UNIVERSIDAD NACIONAL DE

SAN MARTIN
FACULTAD DE INGENIERIA
AGROINDUSTRIAL

DOCENTE

: Ing. Nelson Garca Garay

ASIGNATURA

: Microbiologa
Agroindustrial

TEMA

: Prctica N3

ESTUDIANTE

: Bocanegra Garca Eylen Roco

TARAPOTO SAN MARTN

- 2014-

PRCTICA N3: FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE (Coloracin Gram.

Galera de OxNiGLUMoCISKAD)

I.

INTRODUCCIN
Las enterobacterias (orden Enterobacteriales y
nica
familia Enterobacteriaceae)
son bacterias Gram
negativas que
contiene ms de 30 gneros y ms de 100 especies que pueden
tener morfologa de bacilos o cocos. Los miembros de este grupo
forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y de
otros rganos del ser humano y de otras especies animales.
Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes comunes, incluido
el cloro. Con frecuencia se encuentran especies de enterobacterias
en
la
industria:
para
la
fermentacin
de quesos y
productos lcteos, alcoholes, etc.
Caractersticas
Son bacterias gram negativas, la mayora bacilos, otros
cocobacilos y otros pleomrficos.
No son exigentes, son de fcil cultivo.
Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa
positivo), es decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa.
Son capaces de reducir nitrato en nitrito.
Son anaerbicos facultativos.
Son fermentadores de carbohidratos en condiciones
anaerbicas con o sin la produccin de gas (en especial
glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia gama de
substratos en condiciones aerbicas.
Muchos gneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse,
aunque algunos gneros no son mviles.
Adicional a ello, las enterobacterias no forman esporas, algunas
producen toxinas y pueden ser encapsuladas y son organismos
catalasa positivos. Son quimiohetertrofos, y necesitan para su
crecimiento compuestos simples de carbono y nitrgeno,
generalmente slo con D-glucosa, aunque algunas requieren
aminocidos y vitaminas. La temperatura ptima de crecimiento es
de entre 22 C y 37 C.
Las diferencias entre los nombres de los diversos gneros provienen
de criterios ms precisos, como la fermentacin de los diferentes
azcares, la produccin o no de azufre, la presencia de enzimas
metablicas (-galactosidasa, desaminasas, descarboxilasas), etc.
Los serotipos de importancia mdica y sanitaria pueden distinguirse
entre s por la presencia o ausencia de antgenos en su constitucin

celular, tales como en el lipopolisacrido (antgeno O), el antgeno

flagelar (antgeno H) o el antgeno capsular (antgeno K)
II.

OBJETIVOS
Hacer que el alumno recuerde las tcnicas y procedimientos bsicos
de Microbiologa General, para poderlos aplicar posteriormente en el
control microbiolgico de los alimentos.

III.

REVISIN DE LITERATURA
La tincin Gram se denominada as por el bacterilogo dans
Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su
reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, gram- positivas y gram- negativas (en este caso, los trminos
positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino
simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de
bacterias).
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta
debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes
celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y
forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El
material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y
consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como
algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la
clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gramnegativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada,
nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana
exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas.
Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es
peptidoglicano. (Santambrosio y et al, 2009)
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente
debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el
peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la
pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha
mayor proporcin que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se
debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble
en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de
alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado
delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo
que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa,
perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las
Grampositivas, al poseer una pared celular ms resistente y con

mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin

del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros
cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.
IV.

MATERIALES Y MTODOS
A. Coloracin Gram a partir de una cepa marcada
Desengrasar una porta-objeto con alcohol-acetona y
algodn.
Descolgar una gota de agua estril, suspender en ella una
pequea cantidad de cepa problema y homogenizar.
Dejar secar y flamear suavemente la extensin para
fijarla.
Cubrir con una solucin del colorante primario. Violeta de
genciana u otro similar y dejar en contacto por espacio de
2 minutos. Lavar con agua de cao.
Cubrir con el mordiente o fijador (lugol o solucin de yodo)
y dejar en contacto por un minuto. Lavar.
Decolorar con la solucin de Alcohol-Acetona (1:1). Lavar.
Cubrir con solucin de contraste, safranina, eosina o
fucsina y dejar en contacto por 30 segundos. Lavar.
Secar suavemente, agregar una gota de aceite de
inmersin y observar al microscopio. Anotar los resultados.
B. Galera
Bioqumica
Enterobacteriaceaes

de

OxNiGLUMoCISKAD

para

A partir de una cepa marcada, efectuar las siguientes pruebas

bioqumicas:

Reaccin de la Oxidasa (Ox)

Reduccin de los Nitratos (Ni)
Fermentacin de la Glucosa (G)
Fermentacin de la Lactosa (L)
Hidrlisis de la Urea (U)
Ensayo de Movilidad por cultivo (Mo)
Asimilacin del Citrato (C)
Formacin del Indol (I)
Formacin del cido Sulfhdrico (S)

C. Fundamento v
procedimiento
de
las pruebas
bioqumicas para la familia Enterobacteriaceae
Constituida por grmenes de bastn Gram negativo mviles
(flagelos en peritrico) e inmviles, Oxidasa negativos. Nitratos
son reducidos a nitritos. Todas fermentan la glucosa con o sin

produccin de gas, la diferencia de estas bacterias se basan en el

comportamiento bioqumico, tratamiento recomendado por
MOSSEL-QUEVEDO y llamado:
Ox Ni G L U Mo C I S K A D
Oxidasa (Ox)
Llamada tambin Citrocromo Oxidasa; Es una enzima por la cual las
bacterias que la: poseen, oxidan al tetrametil-para-fenil-endiamina en
Indol (azul).
Prueba
En una placa petri colocar un papel de nitro, humedecer este con el
reactivo de Kovacs (solucin de tetrametil-parafenil-endiamina al 1%
en agua destilada). Preparar el reactivo inmediatamente antes de
usarlo, debido a que se oxida con el aire y la luz. En la parte
humedecida hacer una estra de cultivo joven (18 a 24 horas de
incubacin) de ms o menos 5 mm de longitud considerar la prueba
como positiva, si en 5 segundos aparece un color azul intenso. Las
enterobacterias no deben dar esta reaccin.
Reduccin de Nitratos (Ni)
Las bacterias que poseen las enzimas nitrato-reductasa, tienen la
propiedad de reducir los nitratos a nitritos.
Prueba
Sembrar el germen a estudiar en agar o caldo nutritivo que contenga
adems 1/1000 de Nitrato de Potasio. Despus de incubar a 37/24
horas, aadir gotas de solucin A y de solucin B (Reactivo de Gries)
o en su defecto reactivo slido formado por cido sulfanlico, cido
tartrico, y alfa-naftil -amina.
La prueba es positiva s aparece color rojizo en ambos casos. Sino
aparece dicha coloracin agregar sobre el cultivo que contiene e!
reactivo, Zn o Mg en polvo; observar despus de 10 minutos si la
coloracin es rojiza, considerarla como negativa ya que en el caso,
son el Zn, Mg, y no el germen el que se ha reducido en nitratos.

PRUEBA

MEDIO DE
CULTIVO

T Y TIEMPO DE REACTIVO A
INCUBACIN
AADIRSE

RESULTADO
POSITIVO

Ni

Caldo nitrato

37C X 24-48 H

Sin coloracin
Tetrametil
parafenil
endiamina
Reactivo gries Color rojizo

Agar glucosa

37C X 24-48 H

Color amarillo

Agar lactosa

37C X 24-48 H

Color amarillo

Caldo urea

37C X 24-48 H

Color grosella
intenso
Turbidez

Ox

Mo

------

-----

Agar Movilidad 37C X 24-48 H

Agar Citrato
Simmons

37C X 24-48 H

Caldo
peptonado

37C X 24 H

Agar kligler

37C X 24 H

Coloracin negra

37C X 18-24 H

Disco blanco en
superficie

A
D

Agar base +
0.1
ml de CNK
0.5%
Agar
fenilalanina
Agar lisina
fierro

37C X 18-24 H
35-37C X 24-48H

Color azul
Reactivo de
kovacs

Sal Frrica

Anillo rojo
grosella

Color verde
Color prpura

Fermentacin de Glucosa, Lactosa y Produccin de H S (GLS)

