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REVISIONES

El cultivo celular en la investigacin bsica del

cncer de mama
Pedro Antonio Martnez-Carpioa y Miguel ngel Navarro Morenob
aDepartamento de Biologa Celular y Fisiologa. Facultad de Medicina. Universidad Autnoma de Barcelona. Hospital
Universitario Germans Trias i Pujol. Badalona. Barcelona. bSeccin de Bioqumica Hormonal y Gnica. Servicio de Bioqumica.
Ciudad Sanitaria y Universitaria de Bellvitge. L'Hospitalet de Llobregat. Barcelona.

La tcnica del cultivo celular es la que ha permitido

conocer el comportamiento in vitro de las clulas
cancerosas. En esta revisin pretendemos introducir las peculiaridades bsicas del cultivo celular, referido especialmente a lneas cancerosas mamarias,
relacionar el origen de las lneas celulares ms utilizadas en la investigacin de este cncer, mencionar las tcnicas de laboratorio que pueden aplicarse sobre estos cultivos y ejemplificar la utilidad de
las mismas, tomando como modelo diversos trabajos que estudian los efectos del factor de crecimiento epidrmico sobre lneas celulares hormonoindependientes de cncer de mama.
Palabras clave: cultivo celular, lneas celulares, cncer
de mama.

Cell culture in breast cancer basic

research
The technique of cell culture has made it possible
the knowledge of in vitro behavior of cancerous
cells. In this review we present the fundamentals of
cell culture with a special reference to mammary
cancerous lines; the origin of cell lines used most
frequently in cancer research; the laboratory techniques that can be applied on these cultures; and
examples of the usefulness of these techniques according to the models of various studies that evaluate the effects of epidermal growth factor on hormone-independent cell lines of breast cancer.
Key words: cell culture, cell lines, breast cancer.

Martnez-Carpio PA, Navarro Moreno MA. El cultivo celular

en la investigacin bsica del cncer de mama. Rev Oncol
2003;5(4):184-91.c

INTRODUCCIN AL CULTIVO CELULAR:

ASPECTOS TCNICOS Y CONCEPTUALES
Los primeros cultivos de los que se dispone de informacin datan de 1907, cuando Harrison cultiv en un
cogulo linftico mdula espinal de anfibio. En realidad se trataba de explantes, es decir, fragmentos de tejido cultivados sin la separacin celular propia de los
cultivos actuales. No es hasta principios de la dcada
de los setenta cuando se depura la tcnica de cultivo y
se produce una desbordante irrupcin de publicaciones cuyos resultados se basan en el cultivo celular. Al
igual que en otros tipos de cncer, los principales conocimientos in vitro que tenemos sobre el cncer de
mama se basan en esta tcnica. En este apartado nos
centramos en resumir los aspectos esenciales de la
misma1,2.
La mayora de clulas de vertebrados en cultivo muere al cabo de un determinado nmero de divisiones.

Received 30 October 2002; Revised 9 January 2003; Accepted 16 January

2003.

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A veces, alguna de estas clulas sufre algn cambio

gentico que la hace realmente inmortal y prolifera
indefinidamente (clula variante inmortal) si se mantiene en un cultivo bajo unas condiciones adecuadas,
constituyendo una lnea celular. Los cultivos de clulas cancerosas tienen algunos aspectos diferenciales
si los comparamos con cultivos de clulas normales.
Por ejemplo, muchas veces ocurre que estas clulas
cancerosas pueden crecer sin fijarse a ninguna superficie y proliferan en una placa de cultivo hasta una
densidad mucho mayor que las clulas normales. En
ciertos casos estas propiedades de las clulas neoplsicas pueden inducirse en clulas normales, transformndolas con un virus o con sustancias qumicas
mutagnicas, constituyndose una lnea celular transformada. Esta lnea celular transformada es capaz de
provocar tumores si es inyectada a un animal de experimentacin. Las lneas celulares en cultivo, transformadas o no, tienen gran inters ya que permiten
obtener cantidades ingentes de clulas del mismo tipo y adems porque pueden conservarse en nitrgeno lquido a -196C durante un perodo indefinido de
tiempo, siendo perfectamente viables una vez descon-

Rev Oncol 2003;5(4):184-91

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geladas. No obstante, es importante reconocer que las

clulas de ambos tipos de lneas celulares casi siempre difieren de las clulas progenitoras de los tejidos
de las que derivan, y a veces, en caractersticas importantes. A pesar de que todas las clulas de una lnea celular son muy similares entre s, a menudo no
son idnticas. La uniformidad gentica de una lnea
celular puede mejorarse con el clonaje celular, mediante el cual se asla una nica clula y se le permite
proliferar hasta obtener una colonia de clulas idnticas. Esto posibilita obtener lneas celulares mutantes
con defectos en determinados genes. Estas clulas
pueden tener defectuosa alguna protena concreta,
por lo que pueden revelarse algunas funciones de la
misma si estudiamos tales clulas. En resumen, podemos decir que los subcultivos de una lnea celular
pueden resultar en una prdida en el nmero de clulas y extincin del cultivo (lnea celular finita), o
bien una viabilidad indefinida de los mismos (lnea
celular continua o transformada). Cabe en esto una
apreciacin para diferenciar el trmino de cultivo inmortal de cultivo transformado, pues hay lneas celulares inmortalizadas que no presentan caractersticas
tumorales y que generalmente se refieren como
transformadas.
Las lneas celulares continuas o inmortales normalmente presentan alteraciones citomorfolgicas caractersticas: tamao celular menor, menor adherencia,
ms redondeadas, mayor relacin ncleo/citoplasma
y sobre todo un incremento en la tasa de proliferacin celular, una reduccin del tiempo de doblaje,
menor dependencia de suero en el medio de cultivo y
ms facilidad para crecer en suspensin. Se asume
que estas lneas inmortales aparecen por anomalas
cromosmicas (alteraciones en el apareamiento cromosmico, traslocaciones, no disyunciones parciales
o totales o mutaciones puntuales), pero nadie ha podido descartar la preexistencia de clulas inmortales
en tejidos cancerosos. En ellas es frecuente encontrar
mayor heteroploidicidad (variaciones cromosmicas
entre clulas) y aneuploidicidad1-4. Los cultivos preparados directamente a partir de tejidos son los denominados cultivos primarios. Las clulas de stos pueden recuperarse de la placa de cultivo y utilizarse
para formar un gran nmero de otros cultivos, denominados secundarios. De este modo las clulas pueden ser subcultivadas repetidamente durante semanas
o meses. A menudo estas clulas muestran propiedades diferenciadas tpicas de sus orgenes: los fibroblastos continan segregando colgeno y las clulas
epiteliales forman lminas extensas con muchas de
las propiedades del epitelio intacto. Los cultivos primarios habitualmente son heterogneos y de crecimiento lento, pero son ms representativos del tejido
original del que derivan, ya que expresan muchas de
las propiedades del mismo. Sin embargo, los cultivos
primarios carecen de algunos tipos celulares presen00

tes en el tejido original, que son incapaces de sobrevivir in vitro. Adems, a medida que proliferan los cultivos primarios pierden aquellas clulas de crecimiento ms lento. Por ello, en las fases precoces de
los cultivos primarios es cuando debe separarse el tipo celular que interesa estudiar. Subcultivando a partir del cultivo primario obtenemos cultivos secundarios, de los que pueden obtenerse lneas celulares de
gran uniformidad que proporcionan un gran nmero
de clulas para estudio. No obstante, las lneas celulares procedentes de cultivos primarios pueden diferir
en algunas propiedades de las clulas originales1-3.
El medio de cultivo constituye el medio extracelular
en condiciones in vitro y contiene los nutrientes necesarios para la proliferacin de las clulas, permitiendo a la clula un constante intercambio de molculas y electrlitos. Para cultivos rutinarios es
frecuente utilizar medios lquidos que contienen sales, glucosa, aminocidos, vitaminas y, muchas veces,
proporciones mal definidas de macromolculas en
forma de suero de caballo, suero fetal de ternera, etc.
Evidentemente estos medios son inadecuados para
estudiar las necesidades de macromolculas que un
tipo celular determinado tiene para proliferar y funcionar normalmente. Esto ha conducido al desarrollo
de medios definidos qumicamente y libres de suero.
Estos medios contienen molculas imprescindibles
para la clula (glucosa, aminocidos, etc.), pero generalmente es necesario suplementarios con algunas
protenas como la insulina o algunos factores de crecimiento que estimulan la proliferacin, o la transferrina, que transporta hierro al interior de las clulas. Estos suplementos pueden variar en funcin de
las caractersticas de las clulas cultivadas. La mayora de molculas sealizadoras proteicas extracelulares esenciales para la supervivencia y proliferacin
de determinados tipos de clulas se han descubierto a
travs de estudios en cultivos celulares y la bsqueda
de nuevas molculas ha sido enormemente facilitada
por la asequibilidad de los medios definidos qumicamente y libres de suero. Los constituyentes habituales
de un medio tpico adecuado para el cultivo de lneas
mamarias incluyen:
1) Aminocidos: valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptfano, treonina, cistena, glutamina, arginina, lisina, histidina, tirosina. Todos los
aminocidos se encuentran en forma levogira (L) y la
mayora se utilizan a concentraciones de 0,1 a 0,2 M.
2) Vitaminas: biotina, colina, folato, nicotinamida,
pantotenato, piridoxal, tiamina, riboflavina. Las concentraciones habituales en el medio son unas 100 veces menores que las de los aminocidos, esto es, del
orden de 1 M.
3) Sales minerales: NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3,
CaCl2, MgCl2.
4) Penicilina y estreptomicina: para inhibir el crecimiento o contaminacin bacteriana.

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5) Anfotericina B: para inhibir el crecimiento o contaminacin fngica.

6) Rojo fenol: es un indicador de pH y se utiliza para
observar variaciones de color en el caso que nos alejemos del pH fisiolgico (pH=7,4).
7) Glucosa: se utiliza a concentraciones de 5 a 10 mM,
y es imprescindible en todos los cultivos.
En el caso de medios definidos qumicamente libres
de suero se aade generalmente insulina, transferrina y factores de crecimiento especficos o, ms frecuentemente, se adiciona suero, generalmente de caballo o ternera, hasta formar el 10% del volumen
total para permitir un crecimiento prolongado y nutrido de los cultivos. Generalmente los cultivos se
mantienen en recipientes de plstico o de vidrio, con
una superficie preparada adecuadamente, que permite la adhesin de las clulas. Los recipientes se
conservan en una estufa de cultivo a 37C, en una atmsfera con un de 5% de CO2 y un 95% de aire. El
utilizar suero como medio de cultivo tiene el inconveniente que para la mayora de clulas ste no es el
fluido fisiolgico con el que toman contacto en el tejido que constituyen en condiciones normales. Adems, el suero contiene agentes potencialmente citotxicos, sobre todo el suero fetal de ternera y el suero
humano de gestante, que presentan elevadas concentraciones de la enzima poliamina oxidasa, que al actuar sobre las poliaminas generadas por las clulas
en rpida divisin puede facilitar una sntesis importante de poliaminoaldehdos, altamente txicos para
los cultivos de este tipo de clulas cancerosas, que
acaban distorsionando los resultados obtenidos. Adems existen grandes variaciones en los constituyentes entre los distintos lotes de suero que en muchos
casos puede obligar a determinar factores u hormonas para verificar una mnima homogeneidad, con el
coste econmico adicional que esto supone. Algunas
veces, incluso cuando se utiliza suero, es necesario
aadir o suplementar algn factor u hormona, segn
los requerimientos del tipo de clula cultivado. Las
principales ventajas de utilizar medios libres de suero definidos qumicamente o medios bajos en suero
radica en una mejor reproducibilidad de los cultivos,
menor riesgo de contaminacin, se evita la citotoxicidad del suero y, sobre todo, permiten purificar productos del medio de cultivo que sintetizan las propias
clulas. El inconveniente de estos medios es que la
mayora de veces se precisa suplementarios con hormonas o con factores de crecimiento que deben implementarse adicionalmente. Adems estos medios
artificiales son bastante especficos del tipo de lnea
celular que se desea estudiar, y a veces es necesario
trabajar con varios tipos de estos medios. As pues, el
uso de medios artificiales resulta caro, pero permite
controlar en parte las condiciones del cultivo y a la
vez evitar la incertidumbre en la composicin de los
sueros animales1-3.

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LNEAS CELULARES CATALOGADAS PROCEDENTES DE TEJIDO MAMARIO HUMANO CON

FINES EXPERIMENTALES: CLASIFICACIN,
NOMENCLATURA Y AISLAMIENTO.
Para la investigacin del cncer de mama humamo se
dispone de una amplia variedad de lneas celulares
obtenidas tanto de animales de experimentacin como
de pacientes. Aunque ciertos investigadores cultivan
lneas propias no comercializadas (se comentar luego cmo se aisla una de estas lneas), la mayora de
trabajos se realizan en lneas catalogadas que se comercializan bsicamente en Estados Unidos. Disponemos de informacin de 33 de estas lneas, 22 de
ellas aisladas en la American Type Culture Collection
(ATCC, Rockville, Maryland) y 11 en el Arizona Cancer Center, College of Medicine de la Universidad de
Arizona (Tucson, Arizona) Alrededor de un 85% de
ellas son derivadas de carcinomas intraductales4. El
resto derivan de carcinomas ductales con componente papilar, medular o lobular, una lnea celular de Cystosarcoma phyllodes y 4 lneas celulares de tejido normal de mama. Una primera gran clasificacin
permite conocer si la lnea celular ha sido obtenida
del tumor primario o bien de una metstasis (tabla 1).
Cultivos a corto plazo de tejidos cancerosos procedentes de cnceres de mama humano son relativamente fciles de obtener utilizando varios medios5,6;
pero mantener estas clulas un tiempo suficiente para obtener alguna lnea celular inmortal es realmente
difcil, ya que ello obedece a un hecho fortuito y ocasional tras mltiples intentos de cultivo ms o menos
prolongado en diferentes medios, pues parece que la
posibilidad de obtener estas clulas inmortales ocurre
slo en fases avanzadas del tumor primario, cuando
ya ha producido metstasis al menos a ganglios linfticos7.
TABLA 1. Lneas celulares de tejido primario
Carcinoma intraductal
BT-20, CaMa, BTM-1, BOT-2, BT-483, YMB-1, CAL-18A,
CAL-18B, Ca2-83, VHB-1, 21NT, VACC-812, VACC-893,
8701-BC, 21PT
Carcinoma ductal con componente papilar
BT-549
Carcinoma ductal con componente medular
HMT-390951, HTN-390958
Tejido mamario sano
Hs57Bst, HBL-100, HMT-352, MCF-10
Carcinosarcoma
Hs578T
Cystisarcina phyllodes
RW-972

Lneas celulares obtenidas de tejido mamario primario (tabla 1)

Entre los tipos histolgicos ms frecuentes destacan:
1) Lneas celulares de carcinoma intraductal: en cul-

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TABLA 2. Lneas celulares obtenidas de matstasis

Metstasis a tejidos slidos
AlAb (pulmn), MDA-MB-361 (cerebro)
Du4475 (piel), vacc-2436 (pubis)
Metstasis a lquido pleural
De carcinoma intraductal
MCF-7, MDA-MB-134VI, MDA-MB-415, MDA-MB-435s,
T47D, ZR-75-27, MDA-MB-468, EFM-19, EP, MW, 600 PE,
21-MT-1, 21MT-2, MFM-223, VACC-245, VACC-265,
VAVV-1179
De carcinoma papilar
MDA-MB-175VII, DMC-42
De adenocarcinoma
SK-BR-3, MDA-MB-436, MDA-MB-453
De carcinoma medular
MDA-MB-231
De carcinoma lobular
MDA-MB-330
Metstasis a lquido asctico
De carcinoma intraductal
ZR-75-1, ZR-75-30

tivo forman cmulos o colonias de clulas epiteliales

muy compactos en los cuales es difcil visualizar la
estructura interna de las clulas. Son clulas con ncleo de gran tamao, una relacin ncleo/citoplasma
elevada y presentan varios nucleolos. Generalmente
no forman una completa monocapa.
2) Lneas celulares de carcinoma ductal con componente papilar: slo una lnea celular (BT-549) ha sido
aislada de tejido canceroso primario tipificado como
carcinoma papilar intraductal. Forma monocapa en
cultivo.
3) Lneas celulares de carcinoma ductal con componente medular.
4) Tipos histolgicos menos frecuentes4.
Lneas celulares obtenidas de tejido metastsico
(tabla 2)
Son bastante ms fciles de obtener que en el caso de
los tumores primarios, especialmente cuando las metstasis son a lquido pleural, y en general son mucho
ms heterogneas que las obtenidas del tumor primario. Se clasifican en funcin de la localizacin metastsica a partir de la cual han sido aisladas4.
Es de destacar la utilizacin de clulas primarias senescentes del epitelio mamario, como las HMEC (human mammary epitelial cells), que generalmente se
utilizan como control cuando se estudia alguna de las
lneas referenciadas. Luego se comentarn estas clulas con ms detalle.
A pesar de la dificultad para obtener lneas celulares
mamarias, hemos enumerado una lista importante,
pero debemos tener en cuenta que han sido aisladas a
lo largo de muchos aos, desde 1958 en que Lasfargues y Ozzello aslan la lnea BT-208 hasta 1992 en
que Leibovitz y Massey aslan la UACC-11799. De todas estas lneas, slo algunas han sido profundamen00

