Nociones Fundamentales de La Química Biológica.

Resumen I: Nociones bsicas de la Qumica Biolgica.
ANEXO: Sobre la Qumica Biolgica.
Introduccin a la Qumica Biolgica.

La Teora Celular.
Fundamentos de la Qumica Biolgica: las biomolculas y las complejas propiedades de los seres vivos.
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9
11
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Fundamentos celulares.
1.1 Caractersticas universales de las clulas: m.pl., cit., nucl.
1.2 Niveles de complejidad celular.
1.3 Dimensiones celulares y difusin.
1.4 Nutricin.
1.5 Clulas procariotas.
1.6 Orgnulos eucariotas.
1.7 Citoesqueleto: soporte y dinmica intracelular.
1.8 Monmeros, polmeros y complejos supramoleculares.
1.9 Macromolculas: principal constituyente de las clulas.
1.10 Modelo ejemplo: Escherichia coli.
13
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23
27
31
33
35
37
Fundamentos qumicos.
2.1 Introduccin.
2.2 Un segundo abordaje general a la biomolculas.
2.3 Estructura tridimensional.
39
40
43
Fundamentos fsicos.
3.1 Introduccin.
3.2 Primera ley de la termodinmica: principio de conservacin de la energa.
3.3 Segunda ley de la termodinmica: entropa.
3.4 Los organismos vivos existen en un estado estacionario dinmico y nunca estn en
equilibrio con su entorno.
3.5 Los organismos obtienen su energa del flujo de electrones.
3.6 La energa es necesaria para generar orden (evitar la tendencia entrpica):
espontaneidad de una reaccin qumica y acoplamiento energtico.
3.7 Las enzimas catalizan la sntesis frente a la inestabilidad termodinmica- y la
degradacin frente a la estabilidad cintica-.
3.8 Control global del metabolismo.
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61
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Fundamentos genticos.
4.1 La continuidad gentica reside en las molculas de DNA.
4.2 La secuencia lineal de DNA codifica protenas con estructuras tridimensionales.
67
69
Fundamentos evolutivos.
5.1 Los cambios en las instrucciones hereditarias hacen posible la evolucin.
5.2 La evolucin qumica de las biomolculas.
5.3 La fuente de energa de las primeras clulas eran los combustibles inorgnicos.
5.4 La anatoma molecular revela relaciones evolutivas.
5.5 Genmica funcional: correspondencia entre genes y procesos celulares especficos.
71
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Glosario I.
81
TCNICAS Y HERRAMIENTAS BIOQUMICAS.

1.
83
Tcnicas de purificacin.
1.1 Purificacin de las clulas y de sus partes: CITOMETRA DE FLUJO.
1.2 Purificacin de las clulas y de sus partes: FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR.
85
97
Fotometra.
2.1 Nociones bsicas.
2.2 Procedimiento para cuantificar fotomtricamente una sustancia.
111
113
Investigacin en protenas.
3.1 Consideraciones extra sobre purificacin, cuantificacin
y determinacin de la funcin de las protenas
3.2 Nociones de Inmunoqumica.
3.3 Nociones de Electroforesis.
121
129
133
ESTRUCTURA Y CATLISIS DE LOS PRINCIPALES COMPONENTES CELULARES.
141
2.
3.
1.
El agua.
1.1
1.2
1.3
1.4
Interacciones dbiles en los sistemas acuosos.

Ionizacin del agua, de cidos dbiles y de bases dbiles.
Tamponamiento contra cambios de pH en los sistemas biolgicos.
El agua como reactivo.
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Los organismos son agrupaciones de materia inanimada,

es cuando esta materia inanimada interacta que surgen las cualidades extraordinarias de la vida.
ANEXO. Sobre la
Qumica Biolgica
La Qumica Biolgica
Dr. Hctor Alfredo Molina. Revista Mdica Universitaria. Vol 2. N1 2006.
Facultad de Ciencias Mdicas. Universidad Nacional de Cuyo.
Es cortesa social, saludar a un conocido despus de muchos aos de no haberlo visto, con las
palabras: No has cambiado nada. Secretamente observamos, que su piel est envejecida, las arrugas
ms profundas, el cabello ms gris, etc. Pero en un sentido fsico convencional, no est frecuentemente
lejos de la verdad.
Durante su ausencia este conocido hombre, con la ms simple de las herramientas, podra haber
variado el curso de un ro, construido 10 casas, haber dado vida a 50 nios y haber cambiado de cualquier
manera el medio ambiente, tan profundamente que el menor observador, hubiera percibido estas
transformaciones. Sin embargo, al final de esto, difcilmente podramos advertir, ms que un pequeo
cambio en las dimensiones fsicas o en la composicin qumica del hombre propiamente dicho. Todo ello
es obvio y trivial pero contiene en forma resumida, los dos grandes problemas que han sido la motivacin
intelectual preferente del saber y desarrollo de la Qumica Biolgica. Cmo es que el organismo vivo
desarrolla la energa con la que puede manejar el medio ambiente para su provecho?, y cmo se las
arregla para que este gran flujo de energa, pase por l y sin embargo pueda mantener su propia forma?
Las respuestas las tiene la Qumica Biolgica, que es la Ciencia que estudia la naturaleza y el
comportamiento qumico de las clulas, ya sean de origen animal, vegetal o humano.
Los trminos de Qumica Biolgica y Bioqumica son similares y se suelen usar indistintamente,
pero hoy existe la tendencia a separar Bioqumica para la carrera universitaria y Qumica Biolgica para la
asignatura o especialidad de carreras afines: Bioqumica, Medicina, Agronoma, Odontologa, Biologa, etc.
Es una ciencia joven, que empieza con la Qumica Orgnica y recoge conceptos de la Fisicoqumica. En
ltima instancia todos los sistemas biolgicos se comportan como un conjunto ordenado y complejo de
reacciones qumicas, que obedecen a sus leyes y sin duda se deben explicar en trminos de esta Ciencia.
Se discute pedaggicamente y a veces con razn que para el estudio integral de la Qumica Biolgica se
necesita de la Qumica y la Biologa, y tambin se discute la separacin de la Fisiologa, la Biofsica y la
Qumica Biolgica, desde el punto de vista humano y actualmente ms por de mod, que las mismas
sean incluidas dentro de la Biologa Molecular. Personalmente pienso que la Biologa Molecular es una
necesaria conjuncin entre la Qumica Biolgica y la Gentica.
Vale aclarar que nada es independiente en nuestro organismo y slo por razones didcticas,
comenzaremos diciendo que la Qumica Biolgica nace a comienzos del siglo XX, establecindose las
primeras ctedras en Francia, Inglaterra y EEUU. Sin embargo, existe el antecedente de una Ctedra de
Qumica Fisiolgica en la Universidad de Tubingen (Alemania), en 1880 dictada por el Profesor Flix von
Hoppe Sller. Y se suele citar como los pioneros de la Qumica Biolgica a Chittenden, Mendel, Gie y Folin.
En 1906 aparecen el Journal of Biological Chemistry y el Biochemical Journal, las dos primeras
revistas con artculos mayoritariamente de Qumica Biolgica y que todava persisten, siendo las de mayor
jerarqua internacional. En la primera dcada del siglo XX se publicaban 10.000 trabajos por ao y
actualmente rondan los 5 millones por ao.
En Europa y en EEUU la Qumica Biolgica crece despus de la Primera Guerra Mundial, no as en
Iberoamrica donde la Qumica Biolgica es prcticamente inexistente hasta 1925. Recin en los ltimos
50 aos ha experimentado un desarrollo explosivo, junto con otras ciencias. Se publican ms trabajos en
Qumica Biolgica que en cualquiera otra rea de Qumica (Inorgnica, Orgnica, Analtica o Fsico
Qumica).
Intentaremos ordenar cules son los contenidos mnimos que marcaron el perfil de la Qumica
Biolgica. Abarca dos reas perfectamente definidas:
a) la parte esttica o morfolgica: bsica o descriptiva;
b) la parte dinmica o fisiolgica: biolgica propiamente dicha.
Diremos entonces que esta Ciencia estudia los glcidos, lpidos, protenas, nucleoprotenas y sus
respectivos metabolismos; las enzimas, vitaminas y oligoelementos, hormonas, las inmunoglobulinas, las
bases genticas, el metabolismo pigmentario y la qumica tisular. Recordemos que el concepto de
metabolismo es el balance entre la sntesis o anabolismo y la degradacin o catabolismo.
Descubrimientos pioneros de la Qumica Biolgica
En 1900, Braconet, francs, descubre y asla el primer aminocido: la Glicocola. Entre 1901 y 1950
se descubren los 20 aminocidos fundamentales para el hombre. En 1904 Arrhenius, sueco, establece el
concepto de electrolitos. En 1910 el alemn Kossel, describe los aminocidos bsicos y la albmina. En
1922 se le concede el premio Nobel al alemn Meyeroff y al ingls Hill por sus estudios del metabolismo
muscular y la bioenergtica, demostrando la correlacin entre la proporcin de cido lctico y el consumo
de oxgeno y el desprendimiento de la temperatura.
Quizs mencionando los premios Nobel detallados, perfilaremos los principales avances para la
humanidad vinculados con la Qumica Biolgica:
1917: Banting (canadiense) y Mc Leod (escocs): Insulina y diabetes
1928: Windauss (alemn): cidos biliares y anlogos
1929: Eijkman (holands) y Hopking (ingls): Qumica de las vitaminas
1930: Landsteiner y Wiener (austriacos): Grupos sanguneo y Rh
193l: Warburg (alemn): Cadena respiratoria
1933: Morgan (EEUU): Mapa gentico
1934: Minot, Murphy y Whipple (EEUU): Vitaminas del complejo B
1936: Dale (ingls) y Loewi (alemn): Adrenalina y acetilcolina
1937: Szent (hngaro) y Hawort (ingls): Vitamina C, cidos tricarboxlicos e hidratos de carbono
1938: Carrel (suizo) y Kuhn (austriaco): Qumica de las vitaminas
1939: Butenand (alemn): Hormonas esteroideas
1946: Muller (EEUU): Qumica gentica y Summer (EEUU): Cristalizacin de la primera enzima (ureasa)
1947: Houssay (argentino): Metabolismo glucdico y Cori-Cori (checos): Gluclisis y glucogenlisis
1948: Tisselius (sueco): Estructura proteica y electroforesis
1953: Krebs y Lipman (alemanes): Ciclos de los cidos tricarboxlicos, ciclo de la urea, estructura del ATP y
Coenzima A
1959: Ochoa (espaol) y Kornberg (EEUU): Biosntesis del DNA y RNA
1960: Burneo (australiano) y Medawra (brasileo): Bases de la inmunoqumica moderna.
1968: Khorana (hind), Niremberg y Holley (EEUU): Cdigo gentico y bases de la biosntesis proteica
1970: Leloir (argentino): Biosntesis de nucletidos y sacridos
1974: De Duve (belga): Bioqumica de los lisosomas y peroxisomas, etapa crucial para el desarrollo de la
biologa molecular. Uno de los mejores investigadores del siglo pasado.
No hay que olvidarse de Watson, Crick y Chargaf con sus contribuciones a la Gentica Molecular;
Fisher y Sanger, sobre estructuras proteicas; Jacob y Monod, en la regulacin metablica, etc., etc.
Si nos referimos a nuestro pas, es necesario decir que el crecimiento de la Qumica
Biolgica es muy lento, un poco debido a la ideologa de la poblacin, a gobiernos autoritarios, al idioma, a
falta de recursos y a otras razones. Un impulso importante de la Qumica Biolgica, surge en 1919 al
crearse la carrera de Bioqumica por iniciativa del Dr. Juan Snchez, compaero de Houssay en la Carrera
de Farmacia. El primer investigador Full Time de nuestro pas y pionero de los estudios en reas como el
metabolismo de glcidos y hormonas hipofisarias fue el Dr. Bernardo Houssay.
Son los doctores Marenzi y Dealefau los que echan la base de la Qumica Biolgica no slo en el
campo bsico sino en el clnico. Se agregan progresivamente Cardini, Stoppani, Paladini, Caputto, Pontis,
Dellacha, Olavaria, Trucco, Brenner, etc. A ellos hay que agregar latinoamericanos como Niemeyer en
Chile, Estable en Uruguay, Hurtado en Per, Chagas en Brasil, Gaede en Venezuela, Laguna en Mxico y
Alvaro en Colombia.
Pero por una razn de afecto y de justicia quiero rescatar a Luis Federico Leloir, que naci en Pars
el 6 de setiembre de 1906 y a los 6 aos se naturaliz argentino, recibindose de mdico en 1932 y de
Qumico en 1935 en la UNBA siendo un estrecho colaborador de Bernardo Houssay. Su tesis fue sobre
glcidos y suprarrenales, especializndose en Cambridge y en Columbia; sus primeros trabajos estn
relacionados con la oxidacin del alcohol y de los cidos grasos. En 1947 renunci a la Universidad por
razones polticas. Fue por muchos aos director del Instituto Campomar donde se formaron la mayor
parte de los especialistas en Qumica Biolgica. Recibe el premio Nobel (1970) por el descubrimiento de la
Glucosa 1-6 difosfato, la galactoquinasa, el UDPG y cerca de 80 mononuclotidos que participan en la
interconversin de glcidos y en la biosntesis de oligopolisacridos, etc. Leloir muri el 2 de diciembre de
1987.
Tambin algunas palabras para otro premio Nobel Argentino: Csar Milstein, de Baha Blanca,
nacido en 1927 y recibido de Qumico y Bioqumico en 1957 en la UNBA especializado en Cambridge desde
1969 hasta su muerte (no hace muchos aos), destacndose en evolucin, gentica molecular, enzimas e
inmunologa. En 1984 comparte el Premio Nobel con el dans Jerne y el alemn Koehler.
Los progresos actuales en Qumica Biolgica son sustanciales, no slo en cuanto a instrumentos
altamente elaborados sino tambin en la perspectiva de la ciencia: automatizadores, computadoras,
cromatgrafos, espectromtros, espectrgrafos, fluormetros, enzimmetros, radimetros, etc, etc. que
permiten dosar polipptidos, hormonas, vitaminas, micromolculas en general y monitorear drogas por su
recorrido metablico. Es un verdadero crecimiento logartmico que obliga a la Unin Internacional de
Bioqumica y a otras similares a que se preocupen por uniformar la nomenclatura, los cdigos, las
unidades, los valores de referencia e incluso delimitar especficamente los alcances de la Qumica
Biolgica.
Hace algn tiempo el Prof. J. Ferrier, introdujo 2 trminos: la epistemologa o teora del
conocimiento y la agnotologa, la teora de la ignorancia. Se ha dejado morir este ltimo, pero no deja de
ser completamente cierto que tenemos ms experiencias, por lo menos en Qumica Biolgica, acerca de la
ignorancia que acerca del conocimiento.
Bibliografa
1. Michel Salomn. El futuro de la vida. Ed. Planeta, 1981
2. Informaciones Roemmers, 1960-1988
3. Sauna Anderson. Qumica Clnica. Ed. Interamericana, 1995
Introduccin a la Qumica Biolgica.
La qumica biolgica o bioqumica estudia la composicin qumica, la base qumica de los seres vivos.
Su premisa fundamental consiste en que todo ser vivo est formado por el mismo tipo de materia que el mundo inanimado:
principalmente carbono, y en menor medida por hidrgeno, oxgeno, nitrgeno, fsforo, azufre y otros elementos minoritarios.
Todos estos elementos fundamentales conforman, a su vez, una gran diversidad de molculas que pueden ser clasificadas en cuatro
grandes grupos: carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nucleicos.
La bioqumica estudia todas estas biomolculas: molculas orgnicas sintetizadas por los seres vivos.
La bioqumica, es una parte de la qumica?
A grandes rasgos, la qumica estudia dos clases de compuestos qumicos: inorgnicos y orgnicos. Los compuestos orgnicos
tambin pueden ser clasificados en dos grandes grupos, segn su origen: compuestos orgnicos naturales originados en la
naturaleza- y compuestos orgnicos no naturales no originados en la naturaleza; por ejemplo, los plsticos-.
Los compuestos orgnicos naturales tambin pueden ser clasificados en dos grupos: a) in-vivo y b) ex-vivo.
a) Los compuestos orgnicos naturales in-vivo, son producto de la actividad biolgica. Estn vinculados con los seres
vivos; son biosintetizados. En este grupo encontramos a las biomolculas que estudia la bioqumica.
b) El grupo de los compuestos orgnicos naturales ex-vivo, es el de todas las molculas que no son sintetizadas por los
seres vivos: pueden ser producto de los procesos geolgicos o de los procesos atmosfricos. En este grupo podemos encontrar, por
ejemplo, a los compuestos vinculados con el petrleo que le incumben especficamente al campo de la petroqumica.
Desde la sntesis de Whler de la urea a partir del cianato de amonio (1828), un altsimo nmero de compuestos orgnicos ha sido
sintetizado qumicamente. La sntesis orgnica es la construccin planificada de molculas orgnicas naturales y no naturales
mediante reacciones qumicas, en laboratorios o en la industria. Esta incluye frmacos, desodorantes, perfumes, detergentes,
jabones, fibras textiles sintticas, materiales plsticos, polmeros en general, colorantes orgnicos, etctera. Las molculas
orgnicas artificiales vendran a ser el producto de la sntesis orgnica, pese a que varios autores le llaman de esta manera a las
molculas orgnicas no naturales.
La sntesis de compuestos orgnicos: Whler y el vitalismo.
Suele argumentarse que la qumica orgnica inici en 1828, con la sntesis de Whler de la urea, pero en verdad fue 4 aos antes:
en 1824, Whler sintetiz cido oxlico con un precursor inorgnico, el ciangeno.
Estos descubrimientos se opusieron a la predominante teora del vitalismo, la cual enunciaba que la materia orgnica posee una
fuerza vital inherente a todas las cosas vivas. An as, el vitalismo persisti en figuras como Liebig y Pasteur; no fue hasta 1845,
cuando Kolbe sintetiza cido actico a partir de disulfuro de carbono, haciendo que el vitalismo pierda un gran nmero de
simpatizantes.
Entonces, recapitulando
La bioqumica estudia las biomolculas y las reacciones qumicas que estos compuestos sufren en los organismos vivos: el
metabolismo (, metabol; cambio), que es la suma de o el balance entre- anabolismo (sntesis) y catabolismo
(degradacin).
Podemos entender a la bioqumica como una disciplina cientfica integradora, que aborda el estudio de las biomolculas y los
biosistemas, integrando las leyes fisicoqumicas. Lo hace desde un punto de vista molecular y trata de entender y aplicar su
conocimiento a amplios sectores de la medicina, la agroalimentacin, la biotecnologa, la farmacologa, etctera.
Conceptos clave: bioqumica, qumica biolgica, biologa molecular, biomolculas, compuestos qumicos orgnicos naturales invivo, metabolismo, biosistemas.
La Teora Celular.
En 1665, en el texto Micrographia, el fsico ingls Robert Hooke describe tejidos de distintos vegetales y propone el trmino
cellula (clula) para designar a las estructuras en forma de celdillas presentes en el corcho.
Mucho tiempo despus de Hooke, los Naturphilosophen emprenderan la bsqueda de la unidad de las formas vivientes. El
alemn Richard Oken fue uno de ellos, y ya en 1805 intuye que los seres vivos estn formados por clulas. Tendra que pasar medio
siglo ms antes que esta idea pudiera sostenerse observacionalmente.
Despus de las observaciones microscpicas de Hooke en el corcho, las celdillas descritas por l fueron confirmadas, entre
otros, por Malpighi en las plantas verdes. En 1831, Robert Brown, mdico y botnico ingls, descubri los corpsculos que llam
ncleos (diminutivo de nux, nuez). En 1835, Gabriel Valentin, de Berna, describi el nuclolo y un ao despus introdujo el trmino
parnquima para referirse a la sustancia situada entre el ncleo y la pared de la celdilla. El mdico checo Jan Evangelista Purkinje
introdujo el trmino protoplasma en una conferencia, en 1839, publicada un ao despus. Ese mismo ao apareci su publicacin,
en polaco, sobre las fibras que llevan su nombre, descubiertas en el corazn bovino.
Todas estas observaciones no fueron ms all del aspecto puramente descriptivo. El primer paso en la generalizacin e
interpretacin de las observaciones fue dado por el botnico Matthias Jacob Schleiden (1804-1881). En su trabajo Beitrge zur
Phytogenesis de 1838 (Contribuciones a la fitognesis), sostuvo que todas las plantas estaban formadas de clulas y que stas
correspondan a la unidad estructural del reino vegetal. Pero formulaba, adems, una teora acerca de la manera cmo se formaban
las clulas, a saber: a partir del citoblasto (lase ncleo) y ste, a su vez, se generaba por una especie de coagulacin de la
substancia madre que llenaba la celdilla.
El segundo paso lo dio Theodor Schwann: extendi la doctrina de su amigo Schleiden al reino animal. Theodor Schwann,
mdico, fisilogo y zologo, naci en Neuss, cerca de Dsseldorf, en 1810, y muri en 1882. Hombre tmido, introspectivo y piadoso,
se educ en el Colegio Jesuta de Colonia, estudi en las universidades de Bonn, Wrzbug y Berln. Fue uno de los tantos discpulos
de Johannes Mller.
Puede decirse que toda la obra productiva de Schwann es de su juventud, despus de la formulacin de la Theorie der Zellen
como captulo de su obra de 1839, publicada a los 29 aos de edad, Mikroskopische Untersuchungen ber die bereinstimmung in
der Struktur und Wachstum der Thiere und Pflanzen (Investigaciones microscpicas sobre la concordancia en estructura y
crecimiento de los animales y plantas), abandon Alemania por una crisis personal, agravada por no haber podido encontrar un
puesto universitario, se fue a Lovaina y a Lieja, donde se dedic a la docencia y no hizo ninguna otra contribucin a la ciencia.
Pero de su juventud proceden numerosos aportes en los campos de la histologa, fisiologa y microbiologa, entre otros:
descubrimiento de la vaina de los nervios, la cual lleva su nombre; descripcin de la musculatura estriada del segmento proximal
del esfago, descubrimiento de la pepsina, demostracin de la importancia de la bilis en la digestin, demostracin experimental de
la dependencia funcional entre magnitud de la tensin del msculo en contraccin y longitud; demostracin de la putrefaccin
como fenmeno dependiente de agentes vivos; descubrimiento de la naturaleza orgnica de las levaduras; demostracin de la
fermentacin como fenmeno causado por levaduras.
De manera similar al trabajo de Schleiden, el de Schwann no consisti simplemente en extender la concepcin celular al reino
animal sino adems, en formular un principio acerca de la generacin de las clulas en los seres vivientes, de ah la justificacin de
teora celular. El proceso ocurra as: en una masa informe, el citoblastema, se formaban primero los ncleos, luego, alrededor de
ellos, las celdillas, y todo eso, por una especie de cristalizacin, en todo caso, por un proceso gobernado por leyes fsicas que rigen
la agregacin de molculas del citoblastema.
Schwann, como se ve, no era un Naturphilosoph, su teora muestra un claramente un carcter reduccionista. Los pasos
siguientes en la concepcin de la estructura celular de los seres vivos iban a ser dados por Remak, con el descubrimiento de la
divisin celular en 1852, y, pocos aos despus, por Rudolf Virchow (1855): omnis cellula ex cellula (toda clula proviene de otra
clula).
La demostracin de la estructura celular en el sistema nervioso la iba a hacer Ramn y Cajal a comienzos del siglo XX en
contra de la idea del retculo difuso de Golgi. Ambos recibieron el Premio Nobel en 1906. La demostracin de la estructura celular
del miocardio iba a demorar medio siglo ms: que los discos intercalares representaban lmites celulares requera del microscopio
electrnico.
La Teora Celular puede sintetizarse en los cuatro principios siguientes:
1. Todas las cosas vivas estn compuestas por una o ms clulas.
2. La clula es la unidad fundamental de todos los organismos: los organismos ms pequeos son clulas nicas, y
la unidad funcional de los organismos multicelulares es la clula.
3. Todas las clulas provienen de clulas preexistentes, y la continuidad se mantiene a travs del material
gentico.
4. La unidad de materia viva ms pequea es la clula.
El concepto actual general, que engloba los tres primeros principios de la teora celular clsica, dice que
la clula es la unidad morfolgica, fisiolgica y de origen de todo ser vivo.
10
Fundamentos de la QB: las biomolculas y las complejas propiedades de los seres vivos.
Las primeras formas de vida fueron microorganismos sencillos. Primero estuvieron dotados de la capacidad de extraer energa
de los compuestos qumicos, despus de la luz solar. Esta energa sirvi para sintetizar una amplia variedad de biomolculas cada
vez ms complejas.
Una de las preguntas fundamentales que se plantea la bioqumica, es la siguiente: Cmo y por qu, especficamente, han
aparecido/evolucionado qumicamente cada una de las biomolculas que la bioqumica estudia? Otra pregunta vlida sera de
qu modo, las miles de diferentes molculas inanimadas, interactuaron para dar origen a la vida y sus complejas propiedades?
Cuando las biomolculas se aslan y examinan individualmente, cumplen todas las leyes fisicoqumicas que describen el
comportamiento de la materia inanimada. Del mismo modo ocurre con todos los procesos que tienen lugar en los organismos vivos.
La bioqumica muestra el modo en que las colecciones de molculas inanimadas que constituyen los organismos vivos, interactan
para originar y perpetuar la vida, estando todas estas molculas bajo las mismas leyes fsicas y qumicas que el resto del universo
inanimado.
Pero, los organismos poseen cualidades extraordinarias que los diferencian de otras agrupaciones de materia.
Las siguientes son las caractersticas distintivas de los organismos vivos:

Elevadas complejidad qumica y complejidad en la organizacin microscpica: esto quiere decir que
todas las estructuras estn formadas por miles de molculas diferentes y, a su vez, que estas molculas pueden ser muy
complejas. Por ejemplo, los polmeros; cada uno con su secuencia de subunidades monmeros-, su estructura
tridimensional, su capacidad para interactuar con otras molculas, etctera.
Poseen funciones definidas para cada componente, y pueden regular las interacciones entre estos
componentes. Esto implica que existe una relacin dinmica entre los componentes qumicos de un organismo vivo: los
cambios en un componente producen cambios coordinados en otro componente, de modo que el conjunto de los
componentes tiene un carcter propio, ms all del carcter de cada una de sus partes individuales. Este conjunto lleva a
cabo un programa cuya finalidad es la reproduccin y la perpetuacin de dicho conjunto y del programa mismo-: el
resultado es la vida.
Los componentes no son estticos. Existe un flujo de materia y energa entre el organismo y el entorno, y como ya
fue dicho, existe una relacin dinmica entre los componentes qumicos.
Poseen sistemas para extraer, almacenar, transformar y consumir la materia y energa del entorno.
Esto permite a los organismos constituirse como tales, crecer y desarrollarse, construir y preservar sus estructuras, y
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realizar un trabajo mecnico, qumico, osmtico y elctrico. El metabolismo intenta retrasar, en algn grado, la entropa
tpica del universo. Se contina en las pginas 21 a 22.
Poseen mecanismos para detectar y responder a los cambios y estmulos del entorno. Los procesos
qumicos de los organismos se adaptan y ajustan al ambiente.
Estn formados por clulas.
Pueden autorreplicarse y autoensamblarse. La reproduccin biolgica tiene lugar con fidelidad casi perfecta.
Evolucionan. Varan sus estrategias vitales heredadas, para sobrevivir en situaciones nuevas. La enorme diversidad de
formas de vida est relacionada en lo fundamental: la unidad fundamental de todos los organismos vivos puede observarse
a nivel molecular, en la similitud de secuencias gnicas y de estructuras de protenas.
La bioqumica describe en trminos moleculares estas estructuras, sistemas y procesos qumicos compartidos por los organismos.
Trata de explicar la vida en trminos qumicos unificadores, proporcionando ciertos principios de organizacin molecular que
subyacen en todas las formas de vida: la lgica molecular de la vida.
Los organismos son: agrupaciones de materia inanimada, es decir, de biomolculas que, aisladas, cumplen con
todas las leyes de la fisicoqumica que describen el comportamiento del universo inanimado; pero cuya
interaccin provoca las cualidades extraordinarias de la vida.
Conceptos clave: materia inanimada, universo inanimado, cualidades extraordinarias de los organismos.
Se contina en las pginas 39 a 46.

12
1. Fundamentos celulares.
1.1) Caractersticas universales de las clulas.
MEMBRANA PLASMTICA.
La membrana plasmtica (bicapa lipdica) define la periferia de la clula, separndola del medio externo. Es una
estructura laminar compuesta por lpidos anfipticos con cabeza hidroflica y cola hidrofbica- y protenas, que forman una
barrera hidrofbica fina y flexible, pero resistente.
La elevada flexibilidad global de esta estructura es una consecuencia de la interaccin no covalente entre subunidades de
lpidos y protenas: esto permite que la clula cambie su forma y su tamao.
La m.p. controla el paso de materiales entre la clula y su ambiente: como consecuencia del carcter hidrofbico
de los lpidos, la membrana plasmtica funciona como una barrera que impide la libre circulacin de iones inorgnicos y de
compuestos cargados (polares): es selectivamente permeable para sustancias polares, permitiendo la circulacin de oxgeno,
azcares simples, agua y dixido de carbono. De esta forma se mantiene estable el medio intracelular, regulando el paso de iones y
metabolitos, y manteniendo el potencial electroqumico (haciendo que el medio interno est cargado negativamente).
Adems de lpidos, la membrana tambin incluye protenas de membrana:
1) protenas de transporte, que permiten el paso de ciertos iones y molculas,
2) protenas receptoras, que reciben seales y las transmiten al interior de la clula,
3) enzimas de membrana, que son importantes en algunas reacciones.
La misma clula sintetiza los lpidos y las protenas de membrana.
Las funciones de la membrana plasmtica se pueden resumir en:
Transporte: intercambio de materia entre el interior celular y su ambiente externo. Puede ser llevado a cabo por
las protenas de transporte anteriormente mencionadas, o por procesos de endocitosis y exocitosis: parte de
la membrana plasmtica se invagina o evagina, recubriendo molculas de gran tamao para incorporarlas o
expulsarlas, respectivamente.
Reconocimiento y comunicacin: llevados a cabo por las molculas en la membrana, que actan como
receptoras de sustancias.
El grosor total de la membrana plasmtica suele rondar los 8-10 nm. Se puede observar con un microscopio electrnico de
transmisin, teniendo la forma de una doble lnea delgada y continua. Por ltimo, la interpretacin actual de su organizacin
molecular consiste en el modelo de mosaico fluido modificado (mmfm).
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Tanto en los procariotas como en los eucariotas: la membrana plasmtica es una bicapa fosfolipdica, con una regin
hidrofbica central y zonas hidroflicas superficiales, y presenta protenas de membrana.
En procariotas, la membrana plasmtica se ubica siempre por debajo de la pared celular. No posee colesterol ni otros
esteroides. Adems, puede presentar prolongaciones hacia el interior de la clula. En eucariotas s presenta colesterol y otros
esteroides.
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CITOPLASMA.
El citoplasma es el volumen interno delimitado por la membrana plasmtica. Est compuesto por el citosol y orgnulos en
suspensin.
Citosol: solucin acuosa, matriz acuosa, gel acuoso. Es una disolucin que posee una elevada concentracin de diferentes
partculas en suspensin, cada una con su funcin especfica. Estas partculas estn tanto en eucariotas como en procariotas:
molculas de RNA que codifican para enzimas;
enzimas codificadas por dicho RNA;
ribosomas: macromolculas en las que tiene lugar la sntesis de protenas. Los ribosomas procariotas difieren de los eucariotas.
En los ribosomas encaja el RNAm; los ribosomas le dan lectura y cada aminocido encaja en un codn para dar una protena.
unidades de aminocidos y nucletidos para ensamblar biomolculas;
centenares de metabolitos: pequeas molculas orgnicas, que funcionan como intermediarias de rutas biosintticas y
rutas degradativas (r.b. + r.d. = rutas metablicas);
coenzimas: compuestos esenciales en muchas reacciones;
iones inorgnicos;
proteasomas: complejo proteico que degrada protenas que ya no son necesarias para la clula.
Si se genera la ruptura suave de la membrana plasmtica y centrifugamos el extracto celular a 150.000g durante 1 hora,
obtenemos dos fases: un sobrenadante y un pellet.
Sobrenadante: fraccin homognea que no precipita. Compuesta por citosol y partculas: es una disolucin
concentrada de fracciones de membrana, protenas, RNA, subunidades monomricas, metabolitos e iones inorgnicos.
Pellet: fraccin que sedimenta. Compuesta por partculas y orgnulos. Ribosomas, grnulos de almacenamiento,
mitocondrias, cloroplastos, lisosomas, retculo endoplasmtico.
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NUCLEO y NUCLEOIDE.
El ncleo (en eucariotas) y el nucleoide (en procariotas; tambin llamado regin nuclear o cuerpo nuclear) son el
1. sitio de almacenamiento y replicacin del genoma conjunto de genes, compuestos por DNA y protenas asociadas al DNA-.
Adems, el ncleo y el nucleoide:
2. Son los lugares en donde se llevan a cabo la transcripcin: la sntesis de RNA
3. Regulan el ciclo celular, la divisin celular
4. Regulan la sntesis proteica
En procariotas (bacterias y arqueobacterias), el nucleoide no est separado del citoplasma por una membrana. En el nucleoide
no existen histonas.
En eucariotas el ncleo est bien definido, rodeado por una membrana doble: la envoltura nuclear. Esta envoltura consiste en
dos bicapas lipdicas atravesadas por numerosos poros nucleares y en continuidad con el retculo endoplasmtico. En este caso, el
DNA est organizado en cromosomas, y existen histonas.
En base a esto presencia o ausencia de envoltura nuclear- se separa al dominio Eucarya de los otros dos dominios: Archaea
y Bacteria. Estos tres dominios de la vida representan las tres ramas de la evolucin a partir de un progenitor comn. Los grupos
Bacteria y Archaea se pueden diferenciar en base a consideraciones bioqumicas y genticas. Las pruebas de que se dispone sugieren
que estos dos grupos divergieron pronto. Eukarya, que incluye a todos los organismos eucariticos, evolucion a partir de la misma
rama que dio origen a las arqueas: los eucariotas estn ms estrechamente relacionados con las arqueas que con las bacterias.
Micrografa electrnica de
nucleoide de E. Coli.
Microfotografa electrnica del ncleo

de una clula eucariota.

