II.

Manual de Prcticas del

Laboratorio de Bioqumica

II. Manual de Prcticas del Laboratorio de Bioqumica

1. Agua
La vida en la tierra, desde su origen
mismo, se ha desarrollado siempre con la
ayuda del agua, que ha provisto a los
organismos desde los principios de su
evolucin hasta la actualidad, de un
ambiente en el que las molculas que los
constituyen se han multiplicado
en
nmero y complejidad. En consecuencia,
la fisiologa de los seres vivos est
ntimamente ligada desde sus mismos
niveles moleculares a las propiedades de
3
este solvente vital.
A causa de su ubicuidad es
considerada, con frecuencia, un lquido
inerte, meramente destinado a llenar
espacios en los organismos vivos. Pero en
realidad, el agua es una sustancia de gran
reaccionabilidad, con propiedades poco
frecuentes, que la diferencian mucho,
tanto fsica como qumicamente, de la
mayora de los lquidos corrientes. El agua
posee, elevados puntos de fusin, la
temperatura de ebullicin mas alta, el calor
especfico de vaporizacin ms alto, el
calor de fusin y tensin superficial
elevados. Estas propiedades indican que
en el agua las fuerzas de atraccin entre
las molculas y, por tanto, su cohesin
5
interna, son relativamente elevadas.
Los tomos de hidrgeno y oxgeno
del agua se acomodan en una orientacin
no lineal donde el enlace H-O-H forma un
ngulo de 104.5, figura 1.1.
La naturaleza polar del agua da
lugar a la atraccin electrosttica entre sus
molculas. El hidrgeno de una molcula,
en virtud de su carga parcialmente
positiva, es atrado hacia el oxgeno de
otra molcula que a su vez posee una
carga parcialmente negativa. De esta
manera, cada hidrgeno de una molcula
puede ser compartido con los oxgenos de
otras molculas, del mismo modo en que
se comparten los electrones de dos
tomos, cuando estos forman una unin
covalente, a este tipo de interaccin o

atraccin entre las molculas del agua se

le llama puente de hidrgeno, figura 1.2.

Figura 1.1 Estructura de la molcula de

3
agua.
El hecho de que los puentes de
hidrgeno son en realidad protones que se
comparten entre dos tomos de oxgeno, y
de que el movimiento de estos es mas
lento que el de los electrones en una unin
covalente, es lo que hace que estas
uniones sean ms dbiles que las
covalentes (4.5 kcal/mol vs. 110 kcal/mol,
respectivamente). Debido a que en la
molcula e agua el oxgeno tiene situados
sus orbitales electrnicos de modo
tetradrico, cada molcula de agua solo
puede formar puentes de hidrgeno
estables, con las otras cuatro molculas
vecinas que se encuentran en los vrtices
del tetraedro que forman los orbitales del
3
oxgeno.
A su vez, esta propiedad explica la
extraordinaria capacidad del agua para
actuar como solvente de los compuestos
polares.
Los iones ya sean positivos o
negativos de una red cristalina son
atrados por las molculas dipolares del
agua y se solubilizan. Una vez en solucin,

tanto los iones con carga positiva como los

de carga negativa, son rodeados por
capas protectoras de molculas de agua,
de modo que disminuye la interaccin
entre estos iones con cargas opuestas.

Figura 1.2 Puentes de hidrgeno entre dos

3
molculas de agua.
Los ejemplos de los compuestos
polares que disuelven fcilmente en agua
son molculas orgnicas pequeas que
contienen
uno
o
ms
tomos
electronegativos (tales como oxgeno o
nitrgeno), incluyendo los alcoholes, las
aminas, y los cidos carboxlicos. La
atraccin entre los dipolos de estas
molculas y del dipolo del agua hace que
tiendan a disolver. Las sustancias inicas
y polares son referidas como hidroflicas
debido
a
esta
tendencia.
Los
hidrocarburos
son
no
polares.
Consecuentemente, las molculas no
polares no disuelven en agua y son
referidas
como
hidrofbicas,
los
hidrocarburos en particular tienden a
secuestrarse desde un ambiente acuoso.
Un lquido no polar forma un sistema de
dos capas con el agua; un ejemplo es una
capa de petrleo. Es posible que una sola
molcula tenga porciones polares y no
polares. Las sustancias de este tipo se
llaman amfipticas. Un compuesto tal
como estos en la presencia del agua
tiende a formar las estructuras llamadas
las micelas, en las cuales los grupos
principales polares estn en contacto con
el ambiente acuoso y las colas no polares
2
se aslan del agua.

