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Testosterona Libre
Inmunoensayo enzimtico para la determinacin cuantitativa
de Testosterona Libre en Suero o Plasma Orina humano
Para uso In Vitro nicamente

Nmero del Producto: DNOV009 (96 Determinaciones)

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CONTENIDO
1. INTRODUCCION__________________________________________________________________ 3
2. USO______________________________________________________________________________ 3
3. PRINCIPIO DEL ENSAYO___________________________________________
4. MATERIALES___________________________________________________
4.1. REACTIVOS SUMINISTRADOS
4.2. MATERIALES SUMINISTRADOS
4.3. MATERIALES Y EQUIPOS NECESARIOS
5. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO ____________________________________

3
3

6. PREPARACION DE REACTIVOS_______________________________________
6.1. TIRAS RECUBIERTAS
6.2. CONJUGADO TESTOSTERONA-HRP
6.3. ESTANDARES TESTOSTERONA
6.4. SOLUCION SUSTRATO TMB
6.5. SOLUCION DE PARADA

7. COLECCION Y PREPARACION DE MUESTRAS_______________________________

8. PROCEDMIENTO DE ENSAYO___________________________________________
8.1. PREPARACION DE LA PRUEBA
8.2. MEDICION

9. RESULTADOS______________________________________________________
9.1. CALCULOS DE RESULTADOS
9.2. VALORES DE REFERENCIA

10. CONTROL DE CALIDAD______________________________________________ _

11. CARACTERISTICAS ESPECIFICAS DE DESEMPEO______________________ ___

11.1. PRECISIN
11.2. ESPECIFICIDAD
11.3. SENSIBILIDAD
11.4. CERTERZA
11.5. METODOS DE COMPARACION
11.6. EFECTO HOOK

12. LIMITACIONES DE PROCEDIMIENTO___________________________________

13. PRECAUCIONES Y CUIDADOS_________________________________________

12.1. CONSIDERACIONES DISPONIBLES

14. LITERATURA____________________
15. INFORMACION___________________________________

________________________________ 7
_________

_______7

3
1. INTRODUCCION
La Testosterona es una hormona esteroide del grupo andrognico. La Testosterona es secretada inicialmente en los testculos y ovarios
aunque pequeas cantidades son secretadas por la glndula adrenal. Es una hormona sexual masculina principalmente y un esteroide
anablico. En hombres y mujeres juega un papel importante en la salud y bienestar.
Solamente el 1-2% de Testosterona circulante existe no ligada o Testosterona Libre. La mayora aproximadamente el 60% esta ligada a
encontrada SHBG con tanta afinidad, mientras la restante es perdida ligada a Albmina. Tanto la ligada a Albumina ocmo la Testosterona
libre puede ser biolgicamente ativa, mientras que SHBG inhibe efectivamente la accin de la testostena.
Los efectos de la Testosterona pueden ser clasificados como efectos virilizantes y anablicos. Los efectos anablicos incluyen
crecimiento de la masa muscular e incremento de la densidad sea, y alargamiento y estimulacin del crecimiento linear y maduracin
del hueso. Los efectos virilizantes incluyen la maduracin de los rganos sexuales.
Los niveles de Testosterona declinan gradualmente con la edad en hombres. La medicin de fraccin libre y no ligada de testosterona
libre ha sido propuesta como una hormona bioactiva fisiolgicamente estimulante. Los niveles de Testosterona Libre son elevados en
mujeres con hiperandrogenismo asociado a hirsutismo en la presencia o ausencia de enfermedad poliqustica ovrica. Adems la
medicin de Testosterna Libre puede ser m{a til que tal Testosterna Total en situaciones donde la SHBG se incrementa o disminuye (e.j.
hipotiroidismo y obesidad)

2. USO
Mtodo Inmunoensayo enzimtico colorimtrico Competitivo para la determinacin cuantitativa de Testosterona Libre en suero o Plasma.

3. PRINCIPIO DEL ENSAYO

Los pozos de las Tiras Microtituladoras estn pre-cubiertas con Anticuerpos Anti-Testosterona (Fase-slida). La Testosterona en la
muestra compite con la Testosterona conjugado con peroxidasa de rbano picante por los sitios de unin con el anticuerpo. Despus de la
incubacin una separacin de los sitios libros es realizado por lavado de fase slida. El complejo inmune formado por enzima-Antgeno
marcado es visualizado por la adicin del sustrato Tetrametilbenzidina (TMB) el cual da un producto de reaccin azul, la intensidad es
inversamente proporcional a la cantidad de Aldosterona presente en la muestras. El cido sulfrico es adicionado para pararla reaccin.
Esto produce un color de punto final amarillo, la absorcin es leda a 450 nm usando un Microlector de ELISA.

4. MATERIALES
4.1. Reactivos Suministrados

Pozos Cubiertos con Anticuerpo IgG Anti-Testosterona: 12 tiras rompibles de 8 pozos cubiertas con anti-Cortisol; en
bolsa de aluminio resellable.
Solucin de Parada: 1 botella que contiene 12 ml cido sulfrico, 0.15 mol/l (Evitar cualquier contacto con la piel).
Conjugado Testosterona HRP: 1 botella que contiene 22 ml de Testosterona conjugado con peroxidada de rbano picante.
Solucin Sustrato TMB: 1 botella que contiene 12 ml 3, 3, 5, 5-tetrametilbenzidina (TMB-H2O2-TMB 0.25 g/l) (Evitar
cualquier contacto con la piel).
Estndares de Testosterona: 5 botellas, 1 ml cada uno
Estndard 0: 0 ng/ml
Estndard 1: 0.2 pg/ml
Estndard 2: 1.0 pg/ml
Estndard 3: 4.0 pg/ml
Estndard 4: 20.0 pg/ml
Estndard 5: 100.0 pg/ml

4.2. Materiales suministrados

1 Soporte de Tiras
2 Lminas Adhesivas
1 Protocolo de prueba
1 Hoja Planeadora de distribucin e identificacin

4.3. Materiales y Equipos Necesarios

Equipo Microlector de ELISA, equipado para la medicin de absorbancia de 450 nm.

Incubador 37C
Equipo Manual o automtico para lavado
Pipetas
Mezclador de tubos
Agua destilada
Disponibilidad de tubos
Reloj

5. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO
Los reactivos son estables hasta la fecha de vencimiento que viene rotulada cuando es almacenada 2...8 C en la oscuridad.

6. PREPARATION DE REACTIVOS
Es muy importante dejar todos los reactivos, muestras y estndares a temperatura ambiente (2228C) antes de iniciar la corrida del
test!

6.1. Tiras recubiertas fraccionables

Lista para uso con recubrimiento de Anticuerpo IgG Anti-Testosterona. Almacenamiento de 28 C. Abrir la bolsa cuando se alcance la
tempertaura ambiente. Inmediatamente despus de remover las tiras las restantes deben almacenarse en la bolsa de aluminio con el
desecante suministrado y a 28 C; estabilidad hasta la fecha de expiracin. No remover las hojas adhesivas en las tiras no usadas.

6.2. Conjugado Testosterona- HRP

El Conjugado de Testosterona HRP esta listo para el uso.

6.3. Estndares de Testosterona

Los estndares estn listos para uso y tienen las siguientes concentraciones.
Estndard 0: 0 pg/ml
Estndard 1: 0.2 pg/ml
Estndard 2: 1.0 pg/ml
Estndard 3: 4.0 pg/ml
Estndard 4: 20.0 pg/ml
Estndard 5: 100.0 pg/ml

6.4. Solucin Sustrato TMB

La botella contiene 12 ml de un sistema de tetrametilbenzidina/Peroxido de hidrogeno. El reactive est alisto para uso y tiene que ser
almacenado 2...8C en la oscuridad. La solucin debe ser sin color o podra tener un ligero tinte azul. Si el sustrato se torna azul, puede
estar contaminada y debe ser desechada.

6.5. Solucin de Parada

El frasco contiene 12 ml de Acido Sulfrico 0.15 M (R 36/38, S 26). Lista para uso y debe ser almacenada de 2...8C.

7. COLECCION Y PREPARACION DE MUESTRA

La muestras de suero o plasma para este ensayo deben ser colectadas de pacientes en ayunas. S el ensayo es realizado dentro de las 24
horas despus de colectada la muestras, el especien deben ser mantenido de 28C de otra forma debe ser alicuotado y almacenado en
congelacin de ( -20C a 70C). Si la muestra es almacenada en congelacin, mezclar bien para evitar el hielo antes de la prueba. Evitar
repetidas descongelaciones.

7.1. Precaucin
No use sueros fuertemente hemolizados o ligeramente lipmicos.
Se requiere mxima precisin es requerida para reconstitucin y dispensado los reactivos.
Evitar la exposicin de sustrato TMB substrato a luz directo, metal u oxidantes.
Este mtodo permite la determinacin de Testosterona Libre desde 0.10 pg/ml a 100,0 pg/ml.
Pacientes con tratamiento con Corticosteroides, esteroides natural o sintticos pueden impedir la determinacin de Testosterona
Libre.

8. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
8.1. Preparacin de la Prueba
Por favor leer el protocolo cuidadosamente antes de realizar el ensayo. La confiabilidad de los resultados depende del estricto
seguimiento del protocolo del ensayo, la distribucin e identificacin para todas las muestras y controles debe ser cuidadosamente
establecida en la hoja de resultados suministrados en el estuche.
Seleccionar el nmero de tiras o pozos que se requieran y localcelos en el soporte.
El pipeteo de muestras no debe ser mayor de 10 minutos para evitar que se sequen. Si es requerido ms de un plato se recomienda repetir
la curva correspondiente
Por favor localice y distribuya mnimo los siguientes pozos:
1 Pozo (e.j. A1)
para blanco de sustrato
2 Pozo (e.j. B1+C1) para Estndar 0
2 Pozo (e.j. D1+E1) para Estndar 1
2 Pozo (e.j. F1+G1) para Estndar 2
2 Pozo (e.j. H1+A2) para Estndar 3
2 Pozo (e.j. B2+C2) para Estndar 4
2 Pozo (e.j. D2+E2) para Estndar 5

Se recomienda determinar los estndares y muestras de pacientes por duplicado.

Realice todos los pasos del ensayo en el orden suministrado y sin demora apreciable en los pasos.
Una punta limpia y desechabe debe ser utilizada para distribuir cada estndar y cada muestra de paciente.
Ajustar la incubadora a 37C.
1. Dispensar 20 l estndar y muestra en los respectivos pozos.
2. Adicionar 200 l de conjugado-HRP a cada pozo y dejar el pozo A1 para blanco de sustrato.
2. Cubrir los pozos con la lmina adhesiva suministrada en el estuche.
3. Incubar por 1 hora a 37 C.
4. Cuando la incubacin se ha completado, remover la hoja adhesiva y lavar cada pozo dos veces con 300 l de agua destilada. Evitar
excesos desde los pozos de reaccin. El tiempo de remojo entre cada lavado debe ser mayor de 5 segundos. Al finalizar remover el fluido
por inversin de las tiras sobre papel absorbente antes del prximo paso.
Nota: El lavado es crucial! Lavados insuficientes resultan en prdida de precisin y falsas elevaciones de valores de absorbancias.
5. Dispensar 100 l Solucin Sustrato TMB en todos los pozos.
6. Incubar exactamente por 15 min a temperatura ambiente (22 28C9 en la oscuridad.
7. Dispensar 100 l de Solucin de Parada en todos los pozos en el mismo orden y como fue adicionado el Sustrato TMB.
Todo color azul desarrollado durante la incubacin se torna en Amarillo.
8. Medicin de absorbancia de las muestras a 450 nm dentro de los 30 minutos despus de la adicin de Solucin de Parada.

8.2. Medicin
Ajustar el Lector de Microelisa a cero usando el blanco de sustrato del pozo A1.
Si-debido a razones tcnicas el lector de ELISA no puede ser ajustado usando el blanco de sustrato del pozo A1, sustraer el valor de
absorbancia the ELISA reader de todos los valores de absorbancia medidos en orden para obtener un valor de resultado real!
Mida la absorbancia de todos los pozos a 450 nm y registre los valores de absorbancia para cada estndar y muestra de paciente en la
hoja de distribucin e identificacin o el planeador.
Calcular el promedio de los valores de absorbancia de todos los duplicados.

