en centmetros).
La ley de Beer es idntica a la ley de Bouguer y Lambert, excepto porque est
expresada en trminos de la concentracin. La cantidad de luz absorbida es
proporcional al nmero de molculas absorbentes por las que pasa la luz [4,5].
Combinando las dos leyes se obtiene la ley Beer-Bouguer-Lambert:

T= I/Io = e

kbc

Donde c es la concentracin de las especies absorbentes (normalmente

expresada en gramos por litro o miligramos por litro). Esta ecuacin puede
transformarse en una expresin lineal tomando el logaritmo y, normalmente,
se expresa en la forma decdica:
A = log T = - log (I/Io) = log (I0/I) = bc
Donde es la absorcin molar o coeficiente de extincin. El coeficiente de
extincin () es caracterstico de una sustancia en condiciones definidas de
longitud de onda, disolvente y temperatura [1,2,4,5].

2.6 Instrumentacin
La medicin de absorbancia de la luz por las molculas se realiza en unos
aparatos llamados espectrofotmetros. Aunque pueden variar en diseo, en

especial con la incorporacin de ordenadores para el anlisis de datos, todos

los espectrofotmetros constan, segn se indica en la figura, de [2]:
Una fuente de energa radiante: lmpara de deuterio.
Un monocromador para la seleccin de radiaciones de una determinada
longitud de onda: filtros, prismas, redes de difraccin.
Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o
tubos) que contenga la muestra. Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico
transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o slice
fundido, porque el vidrio no transmite la radiacin UV.
Un detector de luz y un amplificador convertidor de las seales
luminosas en seales elctricas.
Un registrador o sistema de lectura de datos.

Ilustracin 1. Espectrofotmetro convencional

3. Construccin de curvas de calibracin

Un procedimiento analtico muy utilizado en anlisis cuantitativo es el llamado
de calibracin que implica la construccin de una curva de calibracin. Se
trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una
sustancia que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia presente
en una muestra incgnita. Una curva de calibracin es la representacin
grfica de una seal que se mide en funcin de la concentracin de un analito.
La calibracin incluye la seleccin de un modelo para estimar los parmetros

que permitan determinar la linealidad de esa curva, y en consecuencia, la

capacidad de un mtodo analtico para obtener resultados que sean
directamente proporcionales a la concentracin de un compuesto en una
muestra, dentro de un determinado intervalo de trabajo. En el procedimiento
se compara una propiedad del analito con la de estndares de concentracin
conocida del mismo analito (o de algn otro con propiedades muy similares a
ste). Para realizar la comparacin se requiere utilizar mtodos y equipos
apropiados para la resolucin del problema de acuerdo al analito que se desee
determinar.
La etapa de calibracin analtica se realiza mediante un modelo de lnea recta
que consiste en encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de
n puntos experimentales, donde cada punto se encuentra definido por una
variable x(variable independiente, generalmente concentracin del analito de
inters) y una variable y (variable dependiente, generalmente respuesta
instrumental). La recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al
origen (b) y una pendiente (m), mediante la ecuacin

y=mx +b .

A partir de la curva de calibracin (conjunto de concentraciones que describen

el intervalo en el cual se deber cuantificar el compuesto por analizar) y a fin
de asegurar que la recta encontrada con los puntos experimentales se ajuste
correctamente al modelo matemtico de la ecuacin se calculan los valores de
la ordenada al origen, la pendiente y el coeficiente de determinacin ( r

).

Por tener una buena exactitud y confiabilidad estadstica, el mtodo ms

empleado para encontrar los parmetros de la curva de calibrado es el mtodo
de los mnimos cuadrados Este mtodo busca la recta del calibrado que haga
que la suma de los cuadrados de las distancias verticales entre cada punto
experimental y la recta de calibrado sea mnima o tienda a cero. A la distancia
vertical entre cada punto experimental y la recta de calibrado se le conoce
como residual. En forma grfica se representa como:

Ilustracin 4. Curva de calibracin con n= 5

En la prctica para construir la curva de calibracin se utilizan disoluciones que

contienen concentraciones conocidas de analito, llamadas disoluciones patrn
o estndar. Los estndares o disoluciones patrn para construir la recta de
calibrado deben ser preparadas en forma independiente, a partir de una o
varias soluciones madre; el nmero de puntos a escoger depender del uso
que se d a la recta de calibrado. Si bien con dos puntos se puede construir
una curva, estadsticamente se requieren por los menos tres para que la curva
sea confiable; este nmero se suele aplicar a mtodos de rutina perfectamente
establecidos y validados (proceso por el cual se demuestra, por estudios de
laboratorio, que la capacidad del mtodo satisface los requisitos para la
aplicacin analtica deseada).
Sin embargo, si el mtodo est en una etapa de desarrollo, el nmero de
puntos mnimo ser de cinco o seis para que la variabilidad sea mnima y el
intervalo lineal sea suficiente. Hay que considerar que un aumento en el
nmero de puntos experimentales implicara mayor fiabilidad en la recta de
calibrado. La verificacin del comportamiento de un analito mediante una
curva de calibracin requiere un mnimo de cinco puntos para un intervalo de
confianza del 95 % y de ocho puntos para uno del 99 %.
Cabe mencionar que en la prctica es muy importante efectuar la medida del
blanco. Se llaman disoluciones blanco o simplemente blancos a las
disoluciones que contienen todos los reactivos y disolventes usados en el
anlisis, pero sin el analito. Los blancos miden la respuesta del procedimiento
analtico a las impurezas o especies interferentes que existan en los reactivos
o, simplemente, a las especiales caractersticas del instrumento de medida.

La medida de la seal del blanco puede realizarse: a) registrando directamente

la seal del blanco e incluir este punto experimental en la recta de calibrado
con x=0 como seal del blanco; o b) restar a la seal medida con el analito, la
seal media de varias lecturas del blanco (seal observada blanco).

Es importante sealar que los mtodos analticos son establecido por

instituciones nacionales o internacionales que proporcionan procedimientos y
caractersticas del mtodo y que concluyen con indicadores de calidad
(denominados caractersticas del desempeo analtico) que suelen incluir:
exactitud, precisin, especificidad, adems de los parmetros que se
determinan a partir de los curvas de calibracin.
Independientemente de la tcnica instrumental responsable de la seal
analtica (cuyas caractersticas se estudian en forma particular) los parmetros

que se determinan a partir de las curvas de calibracin obtenidas con

cualquiera de ellas son:

La linealidad: para demostrar la linealidad se requieren cumplir ciertos

criterios de aceptacin en la que estadsticamente se puede justificar
esa linealidad; para ello es necesario calcular: la pendiente (m), la
ordenada al origen (b) y el coeficiente de determinacin (r^2). Como
criterio de aceptacin de la linealidad a partir de la curva de calibracin
(conjunto de concentraciones que describen el intervalo en el cual se
deber cuantificar el compuesto por analizar) se considera r2>0.98

La sensibilidad: La sensibilidad de mtodo mide su capacidad para

discriminar entre pequeas diferencias en la concentracin del analito.
Dos factores limitan la sensibilidad.la pendiente de la curva de
calibracin y la precisin del sistema de medida. Para dos mtodos que
tengan igual precisin, el que tenga la mayor pendiente ser el ms
sensible; es importante sealar que para determinar la pendiente de la
curva se considera nicamente el intervalo lineal de la misma puesto
que cuando la curva pierde su linealidad la pendiente tambin es
diferente.

El lmite de deteccin: En general este trmino se define como la mnima

concentracin del analito detectable por el mtodo.

Lmite de cuantificacin: Llamado tambin lmite de determinacin, se

define como la ms pequea concentracin del analito que puede ser
determinada con un nivel de exactitud y precisin aceptables.

Intervalo analtico: Est definido como el intervalo de concentracin en

que el analito puede ser determinado mediante la utilizacin de la curva
de calibracin; se considera que es el comprendido entre el lmite de
cuantificacin hasta la concentracin en la cual se pierde la linealidad de
la curva.

REFERENCIAS
[1] Daz Nieves A. et al. (2010). Espectrofotometra: Espectros de
absorcin y cuantificacin colorimtrica de biomolculas. Extrado de
http://www.uco.es Fecha de consulta: 05/05/15
[2] Owen Tony (2000). Fundamentos de la espectroscopa UV- visible
moderna: Conceptos bsicos. 1ra Edicin.
Agilent Technologies.
Alemania.
[3] Harris Daniel C. (2003). Anlisis qumico cuantitativo. 3ra Edicin.
Editorial Revert. Barcelona, Espaa.
[4] Requena Rodrguez Alberto, Zuiga Romn
Espectroscopa. Editorial Pearson Educacin. 732 pp.

Jos

(2004).

[5] Primo Yfera Eduardo (1995) .Qumica Orgnica Bsica y Aplicada:

Tomo II. Editorial Revert. Espaa.
[6]
Espectrofotometra
ultravioleta
visible.
Extrado
http://www.espectrometria.com/ Fecha de consulta: 05/05/15

de:

[7]
Introduccin
a
la
metrologa
qumica.
http://depa.fquim.unam.mx/ Fecha de consulta: 05/05/15

Extrado

de: