Efeito do extrato alcolico de prpolis sobre a Pasteurella

multocida in vitro e em coelhos

Regina Conceio Garcia1*, Marcos Eielson Pinheiro de S2, Hlio Langoni2 e Slvia
Regina Cunha Funari1
Centro de Cincias Agrrias, campus de Marechal Cndido Rondon, Universidade do Oeste do Paran, 85960-000, Marechal
Cndido Rondon, Paran, Brasil. 2Mdico Veterinrio. *Autor para correspondncia. e-mail: re_conbr@yahoo.com.br
1

RESUMO. O ensaio in vitro objetivou avaliar o efeito do lcool PA e de diferentes

concentraes (5%, 10% e 15%) no Agar, do Extrato Alcolico de Prpolis (EAP), de trs
regies do Estado de So Paulo, sobre a Pasteurella multocida, obtida a partir de swab nasal de
coelhos. Por meio de outro ensaio, analisou-se o comportamento dessas bactrias em lavado
trqueo-brnquico de coelhos, alimentados com raes contendo lcool PA e diferentes
concentraes de EAP (0,1%; 0,2% e 0,3%). O lcool s foi efetivo na inibio do
desenvolvimento bacteriano in vitro na concentrao mais elevada, enquanto o EAP demonstrou
efetividade em todas as concentraes. As amostras de prpolis das trs regies no diferiram
entre si. No lavado trqueo-brnquico, o nmero de Unidades Formadoras de Colnias por
mililitro no diferiu entre os tratamentos, porm houve uma tendncia de maior efetividade nos
tratamentos com EAP em relao ao lcool, acompanhando a ao in vitro.
Palavras-chave: prpolis; Pasteurella multocida; coelhos.

ABSTRACT. Effect of alcohol extract of propolis on the Pasteurella

multocida in vitro and in the rabbits. The essay in vitro aimed to evaluate the
effect of alcohol and different concentrations (5, 10 and 15%) in the agar, of Alcoholic
Extract of Propolis (AEP), from three regions of So Paulo State, Brazil, on Pasteurella
multocida, obtained from rabbits nasal swabs. In other essay the reaction of this bacteria was
observed. In tracheal regions of rabbits, fed on diets with alcohol and AEP in different
concentrations (0.1; 0.2 and 0.3%). The alcohol was only effective on the inhibition of the
bacteria in vitro on highest concentration, while the AEP was effective in all concentrations.
The propolis samples from three regions did not differ. In the other assay, there wasnt any
difference between treatments, but the AEP showed to be more active than alcohol against
Pasteurella multocida, in the tracheal region of the rabbits, as to the action in vitro.
Key words: propolis; Pasteurella multocida; rabbits.

Introduo
De acordo com Cueto (1989), as plantas possuem
um eficiente poder protetor, sintetizando produtos de
elevadas qualidades antimicrobianas e imunolgicas.
As abelhas, com incrvel capacidade biosseletora,
coletam as resinas de que necessitam e as
transformam com uma enzima produzida por suas
glndulas salivares, fornecendo-lhes cidos graxos
insaturados que potencializam as propriedades
teraputicas das resinas vegetais. Como exemplo, a
molcula de pinocembrina, flavonide presente na
resina de algumas rvores que, ao ser processada
pelas abelhas, adquire um on que lhe faculta
propriedades fotoinibidoras. Ainda segundo esse
autor, a defesa antimicrobiana das plantas o
princpio geral que explica a natureza antimicrobiana
da prpolis. De acordo com Rojas (1989), o poder
germicida da prpolis to marcante que, se algum
animal penetra na colmia, as abelhas, aps mat-lo,
recobrem-no com prpolis, mumificando-o. Embora
Acta Scientiarum. Animal Sciences

seja utilizada desde a antiguidade como antibitico

natural, de acordo com Grange e Davey (1990), a
natureza dos componentes antimicrobianos da
prpolis ainda no foi elucidada, embora existam
evidncias que apontem os flavonides e vrios
steres do cido cafico (cido fenlico), como
responsveis por esse efeito.
A composio qumica da prpolis varia de
acordo com a origem botnica dos exsudatos
coletados pelas abelhas, como tem sido demonstrado
por vrios autores, estudando prpolis de diferentes
origens geogrficas. Ghisalberti et al. (1977),
analisando a composio bioqumica da prpolis do
Oeste da Austrlia, isolaram 4 flavononas nunca
isoladas e as associaram quelas encontradas em
algumas plantas comuns da regio, bem como GarciaVigueira et al. (1993), que, estudando a composio
qumica da prpolis do Canad, relacionaram a
pinocembrina (flavonona), a crisina e a galangina
(flavonas) ao Populus americano, enquanto a prpolis
Maring, v. 26, no. 1, p. 69-77, 2004

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originria do Populus europeu (Populus nigro)
caracterizou-se pela presena de altos nveis de cidos
cafico e isoferlico e seus steres.
Segundo Marcucci (1995), em anlises de
amostras de prpolis de diferentes partes do mundo,
foi observado que a composio qumica daquelas
amostras procedentes da Europa, sia e Amrica do
Norte no foi muito varivel, pois as fontes florais
principais so algumas espcies de choupo,
principalmente o preto (Populus nigro). Os mais
importantes componentes dessas amostras de prpolis
foram os fenlicos: flavonides, cidos aromticos e
seus steres (cerca de 50% do peso da prpolis).
Entretanto, a composio qumica e a origem das
resinas da Amrica do Sul so de especial interesse
pela riqueza da flora, sendo que amostras da prpolis
oriundas do Brasil e da Venezuela confirmaram a
presena de compostos incomuns e os flavonides,
por exemplo, foram muito pouco observados, sendo
mais comuns os cidos fenlicos.
Nieva Moreno et al. (1999) compararam amostras
de prpolis de quatro localidades de Almaicha del
Valle (provncia de Tucumn) e de Cerrillo (provncia
de Santiago de Estero), uma outra regio
fitogeogrfica da Argentina. A anlise cromatogrfica
das amostras das regies de Almaicha del Valle foram
semelhantes entre si, mas diferiram da amostra de
Cerrillo, indicando diferenas quanto s composies
das mesmas.
Investigando a composio qumica da prpolis
brasileira de regies diferentes, Marcucci (1999)
encontrou vrios compostos novos, alguns de
interesse particular, especialmente um derivado do
cido cumrico, pois apresentou atividade
antibacteriana e antitumoral significativas. Estes
compostos esto presentes em muitas amostras de
regies diferentes no Brasil, e sua fonte o exsudato
das folhas de algumas espcies de Baccharis spp.
(vassourinha ou alecrim-do-campo). De acordo com o
autor, isso demonstra a importncia dos cidos
fenlicos para a padronizao e controle de qualidade
da prpolis.
Em relao s propriedades biolgicas, sua
atividade antibacteriana tem sido a mais estudada,
sendo consenso entre os autores que a prpolis ativa
principalmente contra bactrias Gram positivas,
havendo, entretanto, atividade limitada contra
bactrias Gram negativas. Fernandes Jr. et al. (1997)
verificaram o efeito bactericida para Staphylococcus
aureus entre 6 e 9 horas de exposio concentrao
de 2% (V/V) de EAP, e efeito bacteriosttico com
concentraes 0,5% e 1,5%. Porm, para Escherichia
coli, embora o efeito bactericida tambm fosse
observado entre 6 e 9 horas de exposio, foram
necessrias concentraes significativamente maiores
(10% e 11%). Sforcin (1996), testando a atividade
antimicrobiana in vitro da prpolis sobre linhagens
bacterianas isoladas de processos infecciosos
Acta Scientiarum. Animal Sciences

humanos, tambm constatou a inibio do

crescimento de bactrias Gram positivas em baixas
concentraes (0,4 %), enquanto as Gram negativas
foram menos susceptveis a este apiterpico, sendo a
concentrao mnima inibitria de 4,5% a 8%.
Entre as bactrias testadas, esto algumas espcies
dos
gneros:
Staphylococcus,
Enteroccocus,
Streptococcus,
Corynebacterium,
Bacillus,
Salmonella, Shiguella, Enteroabcter, alm de
Branhamella catarrhalis, Sarratia marcencens,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus
mirabilis, Prototheca zopfii, Rhodococcus equi,
Geothrichum candidum, Klebsiella pneumoniae,
entre outras (Rojas, 1989; Grange e Davey, 1990;
Langoni et al., 1994; Fernandes Jr. et al., 1995, 1997;
Tosi et al., 1996; Nieva e Moreno et al., 1999;
Kujumgiev et al., 1999, entre outros). Grande parte
dessas bactrias demonstrou resistncia maioria dos
antibiticos tradicionais.
Takaisi-Kikuni e Schilcher (1994), por meio de
micro-calorimetria e de microscopia eletrnica,
utilizando Streptococcus agalactiae, demonstraram
que a prpolis inibiu o crescimento bacteriano por
impedir a diviso celular, desorganizando o
citoplasma, a membrana citoplasmtica e a parede
celular, causando uma lise bacteriana parcial e
inibindo a sntese protica. De acordo com os autores,
ficou evidente que o mecanismo de ao da prpolis
sobre clulas bacterianas complexo e que no pode
ser feita uma simples analogia ao modo de ao de
alguns antibiticos clssicos.
A Pasteurella multocida a bactria mais comum
nos coelhos de laboratrio, mas, em situaes de
estresse dos animais, por temperatura, umidade e pelo
prprio manejo, pode causar problemas de ordem
respiratria, reprodutiva e neurolgica, diminuindo o
desempenho produtivo e reprodutivo dos mesmos (De
Long e Manning, 1994). Segundo os autores, muitas
dessas manifestaes clnicas so refratrias a
antibiticoterapia e no h relatos de estratgia de
vacinao que possa prevenir todas as manifestaes
da doena.
O objetivo do presente estudo foi verificar a
atividade in vitro da prpolis sobre a Pasteurella
multocida, bactria Gram negativa, bem como
observar o efeito do extrato alcolico de prpolis
adicionado rao, sobre bactrias do mesmo gnero
e espcie, em coelhos adultos.
Material e mtodos
Coleta de prpolis

Foram coletadas amostras de prpolis de apirios

nos municpios de Luiz Antonio, de Marlia
(Universidade de Marlia - Unimar) e de Botucatu
(Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia Unesp, localizado na Fazenda Experimental
Lageado), todos no Estado de So Paulo.
Maring, v. 26, no. 1, p. 69-77, 2004

71
A prpolis foi coletada de colnias de abelhas
africanizadas Apis mellifera L., alojadas em colmias
de madeira, modelo Langstroth.
A coleta foi realizada mediante a colocao de
quadros extratores de prpolis entre o ninho e a tampa
das colmias, no perodo de agosto a dezembro de
1999. Assim que os espaos dos extratores foram
preenchidos com prpolis pelas abelhas, essa foi
raspada, colocada em sacos plsticos e armazenada ao
abrigo da luz.
Preparo dos Extratos Alcolicos de
Prpolis (EAP)

Foram preparadas tinturas de prpolis da seguinte

forma: a prpolis foi pesada, triturada, colocada em
uma vasilha de vidro e coberta com lcool etlico PA
(90o GL), a 30% (peso/ peso). Essa vasilha foi
tampada hermeticamente e mantida por 10 dias
temperatura ambiente, protegida da luz, sob agitao
freqente (Sforcin, 1996). Decorrido esse perodo, as
solues foram filtradas e armazenadas protegidas da
luz.
Para o ensaio da susceptibilidade bacteriana in
vitro, foram preparados extratos com as amostras de
prpolis de cada regio a ser testada. O EAP,
adicionado s raes para o teste in vivo, foi
preparado a partir da mistura de amostras de prpolis
dos apirios de Marlia e de Botucatu, citados acima.
Susceptibilidade de Pasteurella multocida
frente ao extrato alcolico de prpolis

Os testes para determinar a sensibilidade da

Pasteurella multocida ao EAP foram realizados no
laboratrio de Zoonoses Bacterianas e Fngicas do
Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica
da FMVZ - Unesp - Campus de Botucatu, Estado de
So Paulo.
Foram utilizadas amostras de Pasteurella
multocida isoladas em meio de gar sangue bovino a
10%, incubadas a 37oC, por at 96 horas. As amostras
foram obtidas a partir de swabs nasais, de coelhos do
Setor de Cunicultura da FMVZ. A identificao do
referido agente foi realizada de acordo com Qinn et
al. (1994), verificando-se a produo de hemlise,
crescimento em Agar MacConkey, produo de indol,
de urease, ornitina descarboxilase e acidificao de
glicose, lactose, sacarose, maltose e manitol, alm das
caractersticas morfolgicas e tintoriais, de acordo
com a tcnica de Gram. O inculo de Pasteurella
multocida a ser utilizado foi padronizado na
concentrao de 5 x 105 unidades formadoras de
colnias por mililitro (UFC/mL).
Foram testadas 3 diluies do EAP (V/V): 5%,
10% e 15%, para cada uma das solues obtidas nas
trs regies, e o grupo controle com 5%, 10% e 15%
de lcool etlico PA, com 3 repeties por tratamento,
em meio de Agar crebro-corao. O extrato ou o
lcool, nas diferentes concentraes, foi adicionado
Acta Scientiarum. Animal Sciences

ao meio de cultura ainda lquido temperatura de

45oC, homogeneizando-se cuidadosamente sob
movimentos rotatrios, distribuindo-se em placas de
Petri, em volume de 20mL. Aps controle de
esterilidade at 24 horas a 37oC, foram adicionados
0,1mL do inculo s placas, espalhando-o sobre as
mesmas, com o auxlio de basto de vidro estril,
incubando-se a 37oC, por at 72 horas, com
observao do desenvolvimento microbiano a cada 24
horas.
Recuperao de Pasteurella multocida
aps a utilizao de raes contendo
extrato alcolico de prpolis

Segundo De Long e Manning (1994), a infeco

por essa bactria geralmente inicia-se na cavidade
nasal, quando o animal portador, ento se propaga
para outras partes do sistema respiratrio por
extenso direta, ou para outras partes do corpo via
sangnea. Tendo-se em vista essas observaes,
optou-se por fazer uma amostragem da secreo
traqueal dos animais, que oferece dados mais
confiveis relacionados contaminao dos mesmos
por Pasteurella multocida, obtendo-se essa a partir de
lavado trqueo-brnquico.
Este ensaio foi realizado no Setor de Cunicultura da
FMVZ-Unesp-Botucatu, utilizando-se 40 fmeas jovens,
da raa Norfolk 2000, linhagem Botucatu, com idade
mdia de 97 4,18 dias e peso mdio de 3273,5
293,03kg,, no incio do experimento. Essas foram
submetidas traqueotomia para obteno do lavado
traqueal, no Setor de Cunicultura. Os animais receberam
como medicao pr-anestsica a Acepromazina a
0,2mg/kg de peso vivo, via intramuscular, e Diazepan, a
10mg/ kg de peso vivo, associado ao cloridrato de
Ketamina, a 4mg/kg de peso vivo, via intravenosa. Em
seguida, realizou-se a traqueotomia e o lavado traqueal
foi obtido injetando-se 3mL de soluo salina estril a
0,9% (NaCl), por animal, via transtraqueal, utilizando-se
seringa descartvel de igual volume e agulha 30x7,
procurando-se recuperar pelo menos 1mL do inculo.
As amostras foram transportadas ao Laboratrio
em isopor com gelo, e submetidas s diluies de 10-1
e 10 -2, sendo que 0,1mL de cada diluio foi semeado
em placas contendo Agar sangue bovino (10%) e
Agar Mac Conkey. As placas foram incubadas a 37oC
e foram realizadas leituras aps 24, 48 e 72 horas, a
fim de serem observados o desenvolvimento e a
contagem das unidades formadoras de colnias
(UFC/mL).
Os animais foram devolvidos sedados s
respectivas gaiolas e, em mdia 2 horas aps a
interveno, estavam ativos, alimentando-se e
bebendo gua.
Foram realizadas 2 coletas de lavado traqueal por
animal, nos dias 1 de fevereiro e 9 de maro de 2000,
ou seja, antes e aps o fornecimento das raes
tratadas, respectivamente.
Maring, v. 26, no. 1, p. 69-77, 2004

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Fornecimento de raes tratadas

O lcool e o Extrato Alcolico de Prpolis (EAP),

nas diferentes concentraes descritas abaixo, foram
incorporados s raes no misturador de Premix,
antes da peletizao das mesmas. Uma amostra do
EAP foi enviada ao laboratrio de Bromatologia da
FMVZ para anlise.
As raes foram preparadas e peletizadas na
fbrica de raes da FMVZ, e sua composio pode
ser observada na Tabela 1.
Tabela 1. Composio percentual e qumica1 da rao de
coelhos utilizada (categoria de reprodutores)
Ingredientes
Milho modo
Farelo de Soja
Farelo de Trigo
Feno de Brachiaria decumbens
leo de soja
Sal
Calcrio
Fosfato biclcico
Mistura mineral e vitamnica2
Total
Energia Digestvel (Kcal/kg)
Protena Bruta (%)
Fibra em Detergente Neutro (%)
Fibra em Detergente cido (%)
Ca (%)
P (%)
Metionina + Cistina

Porcentagem
30,00
33,02
1,55
27,53
2,99
0,89
0,59
2,73
0,70
100,00
2750
18,84
27,22
15,84
1,10
0,80
0,60

Composio qumica estimada com base nos valores tabelados dos alimentos (Valadares
Filho, 2000); 2Composio do Premix Suprevit*: cido flico - 100mg; antioxidante 40mg; cobre - 2400mg; coccidiosttico - 6,6g; colina - 25g; ferro - 16.000mg; iodo 200mg; mangans - 12.000mg; niacina - 6.000mg; selnio - 40mg; vitamina A - 1.400.000
UI; vitamina B1 - 500mg; vitamina B12 - 2.500mg; vitamina B2 - 1.000mg; vitamina B6 400mg; vitamina D3 - 250.000 UI; vitamina E - 7.000mg; vitamina K3 - 400mg; zinco 10.000mg; pantotenato de clcio - 2.000mg; veculo q.s.p. 1.000g.
1

As raes experimentais foram fornecidas a partir

de 04/02/2000. O perodo de 4 dias, at 08/02/2000,
foi considerado de adaptao, no se considerando os
dados de consumo nas anlises estatsticas.
Os animais, aps a obteno do lavado traqueal,
foram distribudos casualmente (8 repeties) em 5
tratamentos, de acordo com o tipo de rao:
- Tratamento 1: grupo controle: rao pura;
- Tratamento 2: lcool PA - 25,86mL/kg de
rao;
- Tratamento 3: 8,62mL de Extrato Alcolico de
Prpolis (EAP)/ kg de rao - 1000 ppm ou
0,1% de Extrato Seco de Prpolis (ESP);
- Tratamento 4: 17,24mL de EAP/ kg de rao 2000 ppm ou 0,2% de ESP;
- Tratamento 5: 25,86mL de EAP/ kg de rao 3000 ppm ou 0,3% de ESP.
O Extrato Alcolico de Prpolis foi preparado
como descrito acima, porm a prpolis bruta foi uma
mistura daquelas obtidas nas regies de Botucatu e de
Marlia. Quando o extrato estava pronto, foram
tomadas 10 amostras de 10mL e colocadas em
Beckers na estufa a 65oC por 72 horas e depois a
105oC, at que seus pesos secos se estabilizassem
(aproximadamente 5 dias). A mdia das 10 amostras
foi de 116mg de extrato seco por mililitro de Extrato
Acta Scientiarum. Animal Sciences

Alcolico. Os clculos das quantidades de Extrato

Alcolico nos diferentes tratamentos foram feitos com
base no peso do extrato seco. Sempre que for citado
um tratamento com determinada proporo de Extrato
Alcolico de Prpolis (0,1%; 0,2% ou 0,3%),
subentende-se que essas propores so referentes ao
peso de extrato seco de prpolis por quantidade de
rao (peso/ peso).
As raes tratadas foram fornecidas do dia 1 de
fevereiro ao dia 8 de maro de 2000, totalizando 37
dias. Foram fornecidos 250g de rao por animal por
dia, completando-se as sobras e, semanalmente,
calculando-se o consumo pela diferena entre o
fornecido e as sobras.
Anlises estatsticas

Os dados referentes ao teste de susceptibilidade in

vitro de Pasteurella multocida s diferentes
concentraes de prpolis de diferentes regies foram
comparados estatisticamente pelo Teste do Quiquadrado.
Os dados referentes ao nmero de unidades
formadoras de colnias de Pasteurella multocida por
mililitro de lavado trqueo-brnquico dos coelhos
foram transformados, por meio da aplicao do
logaritmo de (x + 5), visando-se a uma maior
homogeneizao dos mesmos. Os dados dos
tratamentos foram comparados por meio de testes
estatsticos no-paramtricos de Kruskal-Wallis e as
mdias das duas pocas por meio do teste de
Wilcoxon, com 5% de probabilidade.
O delineamento foi inteiramente casualizado, com
5 tratamentos e 8 repeties por tratamento.
Resultados e discusso
Susceptibilidade de Pasteurella multocida
frente ao extrato alcolico de prpolis

Os resultados do teste de susceptibilidade de

Pasteurella multocida in vitro ao lcool e aos extratos
alcolicos com prpolis de trs localidades do estado
de So Paulo, nas trs concentraes estudadas,
encontram-se na Tabela 2.
Tabela 2. Pasteurella multocida: estudo da susceptibilidade in
vitro, frente ao lcool e ao extrato alcolico de prpolis, de trs
regies do estado de So Paulo, em trs diferentes concentraes
(5%, 10% e 15% - V/ V) no meio de cultura (inculo: 5 x 105
unidades formadoras de colnias)
Tratamentos
lcool
Prpolis de
Botucatu
Prpolis de
Marlia
Prpolis de

Concentraes
(%)
5
10
15
5
10
15
5
10
15
5

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Maring, v. 26, no. 1, p. 69-77, 2004

73
Luiz Antonio

10
15

++
++

++
++

++
++

++
++

Obs: Os graus de inibio esto simbolizados por: 0 - sem inibio (incontveis UFC); + inibio parcial (256 UFC/mL); ++ - inibio total (sem crescimento de colnias).

Pela tabela pode-se observar que as duas

concentraes mais baixas de lcool no meio Agar
(5% e 10%) no inibiram o desenvolvimento
bacteriano e a concentrao mais elevada (15%)
inibiu apenas parcialmente, enquanto os extratos
alcolicos, independentemente da concentrao no
meio (5%, 10% ou 15%), inibiram completamente o
crescimento bacteriano.
Estes dados foram comparados estatisticamente
pelo Teste do Qui-quadrado, visto que, para a maioria
dos tratamentos, no houve desenvolvimento de
colnias e, quando houve, o nmero de colnias
formadas foi extremamente elevado e estas foram
confluentes, impossibilitando sua contagem. O teste
indicou diferena significativa (c= 6,0), ao nvel de
5% de significncia, entre os graus de inibio de
desenvolvimento de colnias de bactrias nos meios
com lcool e aqueles com extrato alcolico de
prpolis, nas trs concentraes testadas.
Esses resultados esto de acordo com aqueles
observados por Sforcin (1996), que verificou que o
lcool etlico PA apresentou ao inibitria sobre o
crescimento bacteriano apenas na concentrao de
15%, valor muito acima do obtido com EAP, sendo
de 8% a Concentrao Inibitria Mnima (CIM) mais
elevada, observada para Escherichia coli e
Salmonella typhimurium. Concluiu que a atividade
antibacteriana verificada no ensaio foi devida
exclusivamente aos componentes da prpolis. Nieva
Moreno et al. (1999) tambm no observaram efeito
antibacteriano do etanol (80%), tanto pela tcnica da
difuso em discos de papel, como pela anlise de
bioautografia de contato, enquanto para os extratos
etanlicos de prpolis o aumento da inibio foi
proporcional ao aumento das concentraes do
extrato.
Quanto ao efeito do extrato alcolico de prpolis
sobre a Pasteurella multocida, Sforcin (1996)
tambm observou inibio do crescimento de
bactrias Gram negativas frente a esse extrato,
embora em concentraes mais elevadas do que as
necessrias para inibir as bactrias Gram positivas.
Enquanto a CIM do extrato alcolico de prpolis para
Staphylococcus aureus foi de 0,40%, para
Pseudomonas aeruginosa, essa concentrao foi em
torno de 5,70% e, tanto Escherichia coli quanto
Salmonella typhymurium, demonstraram-se mais
resistentes, com CIM de 8%. Nesse experimento, o
EAP concentrao de 5% inibiu o desenvolvimento
de colnias de P. multocida.
Os extratos preparados com prpolis dos trs
diferentes municpios do estado de So Paulo no
apresentaram diferenas entre si, com relao
inibio do crescimento de Pasteurella multocida.
Acta Scientiarum. Animal Sciences

Alguns autores tm estudado a correlao entre a

atividade biolgica da prpolis e suas diferentes
composies, de acordo com suas regies de origem.
Boudorova-Krasteva et al. (1997) avaliaram a
prpolis extrada na rea de Produo de Apicultura
da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia de
Botucatu, local onde foi realizado o presente estudo, e
isolaram 6 compostos individuais, sendo que 3 deles
tm sido encontrados por outros autores em diferentes
espcies de Baccharis (gnero muito difundido na
Amrica do Sul) e, de acordo com Marcucci (1999),
esto presentes em muitas amostras de prpolis do
Brasil. Parte da prpolis utilizada neste experimento,
da regio de Botucatu, provavelmente tenha
composio qumica semelhante a esta discutida pelos
autores acima, j que Sforcin (1996), utilizando
prpolis desse mesmo local, obtidas em 4 diferentes
pocas do ano, no observou diferenas significativas
entre elas, quanto ao biolgica, e que a flora local
no sofreu severas alteraes nos ltimos anos.
Essa semelhana de ao antimicrobiana entre
prpolis de diferentes municpios da regio Sudeste
est de acordo, de certa forma, com uma tendncia
observada por alguns autores, como Moura et al.
(1999), que no observaram grande variao no perfil
cromatogrfico de amostras de prpolis da regio
Sudeste do Brasil, e tambm verificaram que todas as
amostras inibiram mais o crescimento de
Staphylococcus aureus do que de Streptococcus
mutans. Kujumgiev et al. (1999) avaliaram a
atividade anti-bacteriana de extrato alcolico e leos
volteis de prpolis de diferentes regies geogrficas:
Bulgria, Albnia, Monglia, duas localidades do
Egito, quatro localidades do Brasil (Rio Claro e
Limeira - SP, Prudentpolis - PR e Pacajus - CE),
duas localidades das Ilhas Canrias, alm de duas
amostras brasileiras coletadas por abelhas sem ferro
(gnero Meliponas). Embora uma amostra de extrato
alcolico e de leo voltil de prpolis das Ilhas
Canrias e de uma das amostras coletadas por
Meliponas no Brasil tenham mostrado atividade
antibacteriana ligeiramente maior, concluram que, de
maneira geral, a atividade antibacteriana foi
semelhante, independentemente de suas diferentes
composies bioqumicas, atribuindo as propriedades
anti-bacterianas da prpolis no a uma ou outra
substncia isolada, mas s diferentes combinaes
delas, presentes nas diferentes amostras.
Alencar et al. (1999), considerando outra regio
geogrfica brasileira que apresenta grande
diversidade de vegetao, analisaram a composio
qumica e a atividade biolgica de prpolis de
diferentes cidades da regio Nordeste do Brasil, e
verificaram que suas composies variaram de acordo
com o tipo de vegetao local, e tambm que as
amostras de prpolis da mata atlntica mostraram
maior
atividade
antimicrobiana
frente
a
Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans,
Maring, v. 26, no. 1, p. 69-77, 2004

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sendo, entretanto, superadas, em termos de ao
antioxidante, pelas prpolis originrias da caatinga
baiana. Comparando diferentes regies brasileiras,
Koo et al. (1999) verificaram que os perfis
cromatogrficos das amostras da regio Sudeste
foram nitidamente diferentes daqueles das amostras
da regio Sul, e a atividade antibacteriana do extrato
etanlico do Rio Grande do Sul foi de 4 a 8 vezes
mais potente que a de Minas Gerais.
Recuperao de Pasteurella multocida
aps a utilizao de rao contendo extrato
alcolico de prpolis

Uma amostra do Extrato Alcolico incorporado

rao foi enviada ao laboratrio de Bromatologia da
FMVZ para anlise. A composio bromatolgica
(em 100% de matria seca) foi a seguinte: 17,84% de
matria seca; 1% de protena bruta; 96,06% de
extrato etreo e 0,42% de minerais.
Considerando-se o desenvolvimento de colnias
de Pasteurella multocida na regio trqueo-brnquica
dos coelhos testados, os dados referentes ao nmero
de Unidades Formadoras de Colnias (UFC)/mL de
inculo obtido desta regio (duas diluies), antes e
aps o fornecimento das raes contendo trs nveis
de Extrato Alcolico de Prpolis (EAP) e lcool,
esto resumidos na Tabela 3. Os dados referem-se ao
nmero de UFC/mL nas placas, com diluio do
inculo a 10-2, uma vez que em 10-1 as colnias foram
incontveis. Os resultados dos testes noparamtricos de Kruskal-Wallis e de Wilcoxon
tambm so apresentados na mesma tabela. A anlise
no-paramtrica foi realizada em funo dos dados
no se ajustarem aos critrios exigidos para a anlise
de varincia.
Tabela 3. Pasteurella multocida: mdias e desvios-padro dos
nmeros de unidades formadoras de colnias por mililitro de
lavado traqueal de coelhos (8 por tratamento), alimentados com
raes com diferentes quantidades de Extrato Alcolico de
Prpolis - EAP (clculo sobre o extrato seco - peso /peso), ou com
lcool, antes e aps o fornecimento das mesmas. Os nmeros entre
parnteses referem-se aos dados transformados por log (x + 5),
para efeito de anlise estatstica
Tratamentos Antes do fornecimento das raes
Unidades formadoras
de colnias/mL
Controle
118,50 250,08
(1,3629 0,8362)
lcool
306,12 749,61
(1,5125 0,9319)
0,1% EAP
275,12 624,36
(1,6037 0,9093) a
0,2% EAP
184,12 513,94
(1,1078 0,8541) a
0,3% EAP
120,63 326,41
(1,1291 0,8038)
Geral
200,90 504,74
(1,3432 0,8469)

Aps o fornecimento das raes

Unidades formadoras
de colnias/mL
150,25 401,62
(1,2792 0,7799)
313,87 484,94
(1,6020 1,0780)
3,50 4,11
(0,8852 0,2087) b
186,12 526,04
(1,0182 0,8715) b
4,63 9,21
(0,8827 0,2738)
131,67 367,44
(1,1334 0,7436)

Obs: As diferenas entre os tratamentos no foram significativas pelo teste de KruskalWallis; Letras diferentes na mesma linha indicam diferenas significativas entre as duas
pocas, pelo teste de Wilcoxon, com P < 0,04224 e P < 0,02799, respectivamente para os
dois tratamentos (0,1 e 0,2% EAP)

Acta Scientiarum. Animal Sciences

Pode-se observar a grande variabilidade dos dados

pelos altos valores de desvios-padro estimados, tanto
quando so considerados todos os dados, como
quando se consideram os valores observados dentro
de cada tratamento. Pelo teste de Kruskal-Wallis, no
foram encontradas diferenas significativas entre as
mdias dos tratamentos aps o fornecimento de
raes tratadas, porm, quando foram comparados os
tratamentos controle e 0,2% de EAP, bem como este
com o lcool, as diferenas observadas (12,13 e
12,50, respectivamente) aproximaram-se bastante da
diferena mnima significativa (15,94), ao nvel de
5%.
Os testes de Wilcoxon, comparando as mdias
entre pocas, em cada tratamento, indicaram que
houve uma reduo significativa no nmero de
UFC/mL de Pasteurella multocida no lavado trqueobrnquico dos animais que receberam raes com
0,1% de EAP (significncia de 4,22%) e 0,2% de
EAP (2,8%), no diferindo para os outros
tratamentos, embora os que receberam tratamento
com 0,3% tambm tenham apresentado uma tendncia
de reduo.
Estes resultados, at certo ponto, confirmam os
obtidos para a anlise do efeito do EAP sobre a
Pasteurella multocida in vitro, discutidos no item
anterior, os quais demonstraram que esse extrato, nas
concentraes testadas, foi efetivo na inibio do
crescimento bacteriano, enquanto o lcool PA,
utilizado como solvente, s demonstrou atividade
parcial na concentrao mais elevada. Assim, tanto in
vitro quanto in vivo, o extrato alcolico de prpolis
foi mais efetivo que o solvente utilizado (lcool)
contra o desenvolvimento dessa bactria Gram
negativa, demonstrando o efeito antimicrobiano da
prpolis.
Outro ponto importante a ser considerado nesta
anlise que, durante o perodo experimental, os
animais foram submetidos ao estresse, j que foram
realizados dois lavados trqueo-brnquicos e trs
coletas de sangue (discutidas em outro trabalho), alm
da mudana alimentar. O estresse dos animais, de
acordo com De Long e Manning (1994), pode
desencadear problemas de ordem respiratria,
reprodutiva e neurolgica, provocados pela
Pasteurella multocida, embora esta seja uma bactria
comum nos coelhos, pertencente a microbiota do
aparelho respiratrio superior. Nesse aspecto, o
fornecimento de extrato alcolico de prpolis pode
ter atuado na preveno desses quadros, uma vez que,
mesmo sob situaes que causam estresse, os animais
que receberam os extratos, nas concentraes 0,1% e
0,2%, apresentaram reduo na carga bacteriana
trqueo-brnquica.
Os resultados obtidos nesse estudo esto de
acordo com dados da literatura referentes anlise in
vitro, j citados acima, embora a maioria dos autores
tenha demonstrado a efetividade da prpolis contra
Maring, v. 26, no. 1, p. 69-77, 2004

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bactrias Gram positivas. Poucos trabalhos, porm,
tm discutido o efeito da prpolis sobre bactrias em
animais, especialmente quando se trata de bactrias
Gram negativas.
Considerando-se algumas doenas fatoriais dos
animais, que podem ser desencadeadas por estresse,
Rodriguez et al. (1989) observaram o efeito clnico
do produto NB-2, preparado a partir da prpolis,
sobre a pneumonia de bezerros, geralmente
provocada por microrganismos como Klebsiella sp.,
Escherichia coli, Salmonella sp., Pasteurella
mutocida, Arcanobacterium pyogenes, IBR, PI3 e
leveduras. Tanto com administrao subcutnea,
quanto por via intramuscular, em casos agudos e
crnicos, concluram que o produto apresentou
eficcia teraputica e efeito antibitico. Fumero et al.
(1989) compararam os tratamentos com NB1, outro
produto comercial base de prpolis, com a
oximicina, sobre a sndrome diarrica em bezerros,
em um local com foco ativo de salmonelose e
colibacilose. Os resultados indicaram uma
recuperao de 100% dos animais tratados com NB,
s 72 horas, e para a oximicina, efeitos mais
retardados e maior nmero de tratamentos.
Em relao a protozorios, Hollands et al. (1984,
1988 e 1989) testaram a atividade da prpolis sobre
coccidiose em coelhos, provocada por protozorios
do gnero Eimeria, administrando extrato alcolico
de prpolis a 2% ou 3%, via oral, na gua. No
primeiro trabalho, testaram em 18 coelhos, por 15
dias e observaram uma reduo significativa da
intensidade da doena, medida pela presena de
oocistos nas fezes nos animais tratados, sendo que o
extrato a 3% foi mais efetivo nessa reduo em
relao quela observada nos animais do grupo
controle (lcool a 95o). No segundo experimento, os
autores compararam a prpolis e sulfonamidas
(sulfametazina e sulfaquinoxalina), habitualmente
utilizadas como coccidiostticos em coelhos,
utilizando 12 animais, e verificaram redues
significativas na intensidade da coccidiose, nos 2
grupos tratados com as sulfonamidas (0,1% e 0,2%) e
com prpolis (3%), aps o tratamento, no havendo
reduo no grupo controle (lcool a 95o). No terceiro
trabalho, os autores acompanharam a mortalidade e a
incidncia de diarria em 80 coelhos, 40 tratados com
propolina e 40 no grupo controle (lcool a 95o),
observando um perodo de recuperao duas vezes
maior dos animais do grupo controle em relao aos
animais tratados, sendo as mortalidades de 10% e
30%, respectivamente, nos animais dos grupos
citados. Concluram que a propolina pode ser
utilizada para combater a coccidiose, sendo um
tratamento mais econmico, aumentando a
produtividade pela reduo na mortalidade. Moura et
al. (1998) tambm testaram o efeito do fornecimento
de prpolis (0mL, 4mL, 8mL, 12mL e 16mL de
soluo hidroalcolica de prpolis/litro de gua)
Acta Scientiarum. Animal Sciences

como coccidiosttico, a coelhos dos 40 dias aos 90

dias de idade, comparando com a robenidina (0,1%
na rao e gua pura) e verificaram que o ltimo
tratamento foi mais eficiente como coccidiosttico
que o primeiro, embora o aumento na concentrao
da soluo hidroalcolica de prpolis, adicionada
gua de beber, tenha reduzido linearmente o nmero
de oocitos de Eimeria spp. por grama de fezes.
Mazzuco et al. (1996) testaram a utilizao da
prpolis e do lcool etlico no controle de Salmonella
sp, em raes avcolas. A adio da prpolis (2%) s
raes artificialmente contaminadas foi realizada
pulverizando-se as solues sobre as mesmas, j
prontas, e realizando-se a homogeneizao manual.
Foi analisada a presena de bactrias nos cecos, sendo
que, segundo os autores, somente a prpolis em
soluo alcolica apresentou ao sobre a bactria,
enquanto a prpolis em p e em soluo aquosa no
exerceram efeito sobre a mesma. Os autores
atriburam o efeito bactericida ao lcool da soluo.
No experimento da susceptibilidade da
Pasteurella multocida frente aos extratos alcolicos
de prpolis, in vitro, o efeito da prpolis, nas
concentraes testadas, contra o desenvolvimento
dessas bactrias Gram negativas foi evidente, uma vez
que o lcool utilizado como solvente demonstrou uma
baixa atividade contra a mesma bactria. Os
resultados obtidos sobre as mesmas bactrias,
alojadas na regio trqueo-brnquica dos coelhos,
quando estes receberam raes com prpolis, tambm
demonstraram sua efetividade. De maneira geral,
esses resultados sugerem que a prpolis pode ser
utilizada para auxiliar no controle dessa bactria
Gram negativa, freqente nas cuniculturas, a qual
pode levar a prejuzos, principalmente em situaes
de estresse dos animais, como em mudanas bruscas
de temperatura e umidade relativa do ar. Como foi
discutido por De Long e Manning (1994), no existe
vacina que possa prevenir esta doena e a mesma tem
demonstrado resistncia antibioticoterapia.
Poderiam ser realizados outros experimentos,
simulando-se situaes de estresse trmico, por
exemplo, e, de preferncia, com a inoculao
controlada dessa bactria em diferentes grupos de
animais, de forma a se obter maior homogeneidade
dentro de cada grupo, para que se pudesse realmente
confirmar a efetividade da prpolis sobre a
pasteurelose em coelhos. Alm disso, deve ser feito
um levantamento de custos em relao aos
quimioterpicos geralmente utilizados, de forma a se
recomendar a utilizao deste produto natural na
cunicultura.
Concluso
A prpolis demonstrou ao contra a Pasteurella
multocida in vitro, e atuou tambm sobre essa
bactria nos coelhos, quando fornecida incorporada s
Maring, v. 26, no. 1, p. 69-77, 2004

76
raes, tendendo a reduzir o nmero de unidades
formadoras de colnias dessa bactria Gram negativa,
em nvel trqueo-brnquico dos animais.
Dessa forma, nas condies testadas, a prpolis
mostrou-se favorvel como auxiliar no controle da
Pasteurella multocida nos coelhos, uma vez que,
principalmente em situaes de estresse dos animais,
os sintomas respiratrios, reprodutivos e neurolgicos
provocados por essa doena tm causado prejuzos
em algumas cuniculturas.
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