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MARCADORES MOLECULARES
Categorias de marcadores
Andersen e Lubberstedt, (2003)
AVALIAO DO POLIMORFISMO
DIRETAMENTE DO DNA
RFLP (1980)- fragmentos de DNA de comprimento
polimrfico
PCR (1985)- reao de polimerase em cadeia
Mini e Microsatlites (1985)- seqncias adjacentes
que se repetem em nmero variado
RAPD (1990)- polimorfismo de DNA amplificado ao
acaso
AFLP (1994) - polimorfismo no comprimento de
fragmentos amplificados
SNP ( 1998) -
MARCADORES DE DNA
Hibridizao
RFLP Hibridizao
Minisatlites ou locos VNTR
RAPD
SCAR
Amplificao D STS
do DNA (PCR) Microssatlite ou SSR
AFLP
SNP
Seqncias
Expressas
ESTP
ASP
SNP
1- Extrao do DNA
2- Digesto por enzimas de restrio
3- Separao dos fragmentos (eletroforese)
4- Transferncia do DNA para membrana de nylon
5- Hibridao (fragmentos x sondas marcadas)
6- Autoradiografia(exposio da memb. a filme de raio X
ou compostos luminescentes
7- Anlise da segregao
HIBRIDIZAO
Seqncia de DNA
ATGCTCGACGTTCGACTTAGC
CTGCAAGCT
Seqncia da Sonda:
(1000 pb tratadas com P32)
Marcadores RFLP
RFLP
VANTAGENS
Cobre potencialmente todo o genoma(detecta
variaes em seqncias de DNA de 4 a 8 pb)
Expresso co-dominante
Alta repetibilidade e consistncia
LIMITAES
Passos intensivos em mo de obra
Inexistncia de biblioteca de sondas disponvel
Instalaes
Tcnica de PCR
Reao em Cadeia de Polimerase
Tcnica que replica milhes de vezes um fragmento de
DNA, possibilitando a sua deteco e anlise
Extrao do DNA
Vrios protocolos
Kits prontos
OP-B07
OP-B04
OP-B11
OP-B08
2
2
3
3
OP-C14
Produtos de amplificao de DNA obtidos com os iniciadores OP-B04, OP-B07, OP-B08, OPB11 e OP- C14. As colunas de 1 a 6 correspondem aos produtos de amplificao das cultivares
de feijo Carioca, Carioca MG, Apor, Prola, IAPAR 57 e IAPAR 81. As setas indicam as bandas
consideradas robustas.
RAPD
Mossor, Quitria,Chonan,Caador,Amarante,Amarante L,Chonan L
Identificao de cultivares
RAPD MELO
(Diversidade gentica)
MELO
RAPD MELO
Acares
Berinjela (Fitoplasma)RAPD
Diagnstico
RAPD
VANTAGENS
Simplicidade, rapidez e baixo custo
No requer biblioteca de sondas
LIMITAES
Expresso dominante
Baixo contedo de informao por bloco
Padronizao de condies de amplificao
Competio entre stios de amplificao
Freqncia de ocorrncia
1 microssatelite a cada 6-7 Kb (EST) Cardle et al,
2000
MTODO
as sequencias que flanqueiam Regies repetidas so
amplificadas por um par de primers especficos (20 a 30
bases) - complementares as seqncias microssatlites.
Cada microssatlite um loco gentico altamente
varivel, multiallico
Separao por eletroforese (cada banda representa um
alelo diferente do mesmo loco)
AT
AT
so multi-allicos
AT
AT
AT
CA
CA
CA
CA
CCG
Alelo
Alelo
31
Alelo 2
Alelo
5
Alelo
Alelo
73
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CCG
CCG
CCG
alelo A
alelo B
alelo C
AA
AB
AC
BB
BC
CC
CACACA
GTGTGT
CACACA
GTGTGT
Amostra 1
Amostra 2
Amostra 3
(CA)3
(CA)3
CA10/CA12
CA18/CA18
CA17/CA17
CA15/CA15
CA12/CA18
CA12/CA15
CA10/CA15
CA12/CA12
CA12/CA15
CA10/CA10
R R R R R R R R R R R R - S S S S S S S S S S S S S S S S - S S PR PS - - M
Anlise dos produtos de amplificao do DNA de feijo-caupi com o primer SSR VM70. PR- CNC
0434 (genitor resistente); PS- IPA 206 (genitor suscetvel); R- indivduos resistentes; S- indivduos
suscetveis; M Marcador de peso molecular 100 pb.
CHICORIA (SSR)
Identificao de cultivares
Bnlg2291
Bnlg238
__________________ ___________________
M 8
3 8/3 7
7/4 8
8/3
7 4
7/4
PIMENTO
Hbridos
DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES DE
MICROSATLITES
DNA genmico total clivado com enzima de corte
freqente
DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES DE
MICROSATLITES
A partir de Bancos de Dados
Recursos Computacionais
Tandem Repeats Finder verso 3.01 (BENSON,
1999)
EST-SSR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Pinto, 2006
Vantagens
Herana codominante;
alta abundncia nos genomas eucariotos;
multi-alelismo;
baixo custo e potencial para amplificao de
sistemas multiplex;
Fcil execuo ;
automatizvel
Transferibilidade
DESVANTAGENS
Desenvolvimento dos pares de primers
especficos-construo de bibliotecas genmicas
enriquecidas com os microssatlites
clonagem e seqenciamento desses e o desenho
dos primers complementares s regies
conservadas que flanqueiam os microssatlites
Enzimas
de
Restrico
DNA Genmico +
Fragmentos de DNA
de variados tamanhos
Ligao de adaptadores
AATTC
G
TTAA5
EcoRI adaptador
5
AFLP
TTA
AAT
Marcao de primers
Primers
T 5TA
AAT
MseI adaptador
AAC
AATTC
TTAAG
TTA
AAT
AAC
AFLP
Polimorfismo
MARCADOR AFLP
COLOR
IAC-22
PRECOCE
REDENO
ITA-96
Tamcot SP-37
GH-11-9-75
REDENO
ITA-90
0.49
0.58
0.68
0.77
0.87
Deltapine Acala 90
AFLP
Tomate
Sacarose-- AFLP
Sacarose
AFLP nabo
MARCADORES MOLECULARES
Construo de mapas genticos
Anlise da diversidade gentica
Mapeamento de caractersticas de interesse
agronmico
AVALIAO DE POLIMORFISMOS DE SEQNCIAS DE DNA
MARCADORES MOLECULARES
Acesso de regies intergnicas
Regies que no codificam seqncias gnicas
INTERESSE
EXPRESSAS
SNP- Polimorfismo de um nucleotdeo
Single Nucleotide Polymorphism ou Polimorfismos de Nucleotdeos
nicos
Polimorfismo baseados na alterao de uma nica base no genoma
Exemplo: AAGGTTA muda para ATGGTTA
e distribuio no genoma:
Genoma humano: 90% polimorfismo SNPs 1,42 milho
Milho: 1SNP 48pb (Regies no-codificadoras)
Total 21.502 SNPs
1SNP 131 pb (Regies codificadoras) Barker, 2002
So encontrados no genoma em :
Haplogrupos: mutaes que ocorrem prximas e so herdadas juntas
Indivduo
Seqncia encontrada
Haplogrupo
1
GATATTCGTACGGATGTATC
AG
2
GATGTTCGTACTGATGTATC
GT
Individuais:
So encontrados em:
1. Em regies codificadoras: podem gerar
alelos
moleculares.
VANTAGENS
Abundncia no genoma
Elevado grau de polimorfismo
Deteco de diferentes alelos para genes de interesse
DESVANTAGEM
Seqenciamento de
Aplicaes
Desenvolvimento
Identificao e seqenciamento dos variantes allicos do gene
de interesse
Desenho de um par de primers
Anelamento local de insero / deleo / substituio
Tcnica de PCR
detectar (screening)
identificar (especfico)
PCR Qualitativo
Segmento comum s
construes gnicas
Ex.:
Soja RR:
CaMV 35S
Promoter
CP4 EPSPS
Petunia CTP
NOS Terminator
Falso positivo
Famlia Cruciferae
CP4 EPSPS
Petunia CTP
NOS Terminator
Obteno de seqncias
Banco de dados
PCR Multiplex
Amplifica mltiplas seqncias alvo
Utiliza combinao de primers
Identificados simultaneamente quatro eventos
DETECO DE COMPONENTES GENETICAMENTE
MODIFICADOS EM PLANTAS E DERIVADOS
PCR Quantitativo
PCR Quantitativo
PCR competitivo
- Visa a padronizao do teste de PCR
DNA competitivo
Primer 1
Primer 2
DNA fragment of transgenic soy
Amostra:
35S-Promotor
Padro Interno:
NOS
Primer 1
Primer 2
3. Liberao da sonda
PCR-Cycles
GMO DNA
Fluorescence Intensity
Detection
15,0 %20
25
30
35
2,0 %
0,5 %
0,1 %
Cycle Number