te investigadas desde el punto de vista de su dependencia hormonal, de los receptores de membrana

para diferentes factores de crecimiento, de la accin
mitognica o antimitognica de stos, etc. Probablemente cuando ha interesado estudiar clulas cancerosas hormonodependientes la lnea celular ms utilizada ha sido la MCF-7, mientras que uno de los
prototipos ms utilizados para el estudio de clulas
hormonoindependientes ha sido la lnea MDA-MB231, y ms recientemente la MDA-MB-468, sobre todo en Europa.
Nomenclatura y aislamiento de las lneas celulares
Cuando se empieza a trabajar con alguna lnea celular muchas veces nos preguntamos a qu se deben las
siglas y los nmeros. La realidad es que tal nomenclatura es muy heterognea y puede responder a las
iniciales de quien la aisl, a una entidad, hospital o
fundacin concreta, y en muchos casos resulta difcil
llegar a conocer el significado al consultar en la bibliografa cientfica. La serie MCF, una de las ms
corrientes, se debe a las iniciales de la institucin Michigan Cancer Foundation. La historia de la nomenclatura de la serie MDA-MB resulta cuanto menos curiosa. Nos centramos en la lnea MDA-MB-231.
Durante 1973, Cailleau et al. (Anderson Hospital y Tumor Institute, Houston, Tejas) aslan tres lneas celulares a partir de derrames pleurales de pacientes con
cncer de mama avanzado. Descubren que los derrames pleurales son una excelente fuente de clulas tumorales mamarias por la alta viabilidad que presentan stas en el lquido pleural y por la ausencia de
fibroblastos en cocrecimiento. Adems, la posibilidad
de separar estas clulas de otras contaminantes resultaba sencillo por la gran diferencia en la fuerza de adhesin al frasco de cultivo. Previamente estos autores
no haban sido capaces de aislar ninguna lnea celular a partir de tumores slidos de mama; ni siquiera
utilizando ms de 200 muestras diferentes. Las clulas procedentes de stas sobrevivan das, o como
mucho meses, ya que acababan invadidas por fibroblastos o bien degeneraban y moran. La lnea celular
MDA-MB-231 se estableci a partir de una nica
muestra de un derrame pleural, obtenida el 17 de octubre de 1973 de una mujer de 51 aos a la que haban practicado una mastectoma radical derecha en
enero de 1969. El estudio anatomopatolgico de la
pieza tumoral indicaba carcinoma indiferenciado con
componente ductal y papilar. Adems, la paciente
present un carcinoma intraductal. En junio y julio
de 1973 present, respectivamente, derrame pericrdico y derrame pleural izquierdo. Ambos contenan
clulas malignas compatibles con carcinoma primario de mama. Tanto la ovariectoma, practicada el
3 de julio de 1973, como la terapia subsiguiente, con
5-FU y prednisona, fueron ineficaces. La poliquimio-

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terapia (ciclofosfamida, adriamicina y ametofterina),

iniciada en septiembre de 1973, tampoco fue beneficiosa. El 21 de diciembre ingres en el hospital donde
fueron precisas varias toracocentesis. La enferma
muri el 13 de enero de 1974, en la habitacin 231,
del edificio principal (Main Building) del Hospital
Anderson, en Houston. En recuerdo a dicha paciente
se denomin as esta lnea. La muestra del drenaje
era hemtica y contena muchas clulas tumorales
que mostraron una viabilidad del 40%. Las clulas
fueron lavadas, concentradas y sembradas en diferentes medios. En pocas semanas se consegua aislar la
lnea MDA-MB-231. Estas clulas se haban mantenido en cultivo desde el 17 de octubre de 1973 hasta la
fecha en que los autores enviaron a publicar sus hallazgos10. Aunque slo haban transcurrido 7 meses, la
consideraron una lnea celular por su uniformidad y
rpido crecimiento, as como por la gran rapidez con
que estas clulas producan ndulos tumorales cuando se inyectaban al ratn. Estudios de estos tumores
eran compatibles con adenocarcinoma mamario humano, lo que indicaba que esta lnea celular proceda
de un tumor de origen mamario. Las caractersticas
de crecimiento de estas clulas, el hecho de ser aisladas a partir de metstasis a pleura y su rpida propagacin a travs del lquido pleural, haca suponer que
se trataba de clulas mutantes de gran actividad metablica y con gran capacidad de adaptacin. Las clulas inicialmente aisladas, a pesar de su rpido crecimiento, permanecan con forma redondeada, con
gran adherencia a las clulas vecinas y con pocos
desmosomas, con una alta relacin ncleo-citoplasma y con un nmero de cromosomas prximo a triploide (entre 60 y 70). Constituan el paradigma de
una clula altamente tumoral y con gran potencial
metablico. El comportamiento de estas clulas haca
apasionante su estudio y, comercializadas desde hace
muchos aos y hasta el da de hoy por la ATCC, pueden considerarse sin duda unas de las ms investigadas en cncer de mama. Trabajos posteriores indicaran que estas clulas no poseen receptores de
estrgenos y que pueden crecer sin stos. En esta lnea se ha comprobado una altsima actividad transcripcional tanto para diversos factores de crecimiento
como para sus receptores, lo que hace pensar que el
crecimiento rpido y autnomo que presentan se debe en gran medida a mecanismos autocrinos10,11.
TCNICAS DE LABORATORIO APLICABLES A
LOS CULTIVOS. UN EJEMPLO: ACCIONES DEL
FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDRMICO
SOBRE LNEAS CELULARES MAMARIAS HORMONOINDEPENDIENTES
Como ocurre en otros tipos de cncer, la mayor informacin sobre el comportamiento de las clulas tumorales mamarias se ha obtenido a travs del estudio de

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los cultivos celulares, sobre los cuales pueden aplicarse una gran variedad de tcnicas de laboratorio,
que incluyen sobre todo procedimientos habituales
en inmunologa, hematologa, bioqumica y gentica
molecular y anatoma patolgica. Con estas tcnicas
puede estudiarse el crecimiento y proliferacin de los
cultivos, la morfologa celular y sus caractersticas
bioqumicas, en especial lo que concierne a receptores de membrana y mecanismos de sealizacin intracelular. En la gran mayora de casos los experimentos consisten en manipular de modo exgeno
determinados cultivos y compararlos con los controles, que se dejan crecer espontneamente, facilitando
nicamente los requerimientos precisos para el crecimiento del cultivo. De este modo se han llevado a cabo
numerosos estudios farmacolgicos y de toxicidad, y
se ha analizado el efecto de hormonas y de muchos
factores de crecimiento11-16.
Para evaluar el crecimiento celular, las clulas son
tripsinizadas para arrancarlas de la placa de cultivo y
contarlas utilizando procedimientos citomtricos (cmara de Neubauer), con recomprobaciones con otros
mtodos (hemocitmetro), calculando e tiempo de
doblaje mediante transformacin logartmica de los
datos y contrastando los resultados con tcnicas que
miden proliferacin o apoptosis ([3H]timidina, fragmentacin de ADN, BrdU-HRP, cdkl, Fas, bcl-2, WAF-1,
p53, NMPCD, etc., generalmente mediante ELISA).
Una vez efectuado el recuento para conocer el efecto
de un factor o frmaco sobre la proliferacin (efecto
mitgeno o antimitgeno), pueden analizarse las clulas individualmente y tambin lisarse para estudiar
su contenido intracelular. A partir de aqu, se utilizar
la tcnica que permita analizar nuestros objetivos,
siempre que sea posible utilizando la ms precisa al
efecto. Entre las ms empleadas en el rea de la investigacin molecular del cncer de mama destacan
las relacionadas con las sondas genticas (marcaje,
purificacin, electroforesis), el clonaje celular, todas
las tcnicas que estudian la expresin de los genes
(hibridacin in situ, Northern blot, anlisis de transcritos por proteccin de nucleasa y ribonucleasa, Dot
y Slot blotting, anlisis de transcritos por reaccin en
cadena de la polimerasa [PCR], transferencia de
cADN, tcnica del radiorreceptor, mtodos inmunoqumicos e inmunohistoqumicos, etc.), diversos tipos
de hibridacin molecular (in situ y en fase lquida) y
finalmente todas las tcnicas destinadas a analizar el
genoma (Southern, anlisis mutacional, etc.)11. Los
procedimientos inmunoqumicos que cuantifican factores de crecimiento en el medio de cultivo, empleados ampliamente en el campo de la Inmunologa y
Hematologa se han utilizado muy poco hasta el momento para el estudio in vitro del cncer de mama,
pero pensamos que se incorporarn en mayor medida
en un futuro prximo, ya que el perfeccionamiento
metrolgico alcanzado permite utilizar tambin estas

