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Curso 2014
Sumario
Las plantas como biorreactores
- Sistemas de expresin
- Las plantas como sistema alternativo
- Ventajas
- Costos comparativos entre distintos sistemas
Aplicaciones
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Referencias
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Bioreactores
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
PROCARIOTA
EUCARIOTAS
Clulas animales
Clulas de insectos
Plataformas
emergentes
Animales transgnicos
Plantas
Elementos a considerar
en una estrategia de expresin
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Factores a
considerar en el
diseo de una
estrategia de
expresin en
plantas
La expresin de
la protena
recombinante
puede
optimizarse
mediante
diversas
estrategias
Plantas
transplantmicas
Integrativos
(cloroplastos)
No integrativos
Expresin transitoria
Vectores
virales
La estrategia
a elegir debe
considerar
las ventajas y
limitaciones de
cada sistema
de expresin
Limitaciones
- Niveles de expresin relativamente bajos.
- Niveles de expresin afectados por silenciamiento gnico
postranscripcional.
El nivel de
expresin
depende
de la utilizacin
adecuada de
las regiones
reguladoras
Nivel de expresin
(% de la protena
total soluble)
Parc
5UTR ar
ss G4 myc
KDEL
3arc
10%
Parc
ss G4 myc
KDEL
3arc
5%
Pphas
5UTR ar
ss G4 myc
KDEL
3arc
36%
P35S
5UTR ar
ss G4 myc
KDEL
3arc
1%
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Los costos
de purificacin
pueden
reducirse
explotando
caractersticas
propias
de las plantas
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
La rizosecrecin
permite reducir
los costos de
purificacin
secuencia de inters
Inicio de la traduccin
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Rizosecresin
de la xilanasa
de Clostridium
thermocellum
en tabaco
transgnico
secuencia seal
Planta no transformada
xilanasa
Planta transgnica
Halo de
degradacin
del sustrato
generado
por la
xilanasa
rizosecretada
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Las fusiones
a oleosinas
permiten
reducir los
costos de
purificacin
Oleosina
Gen de inters
Sitio de reconocimiento
para una proteasa
Cuerpos grasos
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Cuerpos proteicos
La purificacin
a partir de los
cuerpos
grasos es
un proceso
sencillo
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Oleosina
Xa
Hirudina
Control
no transgnico
Cuerpos grasos
transgnicos
sin tratar con proteasas
Cuerpos grasos
transgnicos
+ factor Xa
La hirudina presente en
la fase acuosa inhibe
la actividad de la trombina
Luz blanca
Luz UV
Tomado de: Parmenter, et al., Plant Mol. Biol., 1995.
CARTAMO: Oleaginosa altamente productiva cuya semilla puede ser almacenada por largos
periodos
CARTAMO es poco cultivada por lo cual es fcilmente separada de otras producciones de
crtamo
CARTAMO se autopoliniza y no tiene malezas emparentadas
Protenas en desarrollo
INSULINA
Diabetes
APOLIPROTENA A
Enfermedades
cardiovasculares
Ensayos preclnicos en
modelos animales
OLEOSOMAS
Esttica
Comercializacin
Humanizacin
de las
glicoprotenas
recombinantes
Asn
a -1,3
Fuc
NAcGlc
NAcGlc
NAcGlc
Man
Man
Man
NAcGlc
Xyl
Fuc
Glicanos complejos
en mamferos
Man
Man
Man
NAcGlc
NAcGlc
NAcGlc
NAcGlc
Gal
Gal
Gal
AcNeu
AcNeu
AcNeu
Glicanos complejos
en plantas
Agrobiotecnologa
a-1,6
NAcGlc
La especie a
utilizar debe
seleccionarse
de acuerdo
con las
necesidades
de produccin
de la protena
a sintetizar
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Tabaco
Sistema de transformacin bien establecido.
Produccin de abundante biomasa.
Papa
Disponibilidad de promotores especficos para la expresin en tubrculos.
Procesamiento industrial de los tubrculos bien establecido.
Contenido proteico en tubrculos relativamente bajo.
Tomate
Consumo de los frutos crudos.
Disponibilidad de promotores especficos para la expresin en frutos.
Cultivo en invernaderos a escala industrial bien establecido.
Contenido proteico en frutos relativamente bajo.
Cereales
Tecnologa de produccin ampliamente establecida.
Almacenamiento estable de la protena recombinante en las semillas.
Procesamiento industrial de las semillas bien establecido.
Alfalfa
Alto contenido proteico en hojas.
Produccin de biomasa abundante.
Lemna
Alta eficiencia de proliferacin clonal.
Alta tasa de duplicacin de la biomasa.
Rizosecresin muy eficiente.
