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UNIVERSIDAD ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD


ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGIA E INGENIERIA

ACTIVIDAD: 11

TRABAJO PRCTICO
SIMULADOR HPLC

ESTUDIANTE:
WILLIAM STID ROMERO CAON
COD: 3157574

TUTORA:
GLORIA MARIA DORIA
QUIMICA
MAYO 2015

INDICE
pg.
SECCION A. Reconocimiento de los parmetros cromatograficos en
cromatografa liquida de alta eficiencia (CLAE)
Factor de separacin3
Resolucin..3
Eficiencia.4
Factor de retencin4
Tiempo de retencin..4
Tiempo muerto...5
Ancho de banda.5
Cromatografa liquida en fase normal.6
Cromatografa liquida en fase reversa6
Gradiente de elucin..7
Elucin socrtica.....7
SECCION B. efecto de la estructura de los compuestos (solutos) y de la
composicin de la fase mvil sobre la retencin y la resolucin.
Dibujos de las estructuras de los compuestos indicados8
Usos de cada uno de estos compuestos indicados.10
Registro para cada compuesto12
Seccin c: Efecto por porcentaje del modificador en la composicin de la
fase mvil sobre la retencin y la resolucin.
Registro datos obtenidos de los compuestos Acetophenone (acetofenona) y
Ethylparaben (etilparabeno)25
Bibliografa..33

SECCION A.

Reconocimiento de los parmetros cromatograficos en

cromatografa liquida de alta eficiencia (CLAE)


Defina y explique cmo se relacionan los siguientes conceptos. Incluya cuando
corresponda, el smbolo y ecuacin que representa al concepto
1. Factor de separacin. ()
Define que tan selectiva es una columna para separar dos picos. La columna
puede ser selectiva a una separacin, que se identifica por un valor alto de este
factor.
=

K S
ec .4
KA

En trminos tomados a partir de un cromatograma se puede calcular:


=

( t g ) Bt M
ec .5
( t g ) A t M

2. Resolucin. (Rs)
La resolucin

Rs

de una columna constituye una medida cuantitativa de su

capacidad para separar dos analitos, en este trmino si se toma en cuenta el


ensanchamiento de los picos, as que la magnitud de este valor si permite
asegurar la separacin de dos picos.
Rs =

2 [ ( t R )B ( t R ) A ]
W A +W B

ec .10

Donde WA y WB son los anchos de banda de A y B respectivamente


La resolucin expresada en trminos tericos es:

( )(

N
Rs =
4 1

1+ k s
ec .11
k s

3. Eficiencia. (N)
Para realizar una separacin cromatografa optima, debe evitarse en lo posible, el
ensanchamiento de las bandas debido a la dispersin; en efecto cuanto ms
anchas sean las bandas, menor nmero de ellas podrn ser resueltas en un
espacio de tiempo dado; es decir cunto ms agudos sean los picos que emergen
de una columna mejor estar actuando dicha columna. Las anchuras de las
bandas cromatograficas dependen de las caractersticas de la columna (tamao
de las partculas del lecho estacionario, homogeneidad de este, velocidad de la
fase mvil, etc.). Se expresa como el nmero de platos tericos:
2

[ ]

t
N= R

El nmero de platos de una columna depende de su longitud, por lo que se debe


tener en cuenta la altura equivalente de un plato terico, que relaciona la eficacia
de una columna con su longitud y se define como el cociente entre la longitud de
la columna y su nmero de platos tericos.
H=

L
n

4. Factor de retencin.
Este factor ( K

) es adimensional expresa la retencin de un compuesto por la

fase estacionaria, independiente del caudal de la fase mvil.


K =

t R t Rt M
=
tM
tM

5. Tiempo de retencin.
Es el tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra para que el
pico del analito alcance el detector y se le da el smbolo

t R . O en otras palabras

es el tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el sistema cromatografico.

6. Tiempo muerto.
Es el tiempo para que la especie no retenida alcance el detector.

Ancho de banda (sigma total)


Corresponde al intervalo de longitudes de onda comprendido entre los puntos en
donde la transmitancia (de la radiacin emitida por la fuente y que llega a la rendija
de salida) alcanza la mitad de su mximo de transmisin o el intervalo de
longitudes de onda que contiene el 75% de la energa radiante que proviene del
monocromador. La anchura de banda se puede expresar en trminos de la
apertura o amplitud de las rendijas, S, y la dispersin lineal recproca del
monocromador como:
SBW =S . D1
Cromatografa liquida en fase normal.
La fase estacionaria es polar (gel de slice, grupos ciano, amino y diol) y la fase

mvil es no polar (hexano o isopropileter). El componente menos polar es el que


eluye primero.

Cromatografa liquida en fase reversa

La fase mvil es polar (agua, metanol o acetonitrilo). El componente ms polar es


el primero en eluir y la fase estacionaria es no polar (cadena hidrocarbonada que
puede ser:

Cadena larga: C: 18
Cadena intermedia: C:8
Cadena corta: C:2

7. Gradiente de elucin.
Se utilizan dos o ms disolventes de distinta polaridad y se vara la composicin
de forma continua o mediante etapas escalonadas
8. Elucin socrtica.
Es la separacin con disolvente de composicin constante

SECCION B. efecto de la estructura de los compuestos (solutos) y de la


composicin de la fase mvil sobre la retencin y la resolucin.
Dibuje estructuras de los siguientes compuestos utilizando las convenciones de
cua/slash representando los ngulos de enlace.

NOMBRE

IMAGEN

PROPIEDADES
FISICAS

Formula
Molecular

Densidad:
1030kg/ m

;1,03g/

cm 3
Acetofenona

C8 H 8 01

Punto de fusin:
293,15K ( 20 )
Punto de ebullicin:
475,15K ( 202 )
Densidad:

Benzofenona

3
1110kg/ m ;1,11g/

cm3
Masa Molar:
182,217g/mol
Apariencia:
Solido blanco

C13 H 10 O

Butilparabeno
C11 H 14 03

C 9 H 10 O

Propiofenona

C 9 H 10 03
Etilparabeno

Densidad:
Propilparabeno

3
1,06g/ cm

Masa Molar:

C10 H 12 03

180,2g/mol

Ketoprofeno

Masa Molar:
254,281g/mol

3. Sobre la base de la estructura:

C16 H 14 0 3

10

a. Prediga el orden de elucin de los compuestos, partiendo del menos al ms


retenido en RPLC (Cromatografa lquida en fase reversa).
Justifique su respuesta.
b. Cules son los principales usos de cada uno de estos compuestos?
Acetofenona

Se usa como precursor en la preparacin de fragancias que se asemejan a

la almendra, la cereza, la madreselva, el jazmn y la fresa.


Tambin se usa para preparar resinas y como aditivo en las gomas de

mascar y en cigarrillos.
A finales del siglo XIX se venda como hipntico y anti convulsionante con
el nombre hipnona (Hypnone). Sus efectos sedantes se consideraban
superiores a los del paraldehdo y a los del hidrato de cloral.

Benzofenona

La benzofenona es una cetona aromtica que ayuda a filtrar las


radiaciones. Esta cetona absorbe la radiacin y la disipa en forma de calor.
Por esa principal caracterstica es utilizada en la produccin de perfumes,

jabones y protectores solares.


En el caso de los perfumes y jabones, la benzofenona provoca que ni el
olor ni el color, pierdan sus propiedades debido a la exposicin con los
rayos UV, mientras que en los protectores solares tienen como funcin
absorber la radiacin y transformarla en energa no nociva para la salud de

la piel.
Fabricacin de productos farmacuticos (antihistamnicos, hipnticos,
pantallas solares), cosmticos e insecticidas, en anlisis, qumica fina, etc.

Butilparabeno

Se utiliza muchsimo en muchos productos del cuidado de la piel e incluso

en medicinas tan comunes como el ibuprofeno.


Es el anti fngico ms potente de entre los parabenos. De hecho, su
potencial microbiano es mayor que el del metilparabeno, el propilparabeno

11

o el etilparabeno. Es particularmente eficaz contra mohos y levaduras, y


menos contra bacterias. En cuanto a cmo funciona, parece que inhibe la
capacidad de sntesis del ADN y el ARN y con ello la capacidad de
transporte de sustancias entre membranas, lo cual retarda el crecimiento
microbiano porque les impide desarrollarse al ritmo habitual. Aun as, es
frecuente encontrrselo combinado con otras sustancias biocidas como
liberadores de formaldehido, isotiazolinonas y fenoxietanol para aumentar
sus capacidades conservadoras, as como con otros tipos de parabenos.
Propiofenona

Se utiliza en la sntesis de efedrina y derivados de propiofenona tales

como metcarinona y catinona.


Es un intermediario til para la preparacin de medicamentos que
actan sobre el sistema nervioso central tales como los hipnticos,

ansiolticos
Se puede tambin utilizar en la sntesis de alquenos arilo tales como
fenilpropanoides

Etilparabeno

Son utilizados como conservadores protegiendo a los productos de las


levaduras y los hongos. No obstante, no son muy efectivos contra las
bacterias. Su actividad es independiente de la acidez, y adicionalmente,
son poco solubles, lo que limita sus aplicaciones (antimicrobianos y
ciertas propiedades antioxidantes) en formas farmacuticas liquidas

como jarabes, soluciones, suspensiones e inyectables.


son usados en una gran variedad de alimentos y cosmticos.

Propilparabeno

se usa con frecuencia en cosmticos, productos de cuidado para la piel y

comida. Tiene una toxicidad generalmente baja por ingestin


Es muy poco soluble en agua fra, por lo que se trabaja en procesos con
calor. Es anti fermentativo, tiene amplio espectro antimicrobiano es
bacteriosttico y antioxidante, combate mohos y levaduras. Es muy

12

utilizado en cosmticos (es el segundo producto de este tipo ms utilizado),


pero tambin es empleado en la industria alimenticia, se recomienda
utilizarlo del 0,05 al 0,1%; en la preservacin de grasas en una proporcin
del 0.1%.
Ketoprofeno

El Ketoprofeno de prescripcin se usa para aliviar el dolor, sensibilidad,


inflamacin (hinchazn) y la rigidez causada por la osteoartritis (artritis
causada por un deterioro del recubrimiento de las articulaciones) y la
artritis reumatoide (artritis causada por la hinchazn del recubrimiento
de las articulaciones). Tambin se usa para aliviar el dolor, incluyendo el
dolor menstrual (dolor que se presenta antes o durante el perodo
menstrual). El ketoprofeno sin prescripcin o de venta libre se usa para
aliviar dolores leves causados por cefaleas (dolor de cabeza), perodos
menstruales, dolor de muelas, resfro comn, dolores musculares, dolor
de espaldas y para reducir la fiebre. Pertenece a una clase de
medicamentos llamados antiinflamatorios sin esteroides. Funciona al
detener la produccin de una sustancia que causa dolor, fiebre e

inflamacin.
El ketoprofeno por va oral es efectivo
tratamiento agudo en los ataques de migraa.

4. Configure el simulador de la siguiente forma:


c. posteriormente, registre para cada compuesto:
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)


Ancho de banda (sigma total )
Adjunte imagen del cromatograma obtenido.
Acetofenona

y bien tolerado como

13

Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

1,3431

1,5254

Ancho de banda (sigma total )

0,7629

Benzofenona
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

6,6901

11,5799

Ancho de banda (sigma total )

3,7451

14

Butilparabeno
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

7,4940

13,0915

Ancho de banda (sigma total )

4,1946

Propiofenona
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

2,4337

3,5762

Ancho de banda (sigma total )

1,3679

Etilparabeno
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

2,0070

2,7739

Ancho de banda (sigma total )

1,1306

Propilparabeno
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

3,8315

6,2047

Ancho de banda (sigma total )

2,1476

Ketoprofeno
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

3,5642

5,7020

15

Ancho de banda (sigma total )

1,9984

d. Calcule el tiempo muerto (tM o t0).


Posteriormente, registre para cada compuesto: el tiempo de retencin (tR), el
factor de retencin (k) y el ancho de banda (sigma total), obtenidos con el cambio
de disolvente. Adjunte una imagen del cromatograma obtenido.

16

El tiempo muerto es de 43 segundos


DATOS CON EL CAMBIO DE DISOLVENTE
Acetofenona
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

0,8088

0,5208

Ancho de banda (sigma total )

0,4073

Benzofenona
Tiempo de retencin ( t R

2,4930

17

Factor de retencin (K)

3,6878

Ancho de banda (sigma total )

1,1949

Butilparabeno
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

1,6112

2,0296

Ancho de banda (sigma total )

0,7788

Propiofenona
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

1,2472

1,3452

Ancho de banda (sigma total )

0,6086

Etilparabeno
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

0,7452

0,4012

Ancho de banda (sigma total )

0,3788

Propilparabeno
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

1,0369

0,9498

Ancho de banda (sigma total )

0,5113

18

Ketoprofeno
Tiempo de retencin ( t R

Factor de retencin (K)

1,1140

1,0948

Ancho de banda (sigma total )

0,5469

f) Explique por qu se da el cambio en los tiempos de retencin y en la


separacin de los compuestos cuando el metanol es sustituido por el
acetonitrilo. En qu caso se obtiene una mejor separacin?
Compuesto

Polaridad

Agua

9- 10,2

Metanol

6,6

Acetonitrilo

6,2

Los solventes polares arrastran ms eficazmente los compuestos ms retenidos


en la fase estacionaria.
Los solventes menos polares, arrastran muy lentamente a los compuestos ms
polares estarn menos retenidos que los menos polares.
Los tiempos de retencin disminuyen cuando menor sea la proporcin de agua,
cuando menos polar sea el disolvente empleado.
El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y
disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrolgicos.
En qu caso se obtiene una mejor separacin
En el primer caso, cuando utilizamos metanol, ya que se observan las 7 muestras
con picos bien definidos y separados, solo encontramos un compuesto que sale al.
Mientras que en el segundo caso, utilizando acetonitrilo, vemos las 7 muestras con
los picos menos definidos.
g. Cul es la importancia del agua en la composicin de la fase mvil?

19

El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido


Trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos.
La cromatografa de fase reversa se basa en el principio de las interacciones
hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente
relativamente polar (el agua es altamente polar), un compuesto relativamente
apolar, y una fase estacionaria apolar.
h) Calcule la diferencia en los cambios de energa libre (G) para la retencin de
los solutos en las fases mviles MeOH/Agua, 50/50 y ACN/Agua, 50/50, de
acuerdo con:
Acetofenona:
G1=R T ln k 1
G1=8,31472

J
. 40 .0,803855302
mol .k

G1=267.3532763

J
mol

G2=R T ln k 2
G2=8,31472

J
. 40 .0, 186479566
mol . k

G2=62,02101508

J
mol

G= G1 G2
G=267.3532763(62,02101508 )
G=329,3742914

J
mol

20

Benzofenona
G1=R T ln k 1
G1=8,31472

J
. 40 .1,08146613
mol .k

G1=359,6835224

J
mol

G2=R T ln k 2
G2=8,31472

J
. 40 .2,146866518
mol . k

G2=714,023759

J
mol

G= G1 G2
G=359,6835224(714,023759 )
G=354,3402366

J
mol

Butilparabeno
G1=R T ln k 1
G1=8,31472

J
. 40 . 0,477847783
mol .k

G1=158,9268207
G2=R T ln k 2

J
mol

21

G2=8,31472

J
. 40 .2,212846364
mol . k

G2=735,9679168

J
mol

G= G1 G2
G=158,9268207(735,9679168 )
G=577,0410961

J
mol

Propiofenona

G1=R T ln k 1
G1=8,31472

J
. 40 . 0,11004558
mol .k

G1=36,5999274

J
mol

G2=R T ln k 2
G2=8,31472

J
. 40 .1,030012197
mol . k
J
G2= -342,5705206
mol

G= G1 G2

22

G=36,5999274(342,5705206 )
G=305,97005932

J
mol

Etilparabeno
G1=R T ln k 1
G1=8,31472

J
. 40 .1,104127469
mol .k

G1=367,22043

J
mol

G2=R T ln k 2
G2=8,31472

J
. 40 .0,673046508
mol . k

G2=223,8477304

J
mol

G= G1 G2
G=367,22043223,8477304
J
G= 143,3726996
mol
Propilparabeno

G1=R T ln k 1

23

G1=8,31472

J
. 40 .0,279052745
mol .k
J
mol

G1=92,8098176
G2=R T ln k 2
G2=8,31472

J
. 40 .1,45903354
mol . k

G2=485,2582142

J
mol

G= G1 G2
G=92,8098176(485,2582142 )
G=578,0680318

J
mol

Ketoprofeno

G1=R T ln k 1
G1=8,31472

J
. 40 .0,115410851
mol .k

G1=38,38435644

J
mol

G2=R T ln k 2
G2=8,31472

J
. 40 .1,413106677
mol . k

24

G2=469,983454

J
mol

G= G1 G2
G=38,38435644 (469,983454 )
G=508,3678106

i)

J
mol

Cules solutos poseen las diferencias ms grandes y ms pequeas


en la energa libre asociada a la retencin comparando las fases mviles
MeOH/Agua (50/50) y ACN/Agua (50/50)? Explique la naturaleza de
esos cambios.

Acetofenona:

329,3742914

Benzofenona:

354,3402366

Butilparabeno:

577,0410961

Propiofenona:

305,97005932

Etilparabeno: 143,3726996
Propilparabeno:
Ketoprofeno:

578,0680318

508,3678106

La naturaleza de estos cambios se debe a la polaridad que posee cada


compuesto.
j) Con los hallazgos realizados hasta ahora, elabore una conclusin sobre el efecto
de la estructura de los solutos y la composicin de la fase mvil sobre la retencin
y la resolucin.

25

Una conclusin importante que puedo sacar hasta este momento es que un
elemento muy importante en la fase mvil es la importancia de la polaridad de los
compuestos y es de aqu donde dependen todos los tiempos y resultados que nos
arroja la cromatografa.

Seccin C: Efecto del porcentaje del modificador en la composicin de la


fase mvil sobre la retencin y la resolucin.

26

1. En el listado de compuestos, elimine 7 solutos dejando solo a


Acetophenone (acetofenona) y Ethylparaben (etilparabeno). 2. Fije las
condiciones del simulador de acuerdo con:
a) Registre el tiempo de retencin, el factor de retencin y el sigma total para los
dos compuestos. Adjunte una imagen del cromatograma obtenido.

Compuest

95

Tiempo

Factor

de

de

retenci

retenci

Sigma

27

%
Acetofenona

1,1185

total

0,0516

0,548
5

Etilparabeno

1,1196

0,0526

0,549
0

b) Calcule el tiempo muerto.


El tiempo muerto es de 65 seg
c) Calcule la resolucin, , para los dos compuestos.
Rs =

Rs =

Rs =

2 [ ( t R )S ( t R ) A ]
W A +W B

2 [ ( 1,1196 ) ( 1,1185 ) ]
0,5485+ 0,5490

22
=2,004555809 X 103
10975

2. Cambie gradualmente el porcentaje de metanol en intervalos de 10%


iniciando en 95% y terminando en 5% (95%, 85%, 75%, 5%). 3. Registre el
tiempo de retencin, el factor de retencin y el sigma total para los dos
compuestos. Adjunte una imagen del cromatograma obtenido.
%

95
85

Compuesto

Tiempo

Factor de

Sigma

de

Retenci

total

Retencin

n K

Acetofenona

(tR)
1,1185

0,0516

0,5485

Etilparabeno

1,1196

0,0526

0,5490

Acetofenona

1,1802

0,1096

0,5654

Etilparabeno

1,1987

0,1270

0,5739

Acetofenona

1,3109

0,2325

0,6243

Imagen

28

75

Etilparabeno

1,3897

0,3066

0,6601

65

Acetofenona

1,5885

0,4935

0,7571

Etilparabeno

1,8506

0,7399

0,8785

Acetofenona

2,1774

1,0472

1,0401

Etilparabeno

2,9628

1,7856

1,4101

Acetofenona

3,4272

2,2222

1,6380

Etilparabeno

5,6471

4,3094

2,6934

Acetofenona

6,0793

4,7157

2,8960

Etilparabeno

12,1254

10,4002

5,7717

Acetofenona

11,7073

10,0070

5,5334

Etilparabeno

27,7601

25,0997

13,1177

Acetofenona

23,6504

21,2358

11,0663

Etilparabeno

65,4928

60,5755

30,6429

Acetofenona

48,9946

45,0642

22,7749

Etilparabeno

156,5566

146,1926

72,7735

55
45

35
25
15
5

e) Calcule el tiempo muerto.


Podemos darnos cuenta que el tiempo muerto va disminuyendo, con el cambio del
porcentaje del metanol, en el 95% el tiempo muerto es de 65 seg, y baja
gradualmente con el cambio de porcentaje, para el 5% el tiempo muerto es de o,8
milsimas de segundo.
f) Calcule la resolucin, , para los dos compuestos.
Resolucin Acetofenona
Rs =

Rs =

Rs =
Resolucin Etilparabeno

2 [ ( t R )S ( t R ) A ]
W A +W B

2 [ ( 1,1196 ) ( 1,1185 ) ]
0,5485+ 0,5490

22
3
=2,004555809 X 10
10975

29

Rs =

Rs =

2 [ ( 1,1185 ) ( 1,1196 ) ]
0,5485+ 0,5490

22
=2,004555809 X 103
10975

4. Repita el mismo proceso cambiando el metanol por acetonitrilo.

30

31

32

33

34

5. Con los hallazgos realizados en esta seccin, elabore una conclusin sobre el
efecto del porcentaje del modificador en la composicin de la fase mvil sobre la
retencin y la resolucin.

35

A medida que se va utilizando mayor cantidad de solvente menos polar los


tiempos de retencin son menores, es decir a menor cantidad de agua como
solvente menor tiempo de retencin.
Si fuera contratado en un laboratorio para separar, por medio de cromatografa
liquida, de una mezcla los compuestos acetofenona y etilparabeno. Cul sera la
mejor composicin de fase mvil a emplear? Justifique?
Considero que la mejor composicin de fase mvil es la mezcla de agua: metanol
en las condiciones 5 (45:55) y la 6 (55:45) porque los compuestos salen con
diferencia de tiempo prudencial, los picos estn bien definidos, y gastaramos
menos solventes que en otras condiciones. Los dos reactivos tienen el mismo
riesgo de inflamabilidad (3), igual riesgo de reactividad (0) pero tiene menor riesgo
de salud el metanol (2) y el acetonitrilo (3)

BIBLIOGRAFIA

36

http://www3.uah.es/mol_play/1.htm
http://www.quiminet.com/productos/butilparabeno-6373322859.htm
http://www.madrimasd.org/blogs/remtavares/2009/02/20/113222
http://www.hplcsimulator.org/
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http://www.ulpgc.es/hege/almacen/download/39/39360/separaciones_po
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cromatografia_1.pdf
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatogr
afia/principios_de_cromatografia.pdffile:///D:/DATOS/Downloads/file.pdfhttp://o
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