El H;S es formado por determinadas Enterobacterias, ya sea por
desanimacin de aminocidos azufrados (tiosulfatos, sulfitos), En el
medio, el H2S formado, reacciona con la sal de Fe contenido en l y
da sulfuro de fierro (FeS) de color negro. La prueba en condiciones
aerobias, es reversible.
Prueba y lectura
Se puede realizar en un slo medio: Kligler (Hierro dos azcares), en
el cual la siembra se realiza por picadura profunda, y una estra en la
superficie. Incubar a 37C, por 18 a 24 Horas.

Parte inferior amarilla: Fermentacin de Glucosa.

Parte superior amarilla: Fermentacin de Lactosa.
Ruptura del medio: Produccin gas (Glucosa)
Ennegrecimiento en la puntura de inoculacin: H2S positivo.
Indicador del medio: Rojo le fenol

Hidrlisis de la Urea (U)

Las enterobacterias que poseen la enzima ureasa, hidrolizan la Urea,
alcalinizando en esta forma el medio de cultivo, haciendo virar con
ello el rojo de fenol, indicador de este, del anaranjado al grosella
intenso (prueba positiva).
Medio de cultivo: Caldo urea
Deteccin de Movilidad (Mo)
Prueba
Como medio de cultivo se utiliza un medio semi-slido (agar nitratado
que lleva 3% de agar) distribuidos en tubos de "U" la siembra se
realiza por puntura, introduciendo la aguja de Kolle 5 mm de
profundidad, slo en una de las ramas.
Lectura
Despus de incubar a 37C por 24 horas, considerar la prueba
positiva, si un enturbiamiento. Se extiende desde la rama cultivada a
la otra.
KNO3: Fuente de Oxgeno, necesaria para la movilidad de! germen
aerobio.
Asimilacin del Citrato (C)
Las enterobacterias que utilizan el Citrato de Sodio como nica
fuente de Carbono, alcalinizan el medio agar Citrato de Simona,
haciendo virar el indicador azul de bromo timol, del verde al azul
intenso.
Para esta prueba hay que tener las siguientes precauciones:
Utilizar tubos nuevos, o bien los usados, esterilizado al calor
seco para destruir all los posibles restos de materia orgnica
que pudiera contener.
Realizar siempre la siembra a partir de un medio
slido
porque con medio lquido se arrastrara
restos de materia
orgnica.
Realizar la siembra en pequea cantidad y trazando
slo
una lnea a lo largo de la superficie de inclinacin.
Produccin de Indol (I)

Algunas enterobacterias, tienen la propiedades hidrolizar el

aminocido triptfano. Uno de los productos finales de esta
degradacin es el Indol.
Prueba
Para detectarlo, a un cultivo de 18 a 24 Horas en caldo Peptona do,
adicionar el reactivo de Kovacs pura Indol. Prueba positiva: Anillo
grosella en la superficie.
Tolerancia al Cianuro de Potasio (K)
Prueba
Para determinar la resistencia de las diferentes enterobacterias frente
al OTK; se realiza la siembra del germen a estudiar, en medio base al
que se le ha colocado previamente 0.1 ml. De un solucin al 0.5%.
Se usan tubos de 8 x 160 mm-, y se siembran tres usadas de ms o
menos 6 mm. De dimetro, a partir de un cultivo de 18 a 24 horas
Incubar a 37C por 18 a 24 horas como mximo.
Lectura
Prueba positiva: Disco blanco en la superficie del medio.
Prueba
negativa: Turbidez en
la parte inferior, con
una
superficie
completamente transparente, o ausencia total de
desarrollo.
Prueba de cido Phenil Pir vico (A)
La fenilalanina, es un aminocido que determinadas enterobacterias
pueden transformar en cido phenil pirvico.
Prueba
Sembrar el germen a estudiar, en forma abundante (estras)
aminocido en estudio. Despus de la incubacin a 37C por 24
horas, investigar en el medio la presencia de cido fenil pirvico,
adicionando unas gotas de sal frrica (Cl2 Fe). Prueba positiva:
Aparicin inmediata de color verde.
Descarboxilacin de la lisina (D)
Ciertas enterobacterias pueden transformar por desearboxilacin la
lisina en Cadaverina, que por desanimacin libera grupos amino
(NH3), bajo la forma de NH, alcalinizando el medio de cultivo.
Prueba

Esta prueba se realiza en el medio de Taylor, que lleva glucosa, lisina

y prpura de bromocresol como indicador del medio.
Lectura
Despus de incubar a 37C por 24 horas, considerar la prueba como
positiva si el Violeta vara al color prpura.
Prueba negativa: medio de color amarillo, por fermentacin de la
glucosa.
V.

RESULTADOS
Los resultados se basan en las caractersticas (color y textura) que
mostraron las reacciones de los tubos al finalizar la prctica:
Tratamiento
Ox
Ni
G
L
U
Mo
C
I
S

VI.

Resultado
+
+
+
-

DISCUSIONES
Las enterobacterias Gram negativas, se tien con el colorante de
contraste a color rosado, la forma del microorganismo que se
observ en el microscopio y adems teniendo los resultados segn el
cuadro del Gua de Microbiologa Agroindustrial de las Pruebas
Bioqumicas de Diferenciacin para enterobacterias, nos indicaron
que el grupo de enterobacterias encontrado pertenece a Hafnia.

VII.

CONCLUSIONES
El grupo de enterobacterias encontrado fue Hafnia.

VIII.

CUESTIONARIO
1. Por qu las bacterias Gram negativas retienen el colorante
de contraste durante la coloracin Gram?

Las bacterias Gram negativas retienen el colorante de contraste

durante la coloracin Gram debido a que al no teirse con el
colorante primario, el alcohol-acetona forma poros en su pared
que a su tiene alto contenido lipdico, de esta manera es como
recin el colorante de contraste se fija y nos permite apreciar las
bacterias Gram negativas.
2. Mencione diferencias entre bacterias Gram negativas y
bacterias Gram positivas.
Bacterias Gram Positivas
Poseen una pared celular interna y
una pared de peptidoglucano.

Bacterias Gram Negativas

Poseen una pared celular ms
compleja: pared celular interna,
pared de peptidoglucano, bicapa
lipdica interna.

La red de murena est muy

desarrollada y llega a tener hasta
40 capas.

La red de murena presenta una

sola capa.

En la tincin Gram retienen la

tincin color azul.

Quedan decoloradas, por eso se

tien con safranina y se observan
rojas.

Son esporulantes y no
esporulantes.
Poseen otros componentes: cidos
teicoicos y lipoteicoicos, y
polisacridos complejos.

Pueden ser aerobios o anaerobios.

Posen protenas con
concentraciones elevadas.

3. Describa a las bacterias entricas y nombre a los gneros

ms representativos, dando caractersticas de cada uno de
ellos.
Las bacterias entricas o Enterobacterias son microorganismos
que habitan, generalmente, en el intestino de los animales y las
personas, pudiendo causar enfermedades en algunos casos.
Salmonella: Est formado por bacteria Gram negativa flageladas
y forma bacilar .Las salmonelas son microorganismos anaerobios
facultivos, presentando las dos rutas metablicas, la oxidativa y la
fermentativa.
Son
oxidasa
negativos,
fermentan
la glucosa generando cido y gas, crecen en citrato como nica
fuente de energa, de carboxilan la lisina y la ornitina suele
producir sulfuro de hidrogeno y no hidroliza la urea. Una de las
caractersticas de este gnero es que la mayor parte de sus
integrantes no pueden fermentar la lactosa ni la sacarosa.
Campylobacter: Es un gnero perteneciente a la familia
Campylobacteraceae. Las especies de este gnero son bacilos

Gram negativo con forma de coma y mviles por la presencia de

uno o dos flagelos polares. Miden entre 0,5 y 5 micras de largo
por 0,2 a 0,5 micras de ancho, tomando forma cocoide en cultivos
antiguos o expuestos de forma prolongada al aire.
No son esporulados, reaccionan positivamente a la oxidasa y la
catalasa y su temperatura ptima de crecimiento oscila entre los
25 y 42 C. Las colonias de este gnero no suelen presentar
pigmentacin y poseen metabolismo respiratorio microaerfilo (35 % de O2) con un grado bajo de oxgeno 5%, dixido de carbono
10% y 85% en nitrgeno. Los medios de cultivo de
Campylobacter son medios nutritivos enriquecidos como el
Preston 1/10 y el Park-Sanders 1/10, y en algunos casos
cultivados a 42 C. Por razn de su flagelo, son organismos muy
mviles, con un movimiento peculiar por razn de su forma
morfolgica, al igual que los Helicobacter, se desplazan en forma
de saca corcho. Se destruyen por cloracin y pasteurizacin.
Tienen una morfologa caracterstica al observarlas al
microscopio, en forma de "S" o de "coma".
Escherichia: Caractersticas Morfolgicas, Tintoriales
Nutricionales
Bacilo Gram negativo.
No forma esporas
Mviles (flagelos pertricos).
Miden 0.5 de ancho por 3 de largo.
Catalasa positiva.
Oxidasa negativos.
Reducen nitratos a nitritos.
Producen vitamina B y K.
Fermenta glucosa y lactosa con produccin de gas.
Es anaerobio facultativo
4. Menciones las enfermedades que ocasionan
gneros de la familia enterobacteriaceae.

algunos

Salmonella: Gastro enteritis por salmonella ms conocida

como salmonelosis
Salmonella thipy: Produce la fiebre tifoidea.
Shigella: Produce disentera que es una enfermedad
aguda o crnica del intestino grueso del humano.
Vibrio Cholerae: Produce clera
Echerichia coli: Produce gastro enteritis
Serratia
marcescens: Usualmente
causa
infecciones nosocomiales .
IX.

BILBLIOGRAFA

1. Eduardo Santambrosio, Marta Ortega, Pablo A. Garibaldi, 2009,

Ctedra de Tincin y Observacin de Microorganismos. Pg. 3-5.
2. Mac Faddin J. F., 2003, Pruebas Bioqumicas para la
Identificacin de Bacterias de Importancia Microbiolgica.
LINKS
1. http://ecaths1.s3.amazonaws.com/catmicromed/APUNTE
%20Enterobacterias.pdf
2. http://es.wikipedia.org/wiki/Enterobacteriaceae
3. http://medicina.ens.uabc.mx/manuales_laboratorio/L3M-N3002.pdf
4. http://www.pucmmsti.edu.do/websise/estudiante/materias/201220
132/ST-BIO-231-P-071/BIO-231%20PRACTICA%202%202-1213.pdf
5. http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biot
ecnologia/practico4.pdf
6. http://es.scribd.com/doc/5368278/Fundamentos-de-la-tincion-deGram
7. http://www.uv.mx/personal/sbonilla/files/2011/06/Escherichia-coliI.pdf
8. http://cousasdebioloxia.blogspot.com/2012/03/parede-bacterianagram-e-gram.html
ANEXOS

Enterobacterias del Gnero Hafnia.