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1.2) Niveles de complejidad celular.
En algunos organismos unicelulares (bacterias, algas verdeazuladas) se observa el siguiente nivel de complejidad o tipo de
organizacin:
Colonia celular: grupo de clulas con caractersticas similares, que actan en conjunto, pero que no constituyen una
unidad estructural mayor o una especie de tejido.
En organismos pluricelulares, se pueden encontrar los siguientes niveles de complejidad:
Tejidos: grupo de clulas que realizan una determinada funcin.
Ej., tejido epidrmico.
rganos: grupos de clulas y tejidos que realizan una determinada funcin.
Ej., la hoja, compuesta por grupos de clulas y tejidos que realizan en conjunto una determinada funcin: la fotosntesis.
Sistemas: grupos de clulas, tejidos y rganos, que estn organizados para realizar una determinada funcin.
Ej., sistema vascular de las plantas superiores; sistema circulatorio de animales.
Se relaciona con las pginas 57.
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1.3) Dimensiones celulares y difusin.
Las clulas eucariotas tienen un volumen celular entre mil a un milln de veces superior al de bacterias.
Dimetro tpico de clulas animales y vegetales: entre 5 y 100 micrmetros.
Muchos organismos unicelulares tienen un dimetro de tan slo 1 a 2 micrmetros
y existen unicelulares procariotas considerablemente ms pequeos.
Qu es lo que limita las dimensiones

de una clula?
El lmite inferior probablemente est definido por el nmero mnimo de biomolculas necesarias. Por ejemplo: ciertas
bacterias tienen un dimetro de 300 nanmetros, y un solo ribosoma bacteriano tiene un dimetro de 20 nanmetros en su
dimensin ms alargada. Un ribosoma ocupara 1/15 del tamao total de la clula, y siendo que este tipo de clula necesita una
determinada cantidad mnima de ribosomas para ser funcional, el tamao total de la clula no podr ser menor a un determinado
valor por debajo del cual, la cantidad de ribosomas necesarios no entra en la clula-.
El lmite superior del tamao celular est probablemente definido por la velocidad de difusin de las molculas disueltas en
sistemas acuosos. Al aumentar el tamao de la clula, disminuye la relacin superficie/volumen hasta llegar a un punto en el que
su metabolismo consume las molculas que ingresaron al citoplasma a una velocidad superior a la del suministro mediante
difusin. Entonces, el metabolismo que requiere estas molculas se har imposible cuando el tamao celular crezca por encima de
un determinado valor: el lmite terico superior del tamao de la clula.
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1.4) Nutricin.
Los organismos pueden clasificarse en base a su fuente principal de energa y carbono, para su uso en la sntesis de
material celular.
Se pueden establecer dos amplias categoras en base a la fuente de energa: fottrofos y quimitrofos. Los fottrofos
recolectan y utilizan la luz solar. Los quimitrofos obtienen energa a partir de la oxidacin de combustibles qumicos: qu quiere
decir esto? Que transfieren electrones desde estos combustibles hacia buenos aceptores electrnicos; que transfieren protones desde
estos combustibles hacia buenos aceptores de protones; que transfieren tomos de oxgeno hacia estos combustibles.
Los quimitrofos, adems, pueden ser littrofos u organtrofos. Los littrofos oxidan combustibles inorgnicos: transforman,
por ejemplo, el HS- (anin hidrogenosulfuro) a S (azufre elemental), el S a SO4= (anin sulfato), el NO2- (in
nitrito) a NO3- (in nitrato), o el Fe2+ (in ferroso) a Fe3+ (in frrico). Los organtrofos oxidan compuestos
orgnicos.
Por ltimo, en base a la fuente de carbono, seres vivos pueden dividirse en auttrofos (aquellos que obtienen carbono del
CO2 y otras sustancias inorgnicas) y hetertrofos (los que obtienen carbono de nutrientes orgnicos).
Fottrofos.
Quimitrofos littrofos.
Quimitrofos organtrofos.
Existen fottrofos auttrofos (plantas, cianobacterias), fottrofos hetertrofos (bacterias prpuras, bacterias verdes), y
quimitrofos hetertrofos (mayora de los procariotas, y todos los eucariotas no fottrofos).
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1.5) Clulas procariotas.
Como vimos, los procariotas son organismos unicelulares sin ncleo diferenciado: poseen una regin citoplasmtica
denominada nucleoide, sin membrana o envoltura nuclear, y en donde se encuentra disperso su DNA.
Desde el punto de vista ecolgico: papel fundamental como descomponedores. Degradan los restos orgnicos de otros
organismos muertos, transformndolos en materia inorgnica. Adems, muchos de ellos fijan el N atmosfrico.
Debido a su pequeo tamao, el contacto con su entorno es inmediato: permanente influencia del entorno sobre su
metabolismo y desarrollo.
Envoltura celular bacteriana y arqueobacteriana.
El plan estructural general de la envoltura celular de bacterias comprende las siguientes capas:
1) membrana plasmtica interna.
2) pared celular: capa intermedia de peptidoglucano.
3) membrana externa de proteccin;
Pero cada grupo bacteriano puede presentar caractersticas diferenciales. Por ejemplo, las bacterias no siempre presentan
membrana externa. Adems, las arqueobacterias son un caso aparte: otros lpidos de membrana plasmtica, otra composicin de
pared celular, y nunca poseen membrana externa.
Bacterias gram-negativas: presentes las tres capas de la

envoltura celular.
Bacterias gram-positivas: no hay membrana externa, y la capa
de peptidoglucano es ms gruesa.
Cianobacterias: son gram-negativas pero capa de peptidoglucano
ms resistente.
Arqueas: no hay membrana externa. Capa externa de
pseudopeptidoglucano que confiere una gran rigidez.
Membrana plasmtica interna de arquitectura similar a bacterias,
pero sus lpidos difieren.
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Con respecto a la composicin y localizacin de la pared celular, notemos que:

en bacterias est constituida por peptidoglucano, y puede ser una capa intermedia o externa de la envoltura celular,
en arqueobacterias est constituida por pseudopeptidoglucano y siempre es una capa externa de la envoltura celular
Y que, en todos los casos, rodea a la membrana plasmtica interna.
La funcin de la pared celular es proporcionar integridad estructural: forma y rigidez, pese a que las haya ms rgidas y ms
flexibles. Su estructura es porosa y permite el paso de sustancias. Adems, su grosor puede variar.
En base a la tincin de Gram existen dos categoras de envolturas celulares bacterianas: 1) gram-positivas y 2) gramnegativas:
Las gram-positivas se tien de morado con el colorante cristal violeta usado en la tincin de Gram, ya que ste queda
atrapado en la gruesa capa de peptidoglucanos que rodea a la clula.
Las gram-negativas tienen una capa de peptidoglucano mucho ms delgada, y es por esto que no retienen el colorante
cristal violeta. Por esto acaban teidas de rojo con la safranina.
Estructura de las gram-positivas y gram-negativas.
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Cpsula.
Aparece en algunos grupos. Se localiza superficialmente, por fuera de la envoltura celular. Est formada por polisacridos o
polipptidos. Confiere la propiedad de adherirse a otras clulas, o a sustratos inertes.
Membrana plasmtica.
Sin colesterol y otros esteroides.

Citoplasma.
No est compartimentalizado. Presenta numerosos ribosomas agrupados, que forman polirribosomas o polisomas.
Flagelos.
Aparece en algunos grupos. Son extensiones largas y delgadas, constituidas por monmeros de flagelina (protena globular).
Pili.
Aparece en algunos grupos. Permite la adhesin de ciertas bacterias a una fuente alimenticia.
DNA.
Poseen un solo cromosoma formado por una sola molcula circular de DNA asociada a protenas no histnicas. Adems poseen
plsmidos: material gentico circular y autorreplicante.
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1.6) Orgnulos eucariotas.
A diferencia de las clulas procariotas, las clulas eucariotas poseen compartimentalizacin: orgnulos; estructuras
internas tpicas.
Las estructuras rotuladas en rojo son exclusivas de clulas animales o vegetales.

Los microorganismos eucariticos (protistas, hongos) tienen estructuras similares, pero pueden contener tambin orgnulos especializados no ilustrados aqu.
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Vemos, entonces, que las clulas eucariotas estn multicompartimentadas: confinan sus procesos en orgnulos especficos.
Esta multicompartimentalizacin consiste en un sistema de membranas internas que separan las funciones en compartimientos
diferenciados: orgnulos.
La estructura bsica de la membrana plasmtica se repite en las membranas que rodean al ncleo y a los distintos orgnulos
de la clula eucaritica.
Los orgnulos pueden dividirse en membranosos y no membranosos (ribosomas, centriolos, microtbulos, filamentos).
Dentro de las clulas tambin pueden haber inclusiones: elementos diversos que carecen de membrana; cristales, grnulos de
pigmento, lpidos, glucgeno y productos de desecho.
Una de las principales diferencias entre clulas animales y vegetales es la pared celular, completamente diferente a la de los
procariotas. Es una capa rgida que se localiza en el exterior de la membrana plasmtica de las clulas vegetales. Est formada por
celulosa, pectina y lignina (polisacridos). En hongos tambin hay pared celular, formada por quitina y otros polisacridos.
NCLEO.
En mamferos, dimetro promedio de aproximadamente 6 micrmetros. En la clula vegetal, entre 5 y 25 micrmetros (visible
con microscopio ptico). En las osferas de Cycas y de conferas, 0,6 milmetros (resulta visible a simple vista). En algunos hongos,
ncleos muy pequeos de 0,5 micrmetros.
RETCULO ENDOPLASMTICO.
Es una red interconectada de tubos aplanados y sculos comunicados entre s, de 40 a 50 nanmetros de espesor. El retculo
endoplasmtico rugoso se encuentra unido a la membrana nuclear externa, y se prolonga en el retculo endoplasmtico
liso.
El R.E.R. est relacionado con la sntesis proteica. Tiene apariencia rugosa debido a numerosos ribosomas adheridos a su
membrana: estos ribosomas suelen medir, aproximadamente, entre 20 y 30 nanmetros. El R.E.R. tiene sculos ms redondeados
que el liso, cuyo interior se conoce como luz del retculo o lumen: all caen las protenas sintetizadas por los ribosomas.
El R.E.L. no tiene ribosomas, y participa del metabolismo de lpidos como por ejemplo, algunos esteroides- y frmacos.
Adems, ambos intervienen en el transporte intracelular mediante vesculas de tamao muy variable, desde 25 a 500
nanmetros de dimetro.
APARATO DE GOLGI.
Consiste en un conjunto de sacos membranosos aplanados, rodeados por tbulos y vesculas. El A.G. recibe las vesculas del
retculo endoplasmtico, para procesar su contenido. Este procesamiento consiste en la glicosilacin de protenas y la
glicosilacin de lpidos. Adems, el A.G. participa de la sntesis de polisacridos.
Est dividido en cis-Golgi y trans-Golgi:
Compartimiento cis: proximal al retculo endoplasmtico
Compartimiento o red trans: el ms distal, del que emergen las vesculas con sus diversos destinos celulares
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PEROXISOMAS.
Son orgnulos muy comunes, tanto en clulas animales como vegetales. Tienen forma de vescula. Se forman de vesculas
procedentes del retculo endoplasmtico. Contienen abundantes enzimas de tipo oxidasa y catalasa, que participan en:
LISOSOMAS.
Oxidaciones flavnicas generales

Beta-oxidacin de los cidos grados
Catabolismo de las purinas
Ciclo del glioxilato
No se ha demostrado su existencia en clulas vegetales.
Orgnulos que albergan multitud de enzimas hidrolticas: hidrolasas. Estas enzimas son capaces de catalizar la hidrlisis de
un enlace qumico, es decir, de digerir protenas, carbohidratos, lpidos y cidos nucleicos.
Son vesculas con una morfologa muy variable, formadas por el aparato de Golgi.
VACUOLAS VEGETALES.
Exclusivas de los representantes del mundo vegetal.
Inmersas en el citosol, estn delimitadas por una membrana lipdica simple. Son numerosas y pequeas en las clulas en
crecimiento, y escasas y grandes en clulas diferenciadas, ocupando aproximadamente el 90% del volumen celular.
Sus funciones son:
Facilitar el intercambio con el medio externo

Mantener la turgencia celular
La degradacin y el reciclaje de macromolculas: digestin celular
La acumulacin de sustancias de reserva y de subproductos del metabolismo
MITOCONDRIAS.
En las mitocondrias se completa la oxidacin de metabolitos: tienen lugar la gluclisis, el ciclo de Krebs y la beta-oxidacin de
cidos grasos, para obtener ATP. Tienen un dimetro aproximado de 1000 nanmetros = 1 micrmetro.
Tienen el mismo peso que los lisosomas, pero distinta densidad.
CITOESQUELETO.
Es un andamiaje que permite el mantenimiento de la forma y estructura celular. Constituye adems un sistema dinmico que
interacta con el resto de los componentes celulares generando un alto grado de orden interno: genera movilidad intracelular.
Est formado, principalmente, por microtbulos, microfilamentos de actina y filamentos intermedios: protenas que se
agrupan dando lugar a estructuras filamentosas, a una especie de retculo.
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Cmo hace la bioqumica para estudiar los procesos confinados en estos orgnulos (procesos protagonizados
por biomolculas)? Se pueden utilizar tcnicas de PURIFICACIN/AISLAMIENTO problemas de deteccin de interacciones
moleculares
las biomolculas no se comportan igual en
la clula que in vitro
Muchos estudios de la estructura y funcin celular requieren muestras de un tipo de orgnulo celular en particular. Sin
embargo, la mayora de los tejidos contienen una mezcla de tipos de clulas, y la mayora de las clulas estn llenas de diversos
orgnulos. Ms adelante se describirn algunas tcnicas utilizadas para separar diferentes tipos de clulas, orgnulos y diferentes
tipos de biomolculas: tcnicas de purificacin.
Con respecto a las tcnicas de purificacin, es necesario hacer una consideracin ms:
Los estudios in-vitro pueden no detectar interacciones importantes entre molculas.
Las molculas suelen estudiarse purificadas in-vitro (dentro de tubos de ensayo). As, se evita la interferencia con otras
molculas presentes en las clulas. Si el estudio es para entender un proceso biolgico, esto impone ciertos lmites: los
componentes eliminados mediante purificacin pueden ser crticos para la funcin biolgica o para la regulacin de la actividad de
la molcula en estudio. Resumiendo: una molcula puede actuar de modo muy diferente en la clula que in vitro.
Uno de los retos de la bioqumica consiste en comprender cmo influyen la organizacin celular y las asociaciones
moleculares en la funcin de las biomolculas: comprender la funcin tanto in-vivo como in-vitro.
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1.7) Citoesqueleto: soporte y dinmica intracelular.
El citoesqueleto es una trama tridimensional e interconectada de distintos tipos de filamentos proteicos; un sistema dinmico
no rgido que interacta con el resto de los componentes celulares. Todos ellos proporcionan estructura y organizacin al
citoplasma y mantienen la forma de la clula. Existen tres clases principales de filamentos proteicos:
Microfilamentos de actina.
Microtbulos.
Filamentos intermedios.
Todos estos filamentos proteicos estn compuestos por subunidades proteicas simples asociadas de manera no covalente,
dando filamentos de grosor uniforme. Estos filamentos fluctan constantemente entre su forma monomrica cuando las
subunidades estn sueltas- y su forma polimrica. Se desagregan para reagruparse en otro lugar y as se desplazan (durante
mitosis, citoquinesis, desplazamiento ameboide de clula, etctera): no poseen localizacin celular permanente.
Los orgnulos se mueven a lo largo de estos filamentos, gracias a la energa de motores proteicos. El movimiento y la posicin
de los orgnulos y de los elementos del citoesqueleto estn sometidos a una estrecha regulacin y en el transcurso de la vida de la
clula se producen importantes reorganizaciones finamente orquestadas, tales como la mitosis. Las interacciones entre
citoesqueleto y orgnulos tambin son reversibles, de tipo no covalente, y estn sujetas a regulacin por diversas seales intra y
extracelulares.
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1.8) Monmeros, polmeros y complejos supramoleculares.
Polmeros (en griego, muchas partes; muchos bloques; muchos segmentos): son molculas formadas por la unin de otras molculas ms
pequeas llamadas monmeros (en griego, una parte; un bloque). Estos monmeros o bloques deben ser molculas de arquitectura
semejante o idntica, unindose de manera lineal es decir, al igual que vagones para formar un tren-: en cadena. Este es el motivo por el cual
los lpidos no suelen ser considerados polmeros: no estn formados por monmeros concatenados linealmente (ver estructura de un lpido).
La secuencia de monmeros contiene la informacin necesaria para definir:
a) Estructura tridimensional
b) Funcin biolgica
Entonces, los monmeros de un polmero pueden ser todos iguales, o diferir. La reaccin por la cual es sintetizado un polmero a partir de sus
monmeros, es denominada polimerizacin. Existen diversos mecanismos biolgicos de polimerizacin. Los polmeros pueden clasificarse
segn estos mecanismos de polimerizacin, segn su origen, segn su composicin qumica, segn sus aplicaciones, segn su comportamiento
al elevar la temperatura, etctera.
Las protenas, los polisacridos y los cidos nucleicos son diversos tipos de polmeros, por ende estn formados por monmeros.
Los monmeros de las protenas son los aminocidos.
Los monmeros de los polisacridos son los monosacridos.
Los monmeros de los cidos nucleicos son los nucletidos. Es importante recordar que
base nitrogenada + pentosa + ion fosfato = nucletido [ribonucletidos en el RNA, desoxirribonucletidos en el DNA].
base nitrogenada + pentosa = nuclesido
Los polmeros ms cortos se suelen denominar oligmeros: dmeros, trmeros, tetrmeros, etctera. Ej., la sacarosa, un dmero
formado por glucosa y fructuosa, dos monmeros.
Las siguientes son algunas biomolculas importantes. Memorizarlas puede ser muy til para entender mejor la Qumica Biolgica:
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Los polmeros pueden asociarse para formar complejos supramoleculares. Por ejemplo, la hemoglobina es un complejo
supramolecular en el que aproximadamente 600 aminocidos se enlazan para formar 4 cadenas proteicas, las que tambin se
asocian y se pliegan para dar una estructura globular tpica de aproximadamente 5,5 nanmetros de dimetro. Ntese que este
complejo supramolecular, la hemoglobina, est constituido entonces por cuatro polmeros proteicos asociados entre s.
Las subunidades monomricas de protenas, cidos nucleicos y polisacridos se unen mediante enlaces covalentes. En los
complejos supramoleculares ocurre otra cosa: los polmeros constituyentes se mantienen unidos por interacciones no
covalentes, mucho ms dbiles. Entre las interacciones no covalentes podemos contar (4):
Enlaces por puente de hidrgeno: entre un tomo electronegativo y un tomo de hidrgeno unido covalentemente a
otro tomo electronegativo,
Interacciones inicas: a nivel de catin-anin, entre distintas molculas cargadas, formando una unin electrosttica,
Interacciones hidrofbicas: entre lpidos, cadenas alqulicas y grupos apolares en disolucin acuosa. No se atraen: se
agrupan o agregan porque as el sistema alcanza la mxima estabilidad termodinmica posible.
Interacciones de van der Waals (o fuerzas de dispersin de London): entre molculas sin carga elctrica neta,
debido a fenmenos de polarizacin temporal. Fuerzas muy dbiles que se incrementan a mayor tamao molecular.
Todas ellas poseen una energa considerablemente menor que la de los enlaces covalentes. Estas interacciones se describen ms
adelante.
Los complejos supramoleculares son estables gracias al gran nmero de interacciones dbiles que se establecen dentro de ellos, y
que son las responsables de sus estructuras nicas.
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1.9) Macromolculas: principal constituyente de las clulas.
Las macromolculas son polmeros de masa molecular superior a 5.000. Las macromolculas pueden asociarse y formar
estructuras supramoleculares complejas, como los ribosomas.
Las protenas son las biomolculas ms verstiles, y el catlogo de sus funciones resultara muy largo: estructurales,
catalticas, receptoras de seales, transportadoras, etctera. La suma de todas las protenas que funcionan en una clula se
denomina proteoma.
Los cidos nucleicos almacenan y transmiten la informacin gentica. Algunas molculas de RNA desempean papeles
estructurales y catalticos en complejos supramoleculares.
Los polisacridos, polmeros de azcares simples, tienen tres funciones principales: 1) almacn de combustibles energticos,
2) papel estructural de las paredes celulares plantas, bacterias, hongos -, 3) elementos de reconocimiento extracelular:
oligosacridos actan como seales especficas cuando se presentan unidos a protenas o lpidos de la superficie celular.
Los lpidos, derivados de hidrocarburos insolubles en agua, sirven como reserva de combustible rico en energa, componentes
estructurales de membranas, seales intracelulares y pigmentos.
Protenas, polisacridos y polinucletidos tienen un gran nmero de subunidades monomricas y, por lo tanto, grandes masas
moleculares:
Protenas: entre 5000 y ms de 1 milln.
Polisacridos: del orden de millones en algunos como el almidn.
Polinucletidos: hasta varios miles de millones.
Las molculas de lpidos son mucho ms pequeas: su masa molecular suele estar entre 750 y 1500. No se consideran
macromolculas. Pese a esto, pueden formar estructuras muy grandes por asociacin no covalente. Ej.: membranas celulares.
La secuencia especfica de subunidades monomricas y su disposicin en el espacio tridimensional determinan,

en gran medida, la funcin biolgica particular las macromolculas gentica, catalizadora, hormonal, etctera-.
Cada monmero, por su parte, suele desempear ms de una funcin en las clulas vivas. Ej.: los ocho nucletidos
ribonucletidos y desoxirribonucletidos-, adems de servir como subunidades de los cidos nucleicos, actan como molculas
portadoras de energa. Los aminocidos, adems de subunidades proteicas, son precursores de hormonas,
neurotransmisores, pigmentos y muchas otras clases de biomolculas.
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Modelo ejemplo: Escherichia coli.
E. coli es un inquilino habitualmente inofensivo del tracto intestinal humano.

Estructura.
Tiene aproximadamente 2 micrmetros de longitud y menos de 1 micrmetro de dimetro. Contiene aproximadamente 15.000
ribosomas, de decenas a miles de copias de 1000 o ms enzimas diferentes, aproximadamente 1000 compuestos orgnicos de masa
molecular inferior a 1000 (metabolitos y cofactores) y una variedad de iones inorgnicos.
En la siguiente tabla se muestran las principales clases de biomolculas de E. coli.
E. Coli es gram-negativa: reacciona negativamente a la tincin de Gram envoltura
celular: membrana plasmtica interna, capa intermedia de peptidoglucano y membrana
externa protectora.
Es un microorganismo anaerobio facultativo, mvil por flagelos peritricos (que rodean su
cuerpo), no forma esporas, y es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa.
37
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2. Fundamentos qumicos.
2.1) Introduccin.
El objetivo de la bioqumica es explicar las estructuras y las funciones biolgicas en trminos qumicos.
Durante el siglo XX, se observaron grandes similitudes qumicas entre clulas muy diferentes por ej., entre levaduras y clulas
musculares de animales-, lo que confirm la universalidad de los procesos bioqumicos en seres vivos, idea claramente resumida en
la afirmacin de Monod.
Esta universalidad de intermediarios y transformaciones qumicas (teora de la unidad bioqumica) es uno de los ms slidos
fundamentos de la nocin actual de que todos los organismos comparten un origen evolutivo: en la prctica totalidad de las clulas
existe un conjunto de metabolitos y rutas metablicas centrales que se han conservado a lo largo de la evolucin.
Existe un conjunto casi universal de unos centenares de molculas
de baja masa molecular (metabolitos) y de sus rutas bioqumicas,
que aparecen en la prctica totalidad de los seres vivos.
desarrollados en clulas primitivas.

manifestacin de la conservacin evolutiva.
Existen otras biomolculas pequeas que son especficas para cada tipo de clulas u organismos. Adems, al conjunto de las
molculas pequeas de una clula determinada, se le llama metaboloma de la clula.
De los 90 elementos qumicos presentes en la naturaleza, menos de 30 son esenciales para los seres vivos. La mayor parte de estos
elementos de la materia viva, tiene un nmero atmico relativamente bajo y slo dos de ellos tiene un nmero atmico superior al
del selenio (34).
El hidrgeno, el oxgeno y el nitrgeno y el carbono (CHON) son los cuatro elementos ms abundantes: en conjunto representan
ms del 99% de la masa de la mayora de las clulas. Son los elementos ms ligeros capaces de formar uno, dos, tres y cuatro
enlaces covalentes, respectivamente. Adems, los elementos ms ligeros forman generalmente los enlaces ms fuertes.
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2.2) Un segundo abordaje general a las biomolculas.
Las biomolculas son compuestos de carbono con una diversidad de grupos funcionales.
Por qu de carbono? El carbono puede formar enlaces simples con tomos de hidrgeno, enlaces tanto simples como dobles con
tomos de oxgeno o de nitrgeno, y enlaces simples, dobles y triples con otros tomos de carbono. Y como todos estos elementos
son ligeros, forman enlaces considerablemente fuertes.
Los enlaces simples carbono-carbono son de gran estabilidad, razn por la cual resultan trascendentes para la biologa. Estos se
proyectan desde el ncleo a los cuatro vrtices de un tetraedro, con un ngulo de 109,5 entre cada uno de ellos y una longitud
media de enlace de 0,154 nm. Existe libertad de rotacin alrededor de enlaces simples a no ser que ambos tomos de carbono estn
unidos a grupos muy voluminosos o cargados, en cuyo caso la rotacin puede estar restringida.
Un enlace doble carbono-carbono es ms corto (aprox. 0,134 nm) y rgido, y no permite la rotacin alrededor de su eje.
Los tomos de carbono enlazados covalentemente pueden formar cadenas lineales, ramificadas y estructuras cclicas.
La versatilidad de enlace del carbono fue probablemente una de las principales causas de la seleccin de los compuestos de
carbono para formar parte de la maquinaria molecular de las clulas durante el origen y la evolucin de los seres vivos: ningn otro
elemento puede formar molculas con formas y tamaos tan diferentes o con tanta variedad de grupos funcionales.
40
Puede considerarse que la mayor parte de las biomolculas son derivados de hidrocarburos, con tomos de hidrgeno
reemplazados por una amplia gama de grupos funcionales. Estos GFs confieren propiedades qumicas y reactividad especficas para
dar lugar a las diferentes familias de compuestos orgnicos. Las biomolculas pueden tener un nico tipo de GF o varios GFs
diferentes, cada uno de ellos con propiedades qumicas y reactividad propia. En este ltimo caso, las molculas son consideradas
polifuncionales.
La personalidad qumica de cada compuesto viene determinada por
la qumica de sus grupos funcionales y su disposicin en el espacio tridimensional.
Los siguientes son algunos GFs. Sugiero memorizarlos, con el fin de facilitar el estudio de las biomolculas:
41
42
2.3) Estructura tridimensional.
En este ltimo captulo, vimos que la estructura del esqueleto carbono-carbono, el tipo de enlace covalente y los GFs de las
biomolculas definen en gran medida su funcin. Otra caracterstica de importancia crucial es la estereoqumica: disposicin de
los tomos de una molcula en el espacio tridimensional.
Entre los compuestos de carbono existen muchas molculas que son estereoismeros: molculas que contienen los mismos
enlaces qumicos pero con diferente configuracin (=estereoqumica = distribucin espacial de sus tomos constituyentes). Es
decir, idntica frmula molecular pero diferente frmula estructural.
Existen dos tipos de estereoismeros:
Ismeros geomtricos (cis y trans).
Ismeros quirales: enantimeros y

