CROMATOGRAFIA LIQUIDA (HPLC)

DETERMINACION DE CAFEINA EN COCA-COLA

Herrera, L. Karen Lizeth.; Ramrez, P. Juan Sebastin
karito10_0618@hotmail.com (0637389); jsebas8905@gmail.com (0645006).
Facultad de Ciencias Naturales y exactas; Dep. Qumica; Universidad del valle
Cali, Colombia.
26-04-2010
RESUMEN Se determin experimentalmente la concentracin de cafena en una muestra
problema de Coca-Cola mediante una curva de calibracin realizada a partir del promedio de
reas de pico obtenidas como respuesta instrumental en el HPLC y concentraciones de
soluciones estndar preparadas a partir de una solucin stock de cafena a 300 ppm.
1. DATOS
La determinacin experimental del contenido
de cafena en una bebida de coca cola por
HPLC se llevo a cabo utilizando el mtodo
de curva de calibracin, la cual se preparo a
partir de una solucin de cafena a una
concentracin de 300 ppm, de esta solucin
stock se tomaron cinco alcuotas (tabla No.
1) llevadas a un matraz aforado de 25 mL y
enrasando con fase mvil de metanol: agua
50:50. Las anteriores soluciones estndares
se pasaron por filtros de tamao de poro de
0.45 m antes de inyectar al cromatgrafo.
Tabla No. 1. Datos experimentales en la
preparacin de las soluciones
estndares.
VOLUMEN
CONCENTRACION
ALICUOTA
(ppm)
(mL)
1.0
12
2.0
24
3.0
36
4.0
48
5.0
60
Por su parte para la preparacin de la
muestra problema fue necesario inicialmente
desgasificar la bebida de coca cola por 10
minutos en un equipo de ultrasonido. De la

solucin desgasificada se tomo 15 mL y se

adiciono a un matraz volumtrico de 25 mL
enrasando con metanol puro. Posteriormente
de la solucin anteriormente preparada se
tomo una alcuota de 15 mL y se enraso en
un matraz de 25 mL, esta vez utilizando
como solvente la fase mvil (metanol: agua
50:50). La solucin anterior esta se filtro
empleando
el
mismo
procedimiento
mencionado para la preparacin de
estndares.
Con
las
soluciones
anteriormente
preparadas y filtradas se procedi a realizar
la lectura por cromatografa liquida de alta
resolucin (HPLC) utilizando las condiciones
mencionadas en la tabla No.
Tabla No. 2. Condiciones operacionales
en el cromatgrafo.
Metanol: agua
Fase Mvil
50:50
Flujo
1 mL/min.
Columna
Hypersil ODS
Detector
UV 243 nm.
Los resultados obtenidos en funcin de rea
y concentracin para las soluciones
estndares se encuentran tabuladas en la
tabla No. 3. Las medidas instrumentales
determinadas en el cromatograma fueron
realizadas por triplicado tanto para las

como

para

las

Tabla No. 3. Respuestas instrumentales

para las muestras estndares.
CONCENTRACION
(ppm)

12
12
12
24
24
24
36
36
36
48
48
48
60
60
60

PROMEDIO
DE AREAS
(mAU.s)

AREA
(mAU.s)

143.99207
144.43535 144.3991633
144.77007
433.67084
433.63998 432.3736067
429.81
683.69055
695.40332 693.37919
701.0437
1052.7361
1009.3666 1042.59497
1065.6823
1136.8943
1134.9181 1135.95223
1136.0443

calibracin de promedio de reas vs.

Concentracin de cafena en las soluciones
estndares, determinando la pendiente y el
intercepto
con
sus
correspondientes
desviaciones estndar e intervalos de
confianza. (Grafica No. 1).

1200

1000

AREAS (mAU.S)

soluciones estndares
muestras problemas.

800

600

400

200

10

20

30

40

50

Grafica No. 1. Curva de calibracin de rea vs

concentracin (ppm).

[
Una vez determinado las respuestas
instrumentales para cada muestra de
solucin estndar, se determino las
respuestas instrumentales para las muestras
problemas (Tabla No.4).

coca cola
coca cola
coca cola

AREA
(mAU.s)

PROMEDIO
DE AREAS
(mAU.s)

628.55261
643.34088 634.6270533
631.98767

Donde n corresponde al nmero de datos

utilizados para la realizacin de la curva de
calibracin (5) y Syy y Sxx se determinaron a
partir de las ecuaciones 1.1 y 1.2.

2. CALCULOS Y RESULTADOS

Segn los resultados obtenidos y de acuerdo

a la tabla No. 3 se realiz una curva de

La desviacin estndar de la regresin o

desviacin
estndar
residual
fue
determinada a partir de la ecuacin [1].

Tabla No. 4. Respuestas instrumentales

para las muestras problemas.
MUESTRA
PROBLEMA

60

CONCENTRACIN (ppm)

Y corresponde al eje y de la curva de

calibracin (promedio de reas) x a la
concentracin de cafena en las soluciones
estndares.

Tabla No. 5 Parmetros de linealidad

determinados a partir de la curva de
calibracin.
PARAMETRO

Reemplazando los valores obtenidos en la

ecuacin 1 se encontr que la desviacin
estndar
de
la
regresin
fue
de
70.06 mAU.s.

A su vez tambin se determin la pendiente

(b) e intercepto (a) con sus respectivas
desviaciones estndar y sus intervalos de
confianza al 95%.

En las ecuaciones mostradas anteriormente

y
hacen referencia a la desviacin
estndar de la pendiente y el intercepto
respectivamente.
En los intervalos de confianza la letra t
corresponde a una constante que se
determina dependiendo del nmero de
grados de libertad y el porcentaje al cual se
desea el intervalo de confianza. Por lo tanto,
t para 3 grados de libertad y un 95% de
confianza, t correspondi a 3.18.

PENDIENTE
INTERCEPTO
COEFICIENTE
DE
CORRELACIO
N (R)
R2

DESVIACION
ESTANDAR
1.846
mAU.s/ppm

VALOR
21.61
mAU.s/ppm
-88.26
mAU.s

73.48 mAU.s

0.9714
0.9437

Con la ecuacin de la curva de calibracin

se determino la concentracin de cafena en
la muestra problema de Coca-Cola (Ec. 6),
utilizando para ello el factor de dilucin
empleado y posteriormente se analizo
estadsticamente los resultados obtenidos.

]
[

]
[

m correspondi al nmero de veces a la cual

se ley la seal instrumental para la muestra
problema la cual fue de 3 debido a que se
realizo por triplicado y n fue el nmero de
datos con los que se realizo la curva de
calibracin.

Por tanto la desviacin estndar de la de la

concentracin de cafena en la muestra
problema de Coca-Cola fue de 51.54 ppm y
su intervalo de confianza determinado a
travs de la ecuacin 8 fue de 163.9081

As mismo se determinaron el lmite de

deteccin como la concentracin mnima de
analito que produce una seal que fue
significativamente diferente del blanco. Para
ello se utilizo la Ec. 9 donde k es una
constante que fue definida arbitrariamente.
Limite de deteccin (LD) (3 ) y cuantificacin
(LC) (10

De tal manera, el limite de deteccin y

cuantificacin fueron de 9.725 y 32.42 ppm
respectivamente.
3. ANALISIS DE RESULTADOS
El objetivo de la practica experimental es la
determinacin cuantitativa de cafena en una
muestra de coca cola utilizando el mtodo de
la curva de calibracin realizada a partir de
soluciones estndares de solucin patrn de
cafena. Para la separacin cromatogrfica
se va a utilizar un cromatgrafo de lquidos
que consta de una bomba de alta presin de
dos pistones, una vlvula de inyeccin con
un bucle de 20 l, una columna C18 y un
detector de ultravioleta visible. Los datos
cromatogrficos fueron procesados a travs
de una interfase por un software que
contiene un programa de integracin.

La tcnica de HPLC es utilizada

normalmente en la industria para la
separacin de componentes en una mezcla,
para aislar compuestos deseados en
extractos naturales, al igual que la
identificacin y cuantificacin de compuestos
desconocidos, tambin se utiliza en
investigacin para el desarrollo de nuevos
frmacos y el aislamiento de productos
naturales con importante actividad en
diversas enfermedades.
Para poder llevar a cabo el anlisis mediante
HPLC de cafena en COCA COLA, se debi
desgasificar como primera medida la bebida,
para esto, se utiliz el ultrasonido. Posterior
a la desgasificacin, se prepar soluciones
de cafena de concentracin conocida, las
cuales se filtraron en un filtro de tamao de
poro de 0.45 m para eliminar partculas
solidas presente en la solucin, tambin se
preparo una solucin de muestra problema
de coca cola disuelta en una solucin de
etanol: metanol. Con las soluciones
preparadas, se determin el contenido de
cafena en la muestra problema gracias a la
interaccin de los componentes que tena la
muestra con la fase mvil y la fase
estacionaria. La fase mvil utilizada fue una
mezcla 50:50 de metanol-agua y la fase
estacionaria fue de polmero de silica el cual
se encontraba recubierto con cadenas
laterales C18 hidrofbicas.
Debido a la fuerte interaccin entre la
cafena y la fase estacionaria, el primer pico
observado se debe fundamentalmente a
azucares que se encontraban interactuando
fuertemente con la fase mvil, como se
muestra en la figura xxxxxxxx.
Los resultados experimentales obtenidos y la
concentracin de cafena en la muestra de
coca cola con un 92.92 ppm de

concentracin arrojo un 4.34% de error

segn el valor terico de mg reportado para
una coca cola clsica 350 mL, cuyo valor es
34.0 mg[1] y su correspondiente valor en ppm
fue de 97.14 ppm. Estos errores
experimentales se deben principalmente a la
preparacin de las muestras estndares de
la curva de calibracin cuya relacin entre
las variable fue pequea debido al
coeficiente de correlacin obtenido.
Adems debido a que la desviacin estndar
obtenida para la concentracin de la muestra
problema determinada por triplicado fue tan
amplia se determino entonces que los datos
no fueron reproducibles, esto debido a que si
todos los datos fueran idnticos
la
desviacin estndar de la concentracin de
cafena de la muestra problema hubiera sido
cero. Por lo tanto, los resultados obtenidos
de cafena en la muestra problema no fueron
tan reproducible debido a que la
concentracin de la muestra pudo cambiar
desde que se recogi hasta que se
efectuaron los respectivos anlisis.
Por otra parte la desviacin estndar
residual
determinada
fue
tambin
significativamente grande lo que indico una
menor asociacin lineal entre el rea de pico
y la concentracin de cafena en cada
solucin estndar. La determinacin de la
desviacin estndar residual tambin es una
medida para determinar la variabilidad
promedio de los datos observados con
relacin a la recta de regresin, adems este
valor tambin es directamente proporcional a
la desviacin de la pendiente y el intercepto
que fueron igualmente significativamente
grandes, lo que indico que la preparacin de
la curva de calibracin tuvo inmerso varios
errores experimentales especficamente en

la preparacin de las muestras estndares

como se menciono anteriormente.
4. SOLUCION AL CUESTIONARIO
1.
Defina claramente cromatografa
lquida en fase normal y en fase reversa?
Cuales son las aplicaciones de la
cromatografa en fase normal?
LC en fase reversa: en este tipo de
cromatografa lquida, la fase estacionaria
es no polar, con frecuencia un hidrocarburo y
la fase mvil es un solvente relativamente
polar, por ejemplo agua, metanol, acetonitrilo
o tetrahidrofurano (THF) [x]. En LC en fase
reversa, la fuerza motriz de la retencin, no
es la interaccin favorable del soluto con la
fase estacionaria, si no el efecto del
disolvente de la fase mvil que empuja al
soluto
hacia
adentro
de
la
capa
[x]
hidrocarboncea enlazada .
LC en fase normal: en la cromatografa de
fase normal, el componente menos polar se
eluye primero; al aumentar la polaridad de la
fase mvil ocasiona una disminucin del
tiempo de elucin. Por el contrario, en la
cromatografa
de
fase
inversa,
los
componentes ms polares aparecen primero
y un aumento de la polaridad de la fase
mvil, incrementa el tiempo de elucin.
La cromatografa en fase normal, es
ampliamente utilizada para la separacin de
componentes en una mezcla, segn las
caractersticas qumicas de cada uno de
ellos. Es utilizada en la industria para la
separacin, en muchos campos de la ciencia
y para la sociedad en general, algunos
ejemplos, es la separacin de aminocidos,
protenas, cidos nuclicos, hidrocarburos,
carbohidratos,
frmacos,
terpenoides,

plaguicidas,
antibiticos,
esteroides,
especies organometlicas entre otros.

embargo algunos de los solventes utilizados

en HPLC son de alto costo.

2.
Cules son los recubrimientos
ms comunes de la fase estacionaria
empleada en HPLC y cual es la
metodologa ms empleada para enlazar
fases a la superficie de silica?

4.
Explique porque en el HPLC
realizar la cuantificacin con curva de
calibracin es precisa mientras que en
CG es aconsejable realizarla con el uso
de un patrn interno.

Normalmente, los recubrimientos mas

utilizados para HPLC son los C8 cadena noctilo o una cadena C18 n-octildecilo,
tambin se utilizan las cadenas C4. Los
rellenos utilizados normalmente de la fase
normal unida qumicamente, R en la cadena
de slice, son grupos funcionales polares,
como el caso de los grupos ciano C2H4CN,
diol C3H6OCH2CHOHCH2OH, amino
C3H6NH2 y los dimetilamino C3H6N(CH3)2.
Algunos de estos grupos polares, se unen
qumicamente al final de las cadenas C4 C8 o
C18, aunque el costo de estos recubrimientos
con los grupos polares es mucho mas
elevado que los comnmente utilizados C18.

La tcnica de HPLC es precisa, debido a que

el inyector de la muestra es un rizo de
muestreo el cual controla el volumen de
muestra que se adiciona, por ejemplo,
durante la prctica experimental, se adicion
cantidades de aproximadamente 50 L, y el
inyector tuvo la capacidad de tomar 20 L
para llevar a cabo cada determinacin. Esta
cantidad es reproducible para cada medida,
por lo cual no es necesaria la presencia de
un patrn estndar como en GC, puesto que
en esta tcnica, se necesitaban corregir los
volmenes adicionados, debido a la mala
inyeccin o imprecisin en la medida del
volumen de muestra. Algunos equipos de
HPLC contienen un automuestrador, el cual
tiene la capacidad de recolectar muestras
con volmenes exactos y reproducibles que
no se desvan del volumen fijo, estos
equipos aunque son de costo mayor por el
automuestreador, arrojan un anlisis mas
preciso.

3.
Nombre 3 analitos que pueden ser
analizados tanto por HPLC como por
cromatografa de gases? Cul de los
dos mtodos empleara usted?
Por las dos tcnicas mencionadas, pueden
ser analizados aminocidos, alcoholes de
bajo peso molecular, compuestos orgnicos
de bajo peso molecular, sin embargo la
tcnica que se emplea con mayor frecuencia
es HPLC, aunque esta eleccin depende de
varios motivos, la naturaleza de la mezcla a
separar y de los costos. HPLC es una
tcnica mejor que la GC debido a que puede
separar compuestos que sean voltiles o
termolbiles, esta tcnica utiliza solventes
econmicos a comparacin de gases
costosos como el helio y el hidrogeno
utilizados en cromatografa de gases, sin