Otra
de
las
propiedades
extraordinarias del agua que la hacen un
medio ideal para los organismos vivos es
su capacidad calorfica especfica, (el
nmero de caloras requeridas para elevar
la temperatura de 1 g de agua de 15 a
16 C) que es igual a 1.0 y es
notablemente alta entre las de varios
disolventes con enlaces de hidrgeno.
Cuanto mayor sea el
calor
especifico de una sustancia, menor ser el
cambio de temperatura que resulte cuando
dicha sustancia absorba una cantidad
dada de calor. De este modo, las
propiedades del agua la hacen apropiada
para mantener relativamente constante la
temperatura de un organismo vivo.
El calor de vaporizacin del agua es
muy alto. Expresado como el calor
especfico de vaporizacin (caloras
absorbidas por un gramo de agua
vaporizada), el valor para el agua es de
540 en su punto de ebullicin e incluso
mayor a temperaturas ms bajas. Este alto
valor resulta de gran utilidad para que los
organismos vivos mantengan constante su
temperatura ya que es posible disipar una
gran cantidad de calor por vaporizacin del
agua.
El alto calor de fusin del agua
reviste importancia en la estabilizacin del
medio biolgico. Aunque en las formas
superiores de vida rara vez se congela el
agua, el calor desprendido por sta al
congelarse es un factor importante para
disminuir la cada de temperatura de un
cuerpo de agua durante el invierno. As, 1
g de agua al congelarse a 0 C, debe
ceder 80 veces tanto calor como el que
pierde al disminuir de 1 a 0 C
exactamente antes de congelarse.
El agua se expande al solidificarse,
y por tanto el hielo es menos denso que el
agua. Solo otras pocas sustancias se
expanden al congelarse. Si el hielo fuera
mas pesado que el agua, se hundira. Esto
significa que los ocanos, lagos y
corrientes de agua se congelaran del

fondo hacia la superficie, y una vez

congelados, seran extremadamente difcil
que se fundieran. Obviamente, una
situacin as no permitira que dichos
cuerpos de agua constituyeran el hbitat
de muchas formas vivientes, como
efectivamente sucede. Lo que sucede en
la realidad es que el agua lquida, ms
caliente, se va al fondo de los lagos y el
hielo se mantiene sobre la superficie,
donde el calor proviene del medio externo
lo alcanza y lo funde. Otras propiedades
del agua tales como su alta tensin
superficial y su elevada constante
dielctrica son muy importantes desde el
punto de vista de la biologa.

Ionizacin del Agua

Durante la interaccin con puentes
de hidrgeno entre las molculas de agua,
existe la tendencia a que algunas cedan
totalmente sus protones a las molculas
vecinas y que stas a su vez cedan sus
protones a otras. Cuando esto sucede,
aparecen cargas reales en las molculas,
una carga neta negativa en aquellas que
cedieron sus protones, y una carga neta
positiva en las que ganaron los protones.
De acuerdo con la teora de J. N. Brnsted
y T. M. Lowry, en la que se concepta a un
cido como una molcula que es capaza
de donar protones, y una base como una
molcula que es capaz de aceptar
protones, la ionizacin del agua, tal como
se describe arriba, da lugar a dos especies
inicas de la molcula de agua: el in
+
hidronio, H3O que funciona cono un cido,
pues es capaz de donar un protn y el in
hidroxilo OH que es una base, pues es
capaz de aceptar un protn.
2H2O

H3O + OH

Experimentalmente
se
ha
determinado que en un litro de agua pura
a 25 C se mantiene una concentracin
-7
promedio de 1.0X10 molar de iones
hidroxilo. Aunque no existen realmente
+
protones libres (H ) en el agua, para
facilitar la comprensin del proceso de
ionizacin del agua, consideraremos la
disociacin de sta en:
+

H2O

H + OH

Al producto de la concentracin de
los iones hidrgeno por la de los iones OH
se le da el nombre de producto inico del
agua, kw y tiene entonces el siguiente
valor.
-7

-7

Kw = (1.0X10 ) X (1.0X10 ) = 1.0X10

-4

La constante Kw, expresa el

producto de las concentraciones de iones
+
H y OH que, por definicin, no cambia.
En consecuencia, cuando una solucin es
cida, la concentracin de protones es
relativamente alta; pero la concentracin
de hidroxilos disminuye en una cantidad
igual, para que el producto de las
+
concentraciones de H y de OH se
mantenga constante. En el caso de una
solucin alcalina, la situacin se invierte,
disminuyendo
la
concentracin
de
protones y aumentando en forma
3
correlativa la concentracin de hidroxilos.
Como las concentraciones que se
manejan
son
tan
pequeas,
aun
expresadas,
matemticamente
como
submltiplos de 10 (potencias negativas
de 10), su manejo puede resultar
"complicado" por lo que se utiliza el
logaritmo negativo de base 10 para
expresarlo. Esto es lo que se conoce como
+
"p" y referido a la concentracin de H se
denomina pH. El pH corresponde al
logaritmo negativo de la concentracin de
hidrogeniones, o sea:
+

pH = -log [H ] o bien,

pH = log 1/ [H ]

Ntese que la "p" es minscula, ya

que se trata de una sigla que indica
potencial.
Si se considera que el valor de la
-7
concentracin de protones es de 1x10 ,
se tiene que:
-7

-7

pH = log 1/(1X10 ) =log1-Iog 1x10 = 0-(-7) =

7

Es a partir del agua que se define la

escala de pH , por lo cual se habla de
soluciones cidas cuando tiene valores de
concentracin de hidrogeniones mayores
-7
de 1x10 o pH menores de 7 y de
soluciones alcalinas con concentraciones
-7
de hidrogeniones menores de 1x10 y pH
mayores a 7.
Como la mxima concentracin
posible de hidrageniones en solucin
acuosa es de 1.0 M, el valor de pH mnimo
es 0.0 ya que el log10 1 es 0. En el otro
+
extremo, cuando la concentracin de H es
-14
la mnima (1x10 ) el pH es de 14. El
punto de neutralidad es de pH = 7 o en
+
-7
concentracin de H de 1 x 10 . EI rango
de pH para indicar la acidez de una
solucin va del 0 al 7, mientras que el
correspondiente a la basicidad o
alcalinidad de una solucin va del 7 al 14.

cidos y Bases
La ecuacin para la disociacin o
ionizacin de un cido (HA) en disolucin
acuosa diluida implica la transferencia de
un protn desde el cido al agua, la cual
puede actuar como aceptor del protn y
+
forma el cido H3O :
HA + H2O

H3O + A

Cada base conjugada posee una

afinidad caracterstica para su protn; los
que muestran una afinidad elevada por el
protn son cidos dbiles y solo se
disocian muy ligeramente, los que
muestran una afinidad pequea son cidos
+
fuertes y pierden iones H con facilidad.

La tendencia de cualquier cido a

disociarse viene dada por su constante de
disociacin:
+
Ka = [H ] [A ]
[HA]
Constituye tambin una convencin,
en bioqumica, emplear las constantes de
disociacin basadas en la medida analtica
de las concentraciones de los reactivos y
de los protones, en unas determinadas
condiciones experimentales, es decir, para
una concentracin total y fuerza inica
determinadas y especificando los dems
solutos. Esta constante recibe el nombre
de constante de disociacin aparente y se
designa por K' o constante de disociacin
termodinmica empleada por los qumicosfsicos, la cual esta corregida por la
desviacin del sistema de conducta ideal
provocada por factores tales como la
concentracin y la fuerza inica. Cuanto
ms sea grande la Ka mayor es la
tendencia del cido a disociarse; es decir
ms fuerte es el cido. La fuerza de los
cidos generalmente se expresa en
funcin del valor de pKa en donde:
pKa = - logKa
Dado que pKa es el logaritmo
negativo de Ka un valor numricamente
pequeo de pKa corresponde a un cido
fuerte y un valor numricamente grande
corresponde a un cido dbil.

Indicadores cido-Bsicos
El pH de una disolucin puede
determinarse mediante el empleo de
colorantes indicadores, la mayor parte de
las cuales son cidos dbiles (se designan
como HInd). Tales indicadores se disocian
de acuerdo con el equilibrio:
Hlnd

H + Ind

Supongamos que la especie Hlnd

es incolora y que la especie Ind es
coloreada. La posicin de equilibrio de

II. Manual de Prcticas del Laboratorio de BioqumicaI

esta disociacin y por tanto, la cantidad de

luz absorbida por la especie Ind a su
longitud de onda caracterstica, es
determinada por la concentracin de
hidrgeno del medio. En una disolucin
fuertemente cida, el equilibrio se
desplaza hacia la izquierda y se absorber
poca luz a la longitud de onda del mximo
de absorcin de Ind . En una disolucin
bsica, la especie Ind se halla favorecida,
ya que el exceso de iones OH reacciona
+
con los iones H para formar agua,
impulsando el equilibrio hacia Ind . En este
caso se absorber mucha luz.

Tampones
Los
fluidos
intracelulares
y
extracelulares de los organismos vivos
contienen
pares
conjugados
cidobsicos, los cuales actan como tampones
al pH normal de dichos fluidos.
El
tampn
intracelular
ms
importante es el par conjugado cido2bsico H2PO4 / HPO4 (pK' = 7,2). Los
fosfatos orgnicos, tales como la glucosa6-fosfato y el ATP, contribuyen tambin a
la capacidad de tamponamiento en la
clula. El principal tampn extracelular en
la sangre y en los fluidos intersticiales de
los vertebrados es el sistema tampn del
bicarbonato.
Puesto que por la ley de Henry la
solubilidad de un gas en agua es
proporcional a su presin parcial, el pH de
su sistema tampn constituido por el
bicarbonato es funcin de la presin
parcial del CO2 en la fase gaseosa situada
sobre la disolucin tampn.
El rasgo distintivo del sistema
tampn del bicarbonato lo constituye que
el CO2 sea el producto final de la
combustin aerobia de las molculas
combustibles en los vertebrados, que se
expulsa en ltimo trmino por los
3,7,20
pulmones.

II. Manual de Prcticas del Laboratorio de Bioqumica

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
LABORATORIO DE BIOQUMICA
PRCTICA No. 1
PREPARACIN DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS Y
DETERMINACIN DE pKa
NOMBRE:

GRUPO:

FECHA:

TIEMPO DE PRCTICA: 3 Horas.

OBJETIVOS:

Aprender el uso de la ecuacin de

Henderson-Hassebalch.
Experimentar y entender como se
comporta un sistema amortiguador
de pH.
Aprender a calcular el pKa de un
par cido-base.
Realizar la determinacin del pKa
para diferentes tipos de cidos
mediante la ejecucin de una curva
de titulacin.

PREGUNTAS PRELABORATORIO
1.-Qu es el pKa?
2.-A partir de que parmetro podemos
calcular el pKa?
3.-Qu es una solucin buffer?
4.-Para que
buffer?

se utiliza una

solucin

5.-En los organismos podemos encontrar

sistemas amortiguadores?

