Inibio enzimtica: determinao de

diferentes tipos de inibio enzimtica

Instituto Superior Cincias da Sade Egas Moniz
Campus Universitrio, Quinta da Granja-2829- 511 Caparica, Monte
da Caparica
Tel: +351212946700 Fax: +351212946771
Licenciatura em Cincias Forenses e Criminais
Bioqumica
Prof. Doutor Carlos Monteiro
Discente: Tnia Cunha n110509
Realizao da actividade: 26 de Maio de 2014
Entrega do Relatrio: 12 de Junho de 2014

1.Resumo
A inibio de um enzima corresponde a uma diminuio da sua
atividade, por associao a molculas com estrutura semelhante ao
substrato denominadas inibidores.
Neste trabalho experimental utilizou-se o NaF como inibidor. O
objetivo desta experincia era avaliar o tipo de inibio uma vez que
os processos de inibio de enzimas esto divididos em dois tipos:
inibio reversvel e inibio irreversvel.
Dentro da inibio reversvel temos ainda a Inibio Competitiva,
Mista e a No-Competitiva.
A avaliao do tipo de inibio foi feita consoante a anlise da Vmx e
do Km que determinado a partir da representao grfica da
equao de Lineweaver-Burk. Aps o tratamento dos resultados,
chegou-se concluso que a inibio com o NaF foi uma inibio nocompetitiva.
Para alm da avaliao do tipo de inibio foi tambm determinado, a
partir da equao de Lineweaver-Burk, o Ki da reao.
PALAVRAS-CHAVE:
Inibio Enzimtica, NaF, Inibio Competitiva, Inibio Mista,
Inibio No-Competitiva, Km, Ki, Equao de Lineweaver-Burk, HenriMichaelis-Menten, lei de Lambert-Beer.
1

2. Introduo
Enzimas so um grupo de substncias orgnicas de natureza
normalmente proteica, com atividade intra ou extracelular que tm
funes catalisadoras. Estas catalisam reaes qumicas que, sem a
sua presena, dificilmente aconteceriam. Isso conseguido atravs
do abaixamento da energia de ativao necessria para que se d
uma reao qumica, resultando no aumento da velocidade da reao
e possibilitando o metabolismo dos seres vivos. Em sistemas vivos, a
maioria das reaes d-se em vias metablicas, que so sequncias
de reaes em que o produto de uma reao utilizado como
reagente na reao seguinte. Diferentes enzimas catalisam diferentes
passos de vias metablicas, agindo de forma concertada de modo a
no interromper o fluxo nessas vias. Cada enzima pode sofrer
regulao da sua actividade aumentando-a, diminuindo-a ou mesmo
interrompendo-a, de modo a modular o fluxo da via metablica em
que se insere.
As enzimas convertem uma substncia, chamada de substrato,
noutra denominada produto, e so extremamente especficas para a
reao que catalisam. Isso significa que, em geral, uma enzima
catalisa um e s um tipo de reao qumica. Consequentemente, o
tipo de enzimas encontradas numa clula determina o tipo de
metabolismo que a clula efetua.
A velocidade da reao catalisada por uma enzima aumentada
devido ao abaixamento da energia de ativao necessria para
converter o substrato no produto. O aceleramento da reao pode ser
da ordem dos milhes de vezes.
Como so catalisadores, as enzimas no so consumidas na reao e
no alteram o equilbrio qumico dela.
A actividade enzimtica pode depender da presena de determinadas
molculas, genericamente chamadas cofactores. A natureza qumica
dos cofactores muito varivel, podendo ser, por exemplo, um ou
mais ies metlicos ( como o ferro), ou uma molcula orgnica ( como
a vitamina B12). Estes cofactores podem participar ou no
directamente na reao enzimtica.
Determinadas substncias, podem inibir a actividade de algumas
enzimas, diminuindo-a ou eliminando-a totalmente; so os chamados
inibidores enzimticos. Estas substncias de inibio so muitas,
sendo algumas delas constituintes da clula e outras so estranhas,
levando com a sua presena a alteraes significativas do
metabolismo. Quando o inibidor produzido pela prpria clula, a
variao na sua concentrao vai ser muito empregado pela prpria
clula como uma forma de controlo da velocidade das reaes. Esse
mecanismo vai possibilitar ao organismo responder a diferentes
2

condies fisiolgicas. O bloqueio de uma nica reao vai afetar toda

a sequncia de reaes, j que a reao bloqueada no vai gerar o
produto que vai ser necessrio para reaes seguintes.
Os inibidores podem ser reversveis ou irreversveis, de acordo com a
estabilidade gerada pela sua ligao com a enzima.
Os inibidores irreversveis ligam se s enzimas levando inativao
definitiva desta. Estes inibidores so muito txicos para o organismo
j que no so especficos, sendo capazes de inativar qualquer
enzima. J os inibidores reversveis podem ser divididos em dois
grupos, os competitivos e os no-competitivos. Essa diviso
baseada na presena ou no de competio entre o inibidor e o
substrato pelo centro ativo da enzima.
Os inibidores competitivos competem com o substrato pelo centro
ativo da enzima. Estas molculas apresentam configurao
semelhante ao substrato e por isso so capazes de se ligarem ao
centro ativo da enzima. Eles produzem um complexo enzima-inibidor
que semelhante ao complexo enzima- substrato.
Os inibidores no-competitivos no tem semelhana estrutural com o
substrato de reao que inibem. A sua inibio se d pela sua ligao
a radicais que no pertencem ao grupo ativo. Esta ligao vai alterar
a estrutura da enzima e inviabiliza a sua catlise.

3. Protocolo Experimental/ Materiais e

Mtodos
Preparar os ensaios enzimticos tal como est indicado na Tabela 1,
at adio de gua. Iniciar a reao com a adio de fosfotase cida
0,10 U/ml, contando um minuto de intervalo entre a adio de cada
tubo. Aps 10 minutos de incubao de cada tubo, parar a reao
adicionando KOH, homogeneizado. Para cada tubo, ler a absorvncia
a 405 nm,
aps acertar Tabela 1- Estudo da inibio do fosfatase cido pelo inibidor escolhido
o zero do espectrofotmetro, realizar as leituras contra ar.

Tabela 2- Estudo da inibio do fosfatase cido pelo inibidor escolhido: determinar Ki

Preparar os ensaios enzimticos tal como est indicado na Tabela 2,

at adio da gua. Iniciar a reao com a adio de fosfatase cida
0,10 U/ml, contando um minuto de intervalo entre a adio de cada
tubo. Aps 10 minutos de incubao de cada tubo, parar a reao
adicionando KOH, homogeneizando. Para cada tubo, ler a absorvncia
a 405 nm, aps acertar o zero do espectrofotmetro, realizar as
leituras contra ar.

4. Resultados
Tabela 3-Estudo da inibio do fosfatase cida pelo inibidor escolhido: Avaliao do tipo de
inibio

Tubo

Absorvn

Absorvn

Vi pNPP

Ci

Vf

Cf pNPP
4

cia
1
2

0,121
0,373

cia
Corrigida
0
0,252

3
4
5
6
7
8

0,521
0,72
1,152
1,29
1,66
2,09

0,4
0,599
1,031
1,169
1,539
1,969

(ml)
0
0,0125

pNPP
(M)
0,01
0,01

pNPP
(ml)
2,5
2,5

0,025
0,0625
0,125
0,250
0,625
1,250

0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01

2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5

(M)
0
0,0000
5
0,0001
0,0025
0,0005
0,001
0,0025
0,005

Clculos concentrao final de pNPP:

CiVi=CfVf

Tabela 4- Estudo da inibio do fosfatase cido pelo inibidor escolhido:avaliao do tipo de

inibio

Cf de
pNPP
0

Absorvncia
Corrigida
0

0,00005

0,252

0,0001

0,4

0,0025

0,599

0,0005

1,031

0,001

1,169

0,0025

1,539

0,005

1,969

Tubo

[P] pNPP

V0

0
0,000001
4
2,22222E
-06
3,32778E
-06
5,72778E
-06
6,49444E
-06
0,000008
55
1,09389E
-05

0
0,000000
14
2,2222E07
3,3278E07
5,7278E07
6,4944E07

1/V0

0
714285
7,1
450000
0
300500
8,3
174587
7,8
153977
7,6
116959
8,55E-07
0,6
1,0939E- 914169,
06
63

1/S
0
20000
10000
400
2000
1000
400
200

Clculo da concentrao do produto de pNPP:

Pela lei de Lambe-Beer:

Clculo de V0:

Absorvncia
180000

concentrao do produto de pNPP

10

Absorvncia vs. Cf de pNPP

2.5
2

f(x) = 206.86x + 0.96

R = 0.99

1.5

Absorvncia

1
0.5
0

0.01

0.01

Cf de pNPP

Figura 1- Absorvncia vs. Cf de pNPP

Figura 2- Grafico de Lineweaver-Burk

1
Calcular Vmx: b= Vmx .

(=) Vmx.=

1
b

1
(=) Vmx.= 109959

(=)

Vmx.=9,1 E-06 cm/min

Calcular Km: m=km/Vmx (=) 30,996=Km/9,1 E-06 (=) Km=2,8 E-4

Tabela 5- Estudo do efeito da concentrao de substrato na actividade enzimtica de

fosfatase cida

Tubo

Absorvncia

Cf de pnPP
(M)
0

0,00005

0,165

0,0001

0,211

0,00025

0,332

0,0004

0,424

0,001

0,648

0,0025

1,239

0,005

2,076

0,069

[P]
pNPP
3,83333
E-07
9,16667
E-07
1,17222
E-06
1,84444
E-06
2,35556
E-06
0,00000
36
6,88333
E-06
1,15333
E-05

V0

1/V0

1/S

3,83333E
-08
9,16667E
-08
1,17222E
-07
1,84444E
-07
2,35556E
-07
0,000000
36
6,88333E
-07
1,15333E
-06

2608695
6,5
1090909
0,9
8530805,
69
5421686,
75
4245283,
02
2777777,
78
1452784,
5
867052,0
23

Figura 3-Grfico de Lineweaver-Burk dos resultados experimentais e da reta controlo

Calcular Vmx.: b=1/Vmx. (=) 452187= 1/Vmx (=) Vmx=2,2 E-6 cm/min
Calcular Km: m=Km/Vmx (=) 32,223=Km/2,2 E-6 (=) Km= 7,12 E-5

Calculo de Ki
7

20000
10000
4000
2500
1000
400
200

Tabela 6- Estudo da inibio do fosfatase cido pelo inibidor escolhido: Determinao Ki

Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8

Absorvncia
0,901
0,891
0,821
0,759
0,423
0,366
0,348
0,329

Vi de NaF
0
0,025
0,125
0,25
0,375
0,5
0,625
0,78

Ci de
NaF
0,005
0,005
0,005
0,005
0,005
0,005
0,005
0,005

Vf de
NaF
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5

Cf de
NaF
0
5,00E-05
2,50E-04
5,00E-04
7,50E-04
1,00E-03
1,25E-03
1,56E-03

Figura 4- Absorvncia Vs Cf de NaF

Tabela 7-Estudo da inibio do fosfatase cido pelo inibidor escolhido: Determinao Ki

Calcular concentrao de NaF:

A
A= * C*l (=) C= l
Clculo de V0:

(=) C=

A
180001

concentrao do produto pNPP

10 min

Figura 5- Grfico de Lineweaver- Burk

Calcular Vmx. : b=1/Vmx. (=) 664504= 1/ Vmx (=) Vmx= 1,5 E-6
cm/min
Calcular do Ki: m=Ki/ Vmx (=) -177,98=Ki/1,5 E-6 (=) Ki= -2,68 E-4

5. Discusso e Concluso
Para a avaliao do tipo de inibio temos que tomar especial
ateno leitura das absorvncias da tabela 1.
Para comear calcularam-se todos os parmetros necessrios
realizao dos respetivos grficos.
Em primeiro lugar, comeou-se por corrigir o valor da absorvncia.
Para os valores serem mais precisos e corretos subtraiu-se o valor do
tubo 1 a todos os tubos, funcionando assim o tubo 1 como o branco
da experincia.
Em segundo lugar, recorreu-se relao Ci x Vi = Cf x Vf para
calcular a concentrao final de pNPP de cada um dos tubos.
A concentrao final de pNPP importante para o clculo de 1/[S].
Como a concentrao inicial era de 10mM, o volume final era de
2,5ml e o volume inicial era diferente nos diferentes tubos (ver tabela
9

1), a concentrao final tambm seria diferente nos mesmos. Desta

forma, foi possvel obter a tabela 3.
Aps se possuir os parmetros j calculados foi necessrio calcular a
concentrao de produto de pNPP. Para calcular essa concentrao
recorreu-se lei de Lambert-Beer.
A = .c.l
Sendo, A a absorvncia, a absortividade molar da substncia
(18000M-1cm-1), c a concentrao de sustncia absorvente no meio
e l a distncia que a luz atravessa pelo corpo (1cm da cuvete), temos:

Possuindo a concentrao de produto de pNPP, foi possvel calcular a

velocidade inicial (V0).

Desta forma, temos ento todos os parmetros calculados. A tabela 4

permite visualizar todos os valores necessrios.
Primeiramente, devemos traar o grfico da absorvncia corrigida vs
concentrao final de pNPP. De seguida, traamos o Grfico de
Lineweaver-Burk com os valores experimentais.

A partir do grfico de Lineweaver-Burk podemos determinar os

respetivos valores de Vmx e Km uma vez que possumos j a
equao (y = mx + b):
y=30,996x + 109959
De seguida calculou-se a partir da recta a Vmx e o Km.
Para podermos chegar a uma concluso necessrio possuir uma
reta controlo (1). Essa reta controlo permite-nos avaliar o tipo de
inibio presente. Os valores da reta controlo foram fornecidos por
uma colega que tinha como experincia laboratorial a cintica
enzimtica.
O clculo dos diferentes parmetros fazia-se da mesma forma que se
fez anteriormente pelo que, desta vez, apenas se representar os
valores finais na tabela 5.
Atravs dos valores presentes na tabela 5 foi possvel sobrepor a reta
controlo ao grfico que j tinha sido feito em relao inibio
enzimtica. Desta forma podemos visualizar o grfico 3. Pela
visualizao do grfico possvel supor que se trata de uma inibio
10

no-competitiva, uma vez que as duas retas esto muito prximas de

ser paralelas.
Porm, deve-se fazer uma avaliao mais aprofundada, calculando a
Vms e o Km destes novos valores e ver se os valores anteriores
diminuem, aumentam, ou se mantm constantes.
A nova equao da reta :
y = 32,223x +452187
De seguida calculou-se o valor de Vmx e de Km
Ora, tendo as duas Vmx e os dois Km calculados podemos comparar
ambos os valores.
Trata-se de uma inibio no competitiva quando Vmx diminui e Km
constante, assim sendo, vamos comprovar este caso.
Em relao Vmx:
9,1E-6 cm/min > 2,2E-6 cm/min
H uma diminuio da Vmx.
Em relao ao Km: 2,8E-4>7,12E-5
H uma diminuio do Km.
Desta forma, no podemos concluir com exatido que se trata de
uma inibio no-competitiva mas tambm normal que tal tenha
acontecido uma vez que este tipo de inibio, apesar de muito
mencionado na literatura, corresponde a uma situao experimental
rara (2).
Determinao do Ki
Para a avaliao do tipo de inibio temos que tomar especial
ateno leitura das absorvncias da tabela 2.
Para comear calcularam-se todos os parmetros necessrios
realizao dos respetivos grficos.
Em primeiro lugar, recorreu-se relao Ci x Vi = Cf x Vf para
calcular a concentrao final de inibidor (NaF) de cada um dos tubos.
A concentrao final de inibidor importante para o clculo de 1/[S].
Como a concentrao inicial era de 5mM, o volume final era de 2,5ml
e o volume inicial era diferente nos diferentes tubos (ver tabela 2), a
concentrao final tambm ser diferente nos mesmos. Desta forma
foi possvel obter a tabela 6.
Aps se possuir os parmetros j calculados foi necessrio calcular a
concentrao de produto de NaF. Para calcular essa concentrao
recorreu-se lei de Lambert-Beer

A=

.c.l

Sendo, A a absorvncia, a absortividade molar da substncia

(18000M-1cm-1), c a concentrao de sustncia absorvente no meio
e l a distncia que a luz atravessa pelo corpo (1cm da cuvete), temos:

11

Por ltimo, calculou-se a velocidade inicial (V 0) e obteve-se a tabela 7,

com todos os valores necessrios.

Primeiramente, devemos traar o grfico da absorvncia vs

concentrao final de NaF (grfico 4)
De seguida, traamos o Grfico de Lineweaver-Burk com os valores
experimentais (grfico 5)
A partir do grfico de Lineweaver-Burk podemos determinar os
respetivos valores de Vmx e Ki uma vez que possumos j a equao
(y = mx + b):
y= -177,98x + 664504
De seguida calculou-se o Vmx e o Ki.
A inibio de uma enzima corresponde a uma diminuio da sua
atividade, por associao a molculas com estrutura semelhante ao
substrato denominadas inibidores.
O conceito biolgico de inibidor enzimtico diz respeito substncia
que capaz de interferir, de maneira especfica, na taxa de uma
reao de catlise enzimtica, retardando ou reduzindo o processo ou
a especificidade biolgica da reao.
Os processos de inibio de enzimas esto divididos em dois tipos:
inibio reversvel e inibio irreversvel.
Dentro da inibio reversvel temos ainda a Inibio Competitiva,
Mista e a No-Competitiva.
A avaliao do tipo de inibio pode ser feita consoante a anlise da
Vmx e do Km que determinado a partir da representao grfica
da equao de Lineweaver-Burk.
Para alm da avaliao do tipo de inibio, pode ser determinado
tambm, a partir da equao de Lineweaver-Burk o Ki da reao.

6. Refernicas
(Valores fornecidos pela aluna Joana Gomes do curso de Cincias
Forenses e Criminais, 1 Ano do Institudo Superior de Cincias da Sade
Egas Moniz)
(1)

12

(Quintas, Alexandre, Freire, Ana Ponces, Halpern Manuel J. (2008),

BIOQUMICA Organizao Molecular da Vida. Lisboa, LIDEL)
(2)

13