9. RESULTADOS
9.1. Clculo de resultados
Calcular el promedio de absorbancia de cada punto de los estndares de la curva y cada muestra. Interpole el promedio de los valores de
absorbancia de los estndares contra la concentracin. Dibuje la mejor curva. (Logistica de Cuatro Parmetros).
Interpole los valores de las muestras en la curva estndar para obtener el valor de concentracin correspondiente expresada en pg/ml.

9.2. Valores de Referencia

Mediana
Hombres Normal
Mujeres:
Ovulacin
Contraceptivos Oral
Postmenopausia

14

Promedio 1SD
pg/mL
13 7

Rango
pg/mL
4.5 - 42

1.3
0.9
0.8

1.40.9
1.1 0.6
0.90.5

ND - 4.1
0.3 - 2.0
0.1 1.7

10. CONTROL DE CALIDAD

Cada Laboratorio debe ensayar controles de niveles normales, altos y bajos de Testosterona Libre para monitorear el desempeo del
ensayo.
Estos controles deben ser tratados como desconocidos y determinar los valores en cada procedimiento. Cartas de control de calidad deben
ser mantenidas para realizar el seguimiento del desempeo de los reactivos suministrados.
Los mtodos estadsticos pertinentes deben ser empleados para acertar en la tendencia que se emplee. El laboratorio individual debe
poner lmites aceptables de confianza de desempeo. Otros parmetros que deben ser monitoreados incluyen el intercepto de 80, 50 y
20% de la reproducibilidad de la curva estndar de corrida a corrida. Adems, la absorbancia mxima debe ser coherente con la
experiencia en otros montajes. Las desviaciones significativa del desempeo establecido puede indicar cambio inadvertido en
condiciones o degradacin experimentales de reactivos del estuche. Reactivos frescos deben ser usados para determinar la razn de las
variaciones.
Si un software es empleado como control de la disminucin de datos de los resultados de la prueba, es imprescindible que los valores
predichos para la cada de los calibradores este dentro de 10% de las concentraciones asignadas.

11. CARACTERISTICAS DE DESEMPEO ESPECIFICO

11.1. Precisin
Variacin Intra Ensayo
Dentro de la corrida las variaciones fueron determinadas por determinacin en duplicado (16x) de dos sueros controles diferentes en un
ensayo. La variabilidad del mismo ensayo es de 6,4 %.
Variacin Inter Ensayo
Entre varias corridas las variacin fue determinada por medicin de tres diferentes sueros controles en dos diferentes lotes, la variacin
entre ensayos fue de 8,0 %.

11.2. Especificidad
La reaccin cruzada de anticuerpos calculada a 50% de acuerdo a Abraham es:
Testosterona
DHT
Androstenediona
Androsterona
DHEA-S
Cortisol
Cortisona
17 Estradiol
Estrona
Prednisona
17 Etinilestradiol
Norgestrel

100.0 %
0.006 %
0.0005 %
0.0 %
0.0 %
0.0 %
0.0 %
0.0 %
0.0 %
0.0 %
0.0 %
0.0 %

11.3. Sensibilidad Analtica

La concentracin mnima detectable de Cortisol que puede ser diferenciado a partir del estndar cero es 0.002 pg/ml con el 95 % de
lmite de confianza.

11.4. Comparacin Mtodo

El estuche de Testostena Libre ELISA de NovaTec fue comparado con otro estuche comercial disponible. 69 muestras de mujeres y 26 de
hombres fueron analizados de acuerdo a ambos sistemas. La curva de regresin lineal fue calculada.
y = 0.47 x + 0,378
r = 0.86

11.5. Efecto Hook

El estuche de Testostena Libre ELISA de NovaTec un inmunoensayo enzimtico competitivo, no muestra Efecto Hook hasta 400 pg/ml.

12. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

La contaminacin bacteriana o repetidos ciclos de descongelacin de las muestras pueden afectar los valores de absorbancia.

13. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS

En conformidad con artculo 1 prrafo 2b europeo directivo 98/79/EC para el uso de dispositivos mdicos para diagnstico
In Vitro es destinado por el fabricante para asegurar la oportunidad, desempeo y la seguridad del producto.
Por lo tanto el procedimiento de prueba, la informacin, las precauciones y las advertencias en las instrucciones para el uso
tienen que ser seguidas estrictamente. El uso del estuche con analizadores y equipo semejante tiene que ser validado.
Cualquier cambio en el diseo, composicin y procedimiento de prueba as como el empleo en combinacin con otros
productos no es autorizado por el fabricante; el propio usuario es responsable de tales cambios. El fabricante no es
responsable de falsos resultados e incidentes por estas razones. El fabricante no es responsable de ningn resultado por el
anlisis visual de las muestras pacientes.
Solamente para uso de diagnstico In-Vitro diagnostic use.
Todos componentes de origen humano utilizados para la produccin de estos reactivos ha sido probado para anticuerpos anti
Vih 1+2, anticuerpos de ANTI HCV y HBsAg y ha sido encontrado ser no reactivo. No obstante, todos los materiales deben
ser consideradas y deben ser manejadas como potencialmente contagioso.
No intercambie reactivos o tiras de diferentes lotes de produccin.
No debe usarse reactivos de otros manufacturadores con reactivos de este estuche
No emplee reactivos despus de la fecha de expiracin que esta en el rtulo.

Use puntas limpias, dispensadores y elementos de Laboratorio.

No intercambie las tapas de los viales de reactivos para evitar contaminacin cruzada.
Cierre los viales de reactivo en forma apretada despus de uso para evitar evaporacin y contaminacin microbiana.
Despus de una primera apertura y subsecuente almacenamiento chequee el conjugado y frascos de control por
contaminacin microbiana antes del uso nuevamente.
Para evitar contaminacin cruzada y resultados elevados falsos pipetee muestras de pacientes y conjugado sin salpicar
exactamente en el fondo del pozo.

PRECAUCION: El acido Sulfrico irrita ojos y piel. Evitar el alcance de nios. Sobre el contacto con los ojos, lavar completamente con
agua y consultar a un mdico!

13.1. Consideraciones para el Descarte

Los residuos de qumicos y preparaciones son generalmente considerados como desecho peligroso El descarte de este tipo de desecho es
regulado a travs de leyes y regulaciones nacionales o regionales. Contacto la autoridad local o compaa de manejo de desechos la cual
debe orientar en como manejar el desecho peligroso.

14. LITERATURA
McCann D., Kirkish L. (1985) J. Clin. Immunoassay 8, 234 - 6.
Ekins RP. (1984) J. Clin. Immunoassay 7(2), 163 80.
Paulson JD et al. (1977) Am. J Obst. Gynecol 128, 851 7.
Odlind V. et al. (1982) Clin. Endocrinology 16, 243 49.
Green PJ. (1982) Clin Chem 28, 1237.
Wu CH. (1982) Obstet Gynecol. 60, 188 94.

15. INFORMACION PARA ORDENAR EL PRODUCTO

Prod. No.: DNOV009 Determinacin Testosterona Libre (96 Determinaciones).

ESQUEMA DEL ENSAYO

Testosterona Libre
Preparacin del Ensayo
Preparar reactivos y muestras como lo describe el manufacturador.
Establecer la planilla de distribucin e identificacin para todas las muestras y controles
en la hoja de resultados suministrada en el estuche.
Seleccionar el nmero de tiras de microtitulacin o pozos y colocarlos en el soporte.

Procedimiento de Ensayo
Blanco
Sustrato

Estandard
0

Estandard
1

Estandard
2

Estandard
3

Estandard
4

Estandard
5

Muestra

Estandard
0

20 l

Estandard
1

20 l

Estandard
2

20 l

Estandard
3

20 l

Estandard
4

20 l

Estandard
5

20 l

Muestra

20 l

200 l

200 l

200 ml

200 l

200 l

200 l

200 l

Conjugado
Diluido

100 l

100 l

100 l

100 l

Cubrir pozos con la hoja adhesiva suministrada en el estuche

Incubar por 1 h a 37 C
Lavar los pozos dos veces con 300 l de agua destilada
TMB
Sustrato

100 l

100 l

100 l

100 l

100 l

100 l

Incubar por 15 minutos exactamente a T ambiente en la

oscuridad
Solucin
Parada

100 l

100 l

100 l

100 l

100 l

100 l

Medicin Fotomtrica a 450 nm

Waldstr. 23 A6 D-63128 Dietzenbach, Germany Tel.: +49 (0) 6074-48760 Fax: +49 (0) 6074-487629 Email :
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