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III Semana da Biologia (PET/UFVJM)

17 a 21 de outubro de 2011

Mini-curso: Anlise de protenas por eletroforese


Profas: Anete P. Loureno (anetelourenco@gmail.com) e Elaine C.
Cabral

Procedimentos
Amostras de folha e semente de milho, assim como de hemolinfa e tecido
abdominal de gafanhoto foram processadas. Para tal, as amostras foram extradas
utilizando-se tampo de lise (anexo 1) para macerao.
Aps extrao das protenas, as amostras foram lidas em espectofotmetro a 595
nm utilizando-se o mtodo de Bradford (Bardford, 1976; Anexo 2). Para a separao de
protenas por eletroforese SDS-PAGE foram utilizados 3 e 10 g de protenas totais de
cada uma das amostras, e foram confeccionados dois gis com o mesmo conjunto de
amostras para serem corados com dois tipos de colorao. Os gis foram fabricados na
concentrao de 7,5% (Laemmli,1970; Anexo 3) no dia anterior. Neste mesmo dia, as
amostras foram preparadas utilizando-se tampo da amostra (anexo 5).

No dia

posterior, as amostras foram fervidas por 3 minutos, acondicionadas imediatamente em


gelo por pelo menos 1 minuto, e aplicadas nos gis.A eletroforese foi processada sob
uma corrente de 50 mA (at o marcador de corrida azul de bromofenol- ultrapassar o
gel de empacotamento a voltagem no foi superior a 80V, e depois no foi superior a
250V), durante aproximadamente 2 horas, usando-se tampo Tris-glicina-SDS (Anexo
4) no compartimento dos eletrodos. A colorao dos gis foi por prata (anexo 6) ou
Coomassie (anexo 7). Os gis, aps colorao, foram ento escaneados.

Resultados
Os gis contendo as mesmas amostras, com mesmas concentraes (3 e 10 g.) revelam
a diferena na colorao com prata (Fig. 1) e colorao com Coomassie (Fig. 2).
M

Figura 1- Gel SDS-PAGE 7,5% de amostras de inseto e planta, nas concentraes de 3 e 10 g.


Marcador de peso molecular (M) est no centro do gel. Colorao por prata. Seta indica bandas
de protena que apresentaram maior concentrao.

Figura 2- Gel SDS-PAGE 7,5% de amostras de inseto e planta, nas concentraes de 3 e 10 g.


Marcador de peso molecular (M) est no centro do gel. Colorao por Coomassie. Seta indica
bandas de protena que apresentaram maior concentrao.

Referncias
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of proteins utilizing
the principle of protein binding, Anal. Biochem., v. 72, n. 1-2, pp. 248-254, mai.
1976.
LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, v. 227, n.5259, p. 680-685, 1970.

Anexos

Anexo 1 Tampo de lise


Tris-Hcl ; pH: 7,4
EDTA
NaCl
Triton X 100

10 mM
5 mM
50mM
1%

Anexo 2 Mtodo de Bradford (1976)


Receita do Bradford
Dissolver 100mg de Coomassie Blue G250 em 50 ml de etanol 50%. A esta soluo,
adicionar 100 ml de cido fosfrico 85%. Diluir o concentrado em 800 ml de gua
destilada.
Curva padro
Os valores de densidade ptica (DO) foram obtidos utilizando-se 1, 5, 10, 15 e 20 g de
albumina srica bovina (BSA), em 1 ml de soluo de Bradford, numa absorvncia de
595 nm. A curva padro foi construda a partir dos valores de DO obtidos aps leitura a
595 nm, em espectrofotmetro.

Anexo 3 Gel de poliacrilamida SDS-PAGE 7,5% (mini-gis 10x10cm)


Tampo do gel de separao:
Tris-Base
18,17 g
gua destilada
50 ml
Ajustar pH para 8,8 com adio de Tris-HCl. Completar o volume para 100 ml com
gua destilada.
Tampo do gel de empacotamento:
Tris-Base
3,03 g
gua destilada
50 ml
Ajustar pH para 6,8 com adio de Tris-HCl. Completar o volume para 100 ml com
gua destilada.
Solues de APS (persulfato de amnia):
1% - 0,01g de APS em 1 ml de gua destilada
5% - 0,025g de APS em 0,5 ml de gua destilada

Acrilamida/Bis-acrilamida:
Acrilamida
Bis-acrilamida

30 g
0,8 g

Gel separador para gel 7,5%


gua destilada
Tampo Tris-HCl; pH 8,8
Acrilamida 30%
TEMED
APS 1%

1,75 ml
3,5 ml
1,75 ml
28 l
133 l

Gel empacotador para gel 7,5%


gua destilada
Tampo Tris-HCl; pH 6,8
Acrilamida 30%
TEMED
APS 5%

1,65 ml
2,76 ml
750 l
20 l
102 l

Anexo 4 Tampo dos eletrodos


Tris-Base
4,545 g
Glicina
21,6 g
SDS
1,5 g
Completar com gua destilada at o volume de 1,5 l.

Anexo 5 Tampo da amostra (2x)


Tris (PM=121,14)
0,755g
Glicerol
10 ml
Dissolver em 15 ml de H2O e medir pH para 6,75
Adicionar:
SDS
2g
Mercaptoetanol
5 ml
Bromofenol-azul
0,002g
gua destilada
completar para 50 ml

Anexo 6 Colorao do gel SDS-PAGE por prata


Fixador:
lcool
25 ml
Metanol
25 ml
cido Actico
12 ml
Formaldedo
50 l
Completar o volume para 100 ml com gua destilada.
Fixar por 30 minutos.
Lavar com etanol 50% 2 vezes de 10 minutos cada.
Tiossulfato de sdio 0,8 mM por 5 minutos (redutor), sendo este preparado 2 minutos
antes do uso:
Tiossulfato
0,02 g
gua
25 ml
Retirar 2 ml desta soluo e reservar para revelador.
Adicionar soluo restante 75 ml de gua destilada.
Lavar com gua destilada 3 vezes ( 10 segundos cada lavagem).
Impregnar com nitrato de prata por 10 minutos, sendo este preparado alguns minutos
antes do uso:
Nitrato de prata
0,1 g
Formaldedo 37%
75 l
Adicionar 100ml de gua destilada.
Lavar com gua destilada 2 vezes ( 10 segundos cada lavagem).
Revelador:
Carbonato de sdio monoidratado
4g
Soluo de tiossulfato
2 ml
Formaldedo
50 l
Completar o volume para 100 ml com gua destilada.
Bloquador:
lcool
25 ml
Metanol
25 ml
cido Actico
12 ml
Completar o volume para 100 ml com gua destilada.

Anexo 7 Colorao do gel SDS-PAGE por Coomassie Blue R-250


Coomassie Brillant Blue R-250

0,25 g

gua

50 ml

Etanol absoluto

50 ml

cido Actico Glacial

10 ml

*Colocar tudo em um Becker, embrulh-lo com papel alumnio e deixar em agitao


durante 10 horas.

Soluo de Lavagem para colorao em Coomassie Blue-R 250


gua destilada

50 ml

lcool comercial

50 ml

cido Actico Glacial

10 ml