diasteroismeros (aqu representado un par
de enantimeros).
La estereoselectividad es la formacin preferente de un estereoismero sobre todos los posibles: cuando un precursor
se convierte en varios estereoismeros, pero no en partes iguales (por ej.: 60 % la forma trans-2-buteno, 40% la forma
cis-2-buteno).
Adems, las interacciones entre biomolculas son invariablemente estereoespecficas: una biomolcula debe tener
determinada configuracin para poder interactuar con otra biomolcula (una molcula no interacta con cualquier
estereoismero).
En la siguiente figura se muestran tres formas de ilustrar la estructura estereoqumica o configuracin de una molcula
especficamente, del aminocido alanina-:
(a) Frmula estructural en perspectiva (diagrama
en perspectiva). Las cuas ms slidas (en negrita)
representan un enlace en el que el tomo se proyecta hacia
el exterior del plano del papel; hacia el lector. Las cuas a
trazos (entre los carbonos) representan enlaces dirigidos
hacia la parte posterior respecto al plano del papel. Este
diagrama no es ambiguo, pero ngulos y distancias de
enlace se representan mejor en (b).
43
(b) Modelo de bolas y varillas. Se observan mejor los ngulos de enlaces y las longitudes relativas de enlaces. (c) Modelo
espacial. El radio de cada tomo es proporcional a su radio de van der Waals. Este modelo define mejor el espacio ocupado por la
molcula (as como el volumen del que quedan excluidos los tomos de otras molculas).
Con respecto a la estereoselectividad: para que tuviera sentido, un estereoismero no debera poder transformarse en otros
estereoismeros. Esto es correcto. Los estereoismeros no pueden interconvertirse espontneamente: no se puede transformar un
estereoismero en otro sin romper uno o ms enlaces covalentes. Cul es la causa de esto? (Es decir, la causa de la existencia de los
estereoismeros).
1)
Los enlaces dobles, alrededor de los cuales no hay rotacin, impidiendo que un estereoismero se convierta
espontneamente en otro. Entonces: para provocar la interconversin deberan romperse enlaces covalentes, y este
proceso consume mucha ms energa que la energa cintica media de molculas a temperatura fisiolgica.
Como consecuencia de los enlaces dobles surgen los ismeros geomtricos.
Configuracin de dos ismeros geomtricos. En este caso, si el estereoismero cis absorbe energa lumnica, es convertido en el
estereoismero trans. Obsrvese que en los modelos de bolas y varillas de los retinales se omiten los tomos de hidrgeno.
2)
Los centros quirales. Qu es esto? Para empezar, definamos imagen especular. La imagen especular es el reflejo
en un espejo de cualquier objeto. Si reflejamos un cubo en un espejo, tenemos un cubo original y un cubo especular.
Ahora, si hacemos rotar al cubo especular unos 180, vemos que los dos cubos coinciden perfectamente. Probemos el
mismo ejercicio con una mano, y veremos que no sucede lo mismo: las imgenes especulares no coinciden record girar
mentalmente la mano especular unos 180-.
La mano derecha y la mano izquierda son imgenes especulares que no coinciden. Mir tu mano derecha, despus mir la
izquierda. Notars que no son superponibles, porque si trats de acoplarlas una encima de la otra no encajan: los
pulgares quedan coincidiendo con los meniques. A esta propiedad se le llama quiralidad. Tus manos son quirales!
44
La quiralidad es la propiedad de un objeto de no ser superponible con su imagen especular. Ahora vayamos a las
molculas:
Un centro quiral o carbono asimtrico es un tomo de carbono tetradrico con cuatro grupos sustituyentes
diferentes (ej.: A, B, C, H): ver imagen de la pgina anterior. Para una frmula molecular que incluya un carbono
asimtrico, existen siempre dos frmulas estructurales distintas: ver las dos molculas de la imagen citada anteriormente,
que son imgenes especulares no coincidentes.
Es decir, cuando en un compuesto existe un centro quiral, este compuesto tiene dos estereoismeros, que son imgenes
especulares no coincidentes. A estos dos estereoismeros se les llama enantimeros. Por ms que hagamos girar a
cualquiera de los dos enantimeros, jams coincidirn con el otro (a menos que rompamos enlaces covalentes).
Lo contrario vendra a ser las molculas aquirales, que son molculas simtricas. Cuando tres grupos
sustituyentes son diferentes (es decir, hay dos sustituyentes iguales), solo es posible una configuracin espacial y la
molcula es aquiral o simtrica. En este caso, la molcula puede superponerse a su imagen especular. Las molculas
simtricas son imgenes especulares coincidentes, porque en verdad son la misma molcula (no hay estereoismeros).
El otro tipo de estereoismero quiral, son los diasteroismeros. Como todo estereoismero, los diasteroismeros no
son superponibles, y su diferencia con los enantimeros es que los diasteroismeros no son imagen especular el uno del
otro.
Ver el siguiente grfico.
45
En el dibujo podemos observar cuatro molculas diferentes con la misma frmula molecular: cuatro
estereoismeros. Tambin se puede afirmar que hay dos pares de enantimeros, y cuatro pares de
diasteroismeros.
En las clulas vivas se produce una sola forma quiral de una biomolcula gracias a que las enzimas que sintetizan esa molcula
son tambin, a su vez, molculas quirales: las molculas quirales de los organismos vivos se encuentran generalmente presentes en
slo una de sus formas quirales.
Por ltimo, vale aclarar que no debe confundirse el concepto de configuracin con el de conformacin. La conformacin
molecular describe la disposicin espacial de los grupos sustituyentes que tienen libertad para adoptar posiciones diferentes en el
espacio sin necesidad de romper enlaces, gracias a la libertad de rotacin de los mismos. Es decir, dependiendo del grado de
rotacin del enlace son posibles muchas conformaciones diferentes e interconvertibles. Por supuesto, no es posible aislar ninguna
de las dos formas conformacionales (confrmeros) puesto que son libremente interconvertibles.
CONVENCIN CLAVE PARA ESTEREOQUMICA: El sistema de nomenclatura RS es el ms til para compuestos con ms de un
centro quiral. Se asigna una prioridad a cada uno de los grupos sustituyentes unidos a un carbono quiral. Prioridades:
OCH3 > OH> NH2 > COOH> CHO> CH2OH> CH3> H
Segn este sistema, el grupo de prioridad ms baja debe quedar en direccin opuesta a la del observador. Si la prioridad de los
otros tres grupos disminuye en sentido de las agujas del reloj, la configuracin es R; si va en sentido inverso al de las agujas del
reloj, la configuracin es S. De esta manera, cada carbono quiral es llamado S o R.
Otro sistema de nomenclatura es el D y L.
46
3. Fundamentos fsicos.
3.1) Introduccin.
Todo organismo debe producir trabajo para mantenerse vivo. A su vez, el trabajo requiere energa.
La energa es un tema central en la bioqumica. La sntesis continua de componentes celulares requiere trabajo qumico; la
acumulacin y retencin de sales y componentes orgnicos en contra de un gradiente de concentracin implica la realizacin de un
trabajo osmtico; la contraccin muscular o el movimiento flagelar bacteriano representan un trabajo mecnico. De dnde viene la
energa necesaria para los procesos que permiten que los organismos se mantengan vivos?
A lo largo de la evolucin, las clulas desarrollaron mecanismos muy eficientes para acoplar energa obtenida de luz
solar o de combustibles con procesos celulares que requieren energa. La qumica biolgica se plantea comprender estos
mecanismos de extraccin, almacenamiento, conversin y consumo de energa en las clulas vivas. Para esto, es necesario conocer
los principios de la bioenergtica: las transformaciones e intercambios de energa de las que dependen todos los organismos
vivos.
BIOLOGA y TERMODINMICA.
Las conversiones de la energa celular (la bioenergtica) se pueden explicar con las leyes de la termodinmica. La
termodinmica emplea tres conceptos de gran importancia: sistema, entorno, universo.
Segn la termodinmica, un sistema es todo aquello que est incluido en una regin definida del espacio: la parte del universo que
es objeto de nuestro estudio. El entorno es el resto del universo. Universo= sistema + entorno.
Por ej., si hablamos de reacciones qumicas en una solucin, un sistema es el conjunto de reactivos, productos, el disolvente que los
contiene y la atmsfera circundante.
Un sistema puede ser abierto, cerrado o aislado. Un sistema abierto intercambia materia y energa con su entorno. Un sistema
cerrado no intercambia materia con su entorno. Un sistema aislado no intercambia ni materia ni energa con su entorno.
Los organismos son sistemas abiertos. Con respecto a la energa, como ya vimos, pueden extraerla de su entorno de dos maneras
diferentes:
a) captando combustibles qumicos del entorno, para oxidarlos.
b) absorbiendo radiacin solar, para sintetizar combustibles qumicos y oxidarlos
47
En resumen, durante la oxidacin de los combustibles qumicos 1) disminuye la energa

potencial de las complejas molculas nutrientes, 2) liberando calor y generando
productos metablicos ms simples, tambin liberados al entorno (aumento de la
entropa del entorno), y 3) se usa la diferencia de energa para crear macromolculas
complejas para el organismo (aumento del orden/disminucin de la entropa en el sistema).
Grfico a la derecha.
a) Los organismos extraen energa de su entorno (nutrientes o luz solar).

b) Disminuyen la energa potencial de los nutrientes (combustibles qumicos)
c) Devuelven al entorno parte de la energa, en forma de calor.
d) Liberan algunos productos finales: molculas menos organizadas que el combustible
original, aumentando la entropa del entorno.
e) Usan la diferencia de energa para sintetizar macromolculas complejas (aumentando el
orden/disminuyendo el desorden en el sistema), y para producir trabajo.
Se puede decir que las clulas son transductores consumados de energa: mediante Transducciones Energticas Metablicas, son
capaces de interconvertir energa mecnica, qumica, osmtica y electromagntica con gran eficacia. Pero mientras que los transductores
mecnicos dependen de diferencias en la presin o en la temperatura para generar un flujo de calor y, gracias a este flujo, realizar trabajo,
todas las partes de un organismo vivo deben operar a unas condiciones prcticamente idnticas de presin y temperatura, por lo que el
flujo de calor deja de ser una fuente til de energa.
De ello se desprende la nocin de que las clulas son mquinas qumicas que funcionan a temperatura constante.
Adems, como vemos, los organismos captan materia y energa, y liberan materia y energa, consiguiendo de esta manera mantener un
orden interno y prolongar sus vidas. Al hacerlo, se cumplen las leyes de la termodinmica particularmente, la primera y la segunda ley-.
48
3.2) Primera ley de la termodinmica: principio de conservacin de la energa.
Esta ley enuncia que la energa no se crea ni se destruye, slo se transforma. Es decir que, en cualquier proceso fsico o qumico,
la cantidad total de energa del universo permanece constante, aunque su forma pueda variar: la energa se transforma.
Qu aplicacin tiene este principio en biologa? Cuando un organismo oxida carbohidratos, toma la energa almacenada en los
enlaces qumicos y la transfiere/almacena en enlaces de otras molculas: por ejemplo, en los enlaces de molculas de ATP. En estas
reacciones qumicas, la suma de la energa de los productos de la reaccin y de la energa liberada en la reaccin misma (del ATP
junto a otros productos de la reaccin, y del calor, respectivamente), es igual a la energa inicial de las sustancias que reaccionaron
(carbohidratos y oxgeno, en este ejemplo). La energa se transform: no se cre ni destruy una sola porcin de ella.
CALOR y TRABAJO.
Vale aclarar, el trabajo y el calor no son energas, son maneras en las cuales se transfiere la energa. El trabajo puede ser
mecnico, elctrico, etc., y la cantidad de energa transferida depende en gran medida de la forma en que se lleve a cabo el proceso.
El calor es la transferencia de energa debido a que los sistemas se encuentran a distintas temperaturas: en el ejemplo biolgico
del prrafo anterior, vemos que el calor es solamente transferencia de energa desde la molcula original de carbohidrato en plena
reaccin, al entorno. Disipacin de energa no reutilizable.
A continuacin se trata con mayor detalle el concepto de calor.
Calor.
El calor es definido como la transferencia de energa a travs de una frontera de un sistema debido a la diferencia de
temperatura entre el sistema y su entorno. Es una forma de transferencia de energa. El calor es energa en trnsito, por
ello es incorrecto decir el calor de un cuerpo al igual que decir el trabajo de un cuerpo. Es incorrecto hablar del calor
que posee un sistema. El calor Q no es una funcin de estado.
El calor al igual que el trabajo son modos de transferencia de energa, no formas de energa y no son funciones de
estado del sistema. Un sistema hace trabajo cuando causa movimiento frente a una fuerza opositora. El calor y el trabajo
son variables energticas de transito convertibles entre s. Una mquina de vapor es un ejemplo de una mquina
diseada para convertir calor en trabajo. Por otra parte el giro de una rueda con paletas en un tanque de agua produce
calor por friccin: representa el proceso inverso, la conversin de trabajo en calor.
Cuando se transfiere calor a un cuerpo, y no hay cambio en la energa cintica o potencial del sistema, la temperatura
normalmente aumenta (una excepcin a esto lo constituyen los cambios de fase o transicin de fase que puede sufrir el
sistema, como al congelar o vaporizar el agua). La cantidad de energa trmica (denotada por Q) necesaria (i.e. que debe
ser transferida por calentamiento) para elevar la temperatura de un sistema es proporcional a la variacin de temperatura
( ) y a la masa ( ) de la sustancia:
, donde
es la capacidad trmica o calorfica de la sustancia, que se define como la energa
trmica que se necesita para aumentar un grado la temperatura de la sustancia. El calor especfico ( ) es la capacidad
trmica por unidad de masa ( ):
49
La capacidad trmica es esencialmente una medida de la insensibilidad trmica que muestra una sustancia a la adicin
de energa trmica. Cuanto ms grande es la capacidad trmica, ms energa debe ser aadida a una determinada masa
de material para causar un cambio particular de temperatura.
Histricamente se defini la unidad trmica de calor o calora, como la cantidad de energa trmica necesaria para
elevar la temperatura de un gramo de agua en un grado Celsius (C) (o un kelvin, K; puesto que el grado Celsius y el
kelvin tienen el mismo tamao). La kilocaloria es, entonces, la cantidad de energa trmica necesaria para aumentar la
temperatura de un kilogramo de agua en un grado Celsius.
Dado que hoy sabemos que el calor es una forma de transferencia de energa, no necesitamos ninguna unidad especial
para el calor que sea diferente de otras unidades de energa. Se define en la actualidad la calora en funcin de la unidad
del SI de la energa, el Julio (J):
Segn la definicin original de calora, el calor especfico del agua es:
50
3.3) Segunda ley de la termodinmica: entropa.
Esta ley enuncia que la cantidad de entropa del universo tiende a incrementarse en el tiempo. La entropa es el grado de
desorden de la materia y de la energa de un sistema, y es tambin la cantidad de energa no aprovechable de un sistema.
En la primera ley vimos que la energa se transforma. El segundo principio establece el sentido en el que se produce dicha
transformacin: todo sistema posee estados de equilibrio, y cada estado de equilibrio tiene su propia cantidad de entropa;
cuando se tiene un sistema que pasa espontneamente de un estado de equilibrio A, a otro B, la cantidad de entropa en el estado de
equilibrio B ser la mxima posible, e inevitablemente mayor a la del estado de equilibrio A.
La inexorable tendencia
de todos los sistemas
es la desintegracin
hacia el estado de menor energa.
En resumen: todos los procesos naturales tienden a ocurrir en una direccin tal que la entropa del universo (sistemas + entorno)
se incrementa. Aplicadas estas nociones a la biologa, se puede decir que, por el contrario, el metabolismo es un mecanismo de
postergacin de la entropa en los organismos.
Para mantener la organizacin de la cual depende la vida, los sistemas vivos deben tener un suministro constante de energa que
les permita superar la tendencia hacia el desorden creciente. El Sol es la fuente original de esta energa: todos los organismos vivos
derivan su energa, directa o indirectamente, de la luz solar. Claro, existen organismos no fotosintticos, pero los combustibles
qumicos que emplean para extraer energa son un producto de la fotosntesis.
51
52
3.4) Los organismos vivos existen en un estado estacionario dinmico
y nunca estn en equilibrio con su entorno.
Sistema en estado estacionario: se dice para el caso en que las propiedades del sistema no cambien con el tiempo, pero
igual existe un flujo de materia y/o energa.
Equilibrio termodinmico: se dice que un sistema se encuentra en equilibrio cuando las variables que describen su estado
no varan a lo largo del tiempo (velocidad de formacin de productos es exactamente igual a la velocidad en que el producto se
convierte en reactivos). Si un sistema no est aislado como un sistema biolgico, por ejemplo-, el equilibrio se define en relacin
con el entorno del sistema: es decir, si un sistema est en equilibrio con el entorno, las variables del sistema y del entorno deben
tomar los mismos valores.
Ejemplo en torno a la cuestin de que los organismos son sistemas en estado estacionario dinmico: pese a que la
poblacin de molculas de un organismo est lejos de ser esttica porque continuamente se sintetizan y degradan molculas,
macromolculas y complejos supramoleculares mediante el constante flujo de masa y energa a travs del sistema-, existe una
relativa constancia en la composicin molecular (tipo de molculas y concentraciones respectivas) de los organismos. Slo
cuando la velocidad de sntesis o ingestin- compensa la velocidad de degradacin o consumo-, se produce un estado
estacionario dinmico.
El estado estacionario dinmico de los sistemas biolgicos es la causa de su homeostasis:
Con respecto al equilibrio termodinmico: los organismos nunca estn en equilibrio con su entorno. La composicin y el
valor de las variables termodinmicas (como la temperatura) de un organismo vivo, difieren de la composicin y del valor de las
variables termodinmicas del entorno: iones y molculas, por ejemplo, difieren en cuanto a tipo y concentracin de los presentes en
su entorno. Slo mediante un gasto continuo de energa pueden los organismos establecer y mantener sus constituyentes a
concentraciones diferentes de las del entorno. Y slo cuando el organismo muere, inicia su degradacin entrpica hacia el equilibrio
con su entorno.
53
Entonces, tanto la composicin qumica como el valor de las variables termodinmicas de un sistema biolgico
se mantienen relativamente constantes a) pese al flujo de materia y energa, y
b) pese a que las propiedades del entorno sean diferentes y, adems, cambien constantemente.
Mantenerse en este estado estacionario dinmico (mantener la homeostasis) y fuera del equilibrio con el entorno requiere
aporte constante de energa. Cuando la clula ya no es capaz de generar energa, muere, abandona el estado estacionario, e
inicia su degradacin hacia el equilibrio con su entorno.
54
3.5) Los organismos obtienen su energa del flujo de electrones.
Cuando la energa de la luz descompone molculas de agua durante la fotosntesis, se liberan electrones que reducen
molculas de CO2 para dar como producto una molcula de azcar (glucosa/almidn/sacarosa) y seis de oxgeno:
Tanto los organismos fotosintticos como los no fotosintticos obtienen energa de la oxidacin de los productos de la
fotosntesis: al oxidar esas molculas, transportan sus electrones hasta el O2 para formar agua y dixido de carbono, y mediante
este flujo de electrones provocar una reaccin que produce molculas de ATP (la unidad energtica de la clula).
De este modo, los auttrofos y los hetertrofos participan del ciclo global del O2 y del CO2, gobernado en ltima instancia por
la luz solar: esto los convierte en dos grandes grupos interdependientes.
Prcticamente todas las transducciones energticas metablicas de las clulas pueden entenderse como un flujo de
electrones desde una molcula a otra, cuesta abajo desde potenciales electroqumicos superiores a potenciales electroqumicos
inferiores (como en un circuito elctrico alimentado por una batera elctrica).
A estas reacciones que implican un flujo de electrones se les llama reacciones de reduccin-oxidacin (redox): un
reactivo se oxida (pierde electrones) y otro se reduce (gana electrones).
Oxidante: sustancia que oxida a otra, por lo tanto se reduce y contiene un elemento cuyo nmero de
oxidacin disminuye.
Reductor: sustancia que reduce a otra, por lo tanto se oxida y contiene un elemento cuyo nmero de
oxidacin aumenta.
Seguro que todo esto te recuerda a las reacciones cido-base. El paralelismo entre los pares conjugados cido-base (segn la
teora de Brnsted-Lowry) y los pares redox se ve claramente en el cuadro siguiente:
55
En base a lo ledo hasta este momento, podemos enunciar otros tres principios de la lgica molecular de la vida:
A continuacin se desarrollan con mayor profundidad algunos de los fundamentos termodinmicos de la bioenergtica.
Termodinmica y vida: https://www.youtube.com/watch?v=HZGJ_ovMyDY
56
3.6) La energa es necesaria para generar orden (evitar la tendencia entrpica):
espontaneidad de una reaccin qumica y acoplamiento energtico.
Los sistemas biolgicos deben tener un suministro constante de energa

que les permita superar la tendencia hacia el desorden creciente:
el metabolismo es un mecanismo de postergacin de la entropa.
El DNA, el RNA y las protenas son macromolculas informativas: la secuencia precisa de subunidades monomricas contiene
informacin de la misma manera que las letras de esta frase. Son molculas con un elevado grado de orden interno/complejidad
biolgica. Este elevado grado de orden interno/complejidad biolgica tiene un costo energtico: debe invertirse energa en
a) la formacin de enlaces covalentes entre los monmeros
b) el ordenamiento de los monmeros en su secuencia correcta
Ni la formacin de los enlaces covalentes ni el ordenamiento en secuencia de todos estos monmeros ocurren espontneamente:
eso ira en contra de la segunda ley de la termodinmica, ya que una porcin del universo estara disminuyendo su entropa de
manera espontnea.
Para la formacin de los enlaces y el ordenamiento de los monmeros, se requiere un trabajo celular que tiene un costo
energtico. A su vez, a mayor cantidad de monmeros por ordenar, se necesitan ms energa y ms trabajo, y el producto final
poseer mayor orden interno/complejidad.
Pero, qu determina que una reaccin sea espontnea o no espontnea, requiriendo este ltimo caso un trabajo celular con costo
energtico?
57
ESPONTANEIDAD DE UNA REACCIN QUMICA: ENERGA LIBRE DE GIBBS.

En una reaccin qumica, se ve favorecido el sentido de la reaccin en el que hay:
a) Una disminucin de la entalpa (H). Es decir, se ve favorecido el sentido exotrmico: liberacin de energa
calorfica relacionada con el nmero y el tipo de enlaces qumicos.
b) Un aumento de la entropa (S). Es decir, se ve favorecido el sentido en el que aumenta el desorden interno.
De ambos factores, H y S, depender que una reaccin qumica sea espontnea o no espontnea. Ambos factores pueden ir en
el mismo sentido o estar contrapuestos, teniendo tres posibles situaciones distintas:
1) Tanto H como S favorables (el primero negativo, el segundo positivo): la reaccin ser espontnea a cualquier
temperatura.
2) Tanto H como S desfavorables (el primero positivo, el segundo negativo): la reaccin ser no espontnea a
cualquier temperatura.
3) Una de las dos variables favorable, la otra desfavorable: el resultado final depende de la magnitud de ambos
(es decir, de cul de estas dos fuerzas impulsoras contrapuestas tiene mayor peso en el resultado final), as como de la
temperatura.
Existe una relacin matemtica entre la entalpa y la entropa, dependiente de la temperatura, que nos sirve para predecir la
espontaneidad o no espontaneidad de una reaccin qumica: la Energa Libre de Gibbs (energa libre, entalpa libre, o G).
La relacin matemtica est dada por la expresin siguiente:
G = H TS
El sentido de la espontaneidad en una reaccin qumica, puede determinarse considerando las variaciones de estos factores entre
reactivos y productos, siempre y cuando la reaccin sea a temperatura constante (se calcula en grados Kelvin):
G (variacin de la Energa Libre) = H TS
Donde el factor de entalpa, H, es la energa total del sistema, y el factor TS es la energa no aprovechable de dicha energa
total, es decir, energa que el sistema no puede utilizar para realizar un trabajo. Por esto, la Energa Libre de Gibbs es la
cantidad de energa aprovechable, transformable en trabajo. Es el factor determinante de la espontaneidad de una reaccin qumica,
ya que representa la energa efectivamente disponible en procesos realizados a presin y temperatura constante.
Si la suma del contenido de Energa Libre de los productos de la reaccin qumica es menor que la suma del contenido
de los reactivos, la reaccin libera Energa Libre de Gibbs: ocurre espontneamente. Es decir, un proceso tiende a
ocurrir espontneamente slo si G es negativa.
Reaccin exergnica libera energa G reaccin espontnea {incremento de la entropa}.
58
Por el contrario, una reaccin qumica cuyo producto posee mayor contenido de Energa Libre que los reactivos, posee
un G positivo: la reaccin debe captar Energa Libre, porque la energa no puede crearse de la nada. Estas reacciones
no ocurren espontneamente. Son reacciones desfavorables termodinmicamente.
Reaccin endergnica capta energa G Reaccin no espontnea {disminucin de la entropa}.
Las molculas ms ordenadas y complejas, las menos entrpicas, poseen un elevado contenido de Energa Libre, lo que adems
las hace ms inestables. Este es el caso de los polmeros: molculas con un elevado grado de orden y complejidad, poseen un
contenido de Energa Libre mayor que el de sus reactivos. Por eso no se forman espontneamente.
ACOPLAMIENTO ENERGTICO.
Una reaccin acoplada es un conjunto de reacciones exergnicas que, a travs de un intermediario compartido, empujan a
una reaccin endergnica la que por s misma, espontneamente, no podra ocurrir-.
Esto debe ocurrir de modo que el proceso sea globalmente exergnico: la suma de todas estas variaciones de energa libre (de
todos los G), debe ser negativa. La entropa siempre triunfa.
Es decir que, para llevar a cabo reacciones termodinmicamente desfavorables reacciones endergnicas que requieren ir en
contra de la entropa-, la clula deber provocar otras reacciones exergnicas: reacciones acopladas.
La reaccin exergnica que generalmente le proporciona energa libre de Gibbs a una reaccin endergnica, es la ruptura de
enlaces fosfoanhdrido entre grupos fosforilo, tales como los que se encuentran en el ATP (adenosina trifosfato), el GTP
(guanosina trifosfato), el CTP (citidina trifosfato) y el UTP (uridina trifosfato) hidrlisis del ATP (GTP, CTP o UTP).
59
La siguiente figura (un diagrama de coordenada de reaccin) ilustra el acoplamiento energtico de dos reacciones
biolgicas: la hidrlisis del ATP (altamente exergnica) y la conversin de glucosa en glucosa 6-fosfato (endergnica), el primer
paso en la ruta de oxidacin de la glucosa.
Las dos reacciones que se muestran, comparten un intermediario comn: el ion fosfato (fosfato inorgnico), que se consume en la
reaccin 1 y se produce en la reaccin 2. Las reacciones pueden, por lo tanto, acoplarse omitiendo el intermediario comn de los
dos lados de la ecuacin.
La reaccin 1 da lugar a un producto con una energa superior a la de

los dos reactivos. En la reaccin 2, la ruptura exergnica del ATP o
hidrlisis del ATP- tiene una variacin de energa libre grande y
negativa. Puesto que la reaccin 3 representa la suma de las otras dos, y
es exergnica, se considera que la reaccin global es espontnea.
Vemos, entonces, que el acoplamiento energtico conecta a las reacciones biolgicas, endergnicas y exergnicas, a travs de un
intermediario compartido.
Ideas clave:
1) Reacciones endergnicas facilitadas por el acoplamiento energtico reacciones exergnicas que proporcionan
la energa necesaria.
2) Reaccin endergnica genera productos de menor entropa Generacin y mantenimiento de orden Menor entropa
equivale a mayor energa libre de Gibbs que la de los reactivos Mayor energa, mayor orden = mayor inestabilidad.
3) Segunda ley de la termodinmica: las reacciones qumicas espontneas (exergnicas) hacen que la entropa del universo
aumente.
4) Los sistemas biolgicos siempre dependen de nuevas reacciones endergnicas para evitar ser presa de la entropa:
sin reacciones endergnicas, no es posible la vida.
60
3.7) Las enzimas catalizan la sntesis frente a la inestabilidad termodinmica- y la degradacin frente
estabilidad cintica-.
Hasta ahora hemos tratado la estabilidad e inestabilidad termodinmica de las macromolculas biolgicas:
Las molculas con mayor estabilidad termodinmica son las de mayor cantidad de entropa,
es decir, las que poseen menor contenido de Energa Libre de Gibbs; menor orden interno.
La estabilidad termodinmica est relacionada con el contenido de Energa Libre de Gibbs, el grado de orden interno, y la
tendencia de todas las cosas a caer en un estado ms entrpico: si una molcula es termodinmicamente inestable, se descompone a
una forma ms estable termodinmicamente ms entrpica-.
Todas las macromolculas biolgicas
son ms inestables termodinmicamente que sus subunidades monomricas.
La estabilidad cintica, por otra parte, est relacionada con la velocidad a la que una sustancia se transforma en otra: la
velocidad a la que estas macromolculas se degradan a formas ms estables termodinmicamente ms entrpicas-.
Pese a que las macromolculas biolgicas son termodinmicamente inestables, se las considera cinticamente estables: su
degradacin no catalizada ocurre tan lentamente en la escala de tiempo aplicable a los organismos en un margen de aos y no de
segundos-, que se puede decir que son molculas estables.
Cmo hacen los organismos para sintetizar macromolculas de elevada inestabilidad termodinmica (para subsistir en base a
reacciones endergnicas)? Es decir, cmo hacen para acoplar energticamente a las reacciones biolgicas?
Y cmo hacen los organismos para degradar macromolculas a velocidades mucho mayores a las determinadas por su
estabilidad cintica?
Cmo es que el metabolismo funciona aparentemente en contra de la estabilidad termodinmica y de la estabilidad cintica?
Todas las reacciones qumicas celulares tienen lugar a una velocidad significativa gracias a la presencia de
biocatalizadores: protenas denominadas enzimas. Los biocatalizadores provocan un gran incremento en la velocidad de las
reacciones qumicas.
En cualquier reaccin sea de sntesis o de degradacin-, debe superarse una barrera energtica denominada barrera de
activacin para que dicha reaccin ocurra. Esta barrera de activacin es un estado de transicin entre reactivos y productos,
en el que existe una distorsin de los enlaces existentes. El estado de transicin posee mayor Energa Libre que los reactivos y los
productos. El punto ms alto en el diagrama de coordenadas de reaccin es la barrera de activacin/estado de transicin.
La diferencia de energa entre el estado de transicin y el estado fundamental de un reactivo se denomina energa de
activacin.
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La energa de activacin necesaria para sobrepasar la barrera de activacin podra obtenerse calentando la mezcla de reaccin,
incrementando as la energa cintica de las molculas, la frecuencia a la que colisionan y la probabilidad con que reaccionarn. No
obstante, esta posibilidad no puede contemplarse en las clulas vivas, que generalmente mantienen constante la temperatura: la
mayora de los componentes celulares (protenas, membranas) se inactivan a temperaturas de tan slo unos pocos grados por
encima de la temperatura interna normal del organismo.
En lugar de ello, las enzimas aceleran las reacciones:
a) Aprovechando los efectos de la fijacin: los reactivos se unen a la superficie de la enzima, cercanos entre s y con
una orientacin estereoespecfica que favorezca la reaccin entre ellos. As, las enzimas proporcionan un entorno
confortable y se incrementa en varios rdenes de magnitud (potencias de diez) la probabilidad de colisiones productivas
entre los reactivos en relacin al proceso no catalizado-.
b) Reduciendo la energa de activacin: en el proceso de unin entre enzima y reactivos, estos ltimos sufren
cambios en la forma que los distorsionan hacia el estado de transicin, y la unin entre la enzima y el estado de
transicin es exergnica libera energa- reduciendo todo esto la energa de activacin de la reaccin.
La relacin entre la energa de activacin y la velocidad de reaccin es exponencial: una pequea disminucin en la Ea da
como resultado un gran incremento en la velocidad de reaccin. Las reacciones catalizadas por enzimas tienen lugar, generalmente,
a velocidades entre 10^10 y 10^14 veces ms rpidas que las no catalizadas.
Los catalizadores metablicos son protenas, salvo contadas excepciones: en pocos casos, las molculas de RNA tienen papeles
catalticos. Por lo general, cada protena enzimtica cataliza una reaccin especfica, y cada reaccin celular est catalizada por una
enzima diferente. Por ende, en cada clula son necesarias miles de enzimas diferentes. Adems, las enzimas no se consumen en el
proceso: una enzima puede actuar de modo repetido en la conversin de molculas de A en B.
La multiplicidad de enzimas, su especificidad (capacidad para discriminar entre diferentes reactivos, denominados sustratos)
y su susceptibilidad a la regulacin, confieren a las clulas la capacidad de disminuir selectivamente las barreras de activacin. Esto
es crucial para la regulacin efectiva de los procesos celulares: las enzimas determinan de qu modo se canalizan la materia y la
energa en las actividades celulares.
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RUTAS METABLICAS.
Las miles de reacciones qumicas catalizadas por enzimas en el interior de las clulas se encuentran organizadas en
secuencias: reacciones consecutivas denominadas rutas, en las que el producto de una reaccin pasa a ser el reactivo de la
siguiente.
Rutas catablicas (degradativas): degradan nutrientes orgnicos transformndolos en productos

finales simples, con el fin de extraer energa qumica y convertirla en una forma til para la clula.
Estas formas tiles son el ATP, el GTP, el CTP, el UTP y los transportadores de electrones reducidos
NADH (nicotinamida adenina dinucletido) y NADPH (nicotinamida adenina dinucletido fosfato).
El NADH y NADPH son cofactores transportadores de electrones. Captan electrones en reacciones
oxidativas y pueden donarlos en una gran variedad de reacciones biosintticas de reduccin: en
procesos que generan ATP y en otros pasos reductores de vas biosintticas.
Rutas anablicas (biosintticas): rutas que parten de pequeas molculas precursoras, a las que
aportan energa, convirtindolas en molculas progresivamente mayores y ms complejas
(protenas, cidos nucleicos, etctera).
El metabolismo celular es esta compleja red de reacciones catalizadas por enzimas. El ATP, el GTP, el CTP y el UTP
(ribonuclesidos trifosfatos) son el principal nexo de unin entre los componentes anablicos y catablicos de esta red.
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3.8) Control global del metabolismo.
El metabolismo est regulado para conseguir equilibrio y economa.
Las clulas no slo sintetizan miles de molculas diferentes de glcidos, lpidos, protenas y cidos nucleicos-, tambin son
capaces de hacerlo en las proporciones precisas que requiere cada situacin: esto se consigue mediante la regulacin de las
enzimas clave de cada ruta metablica.
Cuando se regulan las enzimas clave de una ruta metablica, cada molcula precursora se sintetiza en la cantidad adecuada a
las necesidades reales de la clula. Esta regulacin puede efectuarse regulando la actividad enzimtica o regulando la
sntesis de enzimas.
Ejemplo: la ruta de E. coli que conduce a la sntesis del aminocido isoleucina a partir del precursor treonina. Esta ruta est
constituida por cinco reacciones consecutivas, catalizadas por cinco enzimas diferentes (por ende, incluye cinco precursores). La
isoleucina producto final de la ruta- inhibe la actividad de la primera enzima de la ruta, cuyo sustrato es la treonina. Si una
clula comienza a producir ms isoleucina de la necesaria, la isoleucina se acumula y acaba por inhibir la actividad cataltica de la
primera enzima de la ruta, frenando inmediatamente la produccin de isoleucina: inhibicin por retroalimentacin:
retroalimentacin negativa.
El concepto de ruta discreta constituye una simplificacin: en la clula, miles de intermediarios metablicos forman parte
de ms de una ruta. El metabolismo se representa mejor como una red de rutas interconectadas e interdependientes. En
esta ruta, la variacin de la concentracin de cualquier metabolito da inicio a un efecto en cadena que influye en el flujo de
materiales a travs de otras rutas. Por ende, la inhibicin de la actividad enzimtica de una ruta metablica puede afectar
integralmente a otras rutas metablicas diferentes.
Por ltimo, las clulas tambin regulan la sntesis de sus propios catalizadores: regulacin de la sntesis de enzimas.
As, una clula puede detener la sntesis de una enzima necesaria para producir un compuesto dado, en el caso de que dicho
compuesto se halle en el medio. Estas propiedades de autoajuste y autorregulacin permiten a las clulas mantenerse en un estado
estacionario dinmico a pesar de las fluctuaciones ambientales.
La expresin de los genes y la regulacin de la sntesis de las enzimas son otros niveles de control metablico. Todos ellos
deben ser tenidos en cuenta a la hora de describir el control global del metabolismo.
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4. Fundamentos genticos.
4.1) La continuidad gentica reside en las molculas de DNA.
El DNA es un polmero orgnico largo y delgado, una secuencia lineal de nucletidos ms exactamente, de
desoxirribonucletidos- unidos covalentemente, que incluye mensajes genticos codificados: las instrucciones para formar
todos los dems componentes celulares. Adems, el DNA acta de molde para la produccin de molculas idnticas de DNA que
sern distribuidas a la progenie.
La perpetuacin de una especie biolgica a travs de la progenie exige que su informacin gentica se mantenga estable, se
exprese de forma precisa en forma de productos gnicos, y se reproduzca con un mnimo de errores: la correccin y efectividad en
el almacenaje, la expresin y la reproduccin del mensaje gentico define a las especies individuales y asegura su
continuidad.
Cada polmero lineal de DNA, denominado hebra o cadena, est formado por una secuencia precisa de cuatro tipos de
desoxirribonucletidos distintos: desoxiadenilato (A, formado por la base nitrogenada adenina), desoxiguanilato (G, formado
por la base nitrogenada guanina), desoxicitidilato (C, formado por la base nitrogenada citosina) y desoxitimidilato (T,
formada por la base nitrogenada timina), unidos covalentemente entre s (enlaces covalentes especiales denominados enlaces
fosfodister). Es en esta secuencia lineal (monodimensional) y precisa de subunidades desoxirribonucleotdicas que se encuentra
codificada la informacin gentica.
A su vez, cada uno de los desoxirribonucletidos de una cadena se asocia muy especficamente con otro desoxirribonucletido
complementario de una segunda cadena: A+T; G+C. Estas asociaciones son no covalentes, consistiendo en puentes de hidrgeno.
Como consecuencia de este aparejamiento entre todos los pares de desoxirribonucletidos complementarios, la secuencia de
desoxirribonucletidos de una cadena es complementaria con la secuencia de la cadena opuesta. Las dos cadenas polimricas
complementarias, unidas por muchos puentes de hidrgeno, acaban enrollndose una sobre la otra y forman una molcula de
DNA: la doble hlice de DNA.
Antes de producirse la divisin celular, en la replicacin del DNA: las dos cadenas de DNA se separan y entonces cada una
acta de molde para la sntesis de una nueva cadena complementaria. Esto da lugar a dos molculas de doble hlice idnticas entre
s e idnticas a la molcula de doble hlice original cada una de ellas conformada por una cadena original y una cadena nueva-;
dos molculas de doble hlice producto de la replicacin, una para cada clula hija.
Si una cadena resultara daada, la continuidad de la informacin queda asegurada por la informacin presente en la cadena
complementaria, que actuar de molde para la reparacin de la lesin.
Vemos, entonces, que la replicacin y la reparacin del DNA siempre se llevan a cabo sobre una de las cadenas lineales,
que acta a modo de molde.
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4. Fundamentos genticos.
4.2) La secuencia lineal de DNA codifica protenas con estructuras tridimensionales.
Si bien la informacin gentica est codificada en la secuencia lineal (monodimensional) y precisa de subunidades
desoxirribonucleotdicas, la expresin de esta informacin da como resultado una clula tridimensional. La transicin entre una y
tres dimensiones ocurre en dos fases:
1) La secuencia lineal de desoxirribonucletidos de una cadena de DNA codifica, a travs del RNA, la produccin de una
secuencia lineal correspondiente de aminocidos: una protena.
2) La secuencia lineal de aminocidos se pliega adoptando una estructura tridimensional particular, determinada por
la misma secuencia, y estabilizada principalmente por interacciones no covalentes. El proceso de plegamiento recibe
asistencia de protenas chaperonas: conjunto de protenas presentes en todas las clulas que ayudan al plegamiento
de otras protenas recin formadas. Las protenas chaperonas son asistentes del proceso de plegamiento: lo catalizan
impidiendo vas incorrectas de plegamiento.
La adopcin de una estructura tridimensional precisa, o conformacin nativa, es crucial para la funcin de la protena.
Adems, una vez que la protena adopta su conformacin nativa, puede asociarse de modo no covalente con otras macromolculas:
con cidos nucleicos, lpidos, otras protenas. Estas asociaciones entre macromolculas resultan en complejos supramoleculares
tales como cromosomas, ribosomas, membranas-. Muchas macromolculas se asocian autoensamblan- de esta manera porque
poseen sitios de unin especficos y de alta afinidad.
Para alcanzar su estado nativo, las protenas necesitan adems un entorno adecuado (de pH, fuerza inica, concentracin de
iones metlicos, etctera) que favorezca el plegamiento y el autoensamblaje: el proceso depende de las condiciones ambientales.
Por todo esto puede decirse que la secuencia lineal de DNA (unidimensional) no es capaz de dictar la formacin de una clula
por s sola.
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5. Fundamentos evolutivos.
5.1) Los cambios en las instrucciones hereditarias hacen posible la evolucin.
El alto grado de similitud entre las secuencias gnicas y las vas metablicas de organismos de todos los phyla es un
robusto argumento a favor de la hiptesis de que todos los organismos modernos descienden de un progenitor evolutivo comn a
travs de una larga serie de pequeos cambios: mutaciones que confirieron, en cada caso, ventajas selectivas en nichos ecolgicos
concretos.
A pesar de estas grandes similitudes en las instrucciones hereditarias y de la fidelidad casi perfecta de la replicacin y la
reparacin genticas, ciertos errores que producen variaciones en la secuencia de desoxirribonucletidos del DNA errores
llamados mutaciones- pueden cambiar las instrucciones hereditarias para alguno de los componentes celulares.
Para que estas mutaciones sean transmitidas a la progenie: a) deben ocurrir en las clulas reproductoras, y b) dicho
organismo mutante debe ser capaz de dejar progenie. En el caso que ocurra, las mutaciones suelen ser de todas maneras dainas e
incluso letales para el nuevo organismo (por ej., sntesis de enzimas defectuosas incapaces de catalizar una reaccin metablica
esencial).
Sin embargo, ocasionalmente, una mutacin puede dar lugar a un organismo mejor preparado para sobrevivir a su entorno.
De esta manera, el organismo mutante y su progenie podran verse favorecidos por sobre el organismo no mutante (de tipo
silvestre: wild type), y a veces incluso prosperar mientras que el wild type perece: supervivencia del mejor adaptado en
condiciones de presin selectiva.
Sea como sea, esto ltimo puede no ocurrir en la transicin de una generacin a la siguiente, sino ms bien en lapsos
prolongados: una replicacin defectuosa introduce una segunda copia de un gen entero en el cromosoma, las mutaciones sobre la
copia superflua no seran nocivas, y poco a poco se ira produciendo un nuevo gen con una nueva funcin en base a esta segunda
copia, al mismo que se retienen la copia original y su consecuente funcin original.
Esta cadena de sucesos duplicacin gnica y mutaciones sobre la copia superflua- puede, por ejemplo, generar actividades
enzimticas nuevas: una versin de la enzima original, alterada de modo que puede unirse a un nuevo sustrato.
De esta manera, miles de millones de aos de errores de replicacin y reparacin, variacin gentica y seleccin adaptativa
han conducido al refinamiento de los sistemas celulares, volvindolos ms capaces para obtener el mximo provecho de las
propiedades fsicas y qumicas de los materiales crudos del entorno.
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5.2) La evolucin qumica de las biomolculas.
Hiptesis del origen abitico de las biomolculas orgnicas: Los primeros compuestos orgnicos, entre los que se
incluyen algunas biomolculas bsicas como aminocidos y glcidos, se habran creado como consecuencia de la accin de
poderosas fuerzas atmosfricas radiacin ultravioleta, relmpagos, erupciones volcnicas- sobre
a) los gases existentes en la atmsfera prebitica (NH3, N2, CH4, CO, CO2, H2O, H2), y sobre
b) los compuestos inorgnicos disueltos en respiraderos hidrotrmicos (chimeneas trmicas) de los fondos ocenicos.
Experimentos refinados han demostrado que muchos de los componentes qumicos de las clulas vivas, entre ellos
polipptidos y molculas parecidas al RNA, se pueden formar en estas condiciones.
Con respecto a los polmeros de RNA, pueden actuar tanto como depositarios de la informacin gentica que especifica
la estructura de las enzimas, como a su vez ser catalizadores en ciertas reacciones biolgicas entre ellas, pueden catalizar su
propio proceso de formacin-. Gracias a esta doble capacidad, es posible que el RNA jugara un papel crucial en la evolucin
prebitica: los primeros genes y catalizadores podran haber sido molculas de RNA o precursores relacionados, antecediendo al
DNA y a las protenas.
De acuerdo con la hiptesis del mundo del RNA, una de las primeras etapas de la evolucin biolgica habra sido la
formacin al azar, en la sopa primordial, de molculas cortas de RNA con segmentos al azar. Llegado el momento, una molcula de
RNA habra estado capacitada para catalizar la formacin de otras molculas de RNA con la misma secuencia: aparicin de una
molcula de RNA autorreplicante y autoperpetuante. Es presumible que la fidelidad de la reproduccin fuese mucho menos que
perfecta, de modo que el proceso generara variantes de la molcula de RNA, algunas ms eficientes en su autorreplicacin. En la
competencia por la utilizacin de los nucletidos, las secuencias ms eficientes saldran favorecidas, y las menos eficientes
desapareceran del medio.
A continuacin, algunas de estas molculas de RNA autorreplicante se habran vuelto capaces de catalizar la condensacin de
aminocidos en forma de pptidos especficos. Seguido a esto, un aumento de la importancia de los pptidos en la replicacin del
RNA: acaban volvindose capaces de potenciar las capacidades autorreplicativas del RNA, y el conjunto RNA-pptido podra haber
sufrido variaciones secuenciales que generaran molculas an ms eficientes (coevolucin de RNA y protenas).
Ya desarrollado un sistema primitivo de traduccin con RNA genmico y catalizadores de RNA-protena, el RNA genmico
habra empezado a copiarse en forma de DNA. Las molculas de DNA con secuencias complementarias a las del RNA autorreplicante
acaban por reemplazar a estas ltimas en la funcin de conservar la informacin gentica el DNA es ms estable, mejor depositario
de la informacin hereditaria-, y las molculas de RNA siguen su curso evolutivo para especializarse an ms en la sntesis de
protenas. Las protenas, por su parte, acabaron especializndose como catalizadores verstiles.
As, la divisin de funciones entre el DNA (almacenamiento de la informacin gentica) y las protenas (catlisis) se habra
producido en una etapa considerablemente ms tarda a la de la aparicin del RNA, que cumpla la funcin de primer gen y primer
catalizador.
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5.3) La fuente de energa de las primeras clulas eran los combustibles inorgnicos.
Las primeras clulas aparecieron en una atmsfera reductora (no haba oxgeno, y era fuertemente donante de electrones).
Probablemente obtuvieran energa de combustibles inorgnicos tales como el sulfuro ferroso y el carbonato ferroso, ambos
muy abundantes en la tierra primitiva.
La reaccin anterior proporciona la energa suficiente para promover la sntesis de ATP y compuestos similares.
Posteriormente, estos organismos unicelulares primitivos fueron adquiriendo gradualmente la capacidad de sintetizar, con esta
energa, una cantidad creciente de sus propias molculas precursoras para ser gradualmente menos dependientes de fuentes
externas-.
Un acontecimiento evolutivo muy significativo fue el desarrollo de pigmentos capaces de capturar la energa de la luz solar, y
usarla en la reduccin o fijacin del CO2 para producir compuestos orgnicos ms complejos: la fotosntesis. Es probable que el
donador de electrones original para estos procesos fotosintticos fuera el H2S, que genera azufre elemental o sulfato como
productos secundarios. Posteriormente, otras clulas desarrollaron la capacidad enzimtica de utilizar H2O como donador de
electrones en las reacciones fotosintticas, lo que implicaba la liberacin a la atmsfera de O2 como producto de desecho. Las
cianobacterias son descendientes modernos de estos primitivos productores fotosintticos de oxgeno.
Las clulas primitivas de los primeros estadios de la evolucin biolgica eran anaerbicas. Los quimitrofos anaerbicos
podan oxidar compuestos orgnicos a CO2 sin la necesidad de transferir electrones al O2, sino a aceptores tales como el sulfato,
dando H2S como producto. Pero a causa de la actividad de las bacterias fotosintticas, la atmsfera fue enriquecida
progresivamente con oxgeno molecular, un poderoso oxidante y un veneno mortal para los organismos anaerbicos. Respondiendo
a la presin evolutiva de lo que Lynn Margulis y Dorion Sagan han llamado el holocausto del oxgeno, algunos linajes de
microorganismos dieron lugar a los aerobios, que obtenan su energa mediante el transporte de electrones desde molculas de
combustible hacia el O2. Esta transferencia de electrones se caracteriza por desprender mucha energa, razn por la cual los
aerbicos se impusieron sobre los anaerbicos.
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5.4) La anatoma molecular revela relaciones evolutivas.
Con el creciente y enormemente rico repertorio de datos sobre la anatoma molecular de las clulas es posible analizar las
relaciones evolutivas y refinar la teora de la evolucin.
Ej.: En base a las secuencias de genomas es posible llevar a cabo comparaciones detalladas y cuantitativas entre especies.
Hasta ahora, la filogenia molecular derivada de las secuencias gnicas es consistente con la filogenia clsica basada en estructuras
macroscpicas, y en muchos casos ms precisa.
La unidad de la vida a nivel molecular es evidente a pesar de la continua divergencia de los organismos a nivel anatmico: las
estructuras y los mecanismos moleculares son marcadamente similares. Es a nivel de las secuencias donde estas similitudes se
aprecian mejor:
Cuando dos genes comparten secuencias muy similares, se dice que sus secuencias son homlogas y que las protenas que
codifican son homlogas.
Si una misma especie contiene dos genes homlogos, estos dos genes y sus productos proteicos se denominan parlogos. Se
piensa que los genes parlogos han aparecido por duplicacin gnica seguida de cambios graduales en las secuencias de cada una
de las dos copias. Generalmente, las protenas parlogas son similares no nicamente en secuencia sino tambin en estructura
tridimensional, aunque es habitual que hayan adquirido funciones diferentes a lo largo de su evolucin.
Dos genes o protenas- homlogos de especies diferentes se denominan ortlogos. Los ortlogos suelen tener la misma
funcin en ambos organismos. Cuando se encuentra que una secuencia gnica recin secuenciada es altamente ortloga con un gen
de otra especie, se supone que el gen codifica una protena con la misma funcin en las dos especies. De este modo, resulta posible
deducir la funcin de los productos gnicos a partir de la secuencia genmica, sin necesidad de caracterizacin bioqumica del
producto gnico.
Un genoma anotado contiene, adems de la secuencia del DNA, una descripcin de la funcin probable de cada producto
gnico, deducida a partir de comparaciones con otras secuencias genmicas con funciones proteicas establecidas. As, pueden
identificarse las rutas conjuntos de enzimas- codificadas en un genoma, y esto permite deducir directamente las capacidades
metablicas de un organismo.
Las diferencias secuenciales (variabilidad secuencial) entre genes homlogos pueden utilizarse para medir el grado
de divergencia evolutiva que presentan dos especies, es decir, el tiempo transcurrido desde que su precursor evolutivo comn
dio lugar a dos lneas con diferente camino evolutivo. A mayor cantidad de diferencias secuenciales, mayor tiempo transcurrido
desde la divergencia. Estas distancias evolutivas entre especies pueden representarse en un rbol evolutivo.
A lo largo de la evolucin van apareciendo nuevas estructuras, procesos o mecanismos reguladores que reflejan los cambios
en los genomas. El genoma de un eucariota simple tal como la levadura debera poseer genes relacionados con la formacin de la
membrana nuclear, no presentes en los procariotas. A su vez, este gen es ortlogo en la totalidad de los eucariotas, pudiendo
encontrare algn grado de divergencia evolutiva.
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5.5) Genmica funcional: correspondencia entre genes y procesos celulares especficos.
Secuenciado el genoma y asignadas las funciones a cada uno de los genes, estos genes pueden agruparse de acuerdo con los
procesos en los que intervienen (sntesis del DNA, sntesis proteica, sntesis de ATP) y deducir qu fraccin del genoma est
dedicada a cada una de las actividades celulares.
Ej.: En los genomas de E. coli, A. thaliana y H. sapiens, el mayor conjunto de genes es el de funcin desconocida: estos
conjuntos representan ms del 40% en cada una de esas tres especies. Los transportadores de iones y pequeas molculas a travs
de las membranas plasmticas tambin suponen una importante proporcin de genes: el 10% de los ~4.400 genes de E. coli; el
~8% de los ~32.000 genes de A. thaliana; el ~4% de los ~29.000 genes de H. sapiens. Los genes que codifican el RNA y las
protenas necesarias para la sntesis proteica representan entre el 3% y el 4% del genoma de E. coli, pero en las clulas ms
complejas de A. thaliana son necesarios ms genes para dirigir a las protenas a su localizacin celular final que para la propia
sntesis proteica (aproximadamente el 6% y el 2% del genoma, respectivamente).
En general, cuanto ms complejo es el organismo, mayor es la proporcin de su genoma implicada en la regulacin de
procesos celulares, y menor la proporcin dedicada a los procesos bsicos como la generacin de ATP y la sntesis de protenas-.
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6. Glosario I.
Entalpa (H): contenido calrico de un sistema.
Variacin de entalpa (deltaH): para una reaccin es aproximadamente igual a la diferencia entre la energa utilizada
para romper unos enlaces y la energa ganada en la formacin de otros nuevos.
Energa de enlace: energa requerida para romper un enlace.
Reaccin endotrmica: reaccin qumica que absorbe calor (deltaH positiva).
Reaccin exotrmica: reaccin qumica que desprende calor (deltaH negativa).
Entropa (S): cantidad de desorden de un sistema.
Equilibrio: estado de un sistema en el que no se produce ms variacin neta; los reactivos se convierten en productos
a la misma velocidad que los productos en reactivos. La energa libre se encuentra en un mnimo.
Energa libre (G): componente de la energa total de un sistema que puede realizar trabajo a temperatura y presin
constantes.
Variacin de energa libre (deltaG): cantidad de energa libre desprendida (deltaG negativa) o absorbida (deltaG
positiva) en una reaccin a temperatura y presin constantes.
Variacin de energa libre estndar (deltaGestndar): variacin de energa libre de una reaccin que tiene lugar en
condiciones estndar: temperatura 298 K; presin 1 atm (o 101,3 kPa); todos los solutos a concentracin 1M.
DeltaGestandar denota la variacin de energa libre estndar a pH 7,0 en agua 55,5M.
Reaccin endergnica: reaccin qumica que consume energa libre (para la cual deltaG es positiva).
Reaccin exergnica: reaccin qumica que transcurre con la liberacin de energa libre (para la cual deltaG es
negativa).
Energa de activacin: tambin llamada energa libre de activacin. Cantidad de energa (en julios) necesaria para
convertir todas las molculas en 1 mol de una sustancia reaccionante desde el basal al estado de transicin.
Catlisis: la aceleracin de la tasa de una reaccin qumica mediante una sustancia, llamada catalizador.
Enzima (catalizador): biomolcula protena o RNA- que cataliza una reaccin qumica especfica, y no es modificado
por la reaccin permanece inalterado-, lo que lo diferencia de un reactivo-. Un error comn es creer que la reaccin
no se dara sin la presencia del catalizador; un catalizador solamente acelera una reaccin termodinmicamente
favorable. Un catalizador no puede hacer que ocurra una reaccin termodinmicamente desfavorable: no afecta al
equilibrio de la reaccin catalizada, slo aumenta la velocidad de reaccin proporcionando una ruta de reaccin con
una energa de activacin inferior. Es lo contrario a un inhibidor: sustancia que desactiva una catlisis.
Reacciones acopladas: dos reacciones qumicas que tienen un intermediario comn y, por lo tanto, un medio de
transferencia de energa de una a otra.
Metabolismo: conjunto completo de transformaciones catalizadas por enzimas, de molculas orgnicas en las clulas
vivas; suma del anabolismo y catabolismo.
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Catabolismo: fase del metabolismo intermediario relativa a la degradacin de molculas de nutrientes que producen
energa.
Anabolismo: fase del metabolismo intermediario que se ocupa de la biosntesis dependiente de energa de los
componentes celulares a partir de precursores ms pequeos.
Metabolismo basal: velocidad de consumo de oxgeno por el cuerpo de un animal en completo reposo, y mucho
tiempo despus de una comida.
Metabolismo intermediario: en las clulas, las reacciones catalizadas enzimticamente que extraen energa qumica a
partir de molculas nutrientes, utilizndola para sintetizar y unir componentes celulares.
Metabolismo secundario: rutas que conducen a productos especializados que no se encuentran en todas las clulas
vivas.
Metabolito: intermediario qumico en las reacciones del metabolismo catalizadas por enzimas.
Metaboloma: conjunto completo de metabolitos de pequeo tamao (intermediarios metablicos, seales,
metabolitos secundarios) presentes en una clula o tejidos determinados en condiciones especficas.
Genoma: toda la informacin gentica en forma codificada contenida en una clula o virus.
Mutacin: cambio heredable en la secuencia nucleotdica de un cromosoma.
Estereoismeros: compuestos que tienen la misma composicin y el mismo orden de conexiones atmicas, pero
diferentes ordenamientos moleculares.
Configuracin: ordenamiento espacial de una molcula orgnica, que le viene dado por la presencia de (1) dobles
enlaces alrededor de los cuales no existe libertad de giro, o (2) centros quirales, alrededor de los cuales los grupos
sustituyentes estn dispuestos en una secuencia especfica. Los ismeros configuracionales no se pueden
interconvertir sin la ruptura de uno o ms enlaces covalentes.
Compuesto quiral: compuesto que contiene un centro asimtrico (tomo quiral o centro quiral), por lo que puede
existir en dos formas especulares no superponibles (enantimeros).
Centro quiral: tomo con sustituyentes dispuestos de manera que la molcula no se puede superponer con su imagen
especular.
Conformacin: ordenamiento espacial de grupos sustituyentes que tienen libertad para adoptar posiciones diferentes
en el espacio, sin ruptura de enlaces debido a la libertad de rotacin de enlace.
Conformacin nativa (estado nativo): conformacin biolgicamente activa de una macromolcula, es decir, su
estructura tridimensional precisa, determinada por la secuencia de subunidades monomricas y estabilizada por
interacciones no covalentes.
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TCNICAS Y HERRAMIENTAS
BIOQUMICAS
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La citometra de flujo hace un recuento y

clasifica distintos tipos de clulas.
1. Tcnicas de Purificacin.
1.1) Purificacin de las clulas y de sus partes: CITOMETRA DE FLUJO.
La citometra (medicin celular) es el anlisis de las caractersticas de las clulas, ya sea mediante inspeccin al microscopio,
como midiendo de manera automatizada las propiedades de las clulas.
La citometra de flujo es, en cambio, una tcnica biofsica especfica de anlisis celular. Est basada en el uso de luz lser
para el recuento y la clasificacin de clulas. Esta clasificacin de las clulas puede ser, por ejemplo, segn sus caractersticas
morfolgicas o segn la presencia de biomarcadores.
Por qu se usa la citometra de flujo? Si bien algunos tipos celulares difieren en densidad lo suficiente como para ser
separados de acuerdo a esta propiedad fsica (por ejemplo, los leucocitos y los eritrocitos tienen densidades muy distintas debido a
que los eritrocitos carecen de ncleo: por eso, estos tipos celulares pueden ser separados por centrifugacin en equilibrio de
densidad otro tipo de purificacin que tratar ms adelante-), la mayora de los tipos celulares no pueden ser diferenciados con
tanta facilidad. Por eso, para separarlos, pueden usarse otras tcnicas biofsicas como la citometra de flujo.
La citometra de flujo identifica diferentes tipos celulares mediante la medicin de la luz que dispersan y la fluorescencia
que emiten a medida que fluyen a travs de un rayo lser. As, se pueden diferenciar diferentes tipos de clulas en una mezcla, y
hacer un recuento de la cantidad de clulas en la suspensin.
Entonces: es una tcnica de anlisis celular biofsico
en la que se miden las caractersticas de dispersin de luz y emisin fluorescente de clulas
conforme pasan a travs de un rayo de luz.
Para el anlisis por citometra de flujo, las clulas deben encontrarse suspendidas en un fluido. Al atravesar el rayo de luz, las
clulas interactan con ste, causando dispersin de la luz. Las clulas pueden hacerse pasar a muy altas velocidades (pueden llegar
a alcanzar velocidades cercanas a 100.000 clulas por segundo).
Especficamente: las clulas suspendidas en el fluido atraviesan un finsimo tubo transparente sobre el que incide un
delgado rayo de luz lser. La luz transmitida y dispersada por el pasaje de las clulas a travs del tubo, se recoge por medio de unos
dispositivos de deteccin, permitiendo hacer inferencias en cuanto a tamao y complejidad de clulas.
Basndose en la difraccin de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamao de las clulas: parmetro
denominado Forward Scatter. Se trata de luz dispersada hacia adelante, a 0 gados.
Al medir la reflexin de la luz de manera lateral, se evala la granularidad o la complejidad celular (estructura interna,
complejidad citoplasmtica): parmetro denominado Side Scatter. En este caso, la luz es dispersada a 90 grados del eje del haz
lumnico.
La tcnica tambin permite el anlisis multiparamtrico simultneo de otras caractersticas fsicas y qumicas, evaluando
en promedio ms de dos mil partculas por segundo.
La citometra de flujo es una tcnica rutinaria para el diagnstico y seguimiento de muchas enfermedades, tales como
leucemias, granulomatosis crnica, y SIDA. Sus usos han ido desde el contaje celular, frmula leucocitaria, contaje reticulocitario,
85
anlisis de mdula sea, estudios de cintica celular, estudios de subpoblaciones linfocitarias, tipaje tisular, estimulacin
linfocitaria, diagnstico/pronstico de procesos neoplsicos, monitorizar tratamiento en oncologa, hasta para diagnstico
bacteriano y vrico, sensibilidad a antibiticos, cariotipo, diagnstico de portador, diagnstico prenatal.
Tiene, adems, muchas otras aplicaciones en investigacin bsica, prctica y ensayos clnicos. Por ejemplo, una variante
comn de esta tcnica es la separacin de partculas segn sus propiedades fsicas, que puede emplearse para purificar poblaciones
de inters.
Analysis of a marine sample of photosyntetic picoplankton by flow cytometry

showing three different populations (Prochlorococcus, Synechococcus and picoeukaryotes).
Anlisis de una muestra de agua marina conteniendo picoplancton fotosinttico por medio de
citometra de flujo mostrando tres poblaciones diferentes (Prochlorococcus, Synechococcus, y picoeucariotas).
Daniel Vaulot, CNRS, Station Biologique de Roscoff.
Flow Cytometry Animation: https://www.youtube.com/watch?v=2P7YsJ0Zkio
86
FACS: un instrumento basado en la citometra de flujo.

Si la suspensin celular se coloca en presencia de anticuerpos monoclonales (mAB) marcados con molculas fluorescentes, se
puede determinar qu clulas poseen los antgenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados. Es decir, los
anticuerpos especficos, marcados, se unen a los antgenos de clulas diana y (emiten fluorescencia) ayudan a dar informacin
respecto a las caractersticas especficas de dichas clulas. Adems, sigue siendo posible medir la dispersin lumnica.
El uso de distintas molculas fluorescentes distintos colores de fluorescencia- permite analizar la presencia de varios
marcadores de manera simultnea. Esto tiene grandes aplicaciones en medicina (hematologa, inmunologa de tumores y
quimioterapia, gentica, seleccin de esperma en IVF, etctera).
Si el anlisis incluye esta deteccin de fluorescencia, hablamos estrictamente de citofluormetros de flujo (conocidos
como FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorter: Clasificador Celular Activado por Fluorescencia). Es decir, el FACS es un instrumento
basado en la citometra de flujo, que puede seleccionar una clula a partir de cientos de otras.
Ejemplo: si un anticuerpo especfico para una cierta molcula antgeno- de la superficie celular est unido a este
colorante fluorescente, cualquier clula que tenga ese antgeno fijar el anticuerpo y luego podr ser separada cuando fluorezca en
el FACS. Una vez separado este tipo celular, puede cultivarse.
Ejemplo: el procedimiento FACS se utiliza para purificar diferentes tipos de glbulos blancos, cada uno de los cuales
lleva en su superficie una o ms molculas distintivas. Se unen los anticuerpos monoclonales especficos para esa o esas protenas.
Por ejemplo, slo las clulas T del sistema inmune tienen tanto la protena CD3 como la Thy 1,2 en su superficie. Marcar estas
protenas de superficie nos permite aislar clulas T con facilidad, separarlas de otros tipos de clulas sanguneas o clulas del bazo.
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El FACS puede, entonces, hacer mediciones simultneas de luz dispersada (lo que permite inferir, por ejemplo, el tamao
celular) y de cantidad de fluorescencia emitida, por ejemplo, por un colorante unido a DNA o RNA, para determinar la cantidad de
cido nucleico o ribonucleico que contiene la clula.
En una variacin del uso de la citofluorimetra de flujo, pequeas esferas o cuentas magnticas son recubiertas con
anticuerpos monoclonales especficos para una protena de superficie. Slo las clulas con estas protenas se pegarn a las esferas.
Las clulas podrn recuperarse de la preparacin mediante adhesin a pequeos magnetos en los lados del tubo de ensayo.
Fluorescence Animation: https://www.youtube.com/watch?v=pFtO0xxJL9s

Fluorescence-activated cell sorting (FACS): https://www.youtube.com/watch?v=TDRhCWaYRsg&spfreload=1
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ANEXO. Introducindonos un
poco ms en la CMF.
Introduccin a la citometra de flujo.

Historia y principios.
El primer citmetro de flujo, basado en el principio Coulter, fue descrito en 1953 por Wallace H. Coulter. Mack Fulwyler
inventa el precursor de los citmetros de flujo actuales, es decir, de los usados para separar clulas.
El primer dispositivo de citometra de flujo basado en fluorescencia (ICP 11) es desarrollado en 1968 por Wolfgang
Ghde, Universidad de Mnster. Es comercializado por primera vez en los aos 1968 y 1969 por la empresa alemana Partec,
encargada del desarrollo y produccin a travs de Phywe AG en Gttingen. En aquel momento, los mtodos de absorcin
electromagntica tenan el respaldo de la comunidad cientfica por sobre los mtodos fluorescentes. Poco despus comienza el
desarrollo comercial de los citmetros de flujo, incluyendo el citofluorgrafo (1971) de la empresa Bio/Physics Systems Inc., el PAS
8000 (1973) de la empresa Partec, y el primer dispositivo FACS de Becton Dickinson (1974), el ICP 22 (1975) de Partec/Phywe y el
Epics de la Coulter Corporation en el 77/78.
El nombre original de la citometra de flujo era citofotometra de pulso (Impulszytophotometrie). Recin en la 5ta
Conferencia sobre Citometra Automatizada de la American Engineering Foundation realizada en Pensacola, Florida en 1976, se
acord utilizar el nombre de citometra de flujo, trmino que gan popularidad rpidamente.
Como puede verse, la tcnica de la CMF fue desarrollada en la dcada de los aos sesenta como un avance importante en
investigacin de la biologa celular.
Un CMF es un aparato capaz de medir componentes y propiedades celulares (partculas biolgicas) que fluyen en
suspensin. Es necesario disponer de una suspensin de clulas o partculas individuales. Como vimos, las clulas o partculas
tambin pueden ser marcadas con colorantes fluorescentes que se excitan con una fuente luminosa de alta energa.
La suspensin celular convenientemente procesada y teida, se inyecta en la cmara de flujo del citmetro, que est
hidrodinmicamente enfocada para que las clulas pasen individualmente, una detrs de la otra, a travs de un punto en el que
estas interactan fsicamente con un haz de luz monocromtica, dispersando la luz en todas direcciones.
La excitacin de los fluorcromos ocurre en el punto de interaccin de la clula con el haz lumnico, dando como
resultado la emisin de una luz de longitud de onda superior a la incidente. Esta luz es recogida entonces a 90 grados, siendo
dirigida mediante espejos dicroicos adecuados a detectores fotomultiplicadores. Las seales elctricas analgicas son convertidas en
seales digitales y son procesadas por un ordenador, con el fin de generar histogramas correlacionados con los parmetros
deseados y efectuar el anlisis de los mismos.
Ventajas de CMF frente a otros mtodos que emplean fluorcromos: elevada sensibilidad y sensibilidad de anlisis,
posibilidad de realizar mediciones simultneas sobre una sola clula, y separacin celular en sorters (desarrollado posteriormente).
Desventajas y limitaciones: costes de instrumentacin e incapacidad de visualizar las clulas que estamos analizando.
Procedimiento.
Un rayo de luz monocromtico, usualmente de luz lser, es dirigido hacia un finsimo chorro de lquido
hidrodinmicamente enfocado. Se colocan una serie de detectores en el punto en el que el chorro de lquido atraviesa el rayo de
luz. Uno se coloca en lnea con el rayo de luz (a este detector se lo conoce como FSC, por Forward Scatter o detector de Dispersin
Frontal). Otros varios, angularmente a la trayectoria del rayo (a estos se los conoce como SSC, por Side Scatter, o detectores de
Dispersin Lateral). Adems, se colocan uno o ms detectores de fluorescencia.
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Cada una de las partculas suspendidas con un tamao de entre 0,2 a 150 micrmetros- que atraviesan el rayo de luz,
lo dispersan, y las sustancias qumicas fluorescentes que se encuentran dentro o adheridas a la partculas son excitadas hasta emitir
luz a una longitud de onda mayor que la de la fuente de luz. Esta combinacin de luz dispersada y fluorescencia es
recogida por los detectores, y por medio de un anlisis en la fluctuacin de la intensidad luminosa recogida por cada detector, es
posible derivar varios tipos de informacin acerca de la estructura fsica y qumica de cada partcula individual.
El detector frontal o FSC brinda informacin acerca del volumen de la partcula, mientras que los detectores laterales o
SSC brindan informacin acerca de la complejidad interna de la misma (por ejemplo la forma del ncleo celular, la cantidad y tipo
de grnulos citoplasmticos o la rugosidad de la membrana plasmtica). Esto es debido a que los componentes internos de las
clulas dispersan la luz.
Algunos de los citmetros de flujo presentes en el mercado han eliminado la necesidad de un detector de fluorescencia y
utilizan tan slo la informacin de luz dispersada para las mediciones. Otros citmetros de flujo son capaces de generar grficos de
los datos obtenidos de la fluorescencia de las clulas, luz dispersada y luz transmitida.
Esquema de disposicin de elementos en un citmetro de flujo. Una fuente emisora de luz monocromtica, usualmente un haz de
luz lser (A) enva un rayo que es colimado (L1) y enfocado (L2) por medio de lentes sobre la cmara de flujo laminar (C), luego de
atravesar la cmara el rayo de luz directa es detenido por una pantalla (s), mientras que la luz dispersada es enfocada por otra lente
(L3) sobre un fotodiodo (D1), esto constituye el detector de dispersin frontal (FSC). La luz dispersada lateralmente y la fluorescencia
se enfocan por medio de una lente sobre un espejo dicroico (M) que refleja la mayor parte de la luz de igual longitud de onda a la
producida por la fuente (A), atraviesa un filtro (F1) e incide sobre un detector. Esto constituye el sistema de deteccin de dispersin
lateral (SSC). La luz que no es reflejada por el espejo dicroico, ya que tiene una longitud de onda diferente a la emitida, lo atraviesa
e incide sobre un filtro interferencial (F2) que puede ser ajustado para una determinada longitud de onda, discriminando as entre
diferentes fluorforos, para finalmente incidir sobre un tubo fotomultiplicador (D3), esto constituye el detector lateral de
fluorescencia (SFL).
90
Un citmetro de flujo es, en cierta forma, similar a un microscopio; salvo que, en vez de producir imgenes de las
clulas, los citmetros de flujo ofrecen una cuantificacin automtica de altsima calidad de una serie de parmetros.
Un CMF tiene cinco componentes principales:
La celda de flujo laminar, donde el lquido circulando en rgimen de flujo laminar acarrea y pone en lnea a las clulas de modo
que pasen a travs del rayo de luz de a una y en fila.
Un sistema de medicin, los ms comnmente utilizados son la medicin de la impedancia o conductividad (principio Coulter) y
los sistemas pticos.
Un sistema de iluminacin formado ya sea por lmparas de alta luminosidad (de mercurio, xenn) lseres de alta potencia
refrigerados por agua (de argn, de criptn, de tinturas), lseres de baja potencia refrigerados por aire (de argn 488 nm), lser
rojo de helio-nen ( 633 nm), verde de helio-nen, ultravioleta de helio-cadmio; lseres de diodo de baja potencia (azul, verde,
rojo, violeta).
Un detector y un conversor de seales ADC (anlogo a digital), los cuales registran la seal producida (sea FSC, SSC, SFL) y la
convierten en una seal elctrica que puede ser procesada por un computador.
Un sistema de amplificacin, lineal o logartmico.
Un ordenador para el anlisis de las seales.
El proceso de recoleccin de datos es conocido como adquisicin. La adquisicin es mediada por un software presente
en el ordenador fsicamente conectado al CMF. Este software es capaz de ajustar varios parmetros de la medicin, tales como
voltaje, compensacin, etctera, para cada una de las muestras analizadas. Adems se encarga de asistir a la presentacin inicial de
informacin de la muestra mientras se realiza la adquisicin de los datos para asegurar que los parmetros han sido correctamente
ajustados.
Los instrumentos modernos en general poseen mltiples lseres y detectores. El rcord actual para un instrumento
comercial es de cuatro lseres y 18 detectores de fluorescencia. Al aumentar el nmero de lseres y detectores, es posible aumentar
la cantidad de anticuerpos fluorescentes marcadores, y se hace posible identificar con mayor precisin la poblacin de inters a
travs de sus marcadores fenotpicos. Algunos instrumentos pueden, incluso, tomar fotografas digitales de cada clula, permitiendo
analizar si la seal fluorescente se produce dentro de ella o en su superficie.
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92
Citmetros de flujo sorters.
Los conocidos como citmetros de flujo separadores o sorters tambin pueden purificar poblaciones con
determinadas caractersticas (por ejemplo, pueden separar los linfocitos T CD4+ de los CD8+) a medida que fluyen por uno o ms
mecanismos detectores. La separacin resulta en distintas fracciones finales, a la vez que los mecanismos detectores realizan un
conteo del nmero de clulas presentes en la muestra.
Es decir, la aplicacin general de los sorters es
la separacin de subpoblaciones definidas, por anlisis citomtrico.
Tiene menor potencia que otras tcnicas de separacin masiva (como la centrifugacin) pero, de igual manera que en los
casos anteriores, realiza separaciones que las tcnicas de separacin masiva no consiguen.
Existen, adems, diferentes tipos de citmetros de flujo sorters:
Sorters neumticos: emplean jeringas, energa acstica, etctera, para desviar
el flujo lquido durante algunos milisegundos y, con ste, la clula seleccionada.
Son sistemas cerrados: seguros en cuando a contaminacin y evaporacin.
Relativamente simples, baratos, adaptables.
En contraposicin, su velocidad es muy baja.
Sorters de deflexin electrosttica: el primero fue descrito por Fulwyler
(1965). Bonner (1972) fue el primero en aplicar el sorter en funcin de seales
fluorescentes.
El transductor para la formacin de gotas es un cristal piezoelctrico acoplado
al vibrador: la energa que se usa es muy baja y no causa dao celular. El proceso de la ruptura del flujo es funcin de la velocidad de oscilacin y del dimetro del orificio del sorter. Debe existir un dispositivo para visualizar la formacin
de las gotas (cmara estroboscpica), compensacin de carga de las gotas,
detector de coincidencias y abortador de sorter.
Son complejos. Necesitan de un gran soporte tecnolgico e informtico.
Funcionan de modo similar a impresoras de chorro de tinta.
Son los ms empleados.
Sorters de alta velocidad: pueden reducir de 5 a 8 veces el tiempo necesario de sorter. Un sorter
convencional produce 20-40.000 gotas/segundo, y procesa alrededor de 2-3.000 partculas/segundo. Los
sorters de alta velocidad producen 200.000 gotas/segundo, y se pueden procesar 16.000 partculas cada
segundo. Esto produce un descenso en la eficiencia.
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El aumento de la velocidad se consigue disminuyendo el dimetro del orificio del sorter, aumentando la
frecuencia de vibracin (220 Hz) y la velocidad del flujo (50 metros/segundo). Esta situacin, en las cmaras
de flujo convencionales, conducira a la prdida del flujo laminar. Pero en este tipo de sorter, el flujo laminar
se mantiene con diseos especiales de las cmaras, y con trayectos de alineamiento e interaccin luz-clula
muy cortos.
Hay funciones especiales de sorter, como el sorter indexado. Una alternativa al sorter por citometra convencional es la separacin
magntica.
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BIBLIOGRAFA.
No se utiliz el Principios de Bioqumica de Lehninger.
1. Biologa Celular y Molecular. Lodish, Berk, Matsudaira, Kaiser, Krieger, Scott, Zipursky, Darnell. 5ta edicin.
http://books.google.com.ar/books?id=YdyMSxY2LjMC&pg=PA181&lpg=PA181&dq=fraccionamiento+celular&source=bl&ots=
tEMjemr-Yq&sig=uo81VAYsAvKqStvouUkctZqaz4A&hl=es419&sa=X&ei=F4WEVI6CEOO1sQTYjYKQCQ&ved=0CDUQ6AEwBTgK#v=onepage&q=fraccionamiento%20celular&f=false
2. Servicio de citometra de flujo. Universitat de Lleida.
http://web.udl.es/dept/medicina/sedaicmf/sedai/intro.htm
3. Citometra de flujo y srter. Centro Pfizer, Universidad de Granada, Junta de Andaluca de Genmica e Investigacin
Oncolgica.
http://www.genyo.es/content/unidad-citometria
4. Wikipedia, por supuesto. La mayor red de conocimiento open-source.
95
96
1. Tcnicas de Purificacin.
1.2) Purificacin de las clulas y de sus partes: FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR.
En lo que constituy un importante avance bioqumico, Albert Claude, Christian de Duve y George Palade desarrollaron
el mtodo de fraccionamiento celular de tejidos: un conjunto de mtodos y tcnicas que tienen como objetivo obtener
fracciones puras o enriquecidas de un determinado componente celular.
Es decir, su objetivo es la purificacin la separacin individualizada, el aislamiento - de orgnulos citoslicos,
fracciones de membrana, complejos multiproteicos y otras biomolculas, en funcin de sus propiedades biofsicas.
Mediante el fraccionamiento celular,
se consiguen conjuntos homogneos de orgnulos o biomolculas
a partir de una poblacin heterognea de clulas.
El paso inicial en la purificacin de estructuras subcelulares es romper la membrana plasmtica y, si est presente, la
pared celular. Posteriormente, la suspensin puede filtrarse. Al final, se procede a centrifugar para purificar. A continuacin
desarrollo estas tres etapas, siendo las ms importantes la primera y la tercera:
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I. DISGREGACIN, RUPTURA u HOMOGENEIZACIN.

La homogeneizacin es el acto de disgregar los tejidos en las clulas que los componen, y luego realizar la lisis de las clulas
(disrupcin celular): romper las envolturas celulares para que los orgnulos emerjan.
La homogeneizacin rompe la membrana plasmtica pero respeta la integridad de la mayora de los orgnulos y biomolculas.
La homogeneizacin da como resultado un lisado celular o tisular (denominado homogenado): una mezcla de todos los
constituyentes celulares. Estos constituyentes podrn ser separados en fracciones mediante centrifugacin.
Los tejidos deben prepararse para la homogeneizacin. Primero, deben ser suspendidos en un medio apropiado.
Este medio debe ser una solucin de un pH y un contenido salino adecuados: una solucin salina buffereada.
Para regular el pH se usa un buffer (solucin tampn, solucin amortiguadora, solucin
reguladora). Un buffer es la mezcla de un cido dbil y su base conjugada, es decir, sales hidrolticamente
activas. Tienen la propiedad de mantener estable el pH de una disolucin frente a la adicin de cantidades
relativamente pequeas de cidos o bases fuertes.
Esto es importante, ya que un leve cambio en la concentracin de hidrogeniones (H+) en la clula puede
producir un paro en la actividad enzimtica: los organismos vivos soportan muy mal las variaciones del pH,
aunque se trate tan solo de unas dcimas de unidad; por ello han desarrollado sistemas tampn o buffer que
mantienen el pH constante, mediante mecanismos homeostticos (de intercambio de materia y energa con el
entorno). Las variaciones del pH afectan a la estabilidad de las protenas y, en concreto, a la actividad cataltica
de las enzimas, pues en funcin del pH se pueden generar cargas elctricas que modifiquen la actividad
biolgica.
Cada sistema buffer tiene su propio rango efectivo de pH, el cul depender de la constante de equilibrio del
cido o de la base que se emplee. Esta constante de equilibrio es un valor que nos dice hacia dnde se
desplaza el equilibrio en una reaccin, y su empleo es fundamental en la qumica biolgica, razn por la cual
ser tratada con ms detalle posteriormente.
El medio debe ser una solucin con un contenido salino adecuado: un medio isotnico con respecto al
interior celular, es decir, con una concentracin de solutos igual a la existente en el interior de la clula. As
se mantienen las condiciones osmticas y se evita que los orgnulos se contraigan o estallen.
Un medio isotnico debe tener una presin osmtica similar a la de los orgnulos, equilibrando o balanceando
la difusin de agua hacia afuera y hacia el interior de los orgnulos, que se hincharan o romperan en una
disolucin de menor osmolaridad. Un medio isotnico, entonces, previene efectos osmticos y, en este caso,
preserva la integridad estructural de los orgnulos.
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Para esto suele usarse sacarosa isotnica (0,25 M). El medio de sacarosa tiene una presin osmtica muy similar a la de
los orgnulos, equilibrando la difusin de agua hacia fuera y hacia el interior de estos. Pero la sacarosa interfiere con ciertos
ensayos enzimticos: puede ser reemplazada por manitol, sorbitol (polialcoholes de idntica frmula molecular pero diferente
frmula estructural) o por una combinacin de sales similares en composicin a las que se encuentran en el interior de la clula.
Efecto de la osmolaridad extracelular sobre el movimiento del
agua a travs de una membrana plasmtica. Cuando una clula
en equilibrio osmtico con el medio (esto es, un medio
isotnico) (a) se transfiere a un medio hipertnico (b) o
hipotnico (c), el agua fluye a travs de la membrana
plasmtica en la direccin que tiende a igualar la osmolaridad
dentro y fuera de la clula.
El diisopropilfluorofosfato (DFP) es un inhibidor irreversible de las sern-proteasas. Este tipo de enzima, la sern-proteasa,
hidroliza el enlace fsforo-flor del DFP, pero el residuo de fosfato se mantiene unido a la enzima en su centro activo, inactivndola.
Si se quiere determinar la actividad de enzimas que necesitan mantener sus grupos sulfhidrilos en estado reducido, deben
agregarse 2-mercaptoetanol (BME, 2BME, ME, ME) o ditiotreitol (TDT) al medio de homogeneizacin. Debe tomarse en cuenta,
de todas formas, que algunas protenas son desnaturalizadas por el ME y el TDT, ya que reducen puentes disulfuro, afectando a la
estructura terciaria y a la estructura cuaternaria de la protena.
Por ltimo, para propsitos particulares a veces se reemplaza la solucin salina
por un medio acuoso orgnico. Ej., si la intencin es la purificacin de ncleos, se
usa citrato en el medio: capacidad para inactivar desoxirribonucleasas, enzimas
que catalizan la ruptura de los enlaces fosfodister del DNA-.
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Ya preparados los tejidos en un medio adecuado, se procede a homogeneizar: disrupcin tisular y disrupcin celular
(romper la envoltura celular). La homogeneizacin debe ser controlada de manera de no distorsionar ninguna organela subcelular
de inters, ni desnaturalizar ninguna biomolcula de inters. Para esto, los mtodos deben ser moderados: no se deben utilizar
mtodos vigorosos de homogeneizacin.
Existe una gran variedad de mtodos diferentes para homogeneizar, pudiendo ser clasificados en:
a) mtodos mecnicos y b) mtodos qumicos.
a) Algunos mtodos mecnicos de homogeneizacin son moler, picar, triturar, congelar y descongelar, generar cambios de
presin, generar choque osmtico, sonicacin, agitacin de alta velocidad o en presencia de metal o de perlas de vidrio, etctera.
La sonicacin consiste en aplicar ultrasonidos (sonidos de muy alta frecuencia) a la suspensin celular. La intensa agitacin
producida destruye las membranas celulares: dependiendo de la frecuencia, la intensidad y la energa, se pueden destruir
estructuras subcelulares, complejos proteicos Se realiza en fro, para evitar el sobrecalentamiento de las muestras, lo que podra
provocar la desnaturalizacin de las protenas.
Respecto al choque osmtico (shock osmtico), el agua fluye dentro de las clulas cuando se las coloca en una solucin
hipotnica: el flujo osmtico provoca la hinchazn de las clulas, lo que debilita la membrana plasmtica y facilita su ruptura.
Tambin es posible fragmentar la membrana plasmtica mediante equipos especiales de homogeneizacin; algunos de ellos
fuerzan a las clulas a travs de un espacio muy estrecho, generando la ruptura de la membrana.
Los siguientes son algunos instrumentos que pueden usarse para realizar la homogeneizacin mecnica:
o
o
o
o
Mortero con mazo (herramienta estndar).

Batidoras o trituradoras, tambin empleados en la cocina.
Prensa de French.
Homogeneizadores: rompen la membrana con un mbolo rotatorio operado en forma manual o elctrica. Existen dispositivos en los que
est calibrada la separacin mbolo/pared del tubo para producir homogenado con un tamao de partcula determinado. Por ej.,
homogeneizador Potter-Elvehjem, de uso frecuente ya que es relativamente suave, y con una luz entre mbolo y vidrio de entre 0,05 y 0,5mm.
Otros homogeneizadores: Potter; Dunce; Ten Broeck; homogeneizador de aspas (ej., el polytron).
El siguiente cuadro ofrece una visin de conjunto de algunos de estos instrumentos, su fundamento terico y el tipo de
materiales sobre los que consiguen mayor eficacia:
* aspiraciones en vaco. Es un efecto hidrodinmico que se produce cuando el agua o cualquier otro fluido en este lquido para a gran velocidad
por una arista afilada, producindose una descompresin del fluido.
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b) Mtodos qumicos: detergentes que solubilizan las membranas celulares, como el SDS (dodecilsulfato sdico, o NaDS)
o el Triton-X, as como algunas enzimas digestivas (ej., lisozima, colagenasa, tripsina, hialuronidasa), alteran la membrana celular
de tal modo que el contenido puede fluir hacia afuera.
El mtodo elegido depende del tipo de experimento y del tipo de muestra (cultivo bacteriano, tejido de mamfero).
La homogeneizacin produce una mezcla de componentes celulares suspendidos, que se denomina homogenado. De este
homogenado se podrn recuperar, posteriormente, los orgnulos o las biomolculas de inters.
La homogeneizacin de la clula y la dilucin del citosol provocan despolimerizacin de los microfilamentos de actina y de
los microtbulos, liberndose sus subunidades monomricas. De este modo, otros procedimientos pueden ser utilizados para
estudiar estos importantes constituyentes.
La homogeneizacin involucra la desorganizacin de un sistema biolgico, y puede introducir in vitro nuevos estados
morfolgicos y metablicos llamados artefactos. Para evitar o minimizar esto, es necesario una buena eleccin del tejido, del
medio de homogeneizacin y del mtodo de disrupcin celular.
II. FILTRACIN.
Este paso se emplea en algunos tipos de clulas. Se pueden usar tejidos porosos para filtrar, y as eliminar el tejido conjuntivo u
otros elementos indeseables. Dependiendo de la naturaleza del contaminante, esto puede ser tan simple como verter el homogenado
a travs de gasa, o ms complejo.
101
Quelacin.
Un agente quelante (quelante, secuestrante o antagonista) es una sustancia que forma

complejos con iones inorgnicos. A estos complejos se los conoce como quelatos.
Al proceso de formacin de un quelato se le conoce como quelacin o quelatacin.
Una de las funciones de los quelantes es evitar la toxicidad de estos iones en los seres vivos.
Se disean para competir con los iones por los grupos reactivos fisiolgicos, e incrementar
su excrecin.
Ej.: El EDTA (cido etilendiaminotetraactico) tiene una fuerte afinidad por los cationes calcio,
lo que da por resultado una disminucin de sus concentraciones. El EDTA y el EGTA pueden agregarse
para remover cationes bivalentes como Mg^2+ y Ca^2+.
Entre los quelantes naturales cuentan la clorofila, el glutatin, varias enzimas, vitaminas
102
III. CENTRIFUGACION y PURIFICACIN.

En primer lugar deben considerarse y estudiarse los principios de la centrifugacin y los usos de las tcnicas de
centrifugacin para separar orgnulos y biomolculas. El principio de la centrifugacin es el aumento de la velocidad de
precipitacin o sedimentacin de los orgnulos subcelulares, por la aplicacin de una fuerza centrfuga: se usa el aumento de la
fuerza de gravedad para precipitar componentes celulares.
Es decir que las tcnicas de fraccionamiento por centrifugacin se basan en el comportamiento de las partculas en un
campo centrfugo aplicado, y asumen que dicho comportamiento est relacionado con los parmetros de las molculas bajo
investigacin, tales como masa molecular relativa, forma y densidad.
Los orgnulos tienen diferentes densidades:
cantidad de materia por unidad de volumen.
Consiste en un conjunto de mtodos y tcnicas para separar y purificar diversos orgnulos y biomolculas, que
difieren en tamao, forma y densidad: esta diferencia fundamental les hace experimentar la sedimentacin a diferentes velocidades.
Para una dada partcula, la velocidad de sedimentacin es proporcional a la fuerza aplicada, por lo tanto las partculas sedimentan
ms rpido cuando la fuerza aplicada es ms grande que la fuerza gravitacional de la Tierra. Las partculas son suspendidas en un
medio especfico, en tubos o botellas, y son colocadas en un rotor, el cual es posicionado en el centro de la centrfuga. Las
partculas que difieren en densidad, tamao y forma pueden ser separadas porque sedimentan a diferentes velocidades en un campo
centrfugo.
Es til para obtener, por ejemplo, fracciones de membrana o complejos multiproteicos (citoesqueleto de
actina, microtbulos, poros nucleares, etctera).
Las partculas de mayor tamao o densidad se acumulan en el fondo. Se forman entonces dos fracciones:
sobrenadante (supernatant), fraccin homognea que no ha sedimentado; y pellet (sedimento), que queda adherido al fondo del
tubo. Si deseo fraccionar cualquiera de estas dos fases, la extraigo y la vuelvo a centrifugar.
Debido a las diferencias en tamao y densidad, cada componente celular est sujeto a una fuerza centrfuga. La
fuerza generada por la centrfuga se expresa como fuerza centrfuga relativa (RCF, o fuerza G) en unidades de g (gravedad). La RCF
es una funcin de velocidad de centrifugacin en revoluciones por minutos (rpm) y distancia de partculas desde el eje de rotacin.
Conociendo esta distancia (d) y la velocidad de centrifugacin (rpm), se puede determinar el RCF en la ecuacin:
RCF = 1,19 x 10^(-5) x (rpm) x 2d, donde d se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotacin hasta el margen de afuera
del tubo de centrfuga. Las centrfugas, semejantes a las del lavarropas de 350 revoluciones por minuto (3 metros dimetro) pueden
disponerse a baja velocidad (procariotas, clulas, ncleos, etc.) o a mayor velocidad. Usan rotores basculantes (como los de
una presa).
Dependiendo de la densidad del medio voy a conseguir mayor o menor pronunciacin del efecto centrfugo. Tambin se
puede someter a las muestras a diferentes mrgenes de aceleracin: las centrfugas suelen correr a aprox. 3.000g, las
supercentrfugas van desde 2.000 a 20.000 g, y las ultracentrfugas, que emplean un intenso vaco, van desde los 15.000 a 600.000g.
Es importante mencionar que la friccin puede sobrecalentar la muestra.
103
En una centrfuga, el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos:
Rotor basculante: los tubos se colocan en una cestilla perpendicular al eje de giro. El rotor se mueve. +velocidad.
Rotor de ngulo fijo: se colocan en orificios en el interior de rotores macizos. Es inmvil.
Rotores verticales.
Los parmetros a tener presentes son:
Volumen de la solucin a centrifugar. Predetermina el tipo de tubos y rotor.
Naturaleza qumica de la solucin. Determina la naturaleza del tubo.
Diferencia entre la densidad de la partcula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentran. Cuanto mayor
sea esa diferencia, antes (menos tiempo y menor fuerza de aceleracin) sedimentar. Cuando la diferencia es muy pequea
se pueden usar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas.
Segn el propsito, las tcnicas de centrifugacin son de dos tipos:

La centrifugacin preparativa se emplea para separar, aislar y purificar clulas enteras, orgnulos subcelulares,
membrana plasmtica, polisomas, ribosomas, cromatina, cidos nucleicos, lipoprotenas, virus, etc., para ser empleados
en subsiguientes investigaciones.
Las tcnicas de centrifugacin analtica, por otra parte, son desarrolladas principalmente para estudiar las
propiedades de las partculas que sedimentan, tales como el coeficiente de sedimentacin o su masa molecular. En
general, requieren menores cantidades de material que la centrifugacin preparativa. Las partculas se observan mediante
un sistema ptico durante la centrifugacin: los tubos de centrfuga deben ser de cuarzo para dejar pasar la luz visible y
ultravioleta. Se suele usar un rotor basculante.
Segn la forma en que se centrifuga, se puede hablar de:
104
Centrifugacin diferencial (varias centrifugaciones, velocidad creciente).
En la centrifugacin diferencial se aumenta secuencialmente la velocidad de centrifugacin y, por ende, la fuerza

centrfuga, resultando en una separacin secuencial de orgnulos de acuerdo a su tamao y densidad. Se obtienen solamente dos
fracciones: sobrenadante y pellet.
Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poca fuerza) sedimentan las partculas mayores y/o ms densas. Los
componentes de mayor tamao migran ms rpidamente al fondo y forman este sedimento. Cuando el sobrenadante de la primera
centrifugacin es expuesto de nuevo a condiciones de mayores tiempos y mayores fuerzas de aceleracin, sedimentan de nuevo las
partculas ms densas de las presentes y as sucesivamente. Las partculas en suspensin deben diferir en densidad de la del
medio.
Esta tcnica generalmente usa rotor angular, y la separacin es principalmente en funcin del tamao de partcula,
aunque influye el coeficiente de sedimentacin s, que depende de la masa (tamao x densidad) y de la forma.
1ra centrifugacin (1.000G, 10 minutos): clulas enteras, ncleos, citoesqueleto, membranas plasmticas. [PRECENTRIFUGACIN]
2da centrifugacin (20.000G, 20 minutos): cloroplastos, mitocondrias, peroxisomas, lisosomas.
3ra centrifugacin (80.000G, 1 hora): microsomas (fragmentos de RE RoL), vesculas pequeas.
4ta centrifugacin (150.000G, 3 horas): ribosomas, virus, grandes macromolculas. Sobrenadante con protenas. [ULTRACENTRIFUGACIN]
Al final de cada etapa, el pellet y el sobrenadante son separados y el pellet es lavado algunas veces por resuspensin en el
medio de homogeneizacin, seguido de una recentrifugacin bajo las mismas condiciones. El sobrenadante que resulta de cada
etapa es el material con el que se efecta la centrifugacin de la etapa siguiente.
Cabe aclarar que los pellets no son puros, sino que estn enriquecidos en una determinada fraccin. En el tiempo
requerido para la sedimentacin completa de las partculas pesadas, algunas de las partculas livianas o de tamao medio tambin
pueden sedimentar y as contaminar la fraccin. Es por eso que, para obtener fracciones altamente enriquecidas, son necesarias
etapas posteriores de centrifugacin.
Sea como sea, la C.D. permite obtener un fraccionamiento inicial grosero del contenido citoplasmtico, que puede purificarse
con ms precisin mediante una centrifugacin isopcnica (igual densidad).
Esquema de la centrifugacin diferencial, para separar los

diferentes orgnulos obtenidos mediante fraccionamiento celular.
105
Centrifugacin isopcnica (en gradiente de densidad, hasta el equilibrio de sedimentacin).
En la centrifugacin isopcnica, los orgnulos de densidad de flotacin diferente (resultado de las diferentes relaciones
entre cantidad de lpidos y protenas en cada clase de orgnulo) se separan por centrifugacin a travs de una columna de
disolvente que contiene un gradiente de densidad. El tiempo de centrifugacin es lo suficientemente largo (hasta 1 o 2 das) como
para que se alcance el equilibrio de sedimentacin.
El proceso es como sigue: se llena un tubo de centrfuga con una disolucin, la densidad de la cual aumenta desde la
superficie hasta el fondo; para producir este gradiente de densidad se disuelve un soluto como sacarosa a diferentes
concentraciones, y se lo somete a velocidades de centrifugacin muy altas (ultracentrifugacin).
Cuando se deposita la mezcla de partculas orgnulos y biomolculas- sobre este gradiente de densidad, y se centrifuga el
tubo a alta velocidad, los orgnulos individuales sedimentan hasta que su densidad de flotacin corresponde exactamente con la del
gradiente. Por supuesto, para conseguir esto se usan gradientes continuos que cubren todo el intervalo de densidades de los
componentes de la muestra. Adems, en el fondo del tubo la densidad del medio ha de ser mayor que la del componente ms denso.
De esta forma, independientemente del tiempo de centrifugacin, las partculas nunca sedimentarn en el fondo. Al final, puede
recogerse cada capa por separado.
Adems de mayor resolucin, lo interesante de esta tcnica es que separa a los componentes de la muestra exclusivamente
segn su densidad, y que los sita en la posicin del gradiente donde la densidad del medio es igual a la suya propia (isopcnica:
de igual densidad).
Esta tcnica usa rotor basculante, y la separacin es en funcin de la densidad de partcula. El gradiente evita la
mezcla por conveccin/difusin: bandas bien separadas. El tiempo de centrifugacin es lo suficientemente largo como para que se
alcance el equilibrio.
Centrifugacin en gradiente de densidad (isopcnica).
106
Mediante el fraccionamiento subcelular se descubri que los lisosomas contienen enzimas degradativas; que las mitocondrias
contienen enzimas oxidativas; que los cloroplastos contienen pigmentos fotosintticos. El aislamiento de un orgnulo enriquecido
con determinada enzima suele ser el primer paso en la purificacin de dicha enzima.
Debido a que el hgado de rata contiene gran cantidad de un tipo nico de clulas, este tejido se ha utilizado en muchos
estudios clsicos de orgnulos celulares. Obviamente, a causa de las amplias variaciones entre tejidos de distinto origen, en cuanto a
la fragilidad de los distintos orgnulos y en cuanto a la resistencia de las clulas y tejidos a la disrupcin, la homogeneizacin de
los diferentes tipos celulares presenta problemas especficos que pueden ser resueltos ajustando las distintas variables a los
distintos tejidos. Sin embargo, los mismos principios de homogeneizacin y aislamiento se aplican a casi todas las clulas y tejidos,
pudiendo usarse modificaciones de estas tcnicas de fraccionamiento para separar y purificar cualquier componente deseado.
Al final, el procedimiento de aislamiento ideal deber rendir altas concentraciones de los componentes deseados con su
estructura y funcin inalterada.
107
El grado de pureza de las fracciones obtenidas por cualquiera de estos mtodos, puede verificarse mediante
a) Microscopa electrnica de transferencia verificacin morfolgica-,
b) Marcadores enzimticos, o
c) Mtodos inmunoqumicos con agentes intercalantes, colorantes o anticuerpos especficos dirigidos contra protenas-.
La verificacin del grado de pureza mediante mtodos inmunoqumicos
se contina en las pginas 129 a 132.
Adems, pueden obtenerse grados mximos de pureza de orgnulos y macromolculas mediante mtodos inmunoqumicos de
separacin como la cromatografa de afinidad. La cromatografa ser estudiada ms adelante.
Trabajo de laboratorio.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL DE C.D.
1. Se homogenezan 20 g de hgado en 100 ml de buffer fosfato (NaH2PO4NaHPO4 0,1M pH: 7.4). Esta solucin constituye el
homogenado total (HT). Medir volumen exacto y reservar una alcuota de 10 ml para determinacin de protenas.
2. El resto, repartirlo en 6 tubos Sorwall, y centrifugar en centrfuga Sorwall refrigerada de acuerdo al esquema de las fotocopias
(pgina 6). Es decir: centrifugar los 6 tubos a 4.000 rpm, durante 10 minutos. Retirar fraccin nuclear (FN), y guardar para
determinacin de protenas. Centrifugar sobrenadante postnuclear (SPN) a 15.000 rpm durante 15 minutos. Retirar fraccin
mitocondrial (FM), y guardar para determinacin de protenas. Guardar tambin el sobrenadante postmitocondrial (SPMit)
para determinacin de protenas.
3. Resuspender en buffer de homogeneizacin a los precipitados correspondientes a las fracciones nucleares y mitocondriales,
empleando un homogeneizador de vidrio. Deben agregarse los siguientes volmenes:
-fraccin nuclear: 6 ml
-fraccin mitocondrial: 5 ml
Medir el volumen de cada fraccin y anotarlo en la tabla correspondiente. De estas soluciones se tomarn las alcuotas
correspondientes para la cuantificacin de protenas. La cuantificacin de protenas ser explicada en la siguiente seccin.
108
Tipos de centrfugas y usos.
a) Centrfugas pequeas
b) Centrfugas refrigeradas de gran capacidad
c) Centrfugas refrigeradas de alta velocidad
Ultracentrfugas de dos tipos:
d) Preparativas y
e) Analticas
a) Se emplean para colectar pequeas cantidades de material que sedimentan rpidamente (levaduras, eritrocitos, etc.). En
general, alcanzan una velocidad mxima de 4.000-6.000 rev./min., con una fuerza centrfuga de 3.000 a 7.000 g. Algunas son
diseadas para alcanzar velocidades de 8.000 a 13.000 rev./min. y 10.000g: estas incorporan un sistema de refrigeracin para
mantener los rotores fros. Pueden ser empleadas para sedimentar muestras de sangre, sinaptosomas, etc.
b) Desarrollan un mximo de velocidad de 6.000 rev./min. con una fuerza centrfuga de 6.500 g- Las cmaras que contienen los
rotores son refrigeradas y permiten emplear rotores de ngulo fijo como mviles (basculantes). Permiten colectar sustancias
que sedimentan rpidamente como eritrocitos, precipitados voluminosos, clulas de levadura, ncleos, cloroplastos, etc.
c) Estos instrumentos emplean rotores que permiten desarrollar velocidades de 25.000 rev./min., generando fuerzas centrfugas
de 60.000 g. Son empleadas para colectar microorganismos, desechos celulares, orgnulos celulares, etc. No sirven para
precipitar virus u organelas ms pequeas como ribosomas.
d) Pueden alcanzar velocidades de 80.000 rev./min., produciendo fuerzas centrfugas de 600.000 g. La cmara del rotor es
refrigerada y se le hace vaco para minimizar la alta temperatura generada por la excesiva velocidad. Pueden emplearse para
separar macromolculas unidas a ligandos, fracciones de lipoprotenas plasmticas, etc.
e) Pueden operar a velocidades de 70.000 rev./min., produciendo fuerzas centrfugas de 500.000 g. Son similares a las anteriores,
pero adicionan un sistema ptico que permite observar el material que va sedimentando.
109
Bibliografa.
Adems del Principios de Bioqumica de Lehninger, 5ta edicin, se us:

1. Biologa Celular y Molecular. Lodish, Berk, Matsudaira, Kaiser, Krieger, Scott, Zipursky, Darnell. 5ta edicin.
http://books.google.com.ar/books?id=YdyMSxY2LjMC&pg=PA181&lpg=PA181&dq=fraccionamiento+celular&source=bl&ots=
tEMjemr-Yq&sig=uo81VAYsAvKqStvouUkctZqaz4A&hl=es419&sa=X&ei=F4WEVI6CEOO1sQTYjYKQCQ&ved=0CDUQ6AEwBTgK#v=onepage&q=fraccionamiento%20celular&f=false
2. Fraccionamiento celular. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology, Allyn Bregman.
http://facultad.bayamon.inter.edu/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/FRACCEL.htm
3. Wikipedia, por supuesto. La mayor red de conocimiento open-source.
110
2. Fotometra.
2.1) Nociones bsicas.
La luz blanca est compuesta por todos los colores del espectro visible (380 nm780 nm). Cuando un haz de luz blanca
atraviesa una solucin coloreada, parte de la luz es absorbida selectivamente por la sustancia, y el resto se transmite a travs de
dicha solucin. El color de la sustancia es el color de la luz transmitida.
Si medimos la cantidad de luz absorbida por la sustancia (por ejemplo, por una protena), podemos cuantificar a dicha
sustancia en solucin. A mayor absorcin de luz, mayor concentracin de la sustancia.
Absorbancia (Densidad ptica): cantidad de luz absorbida por un cuerpo en determinada cantidad de tiempo.
Transmitancia: cantidad de luz que atraviesa un cuerpo en determinada cantidad de tiempo.
La fotometra se basa en dos leyes fundamentales:

Ley de Lambert: cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su intensidad
disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta.
Ley de Beer: cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente a medida que aumenta la concentracin de la sustancia absorbente en el medio.
Estas dos leyes se combinan en la Ley de Beer-Lambert, que relaciona la absorcin de luz con las propiedades del material
atravesado. El enunciado de la Ley de Beer-Lambert es el siguiente: La absorcin de luz a una determinada longitud de onda es
dependiente de la concentracin del material absorbente y de la longitud del camino que debe atravesar la luz a travs del medio
absorbente. Es decir, que la absorbancia de una muestra a una determinada longitud de onda depende de la cantidad de especie
absorbente con la que se encuentra la luz al pasar por la muestra.
111
io: intensidad de luz incidente.

i: intensidad de luz transmitida.
c: concentracin de la sustancia.
l: longitud del camino que atraviesa la luz (espesor de capa).
: coeficiente de extincin molar (Do de una solucin 1M de la sustancia en una celda de 1cm^2 de espesor).
Expresin que, si se utiliza una cubeta de espesor constante, resulta DO = cte x c
En estas condiciones, la Ley de Beer-Lambert indica que hay una relacin lineal entre DO y la concentracin, siempre que se
tengan en cuenta los siguientes factores:
a)
b)
c)
d)
Que la luz sea paralela y monocromtica

Que el medio sea homogneo
Que la absorcin del solvente sea despreciable
Que no haya asociacin entre las molculas del solvente y del soluto
Esta ley tiene algunas excepciones: generalmente, cuando se tienen concentraciones muy elevadas
o muy bajas, la absorcin deja de ser proporcional.
Representando grficamente una serie de absorbancias o densidades pticas (Abs=DO) a una longitud de onda dada, en
funcin de la cantidad de sustancia (C), la obtencin de una funcin lineal verifica el cumplimiento de la Ley de Lambert y
Beer, como se observa en el grfico anterior.
En el caso de que la recta se transforme en una curva, no se verifica la ley de Lambert y Beer en la zona en que la recta se
curva, no se cumple la ley-.
Para medir la densidad ptica se usa un dispositivo denominado colormetro. Actualmente se usan los colormetros
fotoelctricos, como los fotmetros de filtro y los espectrofotmetros. En general los aparatos constan de:
1. Fuente de luz: lmpara con filamento de tungsteno para emitir luz de 300 a 700 nm.
2. Filtro o monocromador: un sistema de aislamiento espectral que permite seleccionar una banda de longitud de onda
lo suficientemente estrecha como para obtener una luz ms o menos monocromtica-. En el fotocolormetro este sistema
est dado por un filtro gelatina entre dos paneles de vidrio- y en el espectrofotmetro, por un monocromador de prisma
o red de difraccin acoplado a una ranura ajustable.
3. Colimador: para obtener un haz de luz dirigido. Es decir, para que la luz sea paralela.
4. Muestra: colocada en un tubo calibrado o cubeta de un espesor determinado. Aqu se coloca la solucin cuya densidad
ptica se debe determinar. Debe colocarse siempre de la misma manera para evitar cometer errores debido a las
imperfecciones de las cubetas.
5. Dispositivo fotoelctrico: es una clula fotoelctrica que transforma la luz transmitida en corriente elctrica, la cual
se registra por medio de un galvanmetro calibrado para que la lectura del mismo de directamente la densidad ptica.
Un espectrofotmetro es un dispositivo que tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica a travs
de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos
funciones: 1) Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra, e 2) indicar qu cantidad de esta sustancia
est presente en la muestra.
112
2. Fotometra.
2.2) Procedimiento para cuantificar fotomtricamente una sustancia.
La cuantificacin fotomtrica slo puede realizarse en soluciones coloreadas. Si la solucin no es coloreada, se debe
provocar que algn grupo funcional presente en la molcula a dosar reaccione con un reactivo determinado, para que se produzca
una sustancia coloreada: mtodos derivados colorimtricos y fluorimtricos
Para realizar la cuantificacin, es necesario tener una a) solucin standard (patrn o testigo) y una b) solucin
blanco.
a) La solucin standard posee la sustancia a cuantificar (analito) a una concentracin perfectamente conocida, y es
obtenida a partir de una droga pura. Utilizar un colormetro fotoelctrico sobre la solucin standard nos permite definir
la absorbancia del analito a la concentracin ya conocida (AT : absorbancia de los testigos). Este dato nos servir como
patrn para las posteriores cuantificaciones experimentales: nos permite valorar las concentraciones incgnita (CD)
en otras soluciones mediante una regla de tres simple, habiendo medido las absorbancias (AD).
CT: concentracin de los testigos AT: absorbancia de los testigos.
AD: absorbancia de la sustancia en la sol. incgnita CT: concentracin de la sustancia en la sol. incgnita.
b) La solucin blanco contiene todos los reactivos que se utilizarn en la cuantificacin (NaOH, reactivos), menos el
analito de inters (la sustancia a cuantificar). El blanco sirve para calibrar el colormetro a 0 de absorbancia o 100% de
transmitancia. Esto nos permite eliminar posibles errores de medicin causados por impurezas o por reactivos
coloreados. Tanto las impurezas como los reactivos coloreados producen absorciones que interfieren en la lectura
correcta.
El procedimiento de cuantificacin fotomtrica se realiza 1. tomando varias alcuotas de una solucin standard, determinando
las absorbancias de cada una de ellas, y plasmando los datos en una curva standard, curva patrn o curva de calibrado: se
grafican las AT en funcin de las CT (en umoles, miligramos, etc.) del analito.
2. Luego se mide la AD de la extracto a analizar solucin incgnita-. Se entra a la curva patrn con esta absorbancia. En base
a este dato, se determina la concentracin incgnita del analito (CT) en el extracto. Este ltimo paso se realiza con cada una de las
alcuotas del material a analizar.
Ver ej. en las fotocopias siguientes.
Antes de medir la densidad ptica de la incgnita se debe seleccionar la longitud de onda adecuada colocando el filtro o
monocromador correspondiente, o accionando el selector- y ajustar el aparato de manera que la densidad ptica del blanco sea cero
(100% de transmitancia). Si no se realiza la calibracin, la solucin blanco puede emplearse de otros modos:
Si la densidad ptica de la incgnita diera un valor muy elevado o muy bajo-, se debe elegir una alcuota ms pequea o
ms grande- de manera que la lectura entre en el rango lineal del mtodo (parte recta de la curva standard). Por este motivo se
suelen pipetear dos o ms alcuotas de la incgnita, y se eligen aquellas que cumplen con este requisito.
113
CUANTIFICACIN DE PROTENAS.
114
Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas.

El antiguo mtodo de Kjeldahl se basa en la determinacin del nitrgeno total de la muestra: las protenas son digeridas en
un medio cido, y el nitrgeno total es determinado por titulacin (mtodo tambin denominado valoracin o anlisis
volumtrico). La titulacin es un mtodo de anlisis qumico cuantitativo que consiste en hacer reaccionar una solucin estndar de
un reactivo titulador con una solucin de analito de concentracin desconocida en este caso, el nitrgeno proteico-: de esta
manera, se puede determinar la cantidad exacta de titulador y analito que se han consumido cuando se alcanza el punto final de la
reaccin.
Otros mtodos se basan principalmente en:
a) La propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el rango de UV,
b) La capacidad de las protenas para formar derivados qumicos,
c) La capacidad de las protenas para unir ciertos colorantes.
El uso del mtodo adecuado depende de cinco criterios:
1.
2.
3.
4.
5.
La cantidad total de protena presente en la muestra,

La concentracin de la protena,
La especificidad del mtodo,
La presencia de otras sustancias que pudieran interferir,
La facilidad y reproducibilidad del mtodo.
En el caso particular de la cuantificacin de protenas mediante mtodos de absorcin, se determina la absorbancia de las
soluciones de protena en la regin de la radiacin ultravioleta (UV). Los enlaces peptdicos absorben a 205-210 nm, mientras que
los triptfanos y tirosinas lo hacen a 280 nm. Los coeficientes de extincin varan de acuerdo a la protena: as, el a 280 nm
para la albmina de suero bovino es igual a 6.3, mientras que para la inmunoglobulina de ratn es igual a 13.8. Aunado a este
problema, muchas sustancias no proteicas absorben fuertemente en la regin del ultravioleta, produciendo grandes interferencias.
Este es el caso de los cidos nucleicos.
115
Cu (II) = Cu2+
Mtodos derivados colorimtricos: BIURET.
El color natural de las protenas, en ausencia de cobre, puede ser enteramente atribuido al contenido de tirosinas y triptfano.
Pero en presencia de cobre, el tratamiento alcalino de las protenas resulta en un incremento de 3 a 15 veces en el desarrollo de
color. La reaccin con cobre toma de 5 a 10 minutos a temperatura ambiente, pero el calentamiento a 100C o el aumento en la
concentracin de lcali acelera la reaccin con cobre en solucin alcalina. Se requiere muy poco cobre para obtener un color final
completo.
El mtodo de Biuret se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu (II) y los grupos NH de los enlaces
peptdicos, en medio alcalino. Un Cu (II) se acompleja con cuatro NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional
a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica para protenas, de manera que pocas sustancias
interfieren (muestra pocas interferencias).
Esta reaccin se da en aquellas sustancias que poseen grupos carbamnicos CONH unidos entre s, ya sea
directamente o a travs de C o N.
La unin del cobre II con los cuatro enlaces peptdicos se presenta en la forma mostrada a
la derecha.
La sensibilidad del mtodo es muy baja (1.000 a 10.000 microgramos; orden de los mg)
y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados
(por ej.: en suero).
Si la concentracin de protenas es menor a los 1.000 microgramos, la reaccin ocurre igual,
pero la coloracin no aparece.
116
Mtodos derivados colorimtricos: LOWRY.
Es mucho ms sensible y especfica que la determinacin por absorcin en el ultravioleta a 280 nm, as como fcil de adaptar
a anlisis en pequea escala. Tambin es ms sensible que el Biuret, pero ms tedioso de realizar. Puede detectar cantidades de
entre 1 y 100 micrmetros de protenas (cantidades del orden de 0,1 mg). Sin embargo, la cantidad de color producido vara con
diferentes protenas y en algunos casos el color no es estrictamente proporcional a la concentracin.
Se basa en la reaccin de las protenas con Cu (II) en medio alcalino, y en el uso del reactivo de Folin-Ciocalteau
(reactivo fosfomolbdico-fosfotngstico, llamado as porque contiene fosfomolibdato y fosfowolframato) que reacciona sobre grupos
fenlicos (mayoritariamente tirosina en protenas): el reactivo de Folin es reducido por el complejo protena-cobre.
Las protenas son tratadas con Cu (II) en medio alcalino, como en el mtodo de Biuret, lo que potencia el color. Cuando el
reactivo Folin es adicionado a la protena tratada con buffer a pH 10 se obtiene un color mximo debido a la reduccin del
reactivo Folin por el complejo protena-cobre, produciendo un cambio en la absorbancia que puede ser monitoreado a 750
nm, con un rango de sensibilidad de 1-2 microgramos. Para lecturas a 660 nm, el rango de sensibilidad es de 2-30 microgramos.
Para lecturas a 500 nm, el rango de sensibilidad es de 25-100 microgramos. En todos los casos se usa una curva estndar para
calcular la concentracin.
Con respecto a las interferencias, reactivos como el cido rico, la guanina
y la xantina reaccionan con el reactivo Folin.
La guanina, por ej., produce 50% ms color que la protena.
La mayora de los fenoles, excepto los nitrofenoles, reducen al reactivo: tambin
interfieren aumentando el color.
El reactivo Folin muestra muchas interferencias con detergentes no inicos,
sulfato amnico, etc.
117
Mtodos derivados colorimtricos: BRADFORD.
Este mtodo involucra la unin del colorante Azul Brillante de Coomassie G-250 o Serva Blue- a las protenas,
provocando un cambio en el mximo de absorcin de 465 a 595 nm.
Este mtodo es sensible (1-15 microgramos), simple, muy reproducible, rpido, puede ser empleado para procesar un gran
nmero de muestras, es adaptable a la automatizacin, es barato, y pocas sustancias interfieren en su determinacin.
Entre las sustancias que interfieren estn a) los detergentes y b) las soluciones bsicas: buffers altamente alcalinos presentan
interferencia, pero esto puede ser contrarrestado corriendo blancos apropiados-.
El colorante Azul Brillante de Coomassie G-250, en solucin cida, presenta dos formas coloreadas: azul y rojo. El color
rojo pasa a azul cuando el colorante se une a la protena. La formacin del complejo colorante-protena toma aproximadamente 2
minutos y permanece estable por 1 hora, por lo que el procedimiento es muy rpido y el tiempo para el ensayo no es limitante.
El complejo colorante-protena tiene un alto coeficiente de extincin, lo que hace al ensayo aproximadamente cuatro veces
ms sensible que el ensayo de Lowry.
118
Mtodos derivados colorimtricos: BCA.
La determinacin de protenas por BCA es un mtodo altamente sensible, adems del mtodo que muestra menos
interferencias. Este ensayo muestra menos variacin de una protena a otra, es sencillo y rpido.
Este mtodo combina la reaccin de las protenas con Cu2+ en un medio alcalino (produciendo Cu1+) con un reactivo para la
deteccin de Cu1+ altamente selectivo y sensitivo: el cido bicinconnico (BCA). El cido bicinconnico, en la forma de su sal de
sodio soluble en agua, es un compuesto capaz de formar un complejo prpura intenso con iones cuprosos (Cu1+), en medio
alcalino.
La cuantificacin por BCA combina la reaccin de Biuret (reaccin de la protena con Cu2+ en un medio alcalino para producir
Cu1+) con la reaccin entre el BCA y el Cu1+. El producto de la reaccin presenta un color prpura, generado por la interaccin de
dos molculas de BCA con un in Cu1+, unin muy estable y soluble en agua. Esto ltimo permite la cuantificacin
espectrofotomtrica de protenas en solucin acuosa.
El producto de la reaccin exhibe una fuerte absorbancia a 562 nm, con un rango de sensibilidad de 0.5-10 microgramos. Para
el clculo de la concentracin debe usarse curva estndar.
Con respecto a las interferencias, este ensayo est tamponado a un pH ptimo de 11.25. Cualquier reactivo en la muestra
que disminuya el pH de la formulacin a menos de 11 o lo eleve a ms de 11.5 puede afectar la sensibilidad o reproducibilidad del
ensayo. En muchos casos, ajustar el pH de la muestra a 11 antes de realizar la determinacin puede evitar variaciones.
Muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos: ausencia de interferencias en concentraciones
relativamente altas (1%) de detergentes inicos y no inicos.
119
En conclusin El mejor mtodo para la determinacin de protenas depender de varios factores relacionados con la muestra a
analizar. La sensibilidad del mtodo es muy importante cuando la cantidad total de la muestra es limitada, o bien cuando la
concentracin de protena es muy baja. La especificidad del mtodo es importante cuando se analizan muestras de diferente
naturaleza, es decir, la respuesta del mtodo no presentar grandes variaciones dependiendo del tipo de protena presente. De otra
manera sera necesario realizar varias curvas estndar, una para cada tipo de protena a cuantificar. Las interferencias al mtodo
son importantes cuando se trata de muestras no muy puras, obtenidas de medios complejos, conteniendo concentraciones elevadas
de otros compuestos o a condiciones de pH o fuerza inica especiales.
Qu necesito, entonces, para cuantificar una determinada
sustancia por un mtodo colorimtrico? Adems de la solucin con
la sustancia a cuantificar, necesito:
1. Una solucin patrn (estndar).
2. Una curva de calibrado.
3. Un blanco de reactivos.
Con respecto a la curva de calibrado que no es una curva, sino una
funcin lineal-, se realiza con concentraciones crecientes de la
solucin patrn: se miden las absorbancias, se tabula y grafica.
Notar que, obviamente, la curva patrn no se inicia en el cero del eje
de coordenadas. El punto de inicio de cada curva patrn es denominado P.
Los mtodos ms sensibles son aquellos cuyo P es ms cercano a cero.
Restando la absorbancia del blanco a la absorbancia total del ensayo, obtengo la absorbancia de la sustancia a cuantificar,
la ubico en la curva de calibrado y as determino su concentracin respectiva.
Con respecto a los resultados del anlisis, se utilice el mtodo de cuantificacin que se utilice, al final de la determinacin de
las absorbancias y, en base a estas, del contenido proteico en mg de protena por alcuota, se suelen establecer
a)
b)
c)
d)
El contenido proteico en mg de protena totales

La relacin mg protenas/g tejido
El % de contribucin de dicha cantidad de protena al total del peso de tejido
El % de recuperacin
Las ecuaciones para calcular el % de contribucin y el % de recuperacin, se encuentran al final de las siguientes
fotocopias.
120
3. Investigacin en protenas.
3.1) Consideraciones extra sobre purificacin, cuantificacin y determinacin de la funcin de las protenas.
Una de las finalidades primordiales de la bioqumica es determinar de qu manera la secuencia de aminocidos especifica la
conformacin y por ende, la funcin- de las protenas. Para determinar esto, cada protena en particular debe ser sometida a
numerosos tipos de estudios. Los estudios que suelen realizarse, a grandes rasgos, son:
1. PURIFICAR. En el estudio de las protenas, el primer paso suele ser su purificacin. Las protenas se pueden separar
entre s en base a sus propiedades fsicas: tamao, densidad, carga, capacidad de unin, solubilidad, etctera. La purificacin de las
protenas es un primer paso esencial para el conocimiento de su funcin: nunca desperdicies pensamientos puros en una protena
impura.
Se puede separar a las molculas en base a su relacin entre masa y carga, usando la tcnica MALDI-TOF de
espectrometra de masas. As, de la leche se obtienen casena, lactoglobulina, lactalbmina Tambin se puede localizar
protenas in vivo, medir sus cantidades y explicar sus contextos fisiolgicos: empleando anticuerpos monoclonales, que sirven
para reconocer protenas especficas.
Se pueden utilizar diversas tcnicas de purificacin. La precipitacin salina hace que, como el nombre indica, las
protenas precipiten en presencia de alguna sal en especial. El sulfato de amonio 0,8M (sulfato amnico) precipita el
fibringeno, una protena de la coagulacin sangunea. El sulfato de amonio 2,4M precipita la albmina del suero.
Con posterior dilisis es posible eliminar la sal: separa protenas de molculas pequeas. Para esto se necesita una membrana
semipermeable (membrana porosa de celulosa, saco de dilisis). Molculas con dimensiones significativamente mayores que el
dimetro del poro se retienen dentro, el resto se transforma en dializado.
La cromatografa de filtracin por gel tambin llamada cromatografa de exclusin molecular- separa en
funcin del tamao molecular. Implica a la muestra en una columna rellena de un gel cuya matriz consta de un gran nmero de
esferas porosas microscpicas de un polmero insoluble altamente hidratado: dextrano, agarosa, poliacrilamida, sephadex,
sepharosa, biogel. Las molculas ms grandes fluyen ms rpidamente a travs de esta columna y salen antes, porque a causa de su
tamao no son atrapadas por las esferas no penetran en las esferas-.
La cromatografa de intercambio inico separa en base a la carga inica, carga neta. Las protenas cargadas
positivamente (catinicas) se pueden separar en columnas de carboximetil-celulosa (CM-celulosa, o CMC) cargadas negativamente.
Las protenas aninicas se pueden separar por cromatografa en columnas de dietilaminoetil-celulosa (DEAE-celulosa, o DEAEC)
cargadas positivamente.
La cromatografa de afinidad se aprovecha de la afinidad de muchas protenas por grupos qumicos especficos. Ej.: La
protena globular vegetal concanavalina A (Con A) posee afinidad hacia residuos de glucosa unidos covalentemente. Se separa, al
mismo tiempo, si se aade una disolucin concentrada de glucosa. Es un buen sistema para aislar factores de transcripcin,
protenas que regulan la expresin gnica
La HPLC (high-pressure liquid chromatography, o cromatografa lquida de alta presin) es una versin mejorada de las
tcnicas de columna expuestas aqu.
121
Existen consideraciones previas que deben tomarse en cuenta a la hora de aislar una protena especfica
de una mezcla compleja de protenas.
En primer lugar, debe realizarse un ensayo que determine si est presente o no una protena.
Ej.: consideremos la enzima lactato deshidrogenasa, un actor importante en la generacin energtica anaerbica de
lactato a partir de glucosa, y en la sntesis de glucosa a partir de lactato. Veamos, especficamente, la reaccin que cataliza esta
importante enzima:
El NADH (dinucletido de nicotinamida y adenina) se distingue del resto de los componentes de la reaccin por su capacidad
para absorber luz a 340 nm. Entonces, si agrego lactato a una muestra que tenga lactato deshidrogenasa, se formarn piruvato y
NADH, que expuesto a 340 nm actuar como absorbente y confirmar la presencia de la enzima.
Puedo inclusive seguir el progreso de la reaccin observando cunta luz absorbe la mezcla de reaccin por unidad de tiempo,
por ejemplo, cada un minuto: mido el incremento de la actividad enzimtica. Sea como sea, confirmada la presencia de la molcula
en este caso, la enzima lactato deshidrogenasa- ya es posible purificarla.
Pero, concluyendo: necesito purificar para conocer la funcin. Pero para purificar, debo hacer un anlisis o ensayo de
reconocimiento, y para hacer un ensayo de reconocimiento generalmente necesito antes conocer la funcin.
Adems de identificar a una protena, para establecer un esquema de purificacin funcional necesito conocer la cantidad de la
protena presente en la mezcla que se ensaya.
122
Previo a todo esto, las protenas deben ser liberadas de la clula.
Elegidos el ensayo y la fuente de protena, hay que fraccionar clula y precisar qu fraccin est enriquecida con dicha
biomolcula. Se forma homogenado por ruptura de la membrana celular, la centrifugacin da lugar a precipitados de material
pesado en el fondo del tubo pellets-, y a sobrenadantes por encima.
La centrifugacin diferencial produce varias fracciones de densidad decreciente: la secuencia de pellets es de densidad
decreciente. Cada una de estas fracciones integra cientos de protenas distintas, que se ensayan posteriormente para obtener la
actividad que se purifica. Normalmente, al ensayar las fracciones para detectar la protena, se acaba por encontrar una fraccin
especialmente enriquecida. Esto permite determinar, adems, la densidad de la protena.
2. ESTABLECER LA FUNCIN PROTEICA. El segundo paso suele consistir en el empleo de diversos mtodos para determinar
la secuencia especfica de aminocidos (estructura primaria). Tambin pueden estudiarse las relaciones evolutivas entre
protenas de diferentes organismos.
Adems, se pueden emplear tcnicas que proporcionen datos y descripcin de la estructura terciaria: la verdadera unidad
funcional, el determinante clave de la funcin de una protena. Entre las principales tcnicas para averiguar la estructura
tridimensional de una protena, cuentan la cristalografa de rayos X y la NMR (espectroscopa de resonancia magntica
nuclear).
Se pueden usar varios mtodos diferentes para determinar la secuencia especfica de aminocidos de una protena: mtodos
de secuenciacin proteica. Uno de estos mtodos es la degradacin de Edman. Permite obtener informacin valiosa sobre
la funcin de una protena y su historia evolutiva.
La degradacin de Edman etiqueta al residuo amino terminal de una protena, y lo separa del pptido sin afectar a los
enlaces peptdicos entre el resto de los aminocidos. El mtodo va separando un residuo amino terminal tras otro, secuencialmente,
en varias vueltas.
1. El marcaje etiquetado- del aminocido N-terminal se realiza con fenilisotiocianato (PITC), en medio alcalino.
2. Realizado el marcaje, se realiza una hidrlisis entre el aminocido N-terminal marcado y el adyacente el siguiente
aminocido en la secuencia-. La hidrlisis se realiza en medio cido, y el resto del pptido queda intacto.
3. Una vez liberado el aminocido N-terminal, se realiza su identificacin por HPLC.
4. Se inicia una nueva vuelta, repitindose la totalidad del proceso.
Cuando el fenilisotiocianato reacciona con el grupo amino terminal no cargado del pptido, forma un derivado de
feniltiocarbanilo. Posteriormente, se libera este derivado cclico del aminocido terminal bajo condiciones cidas suaves, lo que
deja un pptido intacto acortado en un aminocido. El compuesto cclico que se libera es un aminocido de feniltiohidantona
(PTHaminocido), que se puede identificar por procedimientos cromatogrficos por ejemplo, HPLC-.
123
No es posible secuenciar pptidos cuyo extremo N-terminal se encuentre bloqueado: grupo amino acetilado, formilado, etc.
Alrededor del 50% de las protenas tienen el extremo amino bloqueado, bien por su naturaleza o por su preparacin.
Otra limitacin de la degradacin de Edman es que el rendimiento no es del 100%, por lo tanto, cuando ya se llevan hechos
muchos ciclos (ms de 50 aminocidos analizados) se obtienen errores: secuenciacin eficaz hasta 50 aa. De todas maneras, pese a
que Edman no sea 100% efectivo, facilita el anlisis fragmentando a las protenas en pptidos ms pequeos.
Otro mtodo empleado para marcar y separar el aminocido N-terminal de una protena es usar el reactivo cloruro de
dabsilo. La desventaja de la degradacin mediante el cloruro de dabsilo es que no puede usarse repetidamente: la protena se
hidroliza completamente, perdindose la secuencia de aminocidos (no se pueden hacer varias vueltas, como con Edman).
124
Existen otros mtodos de ruptura especfica de enlaces peptdicos: por medios qumicos o enzimticos. El bromuro de
ciangeno (CNBr) corta la cadena polipeptdica por el lado carboxlico de los residuos de metionina. Con tripsina, una enzima
proteoltica del jugo pancretico, tambin se consigue una ruptura altamente especfica: ruptura especfica en arginina o lisina.
La digestin enzimtica es importante porque no existen tcnicas qumicas confiables para el secuenciamiento de
aminocidos que corran desde el extremo C-terminal. La degradacin de Edman, por ejemplo, separa residuos N-terminales.
Pero, por otra parte, existen varias enzimas que rompen pptidos en el residuo C-terminal: se las denomina
carboxipeptidasas. As, se hace posible separar residuos C-terminales.
La enzima carboxipeptidasa A es una de ellas. Hidroliza el ltimo enlace peptdico: la ruptura es especficamente en el lado
amino del aminocido C-terminal (salvo para arginina, lisina o prolina). El resultado: la reaccin libera el aminocido C-terminal.
125
Una tcnica qumica confiable para la identificacin de un residuo C-terminal es la hidrazinlisis. Un pptido es tratado con
la hidrazina (NH2-NH2) a alta temperatura (90C) por un largo perodo de tiempo (20-100 hr). Este tratamiento rompe todos los
enlaces peptdicos, produciendo derivados de hidrazina con todos los aminocidos (aminoacil hidrazidos, o hidracidas)
excepto con el residuo C-terminal.
El residuo C-terminal se puede identificar cromatogrficamente comparado con los estndares del aminocido. Debido al alto
porcentaje de reacciones laterales inducidas por la hidrazina, esta tcnica se utiliza solamente en los pptidos resistentes a la
carboxipeptidasa.
Existen otros mtodos para hidrolizar un pptido en sus aminocidos constituyentes: ej. Calentndolo en HCl a 110C, durante
24 horas. Luego, los diferentes aminocidos de este hidrolizado peptdico se pueden separar e identificar por cromatografa de
intercambio inico en una resina intercambiadora de cationes a base de poliestireno sulfonado (como la Dowex-50).
Con respecto a la deteccin y cuantificacin de aminocidos, es frecuente el uso de ninhidrina (hidrato de
tricetohidrindeno). La ninhidrina reacciona con los aminocidos, provocando su desaminacin oxidativa ruptura del grupo
amino-: esto causa la degradacin de cada aminocido en amonaco, anhdrido carbnico y un aldehdo. La ninhidrina, por su parte,
queda reducida en forma de hidrindantina.
La hidrindantina reacciona, luego, con otra molcula de ninhidrina y con el amonaco. El producto es un compuesto de
adicin doble que presenta una coloracin que vara de azul a violeta intenso, pasando por rojizo: el prpura de Ruhemann. Si
el aminocido es prolina, da en cambio una coloracin amarillenta.
La reaccin se lleva a cabo en caliente y a valores de pH comprendidos entre 4 y 8. Las aminas primarias ( R-CH2-NH2)
tambin dan positivo al ensayo de la ninhidrina, aunque sin liberar CO2. En aquellos casos en los que da negativa la prueba de
Biuret, y positivo para ensayo de ninhidrina y presencia de CO2, no hay protenas pero s AAC libres.
126
La tcnica es muy sensible, por lo que es ideal para detectar

concentraciones bajas de aminocidos, utilizndose para revelar su
presencia en cromatogramas.
La presencia de aldehdos resultantes de la degradacin de los AAC
modifica, bajo ciertas condiciones, el color formado: esto sirve para
identificar el tipo de aminocido.
El prpura de Ruhemann presenta su mxima absorbancia a 570 nm,
excepto para prolina, hidroxiprolina e histidina.
Vemos entonces que el ensayo de la ninhidrina es un mtodo colorimtrico que sirve para detectar, identificar y cuantificar
esto ltimo mediante absorbancia a 570 nm- los aminocidos. La formacin de color se toma como resultado positivo e indica
presencia de aminocidos; el no desarrollo de color es indicativo de que no estn presentes (determinacin cualitativa de
AACs). Bajo ciertas condiciones, la variacin de color puede servir para identificar el tipo de aminocido que est presente.
Algunos reactivos alternativos a la ninhidrina son la fluorescamina, el orto-ftalaldehdo (OPA), etc. La fluorescamina
es un reactivo no fluorescente que tambin detecta y se une a aminas primarias, aminocidos y protenas, dando productos
altamente fluorescentes.
127
Algunos otros compuestos qumicos que se usan para el marcaje colorimtrico y la deteccin de alfa aminocidos:
Por ltimo, aclarar que la mayor parte de estos mtodos sern considerados posteriormente con mucho ms detalle.
128
3.2) Nociones de Inmunoqumica.
Los mtodos inmunolgicos van de la mano con la purificacin de protenas, su localizacin celular y su cuantificacin. Son
mtodos muy tiles debido a la exquisita especificidad de los anticuerpos por sus protenas diana: los anticuerpos marcados
favorecen esta utilidad.
Anticuerpos contra protenas especficas.
Tambin conocidos como inmunoglobulinas (Ig), los anticuerpos son protenas sintetizadas por un animal en respuesta a la
presencia de sustancias ajenas: antgenos (Ag). Los Ig tienen alta afinidad por Ag que provocan su sntesis. Un anticuerpo reconoce
y se une, especficamente, a una porcin del antgeno: el eptopo o determinante antignico.
Para obtener anticuerpos que reconozcan a una protena determinada, suele inyectarse dicha protena a un conejo a lo largo
de un intervalo de aproximadamente tres semanas. Esto estimula la reproduccin de las clulas que producen anticuerpos que
reconocen a la sustancia extraa. Se extrae sangre del conejo inmunizado, y se la centrifuga para separar clulas sanguneas del
suero denominado antisuero-. El antisuero contiene anticuerpos contra todos los antgenos a los que ha estado expuesto el
conejo.
Anticuerpos policlonales.
Las clulas B producen anticuerpos policlonales: muchos anticuerpos distintos, pero secretados en contra de un mismo
antgeno. Cada anticuerpo policlonal es una mezcla heterognea de inmunoglobulinas, cada una de stas capaz de reconocer un
rasgo diferente de la superficie del mismo antgeno: reconocen diferentes eptopos del antgeno.
Mtodos para preparar anticuerpos monoclonales.
Lo que intensific la capacidad de los abordajes inmunolgicos fue trabajar con clulas que produjeran un nico anticuerpo, o
anticuerpo monoclonal: el problema es que stas, aisladas, mueren rpidamente.
Existen lneas celulares inmortales, derivadas de un tipo de cncer, el mieloma mltiple, que producen anticuerpos
monoclonales. Son poco tiles para inmunologa.
Cesar Milstein y Georges Khler, descubrieron que podan obtenerse grandes cantidades de anticuerpo homogneo de casi
cualquier especificidad deseada, por medio de la fusin de una clula productora de anticuerpo de corta vida con una clula de
mieloma.
Se inyecta antgeno a ratn, se extrae el bazo, mezcla de clulas plasmticas se fusionan in vitro con clulas de mieloma. Las
clulas hibridoma resultantes, producen indefinidamente un anticuerpo homogneo. La fusin se realiza en polietilenglicol.
Verificacin del grado de pureza de la Fraccin Nuclear.
Se comprueba mediante tincin con, generalmente, agentes intercalantes: compuestos que se insertan entre las bases de
una molcula de DNA, interrumpiendo la alineacin y el emparejamiento de las bases nitrogenadas de las cadenas complementarias.
Algunos ejemplos de AI que tien el DNA: colorantes de acridina, bromuro de etidio, SYBR Green, ioduro de propidio, DAPI.
129
El bromuro de etidio (BrEt) fluoresce al unirse al DNA. Cuando se expone esta sustancia a luz
ultravioleta, emite una luz roja-anaranjada, que se intensifica unas 20 veces despus de haberse
unido a una cadena de ADN.
Como la mayor parte de los compuestos fluorescentes, es una sustancia aromtica.
La mayor parte de la molcula es una estructura tricclica con dos grupos amino-benceno, uno a
cada lado del compuesto cclico central.
Como el bromuro de etidio se intercala en el DNA, tiene un poderoso efecto mutgeno y, posiblemente puede ser cancergeno o
teratgeno. Tambin induce citotoxicidad. Actualmente existen otros compuestos que cumplen con la funcin del bromuro de etidio
pero que no tienen efecto mutagnico, como el SYBR Green.
El SYBR Green hace lo mismo que el bromuro de etidio, pero es menos txico y hasta 100 veces ms sensible en tcnicas
como la electroforesis. No es un agente intercalante, ya que no se inserta en el espacio entre dos pares de bases, sino que se asocia a
la molcula de ADN interactuando con la hendidura menor del ADN. El complejo resultante ADN-SYBR Green presenta el pico de
absorcin en = 498 nm y el de emisin en = 522 nm (correspondiente a la zona verde del espectro, de ah su nombre).
El DAPI (o 4',6-diamino-2-fenilindol) es un marcador fluorescente que se une fuertemente a regiones del DNA
enriquecidas en adenina y timina. Es utilizado ampliamente en microscopa de fluorescencia. El compuesto es capaz de pasar a
travs de las membranas celulares, por lo que se lo emplea para teir clulas vivas tanto como clulas fijadas pese a que la
eficiencia disminuye in vivo-.
Cuando el DAPI se une a DNA bicatenario, su mximo de absorbancia es a 358 nm (UV) y su
mximo de emisin es a 461 nm (azul). Por esto, en microscopa de fluorescencia, DAPI es
excitado con luz ultravioleta para despus ser detectado a travs de un filtro azul/cian.
El DAPI tambin puede unirse a RNA, y aunque su pico de emisin sea bastante amplio, no
es tan fluorescente: su emisin se desplaza hacia 500 nm cuando se une al RNA.
Otro uso del DAPI es para marcaje de cultivos celulares con la finalidad de detectar el DNA contaminado con micoplasmas o
virus: detecta micoplasmas y virus dentro de las clulas. Las partculas de micoplasmas o virus marcadas con DAPI son ms fciles
de detectar en un medio de cultivo.
La tincin de DNA mediante agentes intercalantes permite ubicar clulas por sus ncleos, estudiar la mitosis, el ciclo celular,
cariogramas, apoptosis
Otra tcnica para ubicar genes o secuencias particulares de DNA es la hibridacin in situ con sondas fluorescentes
(FISH: Fluorescence In Situ Hybridization). Esta tcnica prescinde de los agentes intercalantes: en su lugar emplea sondas
fluorescentes especficas para los genes o secuencias que se desea ubicar.
Pueden usarse sondas fluorescentes de DNA o, raramente, de RNA- para detectar o cuantificar genes o secuencias
nucleotdicas especficas, y para localizarlas en cromosomas especficos o en ncleos en interfase. La sonda est marcada con un
fluorforo: cumarina, fluorescenas, rodaminas, cianinas, u otros compuestos no fluorescentes como la biotina o el hapteno (ej.:
130
digoxigenina, dinitrofenol) capaces a su vez de unirse posteriormente a una segunda molcula marcada con un fluorforo, como la
avidina en el caso de la biotina, o a un anticuerpo especfico, en el caso del hapteno.
Verificacin del grado de pureza de otros componentes celulares.
Se puede verificar inmunoqumicamente el grado de pureza de las protenas constituyentes del citoesqueleto: utilizando
anticuerpos especficos marcados con un fluorforo, o empleando faloidina tambin marcada con un fluorforo- para
identificar microfilamentos de actina (la faloidina es una micotoxina producida por el hongo Amanita phalloides).
De la misma manera, puede verificarse el grado de pureza de los orgnulos: se pueden emplear colorantes especficos que se
unen a ellos, o anticuerpos dirigidos contra protenas que se encuentran en determinados compartimientos celulares.
131
132
3.3) Nociones de Electroforesis.
Con los mtodos colorimtricos, que son cuantitativos, puedo determinar la cantidad total de protenas que tengo.
La electroforesis, en cambio, es un mtodo cualitativo: me permite separar, identificar y seleccionar un tipo particular de
molcula. La tcnica se emplea sobre protenas, aminocidos, cidos nucleicos
El trmino electroforesis describe la migracin de partculas ionizadas y con una carga elctrica neta, bajo la influencia de un
campo elctrico. Es decir: es una tcnica que separa a las molculas en base a su movilidad en un campo elctrico, dependiendo
esta movilidad del tamao y de la carga elctrica de la molcula.
Muchas molculas biolgicas, como los aminocidos, protenas, nucletidos o cidos nucleicos, poseen grupos ionizables y,
por lo tanto, a un determinado valor de pH, existen en solucin como especies cargadas elctricamente, ya sea
como cationes (+) o como aniones (). Es decir: a cierto pH, toman determinada carga elctrica.
Cuando se aplica un campo elctrico, estas molculas cargadas experimentan una fuerza de atraccin hacia el ctodo (polo
negativo) o hacia el nodo (polo positivo) dependiendo de la naturaleza de su carga neta. As, si se deja transcurrir un cierto
tiempo, las molculas cargadas positivamente se desplazarn hacia el ctodo y aquellas cargadas negativamente se desplazarn
hacia el nodo.
El movimiento de las molculas est gobernado tambin por dos fuerzas adicionales:
a) Friccin: las molculas sufren friccin con el solvente en el cual se encuentran disueltas. Esta friccin dificultar su
movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarn con las molculas de solvente que estn en su camino), lo que
genera una fuerza que se opone al movimiento.
b) Difusin: tendencia de las molculas a moverse en forma aleatoria movimiento browniano- debido a que poseen
energa cintica propia. La energa cintica de las molculas aumenta con la temperatura: a mayor temperatura, mayor
difusin.
La suma de estas tres fuerzas atraccin electrosttica hacia el polo de carga opuesta, friccin, difusin- provoca que las
molculas no migren de una manera homognea, sino en funcin de su carga, tamao y forma.
Para reducir el movimiento de las molculas por efecto de la difusin el movimiento browniano-, se emplea un medio que
oponga ms resistencia a dicho movimiento: un medio que disminuya la energa cintica de las molculas. Un medio de soporte
ideal para conseguir esto, es un gel. El gel consiste en un polmero soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de
agua y forma un tamiz molecular que dificulta el movimiento de los solutos.
Consecuentemente, la migracin electrofortica de las molculas ser ms lenta. La presencia del gel tiene una consecuencia
adicional, ya que aquellas molculas de mayor tamao hallarn mayor resistencia al avanzar a travs de los poros del gel que
aquellas molculas pequeas. Por lo tanto, la friccin que se observa durante el movimiento electrofortico en un gel, depende de la
masa y la forma de la molcula, en adicin a su carga elctrica.
133
Cuando el uso de la tcnica es el anlisis de mezclas de protenas o de cidos nucleicos, utiliza como soporte un gel,
habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para
separaciones electroforticas, dado que renen una serie de propiedades idneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable
y compatibilidad con una gran variedad de compuestos qumicos.
La poliacrilamida es el medio de soporte ms efectivo para la electroforesis de protenas.
La poliacrilamida se forma por copolimerizacin de dos compuestos, la acrilamida y bajas cantidades de bis-acrilamida
(N,N'-metiln-bis-acrilamida, un agente polimerizante), en una reaccin iniciada por la base tetrametiletilndiamina
(TEMED) y el persulfato de amonio (amoniopersulfato).
El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monmero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de
poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bis-acrilamida, formndose as una red de porosidad bastante uniforme, que puede
ser regulada variando las condiciones de la reaccin y las concentraciones de los monmeros.
Segn la concentracin de los monmeros del gel en este caso, concentracin porcentual de
acrilamida-, los poros van a ser ms grandes o ms chicos:
Mayor concentracin Menor poro.
El tamao del poro del gel tambin depende del porcentaje de entrecruzamiento de la acrilamida. A mayor entrecruzamiento,
menor tamao de poro.
El tamao del poro se puede variar, entonces, cambiando las concentraciones tanto de acrilamida como de bisacrilamida.
Porcentajes bajos de acrilamida (3%) dan poros grandes y son tiles para la electroforesis de protenas o cidos nucleicos.
Porcentajes mayores se utilizan para SDS electroforesis, donde se necesita un menor tamao de poro.
La separacin de las molculas dentro del gel est determinada por el tamao relativo del poro. Sea como sea, as adquiere
relevancia el tamao de las molculas a correr en la malla del gel en esta red tridimensional de fibras cruzadas-.
Las molculas pequeas y/o con mayores cargas negativas se movern mejor ms rpidamente- hacia el nodo. Al final
de la corrida electrofortica, habrn avanzado ms.
Las molculas de mayor tamao y/o cargas menos negativas, quedarn cerca del lugar de partida.
Las molculas de carga nula, por otra parte, no sufren migracin. El pH al cual un polianflito tiene carga neta cero se le
denomina su Punto Isoelctrico (PI).
Entre las diversas tcnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis),
probablemente la ms utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente SDS (sodio dodecil sulfato, o
duodecilsulfato de sodio, o dodecilsulfato sdico): modalidad SDS-PAGE. La modalidad SDS-PAGE se usa tanto para
analizar mezclas de protenas, como para ser combinada con tcnicas de inmunoelectrotransferencia.
En la modalidad SDS-PAGE, la separacin de protenas se realiza en un medio desnaturalizante. Usamos -mercaptoetanol
(reduce el pH y reduce los puentes disulfuro) y el detergente aninico SDS (rompe enlaces no covalentes, causando la prdida de la
conformacin nativa, y se liga y mantiene a las protenas en este estado desnaturalizado con una serie de cargas negativas que
aporta) para mantener a las protenas en su estado desnaturalizado.
134
La cantidad de SDS unido a las protenas es proporcional a su tamao: el SDS se une en una proporcin aproximada de 1,4 g
SDS/g protena. Los complejos protena/SDS poseen una estructura elipsoide o de bastn, donde la cadena proteica es distendida y
solubilizada por el detergente.
El detergente SDS incorpora cargas de una manera dependiente de la masa molecular de la protena: todas las protenas
acaban teniendo la misma carga, que est determinada exclusivamente por el SDS. Dado que la relacin final carga/masa queda
constante para las distintas protenas (se anula su carga intrnseca), estas van a ser separadas en el gel poroso fundamentalmente
con base en sus diferencias de peso molecular (PM): a menor tamao, mayor movilidad de la protena, y viceversa.
Se deduce de lo anterior que esta tcnica permite estimar el peso molecular (PM) de una protena, comparando su movilidad
electrofortica con la de protenas de PM conocido. Estas determinaciones poseen un margen de error de 10%.
La determinacin del PM de protenas mediante SDS-PAGE es vlida cuando se analizan cadenas proteicas individuales y
lineales, o aminocidos, en donde se han reducido todos los enlaces disulfuro y por ende, se ha distendido toda la cadena proteica
para su interaccin con el SDS. Bajo estas condiciones, la migracin de las molculas obedece fundamentalmente a su PM.
Si la muestra ha sido reducida con 2-mercaptoetanol (u otro reductor como el ditiotreitol), los enlaces disulfuro intra- e
inter-catenarios son disociados, la estructura cuaternaria se pierde y los complejos supramoleculares se desarticulan dejando
libres a las cadenas peptdicas individuales de las que estaban constituidos-. Tambin se pierden la estructura terciaria y secundaria
de las protenas.
La movilidad electrofortica relativa (Rf) es inversamente proporcional al logaritmo del PM. Trazando un grfico con
estndares de PM conocido, se obtiene una lnea de referencia en la cual se puede interpolar muestras de PM desconocido. El Rf se
calcula dividiendo la distancia (mm) recorrida por la banda en cuestin, entre la distancia recorrida por el colorante azul de
bromofenol (u otro punto de referencia arbitrario). Ejemplo:
Al graficar estos datos en papel semilogartmico (x=Rf, y=Log PM) se observa la relacin mencionada.
El PM estimado para la protena incgnita es de 16.200 daltons, interpolando mediante una regresin lineal en los puntos
adecuados.
135
Antes de la siembra en el gel, las muestras deben ser hervidas 5 minutos en un buffer muestra que contiene los mismos
compuestos agregados al gel: beta mercaptoetanol y SDS. Esto genera y mantiene la desnaturalizacin de las protenas.
Durante la corrida electrofortica, deber considerarse que si la protena estaba compuesta por varias cadenas peptdicas,
estas se separan y el PM total se divide.
Si el complejo supramolecular estaba formado por dos cadenas proteicas idnticas, a stas se les llama homodimricas.
Obviamente, estas dos cadenas proteicas poseern el mismo PM, y migrarn de idntico modo.
Si las cadenas proteicas no son iguales, poseen diferente PM y migrarn de distinta manera: en la corrida electrofortica en
SDS-PAGE se comportarn de diferente manera, aparecern separadas, pese a que pertenecan al mismo complejo supramolecular.
El buffer muestra, adems de -met y SDS, tambin contiene:
a) Un indicador en general, azul de bromofenol- que permite monitorear la corrida, y
b) sacarosa o glicerol, que le da la densidad necesaria al buffer, permitiendo que la muestra en el buffer de corrida
quede en el fondo de la calle de siembra del gel: la muestra queda depositada, sin dispersarse.
Luego de colocar el gel principal de poliacrilamida en el lugar que corresponde, se coloca encima un segundo gel, llamado
stacking o upper gel, que est formado con acrilamida al 4%. Su funcin ser concentrar a las protenas en bandas gruesas antes
de entrar al gel principal. Cuando conectamos la corriente, todas las especies inicas comenzarn a migrar. Los complejos protenaSDS cargados negativamente se movern hacia el nodo. Las protenas se separarn debido a las propiedades del gel principal:
cuanto ms chica sea la protena, ms fcilmente pasar por los poros del gel.
El colorante, al ser la molcula ms pequea, es el que ms fcilmente pasa por el poro del gel, e indica por lo tanto el frente
de corrida. Cuando llega al final del gel, se desconecta la corriente, se retira el gel, y se lo colorea con una solucin de teido:
usualmente Coomassie Blue. Luego del proceso de desteido, slo las protenas quedan coloreadas y se vuelven visibles.
La SDS-PAGE tambin se usa como protocolo de purificacin para determinar la pureza de una muestra. Una protena pura
dar una nica banda. Si la protena tiene 2 subunidades diferentes, veremos 2 bandas que corresponden a cada una de ellas.
136
Geles en condiciones nativas.
La corrida electrofortica puede realizarse en condiciones no desnaturalizantes, es decir, empleando un buffer sin SDS. Esto es
til para el caso particular de evaluar enzimas en base a su actividad biolgica: las enzimas son separadas segn sus distintas
movilidades electroforticas y, finalmente, se puede identificar a la enzima de inters incubando al gel con una solucin del sustrato
de dicha enzima. De esta manera, aparecer un producto coloreado en el sitio de la enzima.
Geles en gradiente de acrilamida.
Son geles en los que la concentracin de poliacrilamida vara uniformemente desde el inicio del mismo (5% acrilamida)
hasta el final (25% acrilamida).
Este tipo de corrida tiene dos ventajas: nos permite separar un rango mayor de masas moleculares relativas de las protenas y,
por otro lado, podremos resolver protenas con pesos moleculares muy similares. Las protenas ms grandes no avanzan desde el
comienzo de la corrida, y el resto se va tamizando ms especficamente.
Isoelectroenfoque.
Esta tcnica separa protenas de acuerdo a su PI (punto isoelctrico). Recordemos que, en el PI, la protena no se mover si se
la somete a un campo elctrico.
Si se coloca una mezcla de protenas en un gradiente de pH, cada molcula se situar en aquel punto del gradiente en donde
el pH sea igual a su PI. El gradiente de pH es generado por una mezcla de polianflitos que cuando son sometidos a un campo
elctrico comienzan a migrar, y dada su propia capacidad de tamponacin, se establece gradualmente este gradiente de pH.
137
Deteccin, estimacin y recuperacin de protenas en los geles.
Anlisis cualitativo.
Uno de los mtodos de tincin de protenas ms comnmente utilizados es el del indicador Coomassie Blue Brilliant R250 (CBB). La tincin se realiza utilizando una solucin al 0.1% de CBB en metanol: agua: cido actico glacial. La mezcla metanolcido acta como desnaturalizante, precipitando o fijando la protena en el gel.
Otro mtodo es el de tincin con plata. Los iones Ag+ se reducen sobre la protena a Ag metlica, dando una banda gris en
el sitio. Esta tcnica es 100 veces ms sensible que la de CBB.
Anlisis cuantitativo.
El anlisis cuantitativo implica medir las cantidades relativas de las distintas protenas que se encontraban presentes en una
muestra, utilizndose para ello un escner densitomtrico.
El fundamento de la tcnica es el siguiente: el gel teido se coloca dentro del aparato, se lo ilumina con luz lser, y se
determina la luz transmitida. Se realiza una representacin grfica de la absorbancia (reas de picos de absorbancia) en funcin de
la distancia de migracin. Para obtener los datos de cantidad de protena se pueden calcular las reas de cada pico.
Otro mtodo, ms barato, se realiza cortando las bandas proteicas teidas del gel, eluyndolas por agitacin en una solucin
de piridina (50%) durante 12 horas, y midiendo espectrofotomtricamente la cantidad de color liberado.
Western blotting.
La tcnica PAGE permite fraccionar o separar protenas de una mezcla, facilitando su anlisis posterior. Para ello se deben
transferir las protenas separadas, desde el gel hacia un papel de nitrocelulosa. La transferencia se realiza por capilaridad o
aplicando electricidad.
ste mtodo se conoce como blotting de protenas o western blotting, y al papel de nitrocelulosa con las protenas
transferidas se le conoce como blot.
Luego de transferidas las protenas, se incuba el blot con una solucin proteica (seroalbmina bovina 10% o leche
descremada 1%) para bloquear sitios de ligando hidrofbicos que queden en el papel de nitrocelulosa.
Posteriormente, se incuba con una solucin de anticuerpo (AC primario) dirigido contra la protena de inters. Para
revelar la banda se utiliza un segundo anticuerpo (AC secundario) marcado con una enzima o istopo radiactivo, que
permita la visualizacin en el blot de la protena buscada.
138
Equipamiento necesario para realizar una electroforesis.
El equipamiento necesario consiste bsicamente en:

1. Una fuente de poder.
2. Una unidad de electroforesis.
Las unidades de electroforesis estn disponibles para correr geles de forma vertical u horizontal. El sistema vertical se utiliza
para separar protenas en geles de poliacrilamida. El gel se forma entre dos placas de vidrio que estn unidas con broches pero
estn separadas por espaciadores de plstico. Las dimensiones de los geles son usualmente de 12 por 14 cm y de 1-2 mm de espesor.
En la parte superior del gel se coloca un peine de plstico que ser removido luego de la polimerizacin, para dar un espacio
fijo para colocar o sembrar las muestras. Cuando se ensambla el aparato, el buffer en la parte inferior del aparato rodea a las placas
de vidrio. Este buffer es esencial para mantener un constante estado de ionizacin de las molculas que sern separadas. Cualquier
variacin en el pH alterar la carga total y por lo tanto la movilidad de las molculas.
Cuando aplicamos una diferencia de potencial (voltaje), las molculas con diferente carga elctrica neta se separarn debido a
sus diferentes movidas electroforticas. El campo elctrico se desconecta antes que las molculas de la muestra lleguen a los
electrodos, separndolas as correctamente.
Para revelar las muestras separadas, podemos utilizar una solucin con colorante adecuado, o por autorradiografa, si la
muestra estaba marcada radiactivamente.
Otros soportes: papel y capa fina de celulosa o slica.
Uno de los primeros soportes utilizados, en estos das se usan menos frecuentemente. Eran tiles para la separacin y anlisis
de molculas pequeas, como aminocidos, pptidos o hidratos de carbono, pero ahora se prefiere separarlos por tcnicas ms
sensibles: ej. HPLC. Con este soporte, la separacin de macromolculas como protenas y cidos nucleicos es muy pobre.
Otros soportes: geles de agarosa.
La agarosa es un polisacrido lineal (PM 12000) formado a partir de subunidades repetidas de agarobiosa, que comprende
unidades alternantes de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. Este polisacrido se utiliza en concentraciones del 1 al 3%.
Los geles se forman suspendiendo agarosa seca en un buffer acuoso que se calienta a ebullicin hasta obtener una mezcla
transparente. Se deja luego solidificar hasta formar un gel rgido a temperatura ambiente. Las propiedades gelificantes se deben a la
formacin de puentes hidrgeno tanto intra como intermoleculares entre las largas cadenas de agarosa. El tamao de poro en el gel
se controla con la concentracin inicial de agarosa: poros grandes se obtienen en bajas concentraciones y poros chicos de altas
concentraciones de polisacrido. Los geles de poros grandes son tiles para la separacin de macromolculas como protenas y
cidos nucleicos.
Los geles de agarosa se utilizan en tcnicas inmunoqumicas como la inmunoelectroforesis o para separar DNA o RNA.
139
Compuestos empleados en la electroforesis.
140
ESTRUCTURA Y CATLISIS DE LOS PRINCIPALES COMPONENTES CELULARES.
Esta seccin comienza ilustrando la estructura y la funcin de la molcula de agua, porque sus propiedades afectan a la
estructura y a la funcin de todos los dems constituyentes celulares.
Luego, para cada clase de molcula orgnica:
1) Se explica la estructura covalente de sus subunidades monomricas
o de sus constituyentes ms simples: caso lpidos-.
2) Se describen las estructuras de las macromolculas y complejos supramoleculares derivados de ellas
o las estructuras moleculares derivadas de la agregacin de aquellos constituyentes ms simples: caso lpidos-.
Las macromolculas polimricas de los sistemas vivos son entidades qumicas muy ordenadas, con secuencias especficas de
subunidades monomricas, lo que da lugar a estructuras y funciones concretas. En base a esto, pueden enunciarse tres principios
interrelacionados:
1) la estructura nica de cada macromolcula determina su funcin,
2) las interacciones no covalentes juegan un papel crtico en la estructura y, por lo tanto, en la funcin de las
macromolculas
3) las subunidades monomricas de las macromolculas polimricas estn dispuestas segn secuencias especficas, lo que
representa una forma de informacin de la que depende el estado vivo ordenado
La relacin entre estructura y funcin es especialmente evidente en las protenas, que muestran una extraordinaria diversidad
de funciones. Pero del mismo modo se pueden entender las funciones especiales de los polisacridos, cidos nucleicos y lpidos:
como la consecuencia directa de su estructura qumica.
A medida que pasemos de unidades monomricas a polmeros cada vez mayores, el nfasis se desplaza desde los enlaces
covalentes a las interacciones no covalentes. Los enlaces covalentes imponen restricciones sobre la forma adoptada por una
biomolcula, tanto a nivel monomrico como macromolecular. Las numerosas interacciones no covalentes, sin embargo, determinan
la conformacin nativa estable de las molculas grandes las estabilizan- a la vez que permiten la flexibilidad necesaria para
su funcin biolgica.
141
Como veremos, las interacciones no covalentes son esenciales para que las enzimas manifiesten su poder cataltico, para
la interaccin especfica de los pares de bases complementarios en cidos nucleicos, y para el ordenamiento y las propiedades de los
lpidos en las membranas.
Con respecto al principio de que las secuencias de unidades monomricas son ricas en informacin, resulta obvio en la
discusin sobre los cidos nucleicos. Pero a) las protenas y b) algunos oligosacridos tambin son molculas ricas en informacin:
a) La secuencia de aminocidos es una forma de informacin que dirige el plegamiento de la protena hacia su estructura
tridimensional nica, determinando su funcin.
b) Algunos oligosacridos tambin tienen estructuras tridimensionales nicas, producto de su secuencia especfica de
subunidades monomricas, que pueden ser reconocidas por otras macromolculas.
En el ltimo captulo de la seccin, se describe la manera en que los sistemas de sealizacin especficos regulan las
actividades de las biomolculas dentro de una clula, dentro de un rgano y entre rganos, para mantener a un organismo en
homeostasis. Recordemos que:
142
1. El agua.
1.1) Interacciones dbiles en los sistemas acuosos.
Los puentes de hidrgeno entre molculas adyacentes de agua proporcionan fuerzas de cohesin interna
que determinan las propiedades de dicho lquido. Como resultado de estas interacciones dbiles en los sistemas
acuosos:
El agua es lquida a temperatura ambiente.

El agua tiene un punto de fusin, un punto de ebullicin y un calor de vaporizacin ms elevados que
la mayora de los disolventes comunes.
Se ve favorecido el extremo ordenamiento de las molculas, tpico del agua cristalina (hielo).
Las biomolculas polares se disuelven fcilmente en agua, porque pueden reemplazar las interacciones
agua-agua por interacciones agua-soluto energticamente ms favorables.
Por el contrario, las biomolculas apolares interfieren con las interacciones agua-agua pero no son capaces
de formar interacciones agua-soluto. En consecuencia, las molculas apolares son muy poco solubles en agua. En
soluciones acuosas, las molculas apolares tienden a agruparse entre s.
Los puentes de hidrgeno, las interacciones inicas, interacciones hidrofbicas e interacciones de van der
Waals, son interacciones individualmente dbiles; pero colectivamente tienen una influencia muy significativa
sobre la estructura tridimensional de protenas, cidos nucleicos, polisacridos y lpidos de membrana.
Las propiedades extraordinarias del agua son consecuencia de los enlaces de hidrgeno.
En una molcula de agua, cada tomo de hidrgeno comparte un par electrnico con el tomo de oxgeno
central. El ncleo de oxgeno atrae electrones ms fuertemente que el ncleo de cada hidrgeno, porque el
oxgeno es ms electronegativo. Por lo tanto, el H y el O comparten los electrones de forma desigual: los
electrones se sitan en los alrededores del tomo de oxgeno con mayor frecuencia. El resultado de esto es la
formacin de un dipolo elctrico en la molcula del agua: cada hidrgeno es portador de una carga positiva
parcial (+) y el tomo de oxgeno es portador de una carga negativa parcial igual a la suma de las dos cargas
positivas parciales (2).
Como resultado de lo anterior, existe una atraccin electrosttica entre el tomo de oxgeno de una
molcula de agua y el hidrgeno de otra. A esta atraccin, que no se da necesariamente entre molculas de
agua, se le denomina puente de hidrgeno.
La energa de disociacin de enlace (E.D.E., o energa requerida para romper un enlace) de un puente de
hidrgeno en el agua lquida, es de aproximadamente 23 kJ/mol. A su vez, el puente de hidrgeno tiene un 10%
de carcter covalente y un 90% de carcter electrosttico.
La E.D.E. de un enlace covalente OH en el agua, es de 470 kJ/mol.
La E.D.E. de un enlace covalente CC, es de 348 kJ/mol.
143
A temperatura ambiente, la energa trmica de una solucin acuosa es del mismo orden de magnitud que la
necesaria para romper los puentes de hidrgeno. El tiempo de vida de cada puente de hidrgeno es de entre 1 y
20 picosegundos (1ps = 10^12 s), y al romperse un puente de hidrgeno, se forma otro en algn lugar de la
solucin en el lapso de 0,1 ps.
Se ha aplicado el trmino flickering clusters (agrupamientos fluctuantes) a las agrupaciones de corta
duracin de molculas de agua unidas por puentes de hidrgeno en fase lquida.
El ordenamiento casi tetradrico de los orbitales alrededor de los tomos de oxgeno permite que, en el
agua lquida a temperatura ambiente, cada molcula de agua forme puentes de hidrgeno con un promedio de
otras 3,4 molculas.
Por el contrario, en el hielo, cada molcula est fija en el espacio y forma puentes de hidrgeno con otras 4
molculas de agua, creando una red cristalina regular. Este retculo cristalino es menos denso que el agua lquida,
y por eso flota en el agua lquida.
Dado que el H la variacin de entalpa relacionada con la ruptura y formacin de enlaces- es positivo para
la fusin y evaporizacin, es el aumento de la entropa (S) lo que provee el empujn energtico e impulsa estas
transformaciones: el S hace que G sea negativa. Vapor de agua ms entrpico que el hielo.
El agua forma puentes de hidrgeno con los solutos polares.

Los puentes de hidrgeno se forman fcilmente entre:
Un tomo electronegativo: normalmente oxgeno o nitrgeno con un par de electrones no

enlazantes aceptor de hidrgeno.
Y un tomo de hidrgeno unido covalentemente a otro tomo electronegativo dador de
hidrgeno.
El enlace CH es dbilmente polar, debido a que el carbono es ligeramente ms electronegativo que el

hidrgeno. El hidrgeno covalentemente unido al carbono no participa en la formacin de puentes.
Una molcula polar posee una separacin de sus cargas elctricas en diferentes regiones.
Las biomolculas polares se disuelven fcilmente en el agua. Esto ocurre debido al efecto estabilizador de
los puentes de hidrgeno que se forman entre los grupos polares (ej. grupos hidroxilo, oxgeno carbonlico) de
dicha biomolcula y las molculas polares de agua
Entonces Si una molcula puede formar puentes de hidrgeno con el agua, es soluble en agua. Este es el
caso de los azcares, alcoholes, aldehdos, cetonas y compuestos que contienen enlaces NH.
Los puentes de hidrgeno alcanzan una fuerza mxima cuando el tomo de hidrgeno y los dos tomos que
lo comparten se encuentran en lnea recta: tomo aceptor alineado con el tomo dador. Por esto se dice que los
puentes de hidrgeno tienen un carcter altamente direccional.
Los puentes de hidrgeno son capaces de mantener un ordenamiento geomtrico especfico: le confieren
estructuras tridimensionales muy precisas a las macromolculas.
144
El agua interacta electrostticamente con los solutos cargados.

El agua disuelve sales como el NaCl mediante la hidratacin y estabilizacin de los iones Na+ y Cl-.
La hidratacin acta debilitando las interacciones electrostticas entre ellos y contrarrestando su tendencia
a asociarse en una red cristalina.
La estabilizacin consiste en que estos iones son ms estables asociados al agua que completamente
disasociados en la solucin.
Lo mismo ocurre con las biomolculas cargadas: compuestos con grupos funcionales tales como los cidos
carboxlicos ionizados (COO-), las aminas protonadas (NH3), los steres y anhdridos fosfricos. El agua disuelve
fcilmente este tipo de compuestos reemplazando puentes de hidrgeno soluto-soluto por otros puentes solutoagua.
La entropa aumenta cuando se disuelve una sustancia cristalina. Este incremento de entropa que se
produce en el sistema es el principal responsable de la facilidad con la que se disuelven en agua las sales: la
disolucin tiene lugar con una variacin favorable en la energa libre de Gibbs.
Los gases apolares se disuelven mal en agua.

Los gases biolgicamente importantes como el CO2, el O2 y el N2- son apolares. La naturaleza apolar de
estos gases, y la disminucin de entropa cuando se introducen en la disolucin acuosa, hacen que sean muy
poco solubles en agua.
Protenas transportadoras hidrosolubles (hemoglobina, mioglobina) facilitan el transporte de O2.
El CO2 forma cido carbnico (H2CO3) en disolucin acuosa, que es transportado en forma de ion
bicarbonato (HCO3-), ya sea en forma libre soluble en agua (aprox. 100g/L a 25C) o unido a hemoglobina.
Los compuestos apolares fuerzan cambios energticamente desfavorables en la estructura del agua.
La disolucin en agua de compuestos hidrofbicos, da lugar a un descenso significativo de la entropa. Es
decir: agregar un soluto apolar a un solvente polar causa una reduccin de entropa en el sistema. Por qu?
En la vecindad del soluto apolar, las molculas de agua estn restringidas en sus orientaciones posibles:
forman una capa o jaula de molculas ordenadas. Es este orden de las molculas de agua lo que reduce la
entropa del sistema.
Como consecuencia de esta variacin desfavorable de la entropa, los grupos apolares se agrupan o
agregan: disminuyen as la superficie apolar que obliga al ordenamiento, y el sistema alcanza la mxima
estabilidad termodinmica posible. Las fuerzas que mantienen unidas a estas regiones apolares son otro tipo de
interaccin dbil: las interacciones hidrofbicas.
Las interacciones hidrofbicas no consisten en ninguna atraccin intrnseca entre las partes apolares. Los
grupos apolares no se atraen, solamente se mantienen unidos para minimizar la capa ordenada de agua,
estableciendo un estado de mayor entropa. Este fenmeno se da tanto en las molculas completamente
apolares como en los compuestos anfipticos.
145
Los compuestos anfipticos son molculas que

contienen regiones polares (o cargadas) y regiones
apolares.
Cuando se mezcla un compuesto anfiptico con agua,
la regin polar hidroflica interacta favorablemente
con el disolvente, pero la regin apolar hidrofbica
tiende a evitar el contacto con el agua: el contacto
provoca esta disminucin en la entropa del sistema.
Las molculas anfipticas en disolucin ac. se organizan
en micelas: agregados o agrupaciones que secuestran a
los grupos hidrofbicos lejos del agua, minimizando an
ms la capa ordenada de H2O y aumentando an ms la
entropa. Slo las partes ms polares interactan con el
agua. Estos agregados o micelas pueden contener cientos o miles de molculas.
Muchas molculas son anfipticas: protenas, pigmentos, algunas vitaminas, esteroles y
los fosfolpidos de las membranas. Las estructuras formadas por estas molculas anfipticas
se estabilizan mediante interacciones hidrofbicas entre las regiones apolares.
Las interacciones hidrofbicas entre lpidos, y entre lpidos y protenas, pueden

determinar estructuras como las de las membranas biolgicas.
Las interacciones hidrofbicas entre aminocidos apolares, estabilizan las estructuras

tridimensionales de las protenas.
Micela
Los solutos polares tambin producen cierto ordenamiento de las molculas de agua, pero el efecto es
mucho menos significativo que con los solutos apolares.
La liberacin de agua ordenada, a su vez, puede empujar termodinmicamente la formacin de un
complejo enzima-sustrato. Es decir, que parte de la fuerza que impulsa la unin de un sustrato polar a la
superficie polar complementaria de una enzima, es la variacin favorable de entropa.
Cuando la enzima y el sustrato estn separados, fuerzan a las molculas circundantes de agua a formar una
capa ordenada. La unin de enzima y sustrato mediante interacciones hidrofbicas, puentes de hidrgeno e
interacciones inicas, secuestra o minimiza parte de las superficies que producen el ordenamiento de H2O:
libera parte del agua ordenada, lo que genera un consecuente aumento en la entropa del sistema, empujando
termodinmicamente la formacin del complejo.
Interacciones de van der Waals.

Las interacciones de van der Waals son atracciones interatmicas dbiles. En qu consisten?
Cuando dos tomos no cargados se encuentran muy cerca, las nubes electrnicas que los rodean se
influyen. Variaciones al azar en las posiciones de los electrones alrededor de un ncleo pueden crear un dipolo
elctrico transitorio en un tomo, que induce un dipolo elctrico transitorio opuesto en otro tomo cercano.
Los dos dipolos se atraen dbilmente, con lo que los ncleos se acercan ms.
(La atraccin de los ncleos no est esquematizada en la imagen).

146
A medida que los dos ncleos se acercan entre s, sus nubes electrnicas empiezan a repelerse. En el punto
determinado en que la atraccin de van der Waals equilibra exactamente esta fuerza repulsiva, se dice que los
ncleos se encuentran en contacto de van der Waals.
Adems, cada tomo posee un radio de van der Waals, medida de lo que este tomo permitir acercarse a
otro: los radios de van der Waals describen las dimensiones espaciales de los tomos.
Cuando dos tomos se unen covalentemente, los radios atmicos en el punto de enlace son menores que
los radios de van der Waals, porque el par de electrones compartido acerca los dos tomos.
Las interacciones dbiles son cruciales para la estructura y funcin de las macromolculas.
Las interacciones no covalentes que hemos descrito puentes de hidrgeno, interacciones inicas,
hidrofbicas y de van der Waals- son dbiles, pero el efecto acumulativo de muchas interacciones de este tipo
puede ser muy significativo.
Las interacciones hidrofbicas son sustancialmente reforzadas por un disolvente de polaridad elevada
(una disolucin salina concentrada, por ejemplo).
La fuerza de los puentes de hidrgeno depende del grado de alineamiento de los tomos unidos.
La fuerza de las interacciones inicas depende de la polaridad del disolvente.
Estos enlaces dbiles se forman y rompen continuamente.

a) La formacin contribuye a un descenso neto de la energa libre del sistema.
b) La disociacin de dos biomolculas asociadas de forma no covalente mediante mltiples interacciones
dbiles, requiere que todas estas interacciones se destruyan al mismo tiempo. Dado que las
interacciones fluctan al azar, tal destruccin simultnea es muy poco probable.
La estructura ms estable (nativa) de la mayora de las macromolculas, es aquella en la que se maximizan
las posibilidades de uniones dbiles.
El plegamiento de una cadena polipeptdica o polinucleotdica en su forma tridimensional viene

determinado por este principio.
La unin de antgenos a anticuerpos especficos depende de los efectos acumulativos de muchas
interacciones dbiles.
La energa liberada cuando una enzima y su sustrato se unen de manera no covalente, es la fuente
principal del poder cataltico de la enzima.
La unin de una hormona o un neurotransmisor a su receptor celular proteico es el resultado de
interacciones dbiles.
Una consecuencia del gran tamao de las enzimas y de los receptores es que sus grandes superficies
proporcionan muchas oportunidades para el establecimiento de interacciones dbiles.
147
Los solutos afectan a las propiedades coligativas de las disoluciones acuosas.

Existen cuatro (4) propiedades coligativas ligadas-: presin de vapor, punto de ebullicin, punto de fusin
y presin osmtica.
Los solutos de cualquier naturaleza alteran las propiedades coligativas del agua disolvente al disminuir la
concentracin efectiva de agua: la concentracin de agua es menor en las disoluciones que en el agua pura.
El efecto de la concentracin de soluto sobre las propiedades coligativas del agua es independiente de las
propiedades qumicas del soluto. Depende nicamente del nmero de partculas de soluto (molculas, iones) en
una determinada cantidad de agua.
Las molculas de agua tienden a trasladarse de una regin de elevada concentracin de agua a una de
concentracin inferior. Si dos disoluciones acuosas diferentes estn separadas por una membrana
semipermeable, las molculas de agua que difunden de la regin de alta concentracin de agua hacia la regin de
menor concentracin de agua producen presin osmtica ().
La presin osmtica es la fuerza necesaria para oponerse al movimiento del agua. Ms especficamente,
puede definirse como la presin que se debe aplicar a una solucin para detener el flujo neto de disolvente a
travs de una membrana semipermeable.
La osmolaridad de una disolucin, por otra parte, es la cantidad de partculas de un soluto en la disolucin.
Ms especficamente, es el producto de la concentracin molar del soluto y el factor de vant Hoff (el grado de
disociacin de ese soluto en especies inicas).
La osmosis puede definirse como el movimiento de agua a travs de una membrana semipermeable,
impulsado por diferencias en la presin osmtica.
148
1. El agua.
1.2) Ionizacin del agua, de cidos dbiles y de bases dbiles.
Como vimos, gran parte de las propiedades del agua como disolvente se puedan explicar en funcin de la
molcula de H2O sin carga. Pese a esto, tambin deben tomarse en cuenta:
La dbil tendencia del agua a ionizarse reversiblemente en iones hidrgeno (H+) y en iones hidroxilo (OH-), y
La ionizacin de cidos y bases dbiles disueltos en agua,
El agua pura est ligeramente ionizada. Pese a esto, en disolucin no existen los protones libres. Los
protones son inmediatamente hidratados a iones hidronio (H3O+). La hidratacin de los protones disociados es
virtualmente instantnea gracias a los puentes de hidrgeno entre las molculas de agua.
Ningn protn individual se mueve muy lejos a travs del volumen de la disolucin, pero una serie de saltos
de protones entre molculas de agua unidas por puentes de hidrgeno produce el movimiento neto de un
protn a una gran distancia en un tiempo notablemente corto.
Como resultado de la elevada movilidad neta del H+, las reacciones cido-base en disolucin acuosa son, en
general, excepcionalmente rpidas. El salto de protones tambin desempea un papel en las reacciones
biolgicas de transferencia de electrones.
149
Un salto de protones es una sucesin de liberaciones e hidrataciones, a corta distancia, de protones. El salto
de protones ocurre a lo largo de una serie de molculas de agua unidas por puentes de hidrgeno. El resultado
del salto de protones: un protn posee un movimiento neto a gran velocidad y a una gran distancia.
El salto de protones explica la elevada movilidad inica de los H+ comparada con otros cationes
monovalentes como el Na+ o el K+.
El principio de saltos de protones o conduccin del protn en el agua se conoce hace 200 aos, y se le
denomina mecanismo Grotthuss. Est basado en la asuncin de que no es un solo protn especfico movindose
de una molcula a otra, sino que el salto de un protn en la ruta de puentes de hidrgeno provoca el salto del
siguiente protn de la ruta y, por ende, la escisin de un enlace covalente O-H por cada salto.
Es decir: un protn se acopla a una molcula de agua, y esto causa que otro protn deje dicha molcula y se
asocie a una segunda molcula de agua en algn otro lugar.
Las molculas de agua danzan unas alrededor de otras hasta que consiguen un estatus energticamente
favorable. Solo entonces un protn saltar a lo largo de la carretera de puentes de hidrgeno hacia otra
molcula. Como resultado, hay una formacin temporal de molculas de agua protonadas con tres protones-.
Cuantificacin del grado de ionizacin.

Es necesaria una manera de expresar el grado de ionizacin del agua (y otras sustancias) en trminos
cuantitativos. El grado de ionizacin de cualquier sustancia est dado por su posicin del equilibrio, denominada
constante de equilibrio, Keq.
La posicin del equilibrio o constante de equilibrio es un valor en funcin de la concentracin de reactivos
(A y B) y de productos (C y D) en el equilibrio termodinmico- tal que, cuando los productos son inicos,
representa una medida del grado de ionizacin en el equilibrio.
La constante de equilibrio es fija y caracterstica para cada reaccin qumica a una temperatura dada. Define
la composicin de la mezcla final en el equilibrio, independientemente de las cantidades iniciales de reactivos y
productos.
De modo inverso, podemos calcular la constante de equilibrio de una reaccin dada a una temperatura
determinada si se conocen las concentraciones en el equilibrio de todos los reactivos y productos.
Sea como sea, la constante de equilibrio es una expresin de la tendencia de una reaccin qumica a llegar a
su final. Cuando Keq posee un valor elevado, la reaccin tiene lugar hasta que los reactivos se han convertido casi
completamente en productos. Si los productos son inicos, se puede decir que la sustancia posee un elevado
grado de ionizacin en trminos cuantitativos.
Recordemos la relacin entre la energa libre de Gibbs y la constante de equilibrio: G es una medida de la
distancia de un sistema a su posicin de equilibrio. Cuando una reaccin ha alcanzado el equilibrio, no persiste
ninguna fuerza que la induzca a ir en una direccin u otra, y no puede realizar trabajo G=0.
En base a lo anterior:
Keq >> 1, la variacin de la energa libre de Gibbs es grande y negativa. Reaccin tiende a producirse.
Keq << 1, la variacin de la energa libre de Gibbs es grande y positiva. Reaccin no tiende a producirse.
150
La ionizacin del agua se expresa mediante un Kw.

El grado de ionizacin del agua en el equilibrio es pequeo (a 25C, slo dos molculas de cada 10^9 estn
ionizadas en un momento dado).
La Keq para la ionizacin reversible del agua es
A 25C, la concentracin del agua pura es de 55,5M. Si reemplazamos esta concentracin por el
denominador de Keq, y despejamos, obtenemos la nueva expresin:
(55,5M).(Keq) = [H+].[OH-] = Kw
en donde Kw es el denominado producto inico del agua a 25C,
El valor de Keq, determinado experimentalmente mediante conductividad elctrica, es Keq = 1,8x10^(16) M.

En base al valor de Keq a 25C Kw= 1,0x10^(14) M.
Por esto, el producto [H+].[OH-] en disoluciones acuosas a 25C es siempre 1x10^(14) M. Cuando existen
concentraciones exactamente iguales de H+ y OH-, tal como sucede en el agua pura, se dice que la solucin est a
pH neutro [H+] = [OH-] = 10^(7) M.
Entonces, siempre que la concentracin de H+ sea superior, la de OH- ser inferior, y viceversa: el producto de
ambos factores debe resultar siempre en Kw. Adems, podemos calcular cualquiera de los dos factores si
conocemos el otro factor.
El producto inico del agua, Kw, es la base terica de la escala de pH. La escala de pH constituye una forma
conveniente de designar la concentracin de iones hidronio y, por consiguiente, de iones hidroxilo- en cualquier
solucin acuosa entre 1M de H+ y 1M de OH- pH= log (1/[H+]) en donde p denota logaritmo negativo de.
La escala de pH es logartmica, no aritmtica. Si el pH de dos soluciones difiere 1 unidad de pH significa que
una de ellas tiene una concentracin de H+ diez veces superior a la de la otra.
El pH se puede medir, aproximadamente, utilizando diversos colorantes indicadores: fenolftalena, rojo fenol,
tornasol. Experimentan cambios de color cuando se disocia un protn de la molcula de colorante.
Determinaciones ms precisas del pH se hacen con un electrodo de vidrio selectivamente sensible a la
concentracin de protones, pero insensible al Na+, K+ y otros cationes: un pHmetro o peachmetro.
Los cidos y bases dbiles tienen constantes de disociacin caractersticas.

Los cidos clorhdrico (HCl), sulfrico (H2SO4), carbnico (H2CO3), fosfrico (H3PO4), ntrico (HNO3) y el
grupo carboxilo de la glicina son cidos fuertes: estn completamente ionizados en soluciones acuosas (Keq
elevadas). El NaOH y KOH son bases fuertes: tambin estn completamente ionizados.
Mientras ms fuerte un cido o base mayor cantidad de reactivo se ioniza en productos.
De mayor inters para la bioqumica es el comportamiento de los cidos y bases dbiles: aquellos que no
estn completamente ionizados al disolverse en agua. Son frecuentes en los sistemas biolgicos, y juegan
papeles importantes en el metabolismo y su regulacin.
Es importante recordar que: los cidos son dadores de protones, las bases son aceptores de protones. Un
dador de H+ y su correspondiente aceptor conforman un par cido-base conjugados. Cuanto ms fuerte sea el
cido, mayor ser su tendencia a perder su protn. La tendencia de cualquier cido (HA) a perder un protn y
151
formar su base conjugada (A-) se define mediante una constante de equilibrio denominada
constante de disociacin Keq = Ka
El cido actico (CH3COOH), un dador de protones, y el anin acetato (CH3COO), el correspondiente

aceptor de protones, constituyen un par cido-base conjugados.
El cido actico es un cido relativamente dbil Ka = 1,74 x 10^(5) M.
Otros cidos relativamente dbiles son el in amonio (NH4+), el in bicarbonato (HCO3-) producto del cido
carbnico, el dihidrgeno fosfato (H2PO4-) y el monohidrgeno fosfato (HPO4 2-) productos ambos del cido
fosfrico, y el grupo amino de la glicina.
Los valores de pKa tambin son relevantes: el pKa es una expresin anloga a la del pH.
pKa = log (1/Ka) = log Ka
Cuanto ms fuerte es el cido, mayor es su Ka.

Cuanto mayor es el Ka, menor es el pKa.
Las curvas de titulacin proporcionan el pKa de los cidos dbiles.

La titulacin (o anlisis volumtrico) se puede utilizar para determinar la cantidad de un cido en una
solucin dada.
A la solucin del cido se aade una solucin de una base fuerte, normalmente hidrxido sdico, de
concentracin conocida. La base fuerte se aade en pequeas porciones, hasta que se ha consumido
(neutralizado) el cido, segn se determina mediante un colorante indicador o un peachmetro (pH=7, final de la
titulacin). En base a la concentracin y al volumen de base fuerte aadida, se puede calcular la concentracin de
cido en la solucin original.
Una curva de titulacin es una grfica del pH (ordenadas) frente a la cantidad de base fuerte aadida
(abscisas). Esta cantidad de base fuerte aadida se expresa como la fraccin 0.1, 0.2 0.9, 1.0- de la cantidad
de base necesaria para neutralizar completamente al cido (1.0= neutralizacin completa). La curva de titulacin
muestra el pKa del cido.
152
Cmo se realiza la titulacin? El pH de la mezcla se mide despus de cada adicin de base fuerte a la
solucin de cido (se aade 1/10 de la cantidad de base fuerte necesaria para neutralizar la solucin de cido
dbil por cada adicin).
Este valor de pH se representa frente a la fraccin aadida de cantidad total de base fuerte requerida para
convertir todo el cido en su forma desprotonada. Los puntos obtenidos dan la curva de titulacin. En el punto
medio de la titulacin (base 0.5) las concentraciones del dador de protones y del aceptor de protones son iguales
(concentraciones iguales de cido-base conjugada), y el pH es numricamente igual al pKa del cido.
De esto se puede deducir que el pKa de un cido dbil es el valor del pH de punto medio, en el cual la
concentracin de dicho cido es igual a la concentracin de su base conjugada. La explicacin y demostracin
matemtica de esto estn dadas por la ecuacin de Henderson-Hasselbalch.
El rasgo ms importante de la curva de titulacin de un cido dbil es que muestra la zona til de capacidad
tamponante: regin de relacin entre [cido dbil] y [base conjugada] en la que el pH vara mnimamente a
causa de la adicin de ms base fuerte. Esta regin til de capacidad tamponante se encuentra,
generalmente, entre el 10% (0.1) y el 90% (0.9) de la titulacin del cido dbil. Adems, la regin
til de capacidad tamponante se extiende alrededor de 1 unidad de pH a cada lado del pH de punto
medio (pKa) de la curva de titulacin de un cido dbil.
El tamponamiento es el resultado de dos equilibrios de reaccin reversibles que tienen lugar en una
disolucin de concentraciones casi iguales de dador de protones y de su aceptor de protones conjugado. Siempre
que se aade OH o H+ a un tampn, el resultado es un pequeo cambio en el cociente de las concentraciones
relativas del cido dbil y de su anin y, por lo tanto, un pequeo cambio de pH.
El pKa expresa la fuerza relativa de un cido o base dbiles, en escala logartmica:
Los cidos ms fuertes alcanzan la igualdad de concentracin con su base conjugada a un pH ms bajo
(pKa ms bajo; regin de tamponamiento ms baja).
Las bases ms fuertes alcanzan la igualdad de concentracin con su cido conjugado a un pH ms alto
(pKa ms alto; regin de tamponamiento ms alta).
153
154
1. El agua.
1.3) Tamponamiento contra cambios de pH en los sistemas biolgicos.
Casi todos los procesos biolgicos son dependientes del pH: un pequeo cambio en el pH produce un gran
cambio en la velocidad del proceso. Esto es cierto tambin para aquellas reacciones en las que no existe un papel
aparente para los iones H+.
Las enzimas que catalizan las reacciones celulares, y muchas molculas sobre las que actan, contienen
grupos ionizables con valores de pKa caractersticos.
Ej. Los grupos amino y carboxilo protonados de los aminocidos y el grupo fosfato de los nucletidos,
funcionan como cidos dbiles: su estado inico depende del pH del medio que los rodea. Y es importante
recordar que las interacciones inicas se cuentan entre las fuerzas que estabilizan una molcula proteica y
permiten que una enzima reconozca y se fije a su sustrato.
Por esto, las clulas y organismos mantienen un pH citoslico especfico y constante: mantiene a las
biomolculas en su estado inico ptimo, normalmente cerca de pH 7. En los organismos multicelulares, pH de
los fluidos extracelulares estrechamente regulado.
El pH se mantiene constante gracias a los tampones biolgicos: mezclas de cidos dbiles y sus bases
conjugadas. El tamponamiento biolgico se ilustra mediante los sistemas tampn del fosfato y el carbonato en el
hombre.
Los tampones son mezclas de cidos dbiles y sus bases conjugadas.

Los tampones son sistemas acuosos que tienden a resistir cambios en su pH cuando se aaden pequeas
cantidades de cido (H+) o base (OH-).
Un sistema tampn consiste en una mezcla de igual concentracin de un cido dbil (dador de protones) y
su base conjugada aceptor de protones).
La regin til de capacidad tamponante (o margen de tamponamiento) es una zona relativamente plana
que se extiende alrededor de 1 unidad de pH a cada lado del pH de punto medio (pKa) de la curva de titulacin de
un cido dbil.
En esta regin tamponante, existen aprox. las mismas concentraciones del par cido dbil-base conjugada,
y una cantidad de H+ o OH- aadida al sistema tiene un efecto mucho menor sobre el pH que la misma cantidad
aadida fuera del margen de tamponamiento.
Exactamente en el punto medio de la regin tamponante (pKa) el poder tamponante del sistema es
mximo: se produce el mnimo cambio de pH cuando se adiciona OH+ o H+. Este cambio de pH es muy pequeo
si lo comparamos con el cambio de pH que se producira si se aadiese la misma cantidad de OH- o H+ al agua
pura o a una disolucin de la sal de un cido fuerte y una base fuerte, tal como NaCl, que no tiene capacidad
tamponante.
Cada par conjugado cido-base tiene una zona caracterstica de pH en la que es un tampn eficaz. El par
dihidrgeno fosfato/monohidrgeno fosfato tiene un pKa= 6,86 sistema tampn eficiente entre
aproximadamente pH 5,9 y pH 7,9.
El par ion amonio/amonaco con un pKa=9,25 sistema tampn eficiente entre aprox. pH 8,3 y pH 10,3.
155
Los cidos o bases dbiles tamponan clulas y tejidos contra cambios de pH.
Los fluidos intracelular y extracelular de los organismos poseen un pH caracterstico y prcticamente
constante. Los sistemas tampn proporcionan la primera lnea de defensa del organismo contra los cambios del
pH interno.
Ej.: la cadena lateral de la histidina tiene un pKa= 6. Las protenas que contienen residuos de histidina
pueden tamponar aprox. entre pH 5 y pH 7.
Ej.: El ATP tambin posee grupos ionizables que pueden contribuir al poder tamponante del citoplasma.
Algunos orgnulos altamente especializados y compartimientos extracelulares contienen elevadas
concentraciones de compuestos que contribuyen a la capacidad tamponante: los cidos orgnicos tamponan las
vacuolas de las clulas vegetales; el amonaco tampona la orina.
Dos tampones biolgicos especialmente importantes, que mantienen el pH fisiolgico, son:
Sistema tampn del fosfato

Sistema tampn del bicarbonato
El sistema tampn del fosfato presenta su efectividad mxima a un pH prximo a su pKa de 6,86. Tiende a
resistir cambios de pH en el intervalo entre 5,9 y 7,9: tampn efectivo en los fluidos biolgicos (en mamferos,
por ejemplo, pH de fluidos extracelulares y mayora de compartimientos citoplasmticos en el intervalo de 6,9 y
7,4.
El plasma sanguneo (pH 7,4) est tamponado en parte por el sistema del bicarbonato: cido carbnico
como dador de protones, in bicarbonato como aceptor de protones.
La actividad cataltica de las enzimas es especialmente sensible a los cambios de pH. Las enzimas tienen un
mximo de actividad cataltica a un pH caracterstico: pH ptimo. A ambos lados del pH ptimo, la actividad
cataltica desciende a menudo de forma abrupta: se producen grandes diferencias en la velocidad de las
reacciones cruciales catalizadas enzimticamente.
156
1. El agua.
1.4) El agua como reactivo.
El agua no es slo un disolvente: puede participar directamente en las reacciones qumicas de las clulas
vivas. Estas reacciones son de dos tipos:
Reaccin de hidrlisis: una molcula de agua se divide y sus tomos pasan a formar parte de otra
especie qumica. La hidrlisis de una molcula orgnica causa la ruptura de un enlace covalente
para formar dos molculas orgnicas con grupos funcionales que incluyen los tomos del agua (se
adicionan los elementos del agua).
Reaccin de condensacin: es la reaccin inversa a la hidrlisis. Dos molculas orgnicas o partes

de una misma molcula, en el caso que la condensacin sea intramolecular- se combinan mediante
un enlace covalente, eliminando los elementos del agua en dicha posicin, acompaando la
reaccin con formacin de agua (se eliminan los elementos del agua).
Las reacciones de hidrlisis, catalizadas por enzimas denominadas hidrolasas, son casi siempre exergnicas.
La formacin de polmeros celulares a partir de sus subunidades es mediante reacciones de condensacin:
endergnicas. Las clulas salvan este obstculo termodinmico mediante el acoplamiento de reacciones
endergnicas de condensacin con procesos exergnicos como la ruptura del enlace anhdrido del ATP.
157
El agua metablica, formada a partir de alimento y grasas almacenadas, es suficiente para permitir que
algunos animales que viven en hbitats muy secos sobrevivan sin beber agua durante largos perodos de tiempo.
Adems, el agua interviene en procesos bioqumicos mediante reacciones de oxidacin-reduccin:
En la formacin de HCO3 a partir de CO2 y H2O, reaccin catalizada por la enzima carbnico anhidrasa, el
agua no es tan solo un sustrato. El agua acta en un proceso de transferencia de protones, formando una red de
molculas de agua unidas por puentes de hidrgeno a travs de las que se produce un salto de protones.
Las plantas y algas verdes utilizan la energa de la luz solar para romper el agua en el proceso de la
fotosntesis. En esta reaccin, un aceptor de electrones que vara segn el tipo de organismo fotosintticoreacciona con el agua, que acta como dador de electrones.
El alto calor especfico del agua, adems, es til para las clulas y organismos porque permite que el agua
acte como un tampn trmico, permitiendo que la temperatura de un organismo permanezca relativamente
constante cuando vara la temperatura del aire o se genera calor como subproducto del metabolismo.
El alto grado de cohesin interna del agua lquida, debido a los puentes de hidrgeno, es aprovechado por
las plantas como medio para transportar nutrientes disueltos desde las races a las hojas durante el proceso de la
transpiracin.
Muchas de las propiedades fsicas y biolgicas de las macromolculas celulares, especialmente de las
protenas y los cidos nucleicos, provienen de sus interacciones con molculas de agua del medio circundante.
158

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Resumen I: Nociones bsicas de la Qumica Biolgica.

ANEXO: Sobre la Qumica Biolgica.

Introduccin a la Qumica Biolgica.

TCNICAS Y HERRAMIENTAS BIOQUMICAS.

ESTRUCTURA Y CATLISIS DE LOS PRINCIPALES COMPONENTES CELULARES.

Interacciones dbiles en los sistemas acuosos.

Los organismos son agrupaciones de materia inanimada,

Introduccin a la Qumica Biolgica.

La bioqumica, es una parte de la qumica?

Las siguientes son las caractersticas distintivas de los organismos vivos:

Se contina en las pginas 39 a 46.

Microfotografa electrnica del ncleo

Se contina en las pginas 23 a 30.

Se relaciona con las pginas 57.

Qu es lo que limita las dimensiones

Se contina en las pginas 47 a 66.

Envoltura celular bacteriana y arqueobacteriana.

Bacterias gram-negativas: presentes las tres capas de la

Con respecto a la composicin y localizacin de la pared celular, notemos que:

Estructura de las gram-positivas y gram-negativas.

Sin colesterol y otros esteroides.

Las estructuras rotuladas en rojo son exclusivas de clulas animales o vegetales.

Oxidaciones flavnicas generales

Exclusivas de los representantes del mundo vegetal.

Facilitar el intercambio con el medio externo

La secuencia especfica de subunidades monomricas y su disposicin en el espacio tridimensional determinan,

E. coli es un inquilino habitualmente inofensivo del tracto intestinal humano.

desarrollados en clulas primitivas.

Ismeros geomtricos (cis y trans).

Ismeros quirales: enantimeros y

En resumen, durante la oxidacin de los combustibles qumicos 1) disminuye la energa

a) Los organismos extraen energa de su entorno (nutrientes o luz solar).

Termodinmica y vida: https://www.youtube.com/watch?v=HZGJ_ovMyDY

Los sistemas biolgicos deben tener un suministro constante de energa

ESPONTANEIDAD DE UNA REACCIN QUMICA: ENERGA LIBRE DE GIBBS.

La reaccin 1 da lugar a un producto con una energa superior a la de

Rutas catablicas (degradativas): degradan nutrientes orgnicos transformndolos en productos

La citometra de flujo hace un recuento y

Analysis of a marine sample of photosyntetic picoplankton by flow cytometry

FACS: un instrumento basado en la citometra de flujo.

Fluorescence Animation: https://www.youtube.com/watch?v=pFtO0xxJL9s

Introduccin a la citometra de flujo.

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I. DISGREGACIN, RUPTURA u HOMOGENEIZACIN.

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III. CENTRIFUGACION y PURIFICACIN.

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Esquema de la centrifugacin diferencial, para separar los

Centrifugacin isopcnica (en gradiente de densidad, hasta el equilibrio de sedimentacin).

Centrifugacin en gradiente de densidad (isopcnica).

Tipos de centrfugas y usos.

Adems del Principios de Bioqumica de Lehninger, 5ta edicin, se us:

La fotometra se basa en dos leyes fundamentales:

io: intensidad de luz incidente.

Que la luz sea paralela y monocromtica

Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas.

La cantidad total de protena presente en la muestra,

Mtodos derivados colorimtricos: BIURET.

Mtodos derivados colorimtricos: LOWRY.

Mtodos derivados colorimtricos: BRADFORD.