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artigos

Cromatografia de Lquidos
e Interface LC-MS*
ALEXANDRE J.C.D. BRITO**,
PAULO J. SALVADOR***
E RAFAEL B. CHUST****

mentos, acessrios e consumveis


actualmente em comercializao,
muitas barreiras tecnolgicas foram
ultrapassadas e muitos problemas
analticos resolvidos.

1. INTRODUO
Nos ltimos anos, tem-se verificado um constante desenvolvimento
da instrumentalizao e aplicaes para
Cromatografia de Lquidos (HPLC),
procurandotiraro maiorpartido possvel
desta potente tcnica analtica.
O objectivo deste artigo centra-se na apresentao e discusso dos
desenvolvimentoslevados a cabo a nvel
de instrumentao (sistemas de injeco de amostras, bombeamento de
solventes, deteco e tratamento de
dados) pelo Departamento de Investigao e Desenvolvimento de KONIK
INSTRUMENTS, relatando a sua evoluo em paralelo com as necessidades
actuais do cromatografista.
Complementarmente, sero
discutidos os ltimos avanos a nvel
das interfaces LC-MS (Cromatografia
de LquidosEspectrometria de Massa),
assinalando a sua evoluo at ao
estgio actual e as tendncias futuras
neste campo analtico.

2. 0 CROMATOGRAFO DE LQUIDOS
Vrios passos se verificaram
com o decorrer dos anos relativamente
tcnica e instrumentao para
cromatografia de lquidos, onde h a
salientar:
a primeira experincia em
cromatografia de lquidos, utilizando
como meio impulsionador a gravidade,
por M. S. Tswett(1872-1919)tido como
o "pai da cromatografia" em 1906, na
qual se levou a cabo a separao de
pigmentos vegetais, conseguindo purificar a clorofila por cromatografia de
adsoro;
o primeiro Prmio Nobel (Qumica) para a Cromatografia, obtido por
A. J. P. Martin e R. L. M. Synge (Reino
Unido), em 1952;
a construo do primeiro
cromatgrafo de lquidos, em 1964, por
Csaba Horvath (1930), o qual permitia
presses de trabalho da ordem de 4000
psi (270 atm).

2.1 Configurao de um
Cromatgrafo de Lquidos Moderno
A configurao de um cromatgrafo de lquidos engloba pelo menos
quatro componentes fundamentais:
Sistema de Injeco ou Injector
Sistema de Bombagem ou
Bomba de Solventes
Sistema de Deteco ou Detector
Sistema de Tratamento de
Dados
De seguida, procuraremos salientar os passos mais importantes na
sua evoluo at ao estgio actual.

2.2 Sistemas de Injeco


Relativamente aos sistemas de
injeco, a evoluo foi na realidade
relativamente pequena, dado que os
engenheiros industriais obviaram muito
dos passos necessrios para ir de
encontro aos requisitos exigidos pelos
cientistas e investigadores em cromatografia de lquidos, os quais
afortunadamente apenas tiveram de
adaptarvlvulasvulgarmente utilizadas
na indstria para a injeco cromatogrfica.
As primeirasvlvulas utilizadas
por Csaba Horvath foram as vlvulas
"deslizantes" de 4 entradas, onde se
dispunha de dois canais alternativos:
um de injeco ou carga de amostra
(load) e outro de injeco no cromatgrafo (inject). Com o aumento de
presso, estas vlvulas demonstraram-se limitadas por se revelarem pouco
estanques.
Actualmente, so universalmente utilizadas as vlvulas de injeco
de 6 vias, cuja concepo e/ou fabricante permitem que sejam vlvulas
de injeco de volume fixo ou de volume varivel dependendo a sua funcionalidade da sua prpria estanquicidade.

2.3 Sistema de Bombagem


e passando pela primeira separao por gradiente de solventes (1967
Csaba Horvath EUA) at aos instru-

Foi precisamente em relao


aos sistemas de bombagem que sur-

giram as primeiras limitaes tecnolgicas no desenvolvimento dos cromatgrafos de lquidos.


Como se afirmava em 1941, num
artigo no Jou rn al of Biochemistry(13581368, 1941), da autoria de A. J. P. Martin
(1910- (e R. L. M. Synge (1914-), em cromatografia de lquidos "a nica forma
de obter a mais baixa HETP (altura
equivalente a um prato terico) sera
utilizando partculas com a menor
dimenso possvel e uma elevada
diferena de presses ao longo da
coluna".
Assim sendo, e havendo a
possibilidade tecnolgica de obter
partculas de pequenas dimenses
(menos de 60 microns), seria necessrio
desenvolver um sistema de bombagem
que permitisse gerar e suportar altas
presses na cabea da coluna, por
forma a garantir uma diferena de
presses entre esta e a presso sada
da mesma (cujo valor ser de 1 a 5 atm),
gerando ainda pulsaes de fluxo to
reduzidas quanto possvel.
Assim, as caractersticas fundamentais de um Sistema de Bombagem
devero ser as seguintes:
fluxo estvel e isento de pulsaes, por forma a prevenir contribuies indesejveis a nvel do sistema
de deteco;
ampla gama de fluxos, permitindo uma maior flexibilidade;
reprodutibilidade do volume
deslocado, por forma a permitir reprodutibilidade de tempos de reteno,
salientando as caractersticas qualitativas da cromatografia de lquidos;
resistncia a altas presses
(400 a 500 atm), pelas razes previamente enunciadas.
2.3.1 Sistema de Bombagem
de Pisto Simples
O primeiro sistema utilizado, no
fim da dcada de 50 ainda antes de
Csaba Horvath baseou-se numa bomba de pisto simples, cuja concepo
se inspirou nas bombas de seringa, a
qual se completava com a fase mvel
desejada e posteriormente seria
despejada a cadncia e consequentemente ao fluxo desejado.
As vantagens bvias de tal
sistema residiam na inexistncia de
pulsaes, dado que o movimento de
esvaziamento do pisto constante, e
facilidade de controle de fluxos, uma

artigos
vez que apenas temos de controlar a
velocidade linear de um nico eixo.
Tais vantagens eram contrabalanadas por um rol de vrias desvantagens, entre as quais se contam a
necessidade de completar o cilindro
onde se movimenta o pisto ao fim de
cada cromatograma e a bvia dificuldade em garantir uma elevada estanquicidade, a despressurizao do sistema sempre que se completa o cilindro,
pondo em causa a estabilidade do leito
cromatogrfico, a dificuldade no desenvolvimento de mtodos, dado ser
necessrio trabalhar com o cilindro
completo com uma fase mvel de dada
composio, obrigando, caso no seja
a fase mais adequada 6 separao, a
reench-lo aofim de cada cromatograma, redundando em falta de flexibilidade
no desenvolvimento de aplicaes e a
um gasto suplementar de solventes e
tempo e, por ltimo, o aparato instrumental necessrio, dado que sendo as
dimenses das partculas relativamente
elevadas (40-60 microns contra os 3-5-lo microns actuais), osfluxos deveriam
ser forosamente baixos para permitir
uma boa resoluo e por outro lado os
tempos de anlise desusadamente
elevados actualmente, separamos 4
cidos nucleicos em 5 minutos a um
fluxo de 1 ml/min (o que implica um
gasto de cerca de 5 ml de eluente),
enquanto a mesma separao tomava
mais de 2 horas a 0,2 ml/min (o que
implica 5 vezes mais gasto de eluente),
bem como a quase impossibilidade de
operao em gradiente de solventes,
por todas as razes anteriormente
referidas.
De seguida, no incio da dcada
de 60,foram desenvolvidos os primeiros
sistemas baseados em bombas de
pisto simplesentre os quais se conta
o sistema de Csaba Horvth cuja
operao se baseia no movimento de
vai-vm de um pisto numa cmara de
volume limitado, dispondo de duas
vlvulas anti-retorno (6 entrada e
sada), e que, por forma a diminuir as
pulsaes, utiliza uma velocidade de
avano (impulso de solvente) consideravelmente mais lenta (cerca de 8 a 10
vezes) que a velocidade de retrocesso
(alimentao do pisto). Tal sistema
provou-se fivel, resistente e resolveu
tecnologicamente (pela incorporao
das vlvulas anti-retorno e vedantes de
alta resistncia) um dos problemas
maiores da cromatografia de lquidos
a alta presso de trabalho. Outra
vantagem bvia a possibilidade de
utilizao de duas ou mais bombas em
paralelo para obteno de gradientes
de solventes. No entanto, tal sistema
(ainda utilizado por alguns fabricantes
actuais, dada a sua simplicidade e baixo

custo), tem uma desvantagem inerente


sua prpria concepo: a gerao de
pulsos, os quais transmitidos ao detector, do origem a picos "fantasmas" ,os
quais no sendo demasiado notados
em detectores espectrofotomtricos
(UV-VIS e fluorimtricos), impedem a
sua utilizao com detectores altamente
sensveis a pulsos, como sejam os
detectores de ndice de refraco
diferencial, electroqumico, de condutividade electroltica e, o mais sensvel
de todos, o espectrmetro de massa
(cujas razes sero explanadas mais
adiante).
2.3.2 Sistema de Bombagem
de Pisto Duplo
No ltimo estgio de desenvolvimento, que o actual, o sistema de
bombagem utilizado o de duplo pisto
de movimento recproco, que tal como
o sistema de pisto simples anteriormente descrito, dispe de distintas
velocidades consoante a fase em que
se encontram mais lenta quando em
fase de impulso e mais rpida quando
em fase de carga.
Este sistema apresenta vantagens sobre todos os demais, dado
que, dispondo das mesmas caractersticas mecnicas das bombas de
pisto simples, suprime as pulsaes
atravs do movimento alternado dos
seus pistes (carga pisto 1/ descarga
pisto 2 seguida de descarga pisto 1 /
carga do pisto 2).
Resumidamente, temos como
vantagens fundamentais dos sistemas
de duplo pisto recproco, e quase como
extrapolao do sistema de pisto
simples, uma relativa simplicidade
mecnica, elevada fiabilidade, possibilidade de operar a altas presses e
ausncia de pulsaes.
Os cromatgrafos de lquidos
KONIK HPLC 500 B utilizam o sistema de
bombagem de duplo pisto recproco
em srie, ao que adicionamos uma
velocidade diferencial de movimento
de pisto com o fim de reduzir as
variaes de presso (pulsaes). O
princpio de funcionamento consiste em
utilizar duas cmaras e apenas duas
"check valves" (vlvulas anti-retorno):
uma entrada do pisto 1 (ou de
alimentao) e outra sada do pisto 2
(ou de bombagem). Alm disso, o pisto
1 trabalha a uma velocidade cerca de
30% mais rpida que o pisto 2 tal
resulta em que evitamos os momentos
"mortos" do pisto 2 (que devido sua
menor velocidade quase no apresenta
pulsaes) garantindo uma bombagem constante atravs do pisto 1
(muito mais rpido porm muito mais
pulsante).

Como exempla das unidades


mais modernas, podemos referir que as
caractersticas fundamentais do sistema de bombagem do cromatgrafo
de lquidos KONIK HPLC 500 B so as
seguintes:
total ausncia de pulsaes
em toda a gama de fluxos, permitindo a
operao em HPLC microbore e analtica, dado o conceito dinmico do
movimento dos pistes;
opes de cabeas analtica
(0,01 a 8 ml/min) e semi-preparativa (0,06
a 48 ml/min), permitindo uma maior
flexibilidade na utilizao do sistema;
opo biocompatvel/inica,
com peas fixas e mveis em PEEK
(cabegas),Teflon(retentores),rubi(vlvulas anti-retorno) e safira (pistes),
permitindo a sua utilizao com solues e tampes de pH entre 1 e 14;
possibilidade de operara altas
presses (500 atm -7000 psi), em quaisquerdasopes(analtica,semi-preparativa ou biocompatvel);
sistema de lavagem automtica de mbolo em todas as verses,
como equipamento standard, prevenindo a precipitao de tampes nos
pistes e diminuindo a necessidade de
interveno/assistncia tcnica ao
equipamento;
2.3.3. Controle de Sistemas de
Bombagem. Gradientes de Solventes
Outra rea de desenvolvimento
em que se verificou uma grande evoluo foi no controle do sistema de
bombagem. Nos primeiros sistemas
comercializados, a seleco do fluxo
efectuava-se por passos discretos,
geralmente de 0.1 ml/min, por meio de
um controle analgico que transmitia
atravs de um circuito elctrico/
electrnico uma frequncia de referncia para o motor elctrico.
Actualmente, apesar de alguns
fabricantes utilizarem nosseus modelos
de baixo de gama o sistema analgico,
o controle dos cromatgrafos efectuado por meio de um microprocessador
incorporado o qual permite no
apenas controlar os caudais da bomba
comotambm a presso da mesma (por
programao de mximos e mnimos), a
programao de gradientes (sejam eles
a baixa ou a alta presso), acessrios
externos (injectores automticos,
fornos de colunas, detectores programveis, sistemas de tratamento de
dados, vlvulas de comutao, etc.) e
outros.
A evoluo dos sistemas de
bombagem aponta para sistemas totalmente controlados atravs de um computador e por meio de um programa de
aplicaes (software) dedicado e de

artigos

uma interface tipo RS-232, permitindo


'ento no s o controle de fluxos como
a integrao, sob o mesmo ambiente,
do controle dos sistemas de deteco,
injeco e tratamento de dados.
Por sua vez, o gradiente de solventes e a sua programao tambm
contaram com uma notvel evoluo,
principalmente no decorrer da decade
de 70 e 80. Os primeiros sistemas utilizados baseavam-se na tcnica dos
fluxos parciais, ou seja, consoante a
contribuio parcial desejada de cada
solvente, operava-se manualmente o
fluxo de cada sistema de bombagem
por forma a obter-se o fluxo final
pretendido. Como facilmente se depreende, tal sistema requeria a total
dedicao do seu operador, pois a
obteno de um cromatograma demorava em media 1 a 2 horas, revelando-se a sua operao totalmente contraproduc ente.
No incio da decade de 70,foram
desenvolvidos os primeiros sistemas de
gradientes com controle automatizado,
onde se permitia controlar o fluxo de
duas bombas isocrticas cada uma
delas com um dos solventes desejados
permitindo a programao da variao
dos seus fluxos parciais por determinado perodo de tempo e por conseguinte, da composio do eluente. Este
sistema denomina do sistema de
gradiente binrio a alta presso e
encontra-se actualmente "em vias de
extino".
As principais vantagens do
sistema de gradientes a alta presso
resumem-se a ausncia de "bolhas"
durante a mistura de solventes, dado
que a mesma ocorre a uma presso
geralmente superiora 80-100 atm, sendo
esta mistura bastante optimizada pelo
facto de dar-se a alta presso, garantindo uma elevada reprodutibilidade do
mtodo (desde que se use o mesmo
sistema cromatogrfico), somando por
ltimo a vantagem adicional de que em
caso de avaria de uma das unidades de
bombagem, continuar a dispr-se de
um cromatgrafo isocrtico.
As desvantagens de um tal sistema residem na irreprodutibilidade de
resultados/composies de solventes
aquando da sua passagem a um sistema
isocrtico, dado que uma mistura a alta
presso, e considerando as distintas
compressibilidades dos solventes, no
tem forosamente a mesma composio que uma mistura efectuada presso atmosfrica, bem como a irreprodutibilidade de resultados/composies
de solventes de sistema para sistema,
dadas as distintas compressibilidades
obtidas por distintos sistemas de
bombagem. Por outro lado, temos uma
maior complexidade mecnica, pela

existncia de duas bombas de solventes, que devem actuar de forma


coordenada e por conseguinte originando um frequente recurso a
assistncia tcnica e um elevado custo
na aquisio e manuteno, pelas
mesmas razes.
Em 1984, KONIK INSTRUMENTS
desenvolveu o seu segundo cromatgrafo de lquidos, o KONIK KNK-500G
(precursor do KONIK HPLC-500-G e que
substituiu o seu predecessor KONIK
KNK-8800, lanado em 1979), onde pela
primeira vez se empregou, a nvel mundial,osistema de gradientes quaternrio
a baixa presso. Neste sistema, o
gradiente de solventes obtido atravs
da abertura e fecho coordenados de
uma vlvula de quatro vies, a qual actua
proporcionalmente a composio de
eluente desejada.
As principais vantagens deste
sistema em relao ao sistema de
gradientes a alta presso encontram-se ao nvel da simplicidade efiabilidade
mecnicadado que se necessita apenas de uma bomba ao invs de dues
exigindo porm um sofisticado controle
por microprocessador. Comovantagem
adicional, temos que a mistura dos
componentes do eluente ocorre b
presso atmosfrica, permitindo a directa aplicao a um sistema isocrtico
de um mtodo isocrtico desenvolvido
por tal sistema de gradientes, misturando na composio encontrada os
componentes da fase mvel, o que no
ocorre com o sistema a alta presso,
dadas as distintas compressibilidades
de cada um deles. A nica eventual
desvantagem com que nos defrontamos
a necessidade de utilizar um sistema
de desgasificao porasperso de hlio
para evitar a formao de bolhas de ar
e optimizar a mistura dos componentes
do eluente, o que em todo o caso
aconselhvel em qualquer sistema
cromatogrfico seja ele de mistura a
alta ou de baixa presso, de gradientes
ou isocrtico.
Resumidamente, temos a concluir como vantagens do sistema de
gradientes a baixa presso os seguintes
factores:
simplicidade mecnica, dado
apenas necessitar de uma bomba de
solventes;
mistura de solventes a presso atmosfrica, o que garante total
reprodutibilidade de composies de
solventes para a sua utilizao isocrtica;
total reprodutibilidade de
mtodos, independentemente do sistema cromatogrfico, dado o j anteriormente exposto;
custo reduzido;
reduzidas dimenses, o que

permite uma razovel economia de espao laboratorial;


controletotalmente automatizado por meio do microprocessador
incorporado na unidade cromatogrfica, necessitando de uma minima
interveno do utilizador;
capacidade para gradientes
de ate 4 solventes.
e como desvantagens:
necessidade de aspergir um
gs inerte (usualmente hlio) nos solventes, porforma a satur-los e prevenir
a eventual formao de "bolhas" de ar
durante a mistura;
necessidade de controle por
microprocessador incorporado na
unidade cromatogrfica.
Attulo de referncia, os termos
"high performance liquid chromatography (HPLC)" (cromatografia de lquidos
de alta eficcia CLAE), "eluio
isocrtica" (pare descrever o uso de
uma fase mvel de composio constante ao longo do tempo) e "gradiente
de eluentes" (para descrever o uso de
uma fase mvel de composio varivel
ao longo do tempo) aplicados cromatografia de lquidos devem-se a
Csaba Horvath.

2.4

Sistemas de Deteco

Em relao aos sistemas de


deteco, a sua evoluo pode ser
resumida a adaptao e adequao de
equipamentos j conhecidos (espectrofotmetros, espectrofluormetros,
refractmetros, etc.) a utilizao em
fluxo constante, ou seja, adequando as
clulas de fluxo continuo a uma geometria miniaturizada que evite as contribuies de eventual refraco do
feixe luminoso durante a passagem da
amostra (pare no comprometer a sua
performance) e a formao de "volumes mortos", bem como a evoluo
sofrida a nvel electrnico pela miniaturizao requerida.
Como referncia, podemos indicer que os detectores mais utilizados
em cromatografia de lquidos so o detector espectrofotomtrico (UV-VIS), o
detector de ndice de refraco
diferencial, o detector espectrofluorimtrico, o detector condutimtrico e o
detector electroqumico ou amperomtrico, chamando-se a ateno pare que
a investigao levada a cabo sobre
novos sistemas de deteco pare HPLC
originou novas categories de detectores
universais e selectivos, como sejam o
detector de rede de diodos (PDA), o detector de infra-vermelhos (IR e FT-IR), o
detector fototrmico (PTD), o detector
polarimtrico ou de rotao ptica, o

artigos
detector de foto-ionizao (PID), o detector de ionizao de chama (FID) e
por Ultimo, o espectrmetro de massa
(MS), sobre o qual nos debruaremos
em detalhe a seguir.

2.5 Sistemas de Tratamento


de Dados
Tambm os sistemas de tratamento de dados em cromatografia
sofreram avanos sensveis em relao
aos sistemas de h trs dcadas.
Os primeiros sistemas utilizados
basearam-se em registadores potenciomtricos, os quais aps o registo
dos picos obrigavam o operador a
quantific-los manualmente por planimetria, triangulao ou pesagem.
Em meados da dcada de 70
assiste-se ao surgimento da primeira
gerao de integradores electrnicos
digitais, com os quais se permite
quantificar os picos automaticamente,
por integrao de rea e/ou clculo da
altura de pico. Estes sistemas, a princpio de operao bastante complexa e
limitada, deram origem aos actuais
integradores, que no apenas integram
reas como tambm permitem a
memorizao de mtodos e respectivas
curvas de calibrao para cada pico,
memorizao de cromatogramas e o
seu reprocessamento, seleco de
diversos mtodos de quantificao
(rea, altura de pico, padro interno,
padro externo, adio de padro, etc.)
e dispem j de interfaces tipo RS-232
para conexo a computadores pessoais.
Com a expanso e quase banalizao verificada na utilizao de
computadores pessoais, no princpio
da dcada de 80 alguns fabricantes de
cromatgrafos, entre os quais se conta
KONIK INSTRUMENTS, iniciaram o
desenvolvimento de sistemas de
tratamento de dados baseados em
pa cotes integrados interface A/D
(analgica/digital) + programa informtico (software) dedicado. Estes sistemas, alm de cumprirem excelentemente as funes de um integrador
de altas prestaes, permitem tambm
elaborar um arquivo de dados permanente em discos flexveis (floppy
disks) e adicionam uma maior rapidez
no processamento de dados com a
flexibilidade conferida pelos actuais
programas informticos para processamento de texto, criao de base de
dados e folhas de clculo e conexo a
sistemas em rede tipo LAN (Local Area
Network) e/ou LIMS (Laboratory Information Management System), para
gesto integrada e total automatizao
do laboratrio. Em 1992, a KONIK iniciou
a comercializao do sistema de tra-

tamento de dados computorizado


KONIKROM,que constitui uma evoluo
dos seus precedentes PEAKMASTER e
EASYCHROM, o qual permite na sua
verso bsica o tratamento de dados
de ate 4 detectores e a expanso ate
um mximo de 16 detectores simultaneamente, permitindo o armazenamento de at 100 mtodos e respectivas
curvas de calibrao para cada uma
das substncias a analisar, uma alta
resoluo para cromatografi capilar,
um mdulo opcional para GPC (Gel Permeation Chromatography) e compatibilidade com redes LAN e LIMS, tudo
isto por um custo cerca de 20% superior
a um integrador de 2 canais.

3. INTERFACES LC-MS
Como fabricantes de equipamentos para cromatografia desde 1976,
KONIK INSTRUMENTS teve a oportunidade de acompanhara evoluo do
nvel de exigncias dos utilizadores das
tcnicas cromatogrficas, as quais
cresceram muito mais rpida e fortemente do que a tecnologia empregue
na fabricao das unidades instrumentais, concretamente a nvel da
sensibilidade e especificidade de
deteco de compostos.
Por outro lado, os nveis de
sensibilidade, especificidade e a possibilidade de somar as suas capacidades analticas qualitativa e quantitativa para compostos orgnicos da
espectrometria de massa (MS),sempre
cativaram os cromatografistas, ansiosos por poder juntar a estas a capacidade separativa da cromatografia,
pelo que ainda na dcada de 60 se
desenvolveram as primeiras interfaces
GC-MS (cromatografia de gases
espectrometria de massa).
Desde o incio se revelaram
crticos os problemas de introduo de
umfluxo de gs na cmara de ionizao
do espectrmetro de massa, a qual se
encontra sob vcuo, dado que os
analizadores de massa necessitam de
um valor de vcuo relativamente elevado da ordem dos 105 a 10-6 mbar
para trabalharem de forma optimizada
e isenta de interferncias de campos
electrostticos e magnticos externos.
No havendo ainda acesso tecnologia
das colunas capilares, foram criados
distintos mtodos de acoplamento,
entre os quais se contam as interfaces
GC-MS tipo "open-split", com o intuito
de reduzir a quantidade de gs a
introduzir no espectrmetro de massa.
Actualmente as interfaces GC-MS so
efectuadas pela prpria coluna capilar,
inserida num "tubo" termostatizado
(para prevenir uma indesejada condensao), dados os baixos fluxos de gs

portador a que se opera a separao


cromatogrfica em colunas capilares.
A espectrometria de massa,
como tcnica analtica quantitativa e
qualitativa de alta sensibilidade e
especificidade, d-nos no s uma
indicao precisa do peso molecular
da substncia em anlise comotambm
uma informao extraordinariamente
detalhada da sua forma estrutural,
traduzindo-se numa "impresso digital"
real da substncia em anlise. Combinada de forma dinmica com a
cromatografia de gases, a espectrometria de massa d origem ao mtodo
analtico mais especfico e sensvel de
caracterizao de substncias presentes numa mistura voltil complexa,
mesmo se estivermos em presena de
picos cromatogrficos sobrepostos.
Por outro lado, a cromatografia
de lquidos permite levar a cabo a
separao de substncias que no so
suficientemente estveis e/ou volteis
para serem analisadas por GC, o que
infelizmente ocorre com a vasta maioria
de compostos orgnicos conhecidos;
desta forma, a combinao dinmica
da espectrometria de massa com a
cromatografia de lquidos estende a
gama de substncias que podem ser
analisadas por espectrometria de
massa, que com a sua especificidade,
permite obter poder adicional a nvel
analtico na resoluo de substncias
com eluio sobreposta, o que no se
pode obter em LC com deteco convencional (espectrofotometria de UV-VIS, fluorescncia, etc.).
Com a tentativa de acoplar a
cromatografia de lquidos espectrometria de massa, os problemas de
optimizar uma interface agravaram-se,
dada a quase impossibilidade de manter
fluxos suficientemente baixos a presses to elevadas de trabalho no LC e
dificuldade emtransferir os solutos para
a fase gasosa, fundamental na cmara
de ionizao (sob vcuo), pelo que os
fabricantes se viram na necessidade
de desenvolver interfaces dedicadas
para conexo LC-MS e que diferem em
muito da simplicidade previamente
referida das conexes GC-MS.
As interfaces LC-MS que de
seguida discutiremos so as seguintes:
Moving Belt (MB)
Continuous Flow FAB (CF-FAB)
Thermospray / Plasmaspray (TSP/
PSP)
Particle Beam (PB)
Electrospray (ESI)
De salientar que a maior parte
destas interfaces so compatveistanto
com espectrmetros de massa quadrupolares como de sector magntico. A
opo por um ou outro sistema ser
definida pela capacidade analtica

Fig. 1
1 - Analisador
2- Fonte El/CI
3 - Vaporizador de Amostra
4 - Escova do Vaporizador
5 - Ligao a Bomba de Vcuo 2
6- Ligao Bomba de Vcuo 1
7 - Escova
8 - Rolamento Director
9 - Amostra proveniente do HPLC
10- Cinta Condutora
11 - Vedantes do Tnel

desejada; enquanto que a mxima


especificidade e sensibilidade em MS
se obtm com espectrmetros de massa
de sector magntico de alta resoluo
(geometrias BE, EB ou EBE)ou sistemas
hbridos MS-MS (geometrias GO, EBC1,
EBEC1 ou ainda EBEBE), para anlises
de rotina sera suficiente um sistema
quadrupolar, que se apresenta como a
soluo de menor custo associada a
uma excelente fiabilidade, reprodutibilidade e robustez.

3.1 Moving Belt (MB)

24
cn

C7

A interface "Moving Belt" (Cinta


Mvel) (fig. 1) foi a primeira interface
LC-MS idealizada e colocada em funcionamento de forma bem sucedida,
tendo sido tambm a primeira interface
comercialmente disponvel.
Tal sistema, hoje praticamente
em desuso, consiste em depositar o
eluente proveniente do LC sobre uma
cinta em movimento continuo uma
plataforma rolante transportando a
amostra ate fonte de ionizao do
espectrmetro de massa.
Durante o processo de transferncia, a substncia dissolvida no
eluente e depositada sobre a cinta
atravessa uma srie de comportas de
vcuo diferencial (vacuumlocks), sendo
de seguida o solvente evaporado por
efeitotrmico, deixando a substncia a
analisar sob a forma de uma "mancha"
ou "borro" slido sobre a superfcie
da cinta que entrada do espectrmetro
de massa, na fonte de ionizao El/CI,
instantaneamente vaporizado.
Por forma a evitar (ou atenuar)
o "efeito de memria" inter-amostras,

so utilizados os sistema de "escovas"


ou de sobreaquecimento da cinta, na
tentativa de retirar da superfcie da
mesma quaisquervestgios da amostra
que possam ainda existir aps a vaporizao instantnea desta.
Como principais vantagens do
"Moving Belt" temos a destacar:
permite obter espectros "clssicos" em ionizao El e CI, possibilitando a sua posterior pesquisa em
bibliotecas de espectros;
6 compatvel comtcnicas de
ionizao que actuam sobre superfcies,
tais como o FAB e o Cs-SIMS;
permite a anlise tanto de
compostos ligeiramente polares como
altamente polares.
Entre as suas desvantagens,
contam-se as seguintes:
elevada complexidade mecnica;
elevada dificuldade em anular
os "efeitos de memria" inter-a mostras,
independentemente do sistema utilizadorescovas"ousobreaquecimento);
baixa sensibilidade para
amostras volteis, dado o tratamento
trmico a ser sofrido pelas amostras;
baixa tolerncia a fases mveis com elevado teor de gua.

3.2 Continuous Flow Fast


Atom Bombardment (CF-FAB)
A interface/fonte de ionizao
CF-FAB (Ionizao por Bombardeamento Atmico de Fluxo Continuo) (Fig.
2), usualmente referida tambm como
Dynamic-FAB (FAB Dinmico), consiste
numa modificao das fontes de
ionizao convencionais por FAB ou
SIMS, por forma a permitir a sua
adaptao a uma situao de fluxo
continuo.

Fig. 2
1 - Analisador
2- Extremidade da Sonda
3 - Isolador Trmico
4 - Capilar de Silica Fundida
5 - Amostra proveniente do HPLC
6- Eixo da Sonda
7 - Bloco de Cobre Aquecido
8 - Feixe Primrio

Tal modificao consiste em


substituir a sonda convencional (que
resumidamente um tubo metlico
dispondo de uma extremidade plana,
onde se deposita uma gota de amostra)
por uma sonda "oca", a qual permite
que um fluxo continuo de eluente +
amostra seja bombeado ate ao "alvo"
do canho de ies, situado na sua
extremidade superior, o qual dispe de
um difusor adequado que regula a sua
disperso na cmara de ionizao.
Ao distinguir o difusor ("alvo"(,
as molculas da amostra diludas no
solvente so bombardeadas por tomos
neutros (FAB) ou ies Cs (SIMS). A
ionizao tem ento lugar por meio do
impacto atmico gerado e os ies da
amostra assim formados so "extrados" da matriz lquida e "pulverizados"
na fase gasosa, permitindo a posterior
anlise de massas.
A ionizao por FAB considerada uma tcnica de ionizao "fraca",
que optimiza prioritariamente a anlise
a nvel de pesos moleculares. Porforma
a optimizar o processo de ionizao, o
eluente usualmente contm entre 3 a
10% de glicerol.
Outro dado importante que,
por forma a manter o alto vcuo requerido na fonte de ionizao, o fluxo mximo permitido por uma interface LCMS tipo CF-FAB est limitado a 10 pl/
min.
Como principais vantagens do
"CF-FAB" temos a destacar:
simplicidade mecnica;
sendofundamentalmente uma
tcnica de ionizao "fraca", permite
obter uma vasta informao a nvel de
pesos moleculares;
permite a anlise tanto de
compostos polares como inicos.
Entre as suas desvantagens,
contam-se as seguintes:
necessidade de adicionar
uma elevada percentagem de glicerol
fase mvel, o que restringe o desenvolvimento de mtodos em HPLC ou a
necessidade de uma bomba suplementar para adio ps-coluna da
quantidade de glicerol necessria,
implicando maior complexidade mecnica;
limitaes crticas a nvel de
fluxos de solvente, os quais devem ser
inferiores a 10 pl/min;
necessidade de recorrer a
colunas capilares para HPLC caso se
deseje proceder a anlises LC-MS "online", d ad as as srias restries defluxo;

3.3 Thermospray/Plasmaspray (TSP/PSP)


A interface/fonte de ionizao
TSP/PSP a tcnica de conexo LC-MS

artigos
de mais vasta utilizao, dada a sua
simplicidade.
Tal tcnica consiste em sobreaquecer e vaporizar o eluente entrada
da fonte, o qual passa de seguida
atravs de um pequeno orifcio dando
origem a um jacto tipo "aerosol",
ocorrendo ento a vaporizao e
ionizao da amostra em simultneo.
A interface/fonte de ionizao
TSP convencional requer um tampo
voltil(electrlito)diludo na fase mvel,
por forma a obter ies reactivos que
permitem ionizar as molculas da amostra em soluo. Tal facto d origem a
que a ionizao sejatanto mais efectiva
quanto mais polar seja a amostra.
As fontes de ionizao TSP
modernas, denominadas Plasmaspray
(PSP) (fig. 3), incorporam elctrodos de
descarga ou filamentos aquecidos que
possibilitem que as amostras apoiares
possam ser ionizadas eficazmente.
Outra inovao adicional nas actuais
fontes de ionizao PSP a existncia
de um elctrodo de repulso inica (ion
repeller electrode) o qual d origem a
reaces de fragmentao no interior
da prpria fonte, o que optimiza significativamente a anlise estrutural da
amostra.
Como principais vantagens das
fontes de ionizao TSP/PSP temos a
destacar:
tal como as fontes CF-FAB, as
fontes TSP/PSP sofontes de ionizao
"fracas", optimizando a anlise a nvel
de pesos moleculares;
a incorporao de um elctrodo de repulso inica permite induzir
uma fragmentao molecular perfeitamente controlada;
a ionizao por TSP/PSP a
tcnica mais amplamente utilizada em
LC-MS, dispondo portanto de uma vasta
bibliografia;
as contribuies relativas
composio e ao fluxo do eluente so
mnimas, sendo portanto as suas eventuais restries perfeitamente negligenciveis;
permite a anlise tanto de
compostos polares como inicos.
Entre as desvantagens desta
tcnica, contam-se as seguintes:
necessria a utilizao de
um tampo voltil, para optimizar a
vaporizao e ionizao da amostra;
as amostras devem apresentar-se isentas de matria slida, pois de
outra forma poder-se- obstruir o vaporizador
apresenta uma elevada sensibilidade composio qumica da
soluo (solvente + amostra), a qual
exerce uma elevada influncia na
optimizao dos mtodos.

3.4

Particle Beam (PB)

A interface LC-MS "Particle


Beam" (Feixe de Partculas) (fig. 4)
consiste em um elaborado sistema que
suplantoutotalmente as interfaces tipo
"Moving Belt" como mtodo de eleio
para ionizao El e Cl em LC-MS. Tal
interface distingue-se pela sua extrema
facilidade de operao a qual se deve
essencialmente sua simplicidade
mecnica.
O princpio de funcionamento
da interface PB consiste emfazer passar
o eluente atravs de um nebulizador
pneumtico (o qual consiste basicamente num t em cujas extremidades
se conecta respectivamente o HPLC,
uma garrafa pressurizada de hlio e a
cmara de dissoluo), de forma a
produzir uma nuvem de vapor formada
por gotculas pulverizadas da mistura
amostra + solvente. Estas gotculas so
transportadas atravs de uma cmara
de dissoluo aquecida, onde se inicia
a formao de pequenos agregados de
partculas da amostra, sendo os
solventes volatilizados e retirados por
meio de um separador de vcuo
diferencial de dois estgios, cujo
conceito muito similar ao "jet separator" utilizado em GC-MS. As partculas
remanescentes, que constituem a
amostra a analisar, so seguidamente
introduzidas na fonte de ionizao El/CI
onde so vaporizadas e ionizadas.
Os espectros obtidos ao utilizar
uma interface PB seguida de ionizao
El/CI dispem de uma informao a nvel
estrutural consideravelmente mais
completa que a obtida por ionizao
TSP/PSP, pelo que estas tcnicas so
consideradas complementares.
Como principais vantagens da
interface PB LC-MS temos ento a
destacar:
simplicidade mecnica, ha-

Fig. 3
1 - Amostra proveniente do HPLC
2 - Spray de Aerosol
3 - Elctrodo de Plasmaspray
4 - Elctrodo Repulsor
5- Ligao Bomba de Vcuo
6- Entrada para o Analisador
7 - Vaporizador Capilar Aquecido

vendo por isso substitudo quase


totalmente a interface "Moving Belt";
permite obter espectros "clssicos" em ionizao El e Cl, possibilitando a sua pesquisa em bibliotecas
de espectros;
as contribuies relativas
composio e ao fluxo do eluente so
mnimas sendo portanto as suas
eventuais restries perfeitamente
negligenciveis;
permite a anlise tanto de
compostos ligeiramente polares como
fortemente polares.
Entre as suas desvantagens,
contam-se as seguintes:
6 necessrio que as amostras
seja apenas parcialmente volteis, pois
de outra forma grande pa rte ser
arrastada juntamente com o solvente;
6 bastante restrita a utilizao
de tampes insolveis, os quais so
vulgarmente utilizados em HPLC.

3.5

Electrospray (ESI)

A interface/fonte de ionizao
Electrospray (fig. 5) a tcnica mais

6- Ligao Bomba de Vcuo 1


7 - Skimmer 1
8 - Entrada de Hlio
9- Nebulizador
10 - Amostra proveniente do HPLC
11 - 0-Ring
12- Cmara de Dissoluo
13- Ligao a Bomba de Vcuo 2

Fig. 4
1 - Analisador
2- Linha de Tranferncia de Gases
3 - Fonte El/CI
4 - Linha de Transferncia
5 - Skimmer 2

13
11

10

artigos

recente de combinao LC-MS, sendo


a interface que tem demonstrado
constituir o passo mais importante ate
ao momento actual no sentido de obter
uma interface LC-MS "universal".
Esta fonte de ionizao contase como a mais "fraca" entre qualquer
outra at hoje desenvolvida, permitindo
analisar pela primeira vez molecules de
elevada instabilidade trmica por LCMS, sendo possvel encontrar na
bibliografia j existente aplicaes bem
sucedidas de anlise de protenas de
pesos moleculares na ordem de 150.000
Dalton.
Na fonte de ionizao ESI, as
molculas da amostra so simultaneamente nebulizadas e ionizadas a presso atmosfrica da seguinte forma: a
soluo que contm a amostra introduzida atravs de um tubo capilar
em ago inox situado a poucos milmetros
de um elctrodo de forma cncava e
dispondo de um orifcio central, entre
os quais mantida uma diferena de
potencial de 4 a 6 kV, de forma a que o
solvente que emerge do capilar d
origem a um "spray" electrosttico em
direco ao referido elctrodo (fig. 6).
Os ies em fase gasosa formados a
presso atmosfrica pela evaporao
inica descrita so ento sugados
atravs do orifcio existente no elctrodo para o alto vcuo do espectrmetro de massa.
Um espectro "em estado bruto"
de um nico componente obtido por ESI
frequentemente apresenta series de
picos representando ies com cargas
distintas. Este tipo de dados "em bruto"
so posteriormente processados pelo
sistema de tratamento de dados por
forma a permitir a identificao de um
nico pico identificativo do verdadeiro
peso molecular. Por outro lado, as mais
sofisticadas fontes de ionizao ESI
frequentemente incluem a possibilidade


Presso

Atmosfrica

26

C)

Bomba
Difusora
(cerca de
105 mbar)

Fig. 5
1 - Amostra proveniente do HPLC
2- Capilar
3- Ligao Bomba Rotative (cerca de 1 mbar)
4- Analisador
5 - Skimmer
6- Orifcio de Amostragem
7 - Elctrodo de Vrtex

de induzir fragmentaes moleculares


por coliso, onde a anlise estrutural
da amostra o objectivo a atingir.
As fontes ESI clssicas, tal
como as fontes CF-FAB, esto restringidas a fluxos da ordem dos 10 til/min.
As fontes mais modernas e sofisticadas,
que incluem acessrios de nebulizao
pneumtica (sistemas similares aos
utilizadores nas fontes PB) do "spray"
electrosttico, permitem utilizar fluxos
superiores a 0.1 ml/min, constituindo
assim a fonte ESI a fonte de eleio
para colunas microbore.
As principais vantagens da interface/fonte de ionizao Electrospray
so as seguintes:
o facto de ser a mais "fraca"
fonte de ionizao (no actual estgio de
desenvolvimento tecnolgico), Permitindo a obteno de uma preciso no
clculo de pesos moleculares melhor
que 0.01%;
permite a anlise de molculas com peso molecular de 100 a mais
de 100.000 Dalton;
permite induzir de forma
perfeitamente controlada a fragmentao molecular;
constitui o mtodo de eleio
para a anlise de digestes enzimticas
de protenas;
permite a sua aplicao na
anlise de molculas polares, inicas e
de elevada termo-sensibilidade.
As desvantagens desta fonte
so as seguintes:
restrio defluxo do eluente a
valores da ordem de 0.1 a 0.2 ml/min;
requer amostras compostas
por molecules polares.

4. CONCLUSES
Apesar do objectivo da maior
parte dos investigadores e principais
fabricantes seja conceber e utilizar
uma interface LC-MS "universal",
como pudemosverificar nenhuma delas
o .
Tal facto leva a que a maior
parte dos laboratrios utilize paralelamente mais de uma das tcnicas de
combinao LC-MS descritas porforma
a garantir a maior e mais flexvel gama
de potencialidades analticas, o que
implica elevados custos tanto a nvel
instrumental como a nvel de manuteno.
H a referir que, como fabricantes de equipamentos de cromatografia de lquidos e espectrometria
de massa, o Departamento de Investigao e Desenvolvimento de KONIK
INSTRUMENTS encontra-se neste
momento a desenvolver intensa actividade na explorao das potencia-

lidadesfuturas dasfontes de ionizao/


interface tipo electrospray na conexo
HPLC-MS, pelas razes anteriormente
apontadas.

Glossrio
B Sector Magntico
-

CF - Fluxo Continuo
CI - Ionizao Qumica
E - Sector Electrosttico
El - Ionizao por Impacto Electrnico
ESI - Ionizao por Electrospray
FAB - Ionizao por Bombardeamento
Atmico
GC - Cromatografia de Gases
HPLC - Cromatografia de Lquidos de
Alta Eficincia
LC - Cromatografia de Lquidos
LSIMS - Espectrometria de Massa de
Ies Secundrios em Fase Lquida
MB - Cinta Mvel
MS - Espectrometria de Massa
PSP - Ionizao por Plasmaspray
- Guadrupolo
TSP - Ionizao por Thermospray

Referncias
R. B. Chust, Bol. Soc. Port. Qum. 39
(1990) 43-53
L. S. Et-tre, Int. Lab. 21 )8) (1991) 18-24
L. S. Et-tre, Int. Lab. 21 (9) (1991) 18-27
Agradecimentos
Desejamos apresentar os nossos sinceros agradecimentos ao Eng.
Josep Mestre (Director de Investigao
e Desenvolvimento de KONIK INSTRUMENTS), ao Doutor Jose M. Gilbert
(Presidente e Director Geral do Grupo
KONIK), ao Doutor Martins Montes (Director do Laboratrio de Investigao
Aplicada de KONIK INSTRUMENTS) e
muito especialmente aos nossos numerosos clientes e utilizadores em Portugal pelo suporte prestado na elaborao deste trabalho.

* O contedo deste artigo foi objecto


de uma conferncia sob o mesmo
ttulo no decorrer do 13.0 Encontro
Anual da Sociedade Portuguesa
de Qumica (Instituto Superior
Tcnico, Lisboa, Janeiro 1992).
**Consultor Tcnico-Comercial, KONIK
INSTRUMENTS (Porto)
*** Director do Laboratrio de Aplicaes, KONIK INSTRUMENTS (Lisboa)
**** Director Geral, KONIK INSTRUMENTS (PORTUGAL)