11/03/2015

Estgios no processo
produtivo
Aula 2 - Profa Dra Ilana L. B. C. Camargo
Cincias Fsicas e Biomoleculares
IFSC - USP

Estgios no processo
produtivo
1- Os trs estgios do bioprocesso
2- Biorreatores
3- Upstream
3.1 Escolha do Biocatalisador
3.2 Obteno do Biocatalisador
3.3 Conservao do Biocatalisador

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1. Os trs Estgios do
bioprocesso

Biotecnologia do bioprocesso tem trs estgios:

Processo Upstream

Biorreatores e biorreao

Processo Downstream

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Upstream

Biorreao
/Biorreator

Downstream

Estgios do processo produtivo

Bioprocesso aplicao industrial de reaes ou vias biolgicas

mediadas

por

clulas

vivas

inteiras

de

animais,

plantas,

microrganismos ou enzimas sobre condies controladas para a

biotransformao de matrias primas em produtos
Bioprocesso tambm pode ocorrer sem resultar em um
produto direto biorremediao, desintoxicao de resduos
ou de efluentes com ou sem subproduto ou derivados
Produto alimento, medicamento ou composto industrial
Escala laboratorial

Escala industrial

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2. Biorreatores

Biorreator ou fermentador

Biorreatores, reatores
bioqumicos, reatores biolgicos
so os reatores qumicos nos
quais ocorrem uma srie de
reaes qumicas catalisadas por
biocatalisadores

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Biorreator ou fermentador

Biorreator de bancada

Biorreator de 90L
http://en.wikipedia.org/wiki/Bioreactor

http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3930

3- Processo Upstream

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Processo Upstream

Escolha do biocatalisador
Preparo da matria prima ou substrato a ser processado
Preparao de meio e sua esterilizao
Alimentao do biorreator
Regulao de temperatura, pH e presso
Inoculao da cultura no meio assepticamente

Biorreao

Processo Upstream
Caractersticas gerais desejveis de microrganismos para
aplicao industrial:
1. Apresentar elevada eficincia na converso do substrato
em produto;
2. Permitir o acmulo do produto no meio, de forma a se ter
elevada concentrao do produto no caldo fermentado;
3. No produzir substncias incompatveis com o produto;
4. Apresentar

constncia

quanto

ao

comportamento

fisiolgico;
5. No ser patognico
6. No exigir condies de processo muito complexas;
7. No exigir meios de cultura dispendiosos;
8. Permitir a rpida liberao do produto para o meio.

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Processo Upstream
1 - Apresentar elevada eficincia na converso do substrato em
produto;
Matrias-primas incidem pesadamente no custo do produto final
(38 a 73% do custo total de produo)
C6H12O6
1 g glicose

2 C2H5OH + 2CO2
0,511g de etanol

S. cerevisiae rendimento de 90% da reao de fermentao anaerbia

Destilao - perda
Quando o produto produzido em menor quantidade em relao ao acar
consumido (enzimas ou antibitico) o custo com a recuperao do
produtos so mais onerosas

Processo Upstream

2 - Permitir o acmulo do produto no meio, de forma a se ter

elevada concentrao do produto no caldo fermentado;
Sem sofrer inibio mais acentuada em virtude deste acmulo
3 -No produzir substncias incompatveis com o produto;
Sem produzir proteases extracelulares
Linhagens que crescem relativamente menos, ou que acumulem
menos compostos intermedirios incrementam a sntese do
produto

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Processo Upstream

3 -No produzir substncias incompatveis com o produto;

Exemplo:
Aspergillus produz glicoamilase
Amido

glicoamilase

Glicose
Vrias aplicaes (xaropes de glicose na
indstria de alimentos)

Alguns microrganismos tambm sintetizam transglicosidase

que polimeriza a glicose novamente, porm de uma forma que
no so mais hidrolisadas pela glicoamilase

Processo Upstream

4. Apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico

Caracterstica importante: Estabilidade fisiolgica da linhagem
No basta uma linhagem hiperprodutora de uma substncia,
mas que se conhea as tcnicas mais adequadas para sua
conservao e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente
produtora da substncia de interesse ao longo de todas as
etapas envolvidas desde sua proliferao no laboratrio,
germinadores e biorreator principal

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Processo Upstream

Para a clula h sempre a tendncia de otimizar o crescimento,

em detrimento da sntese do produto, motivo pelo qual no
basta verificar se a clula cresce, mas se ela continua a
acumular o produto de maneira eficaz!!
Durante a proliferao da clula h sempre chances de
mutaes naturais!!

Massa pequena de clulas no inculo

Biorreatores de dezenas de milhares de litros
10g de matria seca de clulas/ L

Processo Upstream

5. No ser patognico!!
Sem riscos ambientais, particularmente nas etapas
seguintes ao trmino da fermentao (downstream)
Se manuseasse microrganismos patognicos em reatores de
dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de ser bastante
aumentados, o que incidiria em custos adicionais
So utilizados patgenos para produo de vacinas em reatores de
pequeno porte (poucos milhares de litros), porm confinados em
cmaras asspticas, tomando-se precaues necessrias para a no
contaminao do meio ambiente

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Tcnicos do
Instituto Butantan
trabalham na rea
de fermentao da
linha de produo de
vacinas

http://planetasustentavel.abril.com.br/album/albumFotos_301191.shtml?foto=3

Fort Dodge (Pfizer)

http://www.leptospirosenobrasil.com.br/index.php

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Processo Upstream
6. No exigir condies de processo muito complexas
pH e Temperatura: em reatores de grande porte no h controle
preciso, por isso o ideal que o microrganismo tenha uma faixa
de valores timos dessas grandezas e no valores pontuais,
particularmente no que se refere ao acmulo do produto

Reatores de grandes portes

(dezenas de milhares de L)

pH e oxignio
Heterogeneidade ao longo da altura do reator

Importante: clulas devem manter seu

desempenho dentro de uma faixa de
valores timos!!

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Biotecnologia do bioprocesso
Processo Upstream
6. No exigir condies de processo muito complexas
Tenso de oxignio: os microrganismos que conseguem manter
um bom desempenho quando cultivados em baixas concentraes
de oxignio so muito interessantes
H maior gasto de energia para
a agitao e aerao do meio!

Biotecnologia do bioprocesso
Processo Upstream
Tenso de oxignio:

Microrganismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por

exemplo) so evitados, pois a concentrao de oxignio no meio de
cultivo ter de ser mais elevada, a fim de que as clulas mais internas
destes aglomerados tenham acesso a este oxignio, quando
comparadas s clulas que crescem isoladamente

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Biotecnologia do bioprocesso
Processo Upstream
6. No exigir condies de processo muito complexas

No conveniente trabalhar com linhagens que excretam uma

quantidade exagerada de protenas para o meio

Gerao de espuma.
Isso torna complexo os processos aerbios
devido necessidade de aerar e agitar o
contedo do biorreator

Biotecnologia do bioprocesso
Processo Upstream
7. No exigir meio de cultura dispendioso
1. Ser o mais barato possvel;
2. Atender s necessidades nutricionais do microrganismo;
3. Auxiliar no controle do processo, como o caso de ser
ligeiramente tamponado, o que evita variaes drsticas do
pH, ou evitar uma excessiva formao de espuma;
4. No provocar problemas na recuperao do produto;
5. Os

componentes

devem

permitir

algum

tempo

de

armazenagem, a fim de estarem disponveis o tempo todo;

6. Ter composio razoavelmente fixa;
7. No causar dificuldades no tratamento final do efluente.

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Biotecnologia do bioprocesso
Processo Upstream
7. No exigir meio de cultura dispendioso
Meios sintticos ou definidos podem ser onerosos, mas tem composio
conhecida e podem ser reproduzidos a qualquer instante.
Para clulas que apresentam bom desempenho em meios desse tipo,
espera-se a ocorrncia de um sistema produtivo muito estvel, alm de
no apresentarem problemas quanto recuperao e purificao do
produto final.

Meios definidos ou sintticos podem ser preferidos se permitirem uma

maior economia nas etapas de recuperao do produto

Biotecnologia do bioprocesso
Processo Upstream
7. No exigir meio de cultura dispendioso

Algumas linhagens precisam de fatores de crescimento como

aminocidos ou vitaminas (biotina, timina, riboflavina etc)
Adiciona-se as substncias puras para manter o meio em sua forma
mais definida No entanto... Isso pode se tornar invivel
financeiramente quando as instalaes so de grande porte.
Alternativa: adicionar materiais complexos como extrato de
levedura (autolisado de levedura), extrato de carne, extrato de
malte, peptona (hidrolisado de protenas) etc
Problema: substncias caras, composio varivel (ao longo do
tempo de armazenagem e na dependncia do fabricante e do lote
empregado) oscilao no processo fermentativo!!!

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Biotecnologia do bioprocesso
Processo Upstream
7. No exigir meio de cultura dispendioso
Meios mais complexos e menos caros empregados na maioria dos
processos fermentativos em grande escala:
Matrias-primas naturais: caldo de cana-de-acar, melaos, farinhas
diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada), gua de macerao de
milho (Corn Steep Liquor) etc
Composio qumica desconhecida
Pode-se conhecer os teores de aucares disponveis, nitrognio, fsforo,
mas no se conhecem os teores dos sais minerais
Sempre so completados com alguns sais (contento nitrognio e fsforo)
Variao conforme: solo, variedade do vegetal, safra, clima,
processamento durante colheita e estocagem etc oscilaes no processo
fermentativo!!

Biotecnologia do bioprocesso
Processo Upstream
7. No exigir meio de cultura dispendioso
Empresas que produzem antibiticos ou enzimas e que utilizam essas
matrias primas naturais, principalmente a gua de macerao de milho,
devem manter uma planta piloto para o ajuste da composio do meio a
cada novo lote de matria-prima recebida para evitar surpresas nos
biorreatores de grande porte
Por serem as mais baratas so as mais utilizadas
Porm podem causar problemas adicionais na recuperao e purificao
do produto final, bem como problemas nos tratamentos das guas
residurias

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Biotecnologia do bioprocesso
Processo Upstream
8. Permitir a rpida liberao do produto para o meio
Se o produto liberado no meio, ele poder ser recuperado nas
etapas seguintes de uma forma mais simples, sem a necessidade de
lise celular e outras reaes que elevam o custo
Se algum produto permanecer dentro das clulas ele poder ser
perdido aps a separao das clulas do meio aps a fermentao
Pode haver uma eventual inibio do prprio microrganismo pela
reteno de um dado produto do metabolismo
Reteno de certos produtos nas clulas depende entre outros
fatores de: linhagem empregada, da composio do meio de cultura e
das condies impostas (pH, temperatura, etc)

Processo Upstream

3.2. Obteno de Biocatalisadores

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Processo Upstream

3.2. Obteno de Biocatalisadores

Biocatalisadores que possam ter interesse industrial podem ser
obtidos basicamente das seguintes formas:
Isolamento a partir de recursos naturais
Compra em colees de culturas (ATCC, NCTC...)
Manipulaes genticas:
1. Obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais
2. Fuso de protoplastos
3. Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de
engenharia gentica

Biotecnologia do bioprocesso
Processo Upstream

Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais

Solo
gua
Plantas
Muito trabalho experimental
Custo relativamente elevado
Atividade de grande importncia para obteno de novas
linhagens de interesse industrial como linhagens melhor
produtoras de um dado produto. Alm disso, pode conduzir
descoberta de novos produtos, o que confere a esta
prtica uma relevncia inequestionvel

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Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais

Compra em colees de culturas

Disponveis em vrios pases
Compra bastante vivel
Facilidade atravs dos recursos da Internet

Agricultural Research Service Culture Collection - (EUA)

American Type Culture Collection (ATCC) - (EUA)
http://www.atcc.org/

Coleo de Culturas Tropical (Campinas-SP)

http://www.cct.org.br

National Collection of Type Cultures (NCTC) - (Reino Unido)

http://www.hpacultures.org.uk/aboutus/nctc.jsp

German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Alemanha)

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade - INCQS
Lab. de Microrganismos de Referncia - Fundao Oswaldo Cruz - FIOCRUZ

Microrganismos produtores de antibiticos, em geral, no esto

disponveis em uma coleo de culturas
Oriundos de programas de melhoramento gentico

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Biotecnologia do bioprocesso
Processo Upstream

Manipulaes genticas
1. Obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais
2. Fuso de protoplastos
3. Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de
engenharia gentica

Obteno de mutantes induzidos por

mtodos convencionais
Proliferao celular

mutao natural

Mutao deleo ou adio de

uma ou mais partes qumicas
da molcula do DNA

Isolados
Potencialidade de produo

- Mutantes naturais muito tempo

- Mtodos que foram a mutao: radiaes ultra-violeta, substncias
qumicas (nitrosoguanidina)
Destri-se a maioria das clulas e recuperam-se as mutadas
Verifica-se se a mutao ocorreu na direo desejada

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Mutao pode levar perda da funo de

caractersticas indesejadas ou aumento da
produo por perda das funes de controle
Raramente leva ao aparecimento de novas
funes ou propriedades

Utilizar em microrganismo com a

caracterstica desejada para melhoramento

Penicillium chrysogenum NRRL 1951

Modificada por mutaes
Produo de penicilina aumentou de
120 UI para 2658 UI (~20x)

Fuso de protoplastos

Protoplastos
Frgeis sem parede celular
Sem capacidade reprodutiva

Sem parede celular, a

probabilidade de fuso
celular entre diferentes
espcies aumenta

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Protoplasto
Protoplasto de
fuso da clula
da folha com a
da ptala

Digesto da
parede celular

Protoplastos
de clulas das
folhas de
petnias

Meio isotnico

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Protoplast_fusion.jpg

Fuso de protoplastos
Muito utilizados com leveduras, fungos filamentosos e plantas
1. Protoplastos

so

preparados

cultivando

as

clulas

em

meios

isotnicos enquanto tratam-nas com enzimas;

2. Os protoplastos so regenerados usando estabilizadores osmticos
como a sacarose;
3. Se a fuso ocorre para formar hbridos, os recombinantes desejados
so identificados atravs de meios seletivos;
4. Aps a regenerao da parede celular, o microrganismo pode ser
utilizado para futuros estudos.

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Fuso de protoplastos
-

Fuso

pode

ser

realada

usando

polietileno

glicol

tratamento das preparaes com irradiao ultravioleta

- Fuso de clulas humanas ou de animais
-Usado para o melhoramento da produo de antibiticos por
combinar mutaes de diferentes linhagens ou at mesmo
espcies
-Facilita a transferncia de DNA recombinante
-Mtodo de associar grupos inteiros de genes entre diferentes
linhagens de macro- e microrganismos

Fuso de protoplastos
Fuso de clulas de mamferos que levam produo de
anticorpos monoclonais.
Anticorpos so a principal defesa dos mamferos. Uma clula de linfcito
B produz um nico tipo de anticorpo
A produo de linfcitos B em meios de cultura no teve sucesso pois
eles ou morriam ou paravam de produzir anticorpos
1975 Georges Khler e Cesar Milstein
demonstraram a produo de anticorpos monoclonais de um hibridoma
(produto de fuso) de Linfcitos B (clulas produtoras de anticorpos) e
clulas tumorais de mieloma
1984 Prmio Nobel
1990s o valor comercial de terapias por anticorpos sozinha valia
US$ 6 bilhes!!!

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Fuso de protoplastos
Mudana:
Clulas secretoras de
anticorpos
com tempo de vida limitado

Clulas com capacidade

contnua de crescimento
(imortais) que mantm o
potencial de secretar
anticorpos

Fuso de protoplastos
Hibridomas podem ser congelados e re-utilizados mais tarde
Aplicaes do anticorpo monoclonal:
-Diagnstico in vitro em sade humana, plantas e agricultura
animal
-Futuro: terapia com anticorpos para carregar uma droga
citotxica para o stio de clulas cancergenas
-Biotecnologia industrial: usados como ligantes de alta
afinidade para ligar e purificar produtos caros

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Aplicaes do anticorpo monoclonal

Diagnstico imunolgico

Obteno de microrganismos recombinantes por

tcnicas de engenharia gentica

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Obteno de microrganismos recombinantes por

tcnicas de engenharia gentica
Linhagens instveis limitam o emprego de sistemas de
fermentao mais eficientes, como processos contnuos, pois
poder acontecer, ao longo do tempo, a seleo de clulas que
privilegiem o crescimento em detrimento do acmulo do produto

Linhagens naturais
Linhagens mutantes
Clulas recombinantes por introduo de plasmdeos podem
ser instveis

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3.3 - Conservao do
Biocatalisador

Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no

bioprocesso, ela deve ser conservada
Tcnicas de conservao:
1) Transferncia ou sub-cultura peridica em tubos ou placas
de Petri com meio de cultura slido (viabilidade: semanas)

2) Congelamento em freezers -20 C ou -70 C (anos)

3) Ultracongelamento: -196C, N lquido (anos)
4) Liofilizao: desidratao por sublimao da gua,
sob vcuo (anos ou dcadas)

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Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no

bioprocesso, elas devem ser conservadas

... 100

... 100

Walsh G., Pharmaceutical Biotechnology, Willey ed., 2007

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Criotubos

Congelamento
Bactrias

Lento

Desequilbrio
osmtico

Clulas de mamferos
Rpido

Fromao de
cristais
intracelulares
lise

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Congelamento
Congelamento rpido minimiza os efeitos de
concentrao do soluto pois o gelo forma
uniformemente
Congelamento lento, por outro lado, resulta
em grandes perdas de gua da clula e
menos gelo intraceclular, mas aumenta os
efeitos da soluo

Manual de Criopreservao Nunc

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Congelamento
Agente de criopreservao
agente qumico que protege as clulas durante o
congelamento. Pode minimizar os efeitos prejudiciais do
aumento da concentrao do soluto e formao de cristal
Mais comuns:
Dimetilsulfxido (DMSO) e glicerol (menos txico que DMSO).
Escolha depende da clula!!
Agentes de criopreservao podem penetrar na clula e causar um
congelamento lento intracelular e diminuir os efeitos de soluo.
DMSO - Diminui a temperatura de congelamento e permite melhor
desitradao da clula antes do congelamento intracelular.
DMSO penetra melhor nas clulas e geralmente mais usado para
clulas maiores, mais complexas como os protistas.

4 - Produo de etanol

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Upstream

Biorreao
/Biorreator

Downstream

Exemplo prtico: Produo de etanol

Obteno da matria prima;

Upstream

Tratamento/preparo
Escolha do microrganismo
Preparo do pr-inculo e
inculo

Downstream

Resduos dos gros

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Biotecnologia do bioprocesso
Pr-inculo

Biorreao
Biorreatores

Inculo

Smith J E, Biotechnology, ed. Cambridge, 2004

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Biotecnologia do bioprocesso
Prximas aulas!!
- Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de
engenharia gentica
- Biorreatores
- Biorreao
-Processo Downstream

Referncias
Manual de criopreservao Nunc ver site da disciplina

Captulo 3 - Genetics and biotecnology (John Smith Biotechnology)

ver site da disciplina
Prescott, Harley and Klein. 2002 Microbiology, 5th edition, The McGrawHill (Chapter 42- Biochemistry - Industrial Microbiology And
Biotechnology) ver site da disciplina

Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia

Industrial: Engenharia Bioqumica. Volume 2. Ed Edgard Blcher
LTDA, So Paulo, 2001. Cap. 2.

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