FUNDAMENTO
Resulta muy til poder relacionar el
pH de la solucin de un cido dbil con la
constante de disociacin de este.
+

K = [H ][A ]

[HA]
A fin de lograr esta relacin se
puede reordenar la ecuacin para la
constante de disociacin del cido HA,
+

[H ] = Ka [HA]
[A]
si se toman logaritmos negativos
ambos trminos, encontraremos:

de

- log10[H ] = - log10Ka - log10 [HA]

[A]
De manera semejante a la forma en
+
que se define pH (pH = log10 1 / [H ] =
- log10) por definicin pKa es:
pKa = log10 1 = -log10 Ka
Ka
Si se sustituyen pH y pKa por sus
equivalentes en la ecuacin reordenada
de la disociacin del cido HA, tendremos:
pH = pKa log10 [HA]
[A]
Finalmente, se puede cambiar el
signo al logaritmo en la ecuacin
invirtiendo la relacin [HA] / [A], porque
log10 [HA] / [A] = + log10 [A ] / [HA] y
entonces tenemos:

pH = pK + log10 [ A ]
[HA]
Esta es la ecuacin de HendersonHasselbach, que establece la relacin
entre el pH de la solucin acuosa de un
cido dbil, su pK y las cantidades de las
18
formas disociada y no disociada.
Las soluciones buffer por otra parte
contienen un cido dbil y su base
conjugada o una base dbil y su cido
conjugado en donde el pH es igual o
cercano a su valor de pKa, la ecuacin de
Henderson-Hasselbach puede ser usada
para realizar los clculos necesarios para
20
su preparacin.

MATERIAL Y PROCEDIMIENO
EXPERIMENTAL
MATERIAL DE LABORATORIO:
- 2 Vasos de precipitados de 100 ml
- 2 Vasos de precipitados de 150 ml
- 1 Pipeta graduada de 10 ml
- 1 Pipeta graduada de 5 ml
- 1 Pipeta graduada de 1 ml
- 1 Matraz volumtrico de 100 ml
- 1 Bureta
- 1 Agitador magntico
- Piceta
REACTIVOS:
(Para su preparacin vase la preparacin
de soluciones).
- Glicina 0.025 M pH 2.0
- Lisina 0.025 M pH 2.0
- cido asprtico 0.025 M pH 2.0
- NaOH 1 M
EQUIPO:
- Potencimetro
a)

Preparacin
de
Soluciones
Amortiguadoras:
La seleccin
de una solucin
reguladora adecuada para un determinado
proceso bioqumico, debe ajustarse a los
siguientes criterios:

- Escoja el buffer de tal modo que

su pKa est muy prximo al pH al cual se
va a trabajar (generalmente, entre 6 y 8).
Si se espera que el pH va a descender
durante el proceso bioqumico, escjase el
buffer cuyo pKa sea algo menor que el pH
inicial de trabajo; si el pH va a aumentar, el
pKa debe ser algo mayor que el pH inicial.
-Las sustancias que se van a
emplear deben ser hidrosolubles y con un
alto grado de pureza, a fin de evitar
efectos o reacciones espurias.
-No deben usarse en la elaboracin
del buffer, sustancias citotxicas o que
tengan accin inhibidora de enzimas.
-Deben ser sustancias qumica y
enzimticamente estables.
-Si las sustancias empleadas
interactan con cationes o aniones o
tienen efectos salinos, estos efectos deben
ser mnimos y bien conocidos. Si forman
complejos con iones, estos deben ser
hidrosolubles.
-No deben absorber luz en las
regiones visibles y ultravioleta.
-Deben tener adecuada "capacidad
buffer" en el rango de pH requerido. Para
cubrir estos y otros requerimientos
especiales, existe una gran diversidad de
reguladores para uso en bioqumica,
algunos no contienen cationes minerales.
En esta prctica, cada grupo o
alumno recibir un problema especial
consistente en la preparacin de una
solucin buffer, de pH y concentracin
determinados y que llene ciertos
requisitos que se indicaran en cada caso.
Deber: a) efectuar los clculos
correspondientes
para
saber
que
sustancias debe emplear y que cantidad
de cada una de ellas. b) determinar la
capacidad buffer de la solucin que
prepara.
MTODO:
1. Al recibir su problema, estudie las
condiciones que se piden y busque un
buffer cuyo pKa sea adecuado y aplicando

la ecuacin de Henderson-Hasselbach,
calcule las cantidades que debe pesar de
cido y base conjugada, para preparar 100
ml de disolucin.
2. Pese las cantidades que calcul o mida los
volmenes adecuados y disuelva. Afore
aproximadamente a 75 ml.
3. Transfiera esta disolucin a un vaso de
precipitados de 150 ml y verifique el pH en
un potencimetro previamente calibrado y
ajustar a la temperatura a las condiciones
de trabajo. Si el pH no es exactamente el
pedido, ajstelo agregando el componente
(cido o base), que sea necesario para
subir o bajar el pH hasta el valor requerido.
4. Afore a 100 ml con agua destilada y
verifique nuevamente el pH.
5. Determinacin de la capacidad buffer. La
capacidad buffer es la cantidad de base
fuerte requerida para alterar el pH de la
disolucin reguladora, en una unidad de
pH:
C.B.= db
dpH
Siendo dpH el incremento de pH
resultante de la adicin de un volumen db
de base.
6. Ponga su disolucin en un vaso, introduzca
los electrodos del potencimetro y
disponga una bureta con disolucin de
NaOH 1 N y un agitador

7.

magntico, dentro del vaso. Determine el

pH inicial.
Ponga el agitador en marcha sin que
este golpee los electrodos, y agregue un
volumen de NaOH 1 N medido
exactamente en la bureta (1 ml). Anote el
pH resultante. Repita las adiciones de
base, en volmenes iguales (1 ml) y anote
los valores de pH correspondientes, hasta
16
obtener por lo menos cinco lecturas.

b) Determinacin de pKa:
MTODO:
1. Ponga 20 ml de la solucin de glicina en
un vaso de precipitados de 100 ml.
2. Proceda a la medicin del pH.
3. Aada 0.1 ml de NaOH 1.0 M. Agitar el
vaso y volver a medir el pH anotando los
resultados.
4. Repita el paso 3 hasta llegar a un pH de
12 aproximadamente.
5. Haga lo mismo (pasos 1 a 4) para los
otros dos aminocidos.
6. Haga una grfica de pH contra volumen
en ml de NaOH gastados luego de tomar
en cuenta que cada 0.1 ml de NaOH
diluido en 20 ml aumenta la concentracin
de OH en 50 mmoles.
7. Localiza en la grfica los diferentes pK
de los aminocidos.
8. Identifica
a que pH tienen poder
10
amortiguador.

HOJA DE RESULTADOS
NOMBRE:
a)

GRUPO:

FECHA:

Preparacin
de
soluciones b) Determinacin de pKa:
amortiguadoras:
ml de NaOH
pH obtenido
1.- Problema N
pH requerido
agregados
Concentracin molar
0.0
Volumen final
ml.
1.0
2.- Clculos efectuados.
2.0
3.- Cantidades por pesar o medir de A y
3.0
HA.
4.0
4.-Cul es el pH de la solucin inicial?
5.0
5.-Cul es el pH final de la solucin?
6.- Cul es la capacidad buffer?

DISCUSIN DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO
1.- Indica el pKa de los siguientes cidos:
a) cido pirvico.
b) cido lctico.
c) cido benzoico.
d) cido oxlico.
e) cido succnico.
f) cido carbnico.
g) cido ctrico.
h) cido fosfrico.
2.- Indique el nombre completo, pKa y
peso molecular (o frmula) de los
siguientes compuestos usados como
reguladores de pH en bioqumica: TRIS;
CAPS; MES; TES Y Tricina.
3.-Para qu valores de concentracin de
los componente de un buffer, tiene este la
mxima capacidad buffer?

4.-Por qu los aminocidos actan como

reguladores del pH?
5.- Define que es la capacidad buffer?
6.-Identifica los cidos y bases conjugadas
de los siguientes pares de sustancias
+
a) (CH3)3NH / (CH3)3N
+
+
b) H3N-CH2COOH / H3N-CH2COO
+
c) H3N-CH2COO / H2N-CH2-COO
d) OOC-CH2-COOH / OOC-CH2-COO
e) OOC-CH2-COOH / HOOC-CH2-COOH 7.Como podras preparar 1 litro de un
buffer de fosfato 0.05 M. a pH 7.5 usando
K2HPO4 cristalino y una solucin de HCl
1M?

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS