COLORANTES Y TECNICAS DE COLORACION

FUNDAMENTO TEORICO
Colorantes Los colorantes son sustancias de origen qumico o biolgico,
generalmente tintes, pigmentos, reactivos u otros compuestos, empleados en la
coloracin de tejidos microorganismos para exmenes microscpicos,
debiendo tener al menos, un grupo cromforo que le proporcione la propiedad
de teir.
La coloracin es el proceso de teir artificialmente los microorganismos con
colorantes o reactivos para facilitar su estudio microscpico forma, agrupacin
y estructuras)
Un colorante es un compuesto orgnico que consta de anillos bencnicos y
grupos cromforos (agrupacin de tomos que da color a ciertos compuestos)
y auxocromos (sustituyentes como el grupo oxidrilo o el amino que mejoran las
caractersticas de absorcin del cromforo)
En el laboratorio de microbiologa se pueden usar los colorantes de
varias formas como:
a) Para teir bacterias y hacerlas visibles al microscopio
b) Para mostrar estructuras del organismo estudiado.
c) Para la identificacin de microorganismos en base a sus caractersticas
de tincin, por ejemplo, si son o no alcohol-cido resistentes, si son
Gram positivas o Gram negativas.
d) En los medios de cultivo para inhibir el desarrollo de algunas bacterias y
as poder estudiar selectivamente a los microorganismos que si crecen.

CLASIFICACION DE LOS COLORANTES O TINTES

Colorante cido: Sucede todo lo contrario, la sustancia colorante est a

cargo del anin, mientras que el catin no tiene propiedad, por ejemplo:
eosinato- de sodio+

Colorantes bsicos: La accin colorante est a cargo del catin,

mientras que el anin no tiene esa propiedad, por ejemplo: - cloruro de azul
de metileno+.

Colorantes neutros: Estn formados simultneamente por soluciones

acuosas de colorantes cido y bsicos, donde el precipitado resultante,
soluble exclusivamente en alcohol, constituye el colorante neutro, que tiene
la propiedad tintorial de sus componentes cidos y bsicos, por ejemplo: la
giemsa.

Colorantes naturales. Los colorantes naturales son bsicamente histolgicos,

encontrndose entre los empleados con mayor frecuencia, los siguientes:

ndigo: Se obtiene de diversas especie de plantas del genero indigfera

que contiene indican, el cual se fermenta para producir el colorante.

Carmn: Se produce, mediante el tratamiento con alumbre y otras sales

metlicas a hembras del insecto cochinilla "Coccus castis".

Orcena y Tornasol: Se obtiene mediante el procesamiento industrial de

lquenes de los gneros: Le canora tinctoria y Rosella tinctoria.

Hematoxilina: Este colorante se extrae con ter de la madera de un rbol

oriundo de Mxico y de algunos paises suramericanos denominados
Hematoxilium campechianum.

Colorantes sintticos. Se obtiene de la anilina, o es ms exactamente del

alquitrn de hulla siendo todos derivados del benceno.
TECNICAS DE COLORACION

coloracion simple: En la coloracin simple se utiliza un solo colorante

con el que se tie rpidamente el microorganismo, utilizndose
fundamentalmente para observar su morfologa y tamao. Los colorantes
empleados con mayor frecuencia para este tipo de tincin son los
siguientes: azul de metileno, violeta cristal y fuscina fenicada, entre otros.

coloracion compuesta: En este tipo de coloracin, se utiliza ms de una

sustancia tintrea. Los colorantes se aplican, a la preparacin, separados o
juntos, formando parte de una solucin. En consecuencia se puede
determinar algunas caractersticas propias de diversos gneros que
permiten diferenciarlo de los dems, por lo que reciben tambin el nombre
de coloraciones diferenciales. Entre los mtodos ms utilizados se
encuentran: La coloracin de Gram. y la de Ziehl Neelsen.

COLORACION GRAM
Dado que las bacterias no tienen color y por lo general invisible para la
microscopa de luz, diferentes tcnicas de tincin se han desarrollado para
visualizarlas. La ms til es la tincin de Gram, que separa los organismos en 2
grandes grupos: gram-positivos y gram-negativas.
Esta tincin tambin permite que el clnico pueda determinar si el organismo es
redondo o en forma de varilla, etc.
Ambos organismos, gram-positivas y gram-negativas tienen ms que una capa
de proteccin de su citoplasma y ncleo desde el medio extracelular, a
diferencia de las clulas animales, que tienen una sola membrana
citoplasmtica compone de una bicapa de fosfolpidos. La capa externa de la
membrana citoplasmtica bacteriana es el peptidoglicano o pared celular. Est

presente en ambos
organismos gram-positivos y gram-negativas.
La capa de peptidoglicano o pared celular est compuesta de repetidos
disacridos con 4 aminocidos en una cadena lateral que se extiende desde
cada disacrido.
Las cadenas de amino-cidos del peptidoglicano se unen covalentemente a
otros aminocidos de las cadenas vecinas. Esto resulta en una estable
estructura reticulada. La enzima que cataliza la formacin de esta unin Se
llama transpeptidasa y est situado en el interior citoplsmica
membrana. El antibitico se une a la penicilina inhibe esta enzima. Por esta
razn, la enzima es
tambin llamada protena de unin a la penicilina.
La tincin de gram es la tcnica principal utilizada para el examen microscpico
de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clnica pueden
detectarse con este mtodo. Las nicas excepciones son:
Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las
clulas husped (p. ej., clamidias).
Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas).
Los que tienen un tamao insuficiente para ser observados por el
microscopio ptico (p. ej., espiroquetas).
Los que tienen una diferente composicin en su pared y no captan los
colorantes (p. ej., mycobacterias).
PROCEDIMIENTO:
El procedimiento clsico de la tincin de Gram consiste en fijar el
material orgnico a la superficie del portaobjetos del microscopio ya por
calor o con metanol.
Despus de la fijacin el primer paso en la tincin de Gram es la
aplicacin del colorante principal cristal violeta (metil rosanilina o violeta
de genciana). Luego se aplica un mordiente, el yodo de Gram (lugol),
para que el colorante alcalino se una a la pared celular a travs de
enlaces qumicos. La decoloracin distingue las bacterias grampositivas
de las gramnegativas. Despus de la decoloracin los microorganismos
aparecen como grampositivos retienen el cristal violeta y los
gramnegativos lo pierden. El agregado colorante de contraste safranina
(Contratincin) teir de color rosa o rojo las bacterias gramnegativas
claras.
OBSERVACION DE LA TINCION DE GRAM.
Una vez teido el frotis se observa con el objetivo de inmersin (1.000x).
Cuando el material orgnico se tie con Gram (p. ej., frotis directo) el
portaobjetos se evala en busca de la presencia de clulas bacterianas as
como de las reacciones Gram, (Fig. 3) En el anlisis de muestras clnicas
suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:
Identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin.
Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos
bacterianos identificados en la tincin de Gram se deben de
corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si
se observan mayor nmero de formas bacterianas que las aisladas hay

que reconsiderar los medios de cultivos empleados as como la

atmsfera de incubacin.

COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN
La
tincin de Ziehl-Neelsen es una tcnica de tincin diferencial que se basa en
que las paredes celulares de ciertas bacterias contienen cidos grasos (cidos
miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la
propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-acido, despus de la tincin
con colorantes bsicos. Las micobacterias absorben los colorantes solo muy
lentamente debido a la elevada proporcin de ceras y lpidos en la pared
celular. Para acelerar la absorcin del colorante fuscina y as la formacin del
complejo micolatofusina en la pared celular, se calienta la solucin de fuscina
fenicada aplicada sobre el preparado normalmente hasta la formacin de
vapores. Una vez que las micobacterias han absorbido el colorante, difcilmente
lo ceden a pesar del tratamiento con solucin decolorante alcohol-cido
clorhdrico. Por esto se denominan bacilos alcohol acido resistente o BAAR y
aparecen en el preparado microscpico teidas de rojo, mientras que todos los
microorganismos no resistentes a los cidos se tien de acuerdo con la
contratincin.1 Esta tincin tiene inters desde el punto de vista del diagnstico
clnico puesto que algunos microorganismos patgenos cido-alcohol
resistentes, tales como Mycobacterimum tuberculosis son patgenos muy
importantes para los humanos. Las micobacterias no constituyen el nico grupo
que tienen propiedades alcohol-acido resistentes. Las especies de Nocardia y
Rhodococcus poseen una alcohol-acido resistencia parcial as como Legionella
micdadei causante de neumona. Los quistes de los gneros Cryptosporidium e
Isospora tienen resistencia definida a las tinciones con acido alcohol

BIBLIOGRAFA
1.Koneman, E. Diagnostico microbiolgico, Editorial mdico panamericana,
2.Jawetz Ernest, Microbiologa mdica, 17 edicin en espaol, Manual
moderno, Mxico, Mxico 2002.
3.Bailey & Scott, Diagnstico microbiolgico, 11 edicin, Editorial
Panamericana, Buenos Aires Argentina, 2 004.
4.Salazar Wilson, Guas de prctica de Laboratorio de Microbiologa, Depart.
de publicaciones de la Facultad de Ciencias Mdicas, Quito Ecuador, 2007.
5 Koneman, E. Diagnostico microbiolgico, Editorial mdico panamericana, 110
111.
6 Mandell, Bennett, & Dolin: Principles and Practice of Infectious Diseases 6th
ed.
7Copyright 2005. Churchill Livingstone, An Imprint of Elsevier.
8.- http://www.opsecu.org/informativo/informativo5/tuberculosis.htm