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tcnicas en los cultivos13,14. Recientemente hemos

comprobado en nuestro laboratorio que estos mismos
procedimientos inmunoqumicos (especialmente radioinmunoanlisis [RIA] y ELISA) pueden utilizarse
para medir protenas de sealizacin intracelular tan
importantes como la p21 o la p53, as como para
comprobar el efecto sobre las mismas, tanto de factores de crecimiento como de quimioterpicos15,16.
Cada una de estas tcnicas se aplica con finalidades
concretas y la gran mayora de ellas se utilizan de
modo comn para estudiar hormonas, frmacos, factores de crecimiento y receptores de membrana para
todos ellos. Para conexionar estas tcnicas de laboratorio con el significado fisiolgico de lo que quiere
buscarse resulta til centrarse en un factor o en una
hormona y en una lnea celular concreta, analizando
los diversos estudios existentes. Por ello pensamos
que antes de disear un experimento utilizando cultivos resulta muy til centrarse en una lnea celular
concreta y en un factor de crecimiento o un frmaco
especfico. Podr comprobarse que prcticamente todas las tcnicas citadas han sido estudiadas para la
mayora de quimioterpicos comercializados y para
la mayora de factores de crecimiento, al menos para
el factor de crecimiento epidrmico (EGF), descubierto por el premio Nobel de Medicina, Stanley Cohen, hace justamente 40 aos. Para ejemplificar el caso, facilitamos una bibliografa sobre algunos de los
trabajos ms interesantes de cultivo celular que estudian el efecto del EGF sobre la lneas celulares mamarias hormonoindependientes, junto al objetivo
principal planteado. La lectura atenta de los materiales y mtodos de estos estudios y el relacionarlos con
el objetivo propuesto y los resultados obtenidos permite comprender perfectamente cmo se correlacionan las tcnicas aplicadas con lo que se busca en
cada caso. Estos trabajos no han sido escogidos al
azar, sino que se caracterizan por utilizar procedimientos de medida diferentes, evidencindose algunos resultados discrepantes entre ellos que objetivan
la dificultad de aplicar ciertas metodologas para determinados objetivos.
ANLISIS POR OBJETIVOS DE LA FISIOLOGA
CELULAR DEL EGF EN LNEAS MAMARIAS
HORMONOINDEPENDIENTES
Osborne K et al17: proliferacin celular.
Imai Y et al18: correlacin entre actividad mitognica
y unin ligando-receptor y relacin dosis exgena de
EGF y efecto mitognico.
Fitzpatric SL et al19: caracterizacin del EGFR.
Zajchowski D et al20: expresin transcripcional.
Veber N et al21: proliferacin celular.
Armstrong DK et al22: induccin de apoptosis.
Yarden RI et al23: relacin EGFR/estrgenos.
Buik RN et al24: estudio de transduccin de seal.
00

Kaplan O et al25: toxicidad sobre el metabolismo de la

glucosa.
Hamburger AW26: regulacin de la expresin EGFR.
Dong XF et al27: correlacin entre actividad mitognica y unin ligando-receptor.
Sheick MS et al28: regulacin EGFR por el TGF-
(anlogo del EGF).
Geier A et al29: EGF como interferente en la accin de
la actinomicina D.
Godden J et al30: proliferacin celular.
Mueller H et al31: transduccin de la seal.
Martnez-Carpio PA et al14: cuantificacin de la secrecin constitutiva.
A diferencia de otros tipos de cncer el estudio in vitro de lneas celulares de cncer de mama es muy deficitario en nuestro pas. La gran mayora de los trabajos se ha llevado a cabo en Estados Unidos, y
mucho menos en algunos pases europeos, especialmente en Gran Bretaa y Francia. El coste econmico
es alto y el rendimiento a corto plazo aparentemente
slo descriptivo y sin utilidad clnica. Pero cabe no olvidar que el cncer de mama es el ms mortal en la
mujer, y que todos los esfuerzos que se llevan a cabo
para conocer mejor el funcionamiento de este tipo de
clulas cancerosas contina siendo todava insuficiente en nuestro mbito. Cuando se empez a estudiar la fisiologa celular del EGF en en cncer de
mama, pocos prevean en aquel momento las aplicaciones clnicas que este factor tiene ya en estos momentos, en que por ejemplo la determinacin de su
receptor en muestras tumorales se correlaciona estrechamente con el pronstico del tumor, lo que hace
que tal determinacin sea ya necesaria en los grandes
hospitales32. Adems, la posibilidad de intervenir teraputicamente sobre el EGF, EGFR o sobre algn
intermediario implicado en su mecanismo de sealizacin intracelular constituye una esperanza real de
futuro para combatir el cncer de mama. En este sentido, el ensayo de anticuerpos monoclonales (de ratn
y humanos) contra el EGFR viene siendo una dedicacin absoluta por parte de ciertos laboratorios en todo
el mundo. La utilizacin de frmacos y/o anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el receptor de EGF
(EGFR) se prev como uno de los arsenales teraputicos ms esperanzadores contra el cncer de mama33-39.
Las lneas celulares senescentes tienen tambin gran
inters. Estas clulas pierden su capacidad proliferativa o mitgena, presentan gran tamao celular, forma aplanada y marcadores enzimticos especficos
(SA-galactosidasa, inactivacin de la p16 y p53, acortamiento de los telmeros, etc.). Trabajos importantes
parten del estudio de las clulas HMEC, sobre todo
del proceso epigentico que conduce a la activacin
de la telomerasa en estas clulas senescentes, los
cambios moleculares que se acompaan y el modo en
que se dirigen a estados senescentes o inmortaliza-

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dos. Se han encontrado importantes relaciones con

las ciclinas-cdk y otros intermediarios del ciclo celular, especialmente la Cdk2, p21 y p5340-42, pero las
conclusiones globales son complejas dado los incontables puntos de regulacin que interactan. Tenemos
aceptado un trabajo de inminente aparicin donde se
revisan de modo sencillo las bases actuales del ciclo
celular, centrando el tema en las ciclinas-cdks y las
protenas 21 y p5316.
Los grandes avances en el cncer los debemos a investigadores que desde hace dcadas, y utilizando el
cultivo celular, han estudiado mecanismos fisiolgicos y patolgicos en el comportamiento de las lneas
celulares. Estos investigadores han sido en su mayor
parte eminentemente clnicos, pero han tenido que
esforzarse para introducirse en el complejo mundo
de la investigacin bsica y de la metodologa del laboratorio. En nuestro pas, para el onclogo, la experimentacin clnica (a partir de datos clnicos, o de
laboratorio, obtenidos de pacientes) supone un importante reto, pero fcil de asumir ya que no se escapa de su terreno. La experimentacin ms bsica,
donde se necesitan complejas tcnicas para manipular las clulas, precisa de una formacin especfica y
complementaria a la que, slo dedicando tiempo, alcanza a comprender al nivel necesario para efectuar
novedosos descubrimientos. Los resultados de stos
no los podr aplicar sobre ninguno de sus pacientes
(eso es terreno de la investigacin clnica), pero favorecer sin duda futuros avances de los que se aprovecharn futuros clnicos, y en definitiva el paciente.
Con esta revisin hemos pretendido acercar al onclogo clnico de nuestro pas el estudio de las lneas
celulares en la investigacin bsica del cncer de
mama, cuya contribucin a la literatura cientfica internacional en este campo es todava escasa en Espaa, y que pensamos debe potenciarse tanto por parte
de los mdicos que trabajan en el laboratorio (bioqumicos, microbilogos, hematlogos, anatomopatlogos, inmunlogos, etc.), como de los onclogos que,
idealmente, deberan involucrarse ms directamente
en la investigacin bsica, tal como ocurre en los pases cientfica y tecnolgicamente ms adelantados en
la investigacin oncolgica.

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