La estrategia
a elegir debe
considerar
las ventajas y
limitaciones de
cada sistema
de expresin
Limitaciones
- No existen mecanismos de glicosilacin.
Ventajas
- Niveles de expresin potencialmente altos
- No se integran al genoma- No tienen efecto de posicionamiento
- Corto tiempo de desarrollo y produccin
- Permite el direccionamiento de protenas a compartimiento
subcelulares o al espacio apoplstico.
- Permite la modificacin postraduccional de protenas
Limitaciones
- Limitaciones en el tamao de la secuencia introducida
- Inestabilidad gentica de la secuencia introducida.
- Silenciamiento gnico
1. Infeccin inicial
3. Movilizacin sistmica
TMV
ARN
Obtencin del ADNc del
genoma viral completo
ADNc del
genoma viral
ADNc
Clonado del ADNc en un
plsmido. Introduccin de
un sitio de clonado mltiple
Vector viral
T7
ADNc
SCM
Clonado del gen de inters
Vector viral
recombinante
T7
Gen X
Transcripcin in vitro
Infeccin mecnica
con transcriptos de ARN
Expresin transitoria
ARN
Obtencin del ADNc del
genoma viral completo
ADNc del
genoma viral
ADNc
Amplicn viral
35SCaMV
Amplicn viral
recombinante
35SCaMV
Gen X
Expresin transitoria
t-nos
Los vectores y
los amplicones
virales
amplifican la
expresin de
los genes
forneos
Esquema
de la expresin
de un gen forneo
a partir de un
vector y de un
amplicn viral
de un virus
a ARN en
comparacin
con la expresin
de un gen forneo
por expresin
nuclear.
*
B
Complementacin
A: Fusin traduccional de una pequea secuencia dentro del gen de la protena de la cpside.
B: Translectura traduccional de un codn de terminacin mbar (*) en el extremo 3
Genes virales
Reemplazo gnico
Genes forneos
Bromovirus
Caulimovirus
Complementacin
Furovirus
Alfamovirus
Geminivirus
Caulimovirus
Insercin gnica
Hordeivirus
Dianthovirus
Caulimovirus
Geminivirus
Geminivirus
Presentacin de epitopes
Potexvirus
Potexvirus
Potexvirus
Comovirus
Tobamovirus
Tobamovirus
Potyvirus
Tobamovirus
Tobravirus
Tombusvirus
Tobamovirus
Tombusvirus
Tombusvirus
Bioseguridad alta
Rpida
6-10 das.
Eficiente:
1-5 g protena/kg hoja
Escalable
Complejo Se requiere
equipamiento especfico y
standard
Flexible: puede utilizarse
para producir protenas de
membrana, enzimas o
virus quimricos.
NUCLEAR
CLOROPLASTOS
VECTORES
VIRALES
Bajos niveles de
expresin (0,01-0,1 %
TPS)
Altos niveles de
expresin (1-10%)
Largo
6-24 meses
Mediano
3-12 meses
Corto
1-2 semanas
Efecto
posicionamiento
gnico
Si
No
No
Estabilidad de las
secuencias
Alta
Alta
Baja
Plantas en que se
puede expresar
Limitado a la
disponibilidad de
protocolos de
transformacin
Muy limitado a la
disponibilidad de protocolos
de transformacin
Limitado al rango
de hospedante
Si, PTGS
No
Si, VIGS
Si
No
Si
Media
Alta
Baja
Niveles de
expresin
Tiempo de
evaluacin de
construcciones
Silenciamiento
post-transcripcional
Modificaciones
posttransduccionales
Bioseguridad
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Las plantas
constituyen
un sistema
alternativo
para la
produccin
de vacunas a
subunidad
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Vacunas a subunidades:
Seguras
Poco inmunognicas
Inyeccin
DESVENTAJAS
Supervivencia del antgeno en el
tracto digestivo
Induccin de una respuesta inmune
Promocin de una proteccin
adecuada
Ausencia de efectos de tolerancia
Ausencia de inmunogenicidad del
vehculo vegetal
Vacunas en
fase clnica:
hepatitis B
Expresin de HBsAg
en tubrculos de papa.
El antgeno recombinante forma
estructuras vesiculares similares
a las observadas en el suero de
pacientes infectados con HBV.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Kong et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.
Expresin
de HBsAg
en plantas
transgnicas
de Solanum
tuberosum
HB103
P35S
TEV
0,33 g/g
NOS 3
HBsAg
SEKDEL
HB105
P35S
TEV
HBsAg
NOS 3
1,25 g/g
NOS 3
0,80 g/g
VspaS
HB106
P35S
TEV
HBsAg
VspaL
HBsAg
2,40 g/g
NOS 3
HB107
P35S
TEV
HB104
P35S
TEV
HBsAg
VSP 3
6,50 g/g
HB114
P35S
TEV
HBsAg
Pin2 3
16,00 g/g
HB111
P35S
HBsAg
NOS 3
0,33 g/g
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Kong, Q. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.
La respuesta
inmune
disminuye con
la eliminacin
del adyuvante o
la coccin de
los tubrculos
La eliminacin del
adjuvante (CT: toxina
colrica) en los
esquemas de
inmunizacin lleva a
una fuerte disminucin
de la respuesta inmune
La coccin previa de
los tubrculos
disminuye pero no
elimina la respuesta
inmune.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Kong, Q. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.
Inmunizacin
oral de
humanos
con lechuga
transgnica
que produce
HBsAg
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Pathogen or Disease
Antigens
References
VP1 protein
Hypervariable region I
Glicoprotein D
Ga733-2 antigen
Tat protein
p24 protein
Domain III of E protein
ESAT6-Ag85 antigens
Replacement vectors
Human papilloma virus
Yersinia pestis
Bacillus anthracis
Influenza
E7 protein
F1 and V proteins
PA and LF domains
Hemoagglutinin
Modular vectors
Yersinia pestis
Smallpox virus
F1 and V proteins
pBS antigen domain
Glicoprotein 41
HA epitope
Several epitopes
F protein epitopes
L2 protein
p15-Trp2 epitopes
ESAT6-Ag85 antigens
F protein epitopes
Vectores
basados en
TMV
Agrobiotecnologa
Vectores basados
en virus vegetales
Insertion vectors
Foot and mouth disease virus
Hepatitis C virus
Mycobacterium bovis
Pseudomonas aeruginosa
Vectores
basados en
Pathogen or Disease
PVX
Insertion vectors
Human papilloma virus
Avian Influenza A virus
Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii
Hepatitis B virus
Transmissible gastroenteritis virus
Antigens or Antibodies
References
E7 protein
M2 protein ectodomain
SAG1 protein
Gra4 peptide
nucleocapsid protein
derivate antibody
capside epitopes
Several epitopes
E7 protein
E2 glicoprotein peptides
ESAT6 antigen
E7 and L2 epitopes
F protein epitope
VP6 protein
Agrobiotecnologa
Vectores basados
en virus vegetales
Produccin de anticuerpos
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
La produccin
de anticuerpos
en plantas
transgnicas
permite
ensamblar
molculas de
Ig complejas
Cadena liviana
()
Cadena J
(J)
Cadena pesada
(a)
Ig monomrica
(Ig)
Ig dimrica
(dIg)
Componente
Secretorio (SC)
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Ig secretoria
(sIg)
Expresin
del
anticuerpo
monoclonal
anti-AgI/II en
plantas de
tabaco
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Cruzamientos
Se obtuvieron plantas
de N. Tabacum que
expresan las cuatro
protenas juntas.
Estas cadenas se
ensamblan para dar
lugar a una
inmunoglobulina
secretoria funcional
que reconoce al
antgeno nativo AgI/II
El anticuerpo
anti Agl/II
actuara
alterando la
dinmica de
repoblacin
de la superficie
dental
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Adaptado de: www.planetbiotechnology.com
CaroRxTM
Planet Biotechnology
Protocolo de inmunizacin:
Aplicacin directa en los dientes del anticuerpo secretorio producido en plantas de
tabaco (SIgA/G, lnea roja) durante 3 semanas con 2 tratamientos por semana. Se
realizaron controles con solucin salina (lnea verde claro), con un anticuerpo bovino no
relacionado producido en plantas (lnea azul) y con el anticuerpos murino (Guys 13,
lnea verde oscuro). n: nmero de voluntarios
RinoRxTM
DoroRxTM
PAGE
TMV-LC
No desnaturalizante
PVX-HC
SDS-PAGE
TMV-HC
+
PVX-LC
Westen blot
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Medicin de la eficacia de la
enzima GalA producida
Medicin de la acumulacin
de GB3 en ratones wt y en
ratones knockout GalA
Clearance plasmtico
Organo blanco
Produccin
de factor de
crecimiento
epidrmico
humano en
plantas
de tabaco
P 35S CaMV
hEGF
tNOS
hEGF
tNOS p35(L)EGF
hEGF
tNOS p35(L)APEGF
Versin
P 35S (L) CaMV W
apoplstica
ss
p35EGF
104
0,11% protena
total soluble
(33 g/g de hoja)
103
102
10
Agrobiotecnologa
1
Control
hEGF st10ng
Planta no tranformada
Protenas
terapeuticas
producidas en
plantas en el
mercado o fase
clnica
Otras aplicaciones:
produccin de enzimas de inters
industrial, suplementos alimenticios y
biopolmeros
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
La avidina de
pollo fue la
primera
protena
recombinante
comercializada
obtenida
en plantas
avidina
Pin II 3
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Hood et al, Mol. Breed. 1997.
Caractersticas
de la avidina
producida
en maz
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Produccin
de brazzena
en plantas
de maz
Las protenas
edulcorantes tienen gran
demanda para productos
dietticos y para enfermos
de diabetes.
La brazzeina es una
protena producida por la
planta africana
Pentadiplandra brazzeana
que posee un poder
edulcorante 1.200 veces
ms alto que el azcar.
Su produccin en la
planta nativa es
imprctica debido a los
altos volmenes de
produccin requeridos.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Se transformaron plantas
de maz con dos
variantes de la secuencia
de brazzena y se la
expres en las semillas a
nivel del embrin y del
endosperma.
Se obtuvieron niveles de
acumulacin en semilla de
hasta 4% de la PST.
Niveles de
expresin de
brazzana en
semillas T1
para los
mejores
transformantes
obtenidos con
las
construcciones
1-8 detalladas
en la
transparencia
anterior
PST)
Brazze na (%
(% PST)
Produccin
de brazzena
en plantas
de maz
g (
Agrobiotecnologa
Brazzena
(g/g de peso seco)
Construccin gentica
Maz
entero
Grano entero
Grano
molido
endosperma
embrin
Germen
pericarpio
Contenido de
brazzena en
fracciones
obtenidas por
molienda seca
de las semillas
de la lnea 5
(promotor para
embrin).
Produccin
de brazzena
en plantas
de maz
Extraccin a pH 4
Tratamiento de calor
Intercambio catinico
Filtracin en geles
Desalado
Freeze Drying
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Produccin
de PHB en
plantas por
transferencia
de la va
metablica
bacteriana
Acetil-CoA
H3C
H3C
CoA
3-cetotiolasa (phbA)
S
CH2
OH
CoA
Acetoacetil-CoA-reductasa
(phbB)
S
CH2
H3C
CoA
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
CH2
CH3
CH3
CH
CH
CH2
n
PHB
Las plantas
de A. thaliana
transformadas
con los genes
phbA, phbB y
phbC
acumulan
grnulos de
PHB en los
cloroplastos
phbB
NOS 3
p35S TPSS
phbA
phbABC
Microscopia electrnica de una
clula del mesfilo de una hoja
madura de una lnea de A.
thaliana que expresa las enzimas
responsables de la sntesis de
PHB. Se muestra un cloroplasto
conteniendo grnulos de PHB.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Bohmert et al, Planta, 2000.
Enzimas industriales
Avidina: kit de diagnstico
-glucuronidasa: kit de diagnstico
Trypsin: wound care
Cellulasa: produccin de etanol
Xylanasa: procesamiento de biomasa
Fitasa: procesamiento de alimentos
(1-3)(1-4)-glucanasa: Brewing
Lignin peroxidasa: Paper manufacture
Biopolmeros
protenas de la seda de araa
polipptidos tipo elastina
colgeno
Aspectos de
bioseguridad
Bioseguridad:
En el caso de produccin de protenas teraputicas o con
actividad biolgica, se deben establecer condiciones de
bioseguridad an ms estrictas que las adoptadas para
otros OGMs, ya que stas no deben ingresar bajo ningn
punto de vista a la cadena alimentaria humana.
Recomendaciones:
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Referencias
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platforms for recombinant proteins. Biotechnol Adv. 30(5):1171-84. 2012.
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Gleba Y, Klimyuk V. and Marillonet S. Viral vectors for the expression of proteins in plants
Current Opinion in Biotechnology 18:134141, 2007.
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pharmaceutical proteins from plants. Current Opinion in Biotechnology, 16:167-173, 2005.
Fischer, R., Stoger, E., Schillberg, S., Christou, P. and Twyman, R. Plant-based production of
biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7:152-158, 2004.
Twyman, R., Stoger, E., Schillberg, S., Christou, P. and Fischer, R. Molecular farming in plants:
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Walmsley, A. and Arntzen, C. Plant cell factories and mucosal vaccines. Current Opinion in
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Streatfield, S and Howard, J. Plant-based vaccines. International Journal of Parasitology,
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Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Mason, H., Warzecha, H., Mor T. and Arntzen, C. Edible plant vaccines: applications for
prophylactic and therapeutic molecular medicine. Trends in Molecular Medicine, 8:324-329,
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Hood, E., Woodard, S., and Horn, M. Monoclonal antibody manufacturing in transgenic plantsmyths and realities. Current Opinion in Biotechnology, 13:630-635, 2002.
Giddings, G., Allison, G., Brooks, D. and Carter, A. Transgenic plants as factories for
